Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Aplicación de un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional para inducir la diferenciación tenogénica de células madre derivadas del tendón

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional es un biorreactor ideal para la diferenciación tenogénica específica de las células madre derivadas del tendón y la formación de neo tendones.

Abstract

La tendinopatía es una enfermedad del tendón crónico común relacionada con la inflamación y la degeneración en un área ortopédica. Con alta morbilidad, capacidad de autorreparación limitada y, lo que es más importante, sin tratamientos definitivos, la tendinopatía todavía influye negativamente en la calidad de vida de los pacientes. Las células madre derivadas del tendón (TDSC), como células precursoras primarias de las células tendones, desempeñan un papel esencial tanto en el desarrollo de la tendinopatía como en la restauración funcional y estructural después de la tendinopatía. Por lo tanto, un método que puede imitar in vitro la diferenciación in vivo de los ETDSC en las células tendinosas sería útil. Aquí, el presente protocolo describe un método basado en un sistema de estiramiento uniaxial tridimensional (3D) para estimular a los TDSC a diferenciarse en tejidos similares a los tendones. Existen siete etapas del presente protocolo: aislamiento de ratones TDSC, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células madre del tendón 3D, montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial, y evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro. La eficacia fue demostrada por la histología. Todo el procedimiento toma menos de 3 semanas. Para promover la deposición de matriz extracelular, se utilizó 4,4 mg/ml de ácido ascórbico en el medio de cultivo de estimulación. Una cámara separada con un motor lineal proporciona una carga mecánica precisa y es portátil y se ajusta fácilmente, que se aplica para el biorreactor. El régimen de carga en el presente protocolo fue 6% cepa, 0,25 Hz, 8 h, seguido de 16 h de descanso durante 6 días. Este protocolo podría imitar la diferenciación celular en el tendón, lo cual es útil para la investigación del proceso patológico de tendinopatía. Por otra parte, el tejido similar al tendón se utiliza potencialmente para promover la cicatrización del tendón en la lesión del tendón como un injerto autólogo diseñado. En resumen, el presente protocolo es simple, económico, reproducible y válido.

Introduction

La tendinopatía es una de las lesiones deportivas comunes. Se manifiesta principalmente por el dolor, hinchazón local, disminución de la tensión muscular en la zona afectada, y disfunción. La incidencia de tendinopatía es alta. La presencia de tendinopatía de Aquiles es más común para los corredores de media y larga distancia (hasta 29%), mientras que la presencia de tendinopatía rotuliana también es alta en los atletas de voleibol (45%), baloncesto (32%), pista y campo (23%), balonmano (15%), y fútbol (13%)1,,2,3,,4,5. Sin embargo, debido a la limitada capacidad de autocuración del tendón, y la falta de tratamientos eficaces, la tendinopatía todavía influye en la vida de los pacientes negativamente6,7. Además, la patogénesis de la tendinopatía sigue sin estar clara. Ha habido muchas investigaciones sobre su patogénesis, incluyendo principalmente "teoría de la inflamación", "teoría de la degeneración", "teoría del uso excesivo", y así sucesivamente8. En la actualidad, muchos investigadores creían que la tendinopatía se debía a la reparera fallida de las microlesiones causadas por la carga mecánica excesiva del tendón experimenta9,,10.

Las células madre derivadas del tendón (TDSC), como células precursoras primarias de las células tendonesas, desempeñan un papel esencial tanto en el desarrollo de la tendinopatía como en la restauración funcional y estructural después de la tendinopatía11,12,13. Se informó que la estimulación mecánica del estrés podría causar la proliferación y diferenciación de osteocitos, osteoblastos, células musculares lisas, fibroblastos, células madre mesenquimales y otras células sensibles a la fuerza14,15,16,17,18. Por lo tanto, los TDSC, como una de las células mecanósensibles y multipotentes, pueden ser estimulados de manera similar para diferenciar por carga mecánica19,20.

Sin embargo, diferentes parámetros de carga mecánica (fuerza de carga, frecuencia de carga, tipo de carga y período de carga) pueden inducir a los TDSC a diferenciarse en diferentes celdas21. Por lo tanto, un régimen de carga mecánica eficaz y válido es muy significativo para la tenogénesis. Además, existen diferentes tipos de biorreactores como sistemas de estimulación utilizados actualmente para proporcionar carga mecánica a los TDSC. Los principios de cada tipo de biorreactor son diferentes, por lo que los parámetros de carga mecánica correspondientes a diferentes biorreactores también son diferentes. Por lo tanto, se demanda un protocolo de estimulación simple, económico y reproducible, incluyendo el tipo de biorreactor, el medio de estimulación correspondiente y el régimen de carga mecánica.

El presente artículo describe un método basado en un sistema de estiramiento uniaxial tridimensional (3D) para estimular a los TDSC a diferenciarse en tejido similar al tendón. Hay siete etapas del protocolo: aislamiento de ratones TDSC, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante el cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células madre del tendón 3D, montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial, y evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro. Todo el procedimiento tarda menos de 3 semanas en obtener la construcción de la célula 3D, que es mucho menor que algunos métodos existentes22,,23. Se ha demostrado que el presente protocolo es capaz de inducir a los ETS para que se diferencien en tejido tendino, y es más fiable que el sistema de estiramiento bidimensional (2D) de uso comúnactual 21. La eficacia fue demostrada por la histología. En definitiva, el presente protocolo es simple, económico, reproducible y válido.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Los métodos descritos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices y regulaciones del Comité de Etica Animal de la Universidad de Australia Occidental.

1. Aislamiento de ratones TDSC

  1. Eutanasia los ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad por luxación cervical.
  2. Cosecha de tendonesrotulosos 24 y tendones de Aquiles25.
  3. Digerir tendones de uno con 6 ml de colagenasa de tipo I (3 mg/ml) durante 3 h.
    NOTA: Como el tamaño del tendón en el ratón es pequeño, todos los tendones cosechados de un ratón deben utilizarse en este paso.
  4. Recoger las células y el cultivo en medio esencial mínimo completo (Alpha-MEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de la mezcla de estreptomicina y penicilina durante 7 días.
  5. Identificar los TDSC mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia por citometría de flujo (expresión de marcadores de superficie celular, incluidos CD44, CD90 y Sca-1; falta de expresión de CD34 y CD45).
  6. Células de paso y congelación (el paso 4 células se utilizará para pasos adicionales).

2. Cultivo y expansión de ratones TDSC

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Tome las células calentadas (ratones TDSC, 1 millón de células, paso 4, a 37 oC).
  2. Agregue lentamente 4-5 mL adicionales de medio esencial mínimo completo (Alpha-MEM).
  3. Transfiera la mezcla a un tubo centrífugo de 15 ml con una pipeta.
  4. Reta con un total de medio a 8 ml con una pipeta.
    1. Precalentar el medio en una incubadora de horno de 37oC.
  5. Coloque el tubo en centrífuga y equilibre.
  6. Células centrífugas y pellets a 347 x g durante 5 min.
  7. Sacar después de la centrífuga y comprobar el pellet en la parte inferior.
  8. Decantar el medio de congelación, y resuspend las células suavemente en 1-2 mL de medio completo (evitar hacer demasiadas burbujas).
  9. Transfiera las celdas resuspendidas a un matraz T-75 por una pipeta.
  10. Utilice una pipeta para añadir el medio Alfa-MEM completo al matraz para alcanzar un volumen total de 10 ml con una concentración final de 13.000 células/cm2.
  11. Colocar el matraz en la incubadora y en forma de cultivo a 37oC con un 5% de CO2.
  12. Cambie el medio cada 3 días.
  13. Observar y monitorear las células bajo un microscopio al cambiar el medio hasta que las células se cultivan a 100% confluencia (alrededor de 40.000 células/cm2).

3. Preparación del medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Vierta 15 ml de medio Alpha-MEM completo en un tubo estéril de 15 ml.
  2. Añadir 6 l de ácido ascórbico (11 mg/ml) en 15 ml de medio para una concentración final de 4,4 g/ml.
    NOTA: Además, añadir un factor de crecimiento del tejido conectivo de 25 ng/ml en el medio de cultivo de estimulación puede acelerar todo el proceso de crecimiento y diferenciación.
  3. Mezclar suavemente invirtiendo hacia arriba y hacia abajo.

4. Formación de láminas celulares mediante el cultivo en medio de estimulación

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Deseche cuidadosamente el medio alfa-MEM completo normal y evite tocar las celdas unidas a la parte inferior del matraz.
  2. Añadir 10 ml de medio de estimulación lentamente y evitar causar ninguna alteración a las células completamente confluentes.
  3. Cultivo de las células en medio de estimulación durante 9 días (cambiar el medio cada 3 días) para generar suficientemente la hoja celular a 37 oC con 5% de CO2.
    NOTA: La matriz extracelular se volverá gruesa y presente para estar turbia cuando se observa desde la parte inferior del matraz después de estimularse por ácido ascórbico, lo que significa que la hoja celular está suficientemente generada.

5. Preparación de la construcción de células madre del tendón 3D

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Saque el matraz de la incubadora.
  2. Deseche completamente el medio de estimulación.
  3. Lave la lámina celular monocapa con solución salina tampón de fosfato (PBS) girando el matraz.
  4. Deseche el PBS por completo.
  5. Utilice una pipeta para añadir 1 ml de 0,25% de trippsina a la esquina del matraz.
  6. Toque la esquina del matraz para desajuntar la hoja de celda monocapa hasta que la esquina de la hoja de celda esté fuera de la parte inferior del matraz.
  7. Añadir inmediatamente 9 ml de medio Alfa-MEM completo para detener la tripsinación.
  8. Continúe girando el matraz para despegar completamente la lámina de celda monocapa.
  9. Vierta la hoja de celda total desajunida en un plato de Petri con un medio.
  10. Utilice una pinza estéril para recoger una esquina de la hoja de celda y gire en el sentido de las agujas del reloj durante 15 veces.
  11. Recoja otro extremo de la hoja de celda y gire en sentido antihorario durante 10 veces para generar firmemente una construcción in vitro similar a un tendón(Figura 1A).

6. Montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial en un biorreactor de diseño único

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos en una capucha de bioseguridad estéril.

  1. Conecte los ganchos del conectador y ajuste a la distancia deseada (2 cm) entre dos ganchos.
  2. Enrolle suavemente la construcción de los TDSC 3D en el gancho montado 3 veces en cada gancho (Figura 1B).
  3. Fije los ganchos con la construcción de la célula en la cámara del biorreactor apretando los tornillos en dos extremos.
    NOTA: Toda la cámara, incluidos los tornillos y ganchos, es estéril (autoclave durante 1,5 h a 134 oC y los rayos ultravioleta (UV) exponen durante 24 horas antes de su uso). Para el soporte de metal de las cámaras, la luz UV se expone durante 48 horas antes de su uso.
  4. Llene la cámara con un medio Alfa-MEM completo.
  5. Conecte el actuador a la cámara de cultivo por cable.
  6. Corte el comediante de ganchos con tijeras estériles.
  7. Encienda la alimentación y el controlador de canal correspondiente para iniciar la estimulación mecánica.
  8. Pon la tapa en la cámara.
  9. Compruebe las luces indicadoras y asegúrese de que el biorreactor pueda funcionar correctamente.
  10. Poner el biorreactor en la incubadora y someter la construcción de la célula 3D a estiramiento mecánico durante 6 días (6% de estiramiento, 0,25 Hz, 8 h, seguido de 16 h de descanso).

7. Evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro

  1. Afloje los tornillos con un destornillador y retire el conjunto con cuidado.
  2. Poner el tejido similar al tendón en 4% de paraformaldehído para fijación durante 15 min.
  3. Coloque el tejido similar al tendón fijo en un casete de biopsia con almohadillas de espuma de biopsia.
  4. Proceso para deshidratar la muestra y finalmente evaluar por tinción histológica H&E.
  5. Repita todo el protocolo y extraiga el ARN del tejido similar al tendón para evaluar la expresión de marcadores tenogénicos por PCR cuantitativo (qPCR). Los primeres para los genes seleccionados se enumeran en la Tabla 1.
    NOTA: El protocolo de histología y el protocolo qPCR son estándar y siguen un estudio anterior21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antes de la estimulación mecánica, los TDSC crecieron al 100% de confluencia en un medio completo y mostraron una morfología ultraestructural desorganizada(Figura 2A). Después de 6 días de estiramiento uniaxial de carga mecánica, matriz extracelular (ECM) y alineaciones celulares fueron bien orientados (Figura 2B). Las células estaban bien pobladas y bien envueltas en ECM después de la carga mecánica. La morfología celular se presentó para ser alargada y era más similar a la célula del tendón normal en comparación con la que no se estiraba (Figura 2C). La densidad celular en la construcción de celdas con carga era mayor que en la que no se cargaba. Los resultados de QPCR mostraron que el método actual aumentó la expresión de los marcadores tenogénicos incluyendo Escleraxis, Mohawk, Tenomodulin y COL1A1 (Figura 3) en comparación con los tratados por cultivo estático.

Figure 1
Figura 1: Montaje de la construcción de células tridimensionales (3D) sobre los ganchos del biorreactor. (A) Vista general de la construcción de celda 3D sobre los ganchos. (B) El diagrama para ensamblar la construcción de celda 3D sobre los ganchos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Morfología celular antes y después de la estimulación mecánica. (A) Las células madre derivadas del tendón se cultivaron al 100% de confluencia en un medio completo y mostraron una morfología ultraestructural desorganizada antes de la estimulación mecánica. (B) Las imágenes histológicas mostraron tinción H&E de la construcción celular después de la estimulación mecánica. (C) Las imágenes histológicas mostraron tinción H&E de una construcción celular de control cultivada en biorreactor durante 6 días sin estimulación mecánica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Nivel de expresión de marcadores de tenogénesis. Los niveles individuales de expresión génica se normalizaron primero contra el control interno, 36B4, y luego se normalizaron contra los niveles de expresión génica de cultivos estáticos. Se muestran los resultados de 3 experimentos. Las secuencias de imprimación utilizadas para el análisis qPCR se proporcionan en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: El sistema de biorreactor de estimulación mecánica noiaxial tridimensional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gene Secuencia de imprimación
Adelante 5'->3' Invertir 5'->3'
COL1A1 TGACTGGAAGAGCGGAGAGT GTTCGGGCTGATGTACCAGT
Escleraxis CCCAAACAGATCTGCACCTT GGCTCTCCGTGACTCTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTAAG TCGCTGAGCTTTCCTTTA
Tenomodulin CCGCAGAAAAGCCTATTGAA GACCACCCATTGCTCATTCT
36B4 CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tabla 1: Secuencias de imprimación utilizadas para el análisis qPCR

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El tendón es un tejido conectivo fibroso mecanosensible. Según investigaciones anteriores, el exceso de carga mecánica podría conducir a la diferenciación osteogénica de las células madre del tendón, mientras que la carga insuficiente conduciría a una estructura desordenada de la fibra de colágeno durante la diferenciación del tendón21.

Una opinión común es que la clave para un biorreactor ideal es la capacidad de simular el microambiente celular in vitro que sufren las células in vivo. Por lo tanto, imitar el entorno de tensión normal in vivo in vitro es la clave para estimular la diferenciación de un solo linaje de los ETDS en las células del tendón. En el protocolo actual, el ancho de la construcción TDSC era de 2 cm, y el rango de movimiento del gancho era de 0,12 cm, lo que significa que la tensión era de 0,12/2 (%). En conclusión, las ETDS se estimularon mecánicamente en un biorreactor durante 6 días (6%, 0,25 Hz, 8 h, seguido de 16 h de descanso) en el presente protocolo. Después de la evaluación, se ha demostrado que los parámetros de carga mecánica utilizados en este protocolo inducen a los TDSC a generar tejido similar al tendón. Cabe señalar que los parámetros del biorreactor deben coincidir específicamente con el tipo correspondiente de sistema de estiramiento. Por ejemplo, los parámetros adecuados para el estiramiento de celda monocapa son diferentes de la hoja de celda 3D actual que se extiende26,27. Una posible razón son los diferentes modos de fuerza21. En el sistema de estiramiento monocapa 2D, las células se unen al sustrato de cultivo mediante adherencias focales en la parte inferior y se conectan entre sí a través de uniones celda-célula. Sin embargo, en una hoja de celda 3D, también hay muchas más conexiones celda-ECM formadas como resultado del nicho 3D, lo que significa que las células están bajo presión además de estirarse.

La eficacia del presente protocolo se demostró mediante la morfología y el nivel de expresión de los marcadores tenogénicos. En términos de morfología, aparte de la histología, el uso de microscopía de inmunofluorescencia confocal para detectar colágeno I es una forma común de caracterizar la organización del colágeno y luego evaluar la alineación ECM. Estudio previo confirmó la formación de paquetes de colágeno bien alineado tipo I en la construcción TDSC con 6% de estimulación mecánica uniaxial durante 6 días, pero no en el uno sin carga21. Se utilizaron marcadores tenogénicos para identificar células tendinosas, incluyendo Escleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) y COL1A1. Sólo TNMD era un factor de no transcripción, y el resto de ellos son factores de transcripción28. Todos fueron bien reconocidos. SCX podría regular el desarrollo del tendón en la etapa embrionaria29,mientras que MKX podría regular la diferenciación y maduración del tendón en la etapa postnatal30. Por otra parte, las propiedades mecánicas (carga máxima y rigidez) del tejido similar al tendón se han evaluado en estudios anteriores también, y mostró que las propiedades mecánicas de la construcción TDSC con carga eran mejores que en el que se encuentra sin carga21.

El medio puede afectar el crecimiento celular y la diferenciación. En el presente protocolo, con el fin de formar la lámina celular de manera adecuada, los TDSC crecieron al 100% de confluencia en matraces de plástico estándar sin recubrimiento en un medio completo, y luego se estimularon los TDSC para promover la deposición de ECM añadiendo 4,4 mg/ml de ácido ascórbico para 6 d. Varios factores de crecimiento, incluyendo insulina-como factor de crecimiento I, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento transformador, y factor de diferenciación del crecimiento 5, jugó un papel importante en la formación de tendones y la curación31,,32,33,34. Además, la adición de 25 ng/ml factor de crecimiento del tejido conectivo en el medio de cultivo de estimulación como Ni et al. informó podría acelerar todo el proceso de crecimiento y diferenciación35.

En la actualidad, la hoja celular 2D, también conocida como la célula monocapa, es el sistema más común utilizado para las investigaciones mecánicas. El estiramiento biaxial proporciona tensión multidireccional, tanto longitudinal como lateralmente, ya que el estiramiento uniaxial sólo proporciona tensión longitudinal36. Por lo tanto, el cultivo celular monocapa con estiramiento biaxial podría imitar el entorno de crecimiento de algunos tipos de células, como los cardiomiocitos y las células epidérmicas. Sin embargo, la construcción de la célula 3D es más similar a la forma real de un tendón, y el estiramiento uniaxial es más similar a las características de tensión de las células del tendón, en comparación con la hoja de celda 2D y el estiramiento biaxial. Por lo tanto, la combinación de la construcción de la célula 3D y el estiramiento uniaxial es más competente para una mejor comprensión del tendón y su microambiente mecánico. Esto proporciona una base teórica para el uso de un sistema de estiramiento uniaxial 3D para estimular la diferenciación de los ETDSC. Por lo tanto, la hoja celular 2D finalmente se enrolló en una construcción de celda 3D y se sometió a un estiramiento uniaxial en el protocolo actual.

El biorreactor utilizado en el presente protocolo consistía en actuador y cámara de cultivo (Figura 4). Los detalles del actual biorreactor están disponibles en un estudio anterior37. Actualmente, los actuadores más comunes utilizados para el tendón incluían actuadores neumáticos, motores lineales y tornillos de motos paso38,,39,,40. Las cámaras incluían cámaras integradas y separadas41,,42. Entre ellos, una cámara separada con un motor lineal proporcionaba una carga mecánica precisa y era portátil y fácil de ajustar43.

Excepto los TDSC, otros tipos de células madre pueden ser una fuente de células potencial que se utilizará en el método actual. Investigaciones anteriores han demostrado que otros tipos de células madre podrían tener capacidad terapéutica potencial y podrían mejorar la regeneración del tendón. En comparación con los tendones equinos lesionados tratados con el manejo convencional no celular, la tasa de re-lesiones de los tendones tratados por bmSC fue menor44,,45. Además, la inyección intratendosa de BMSC en un modelo de tendinopatía podría inducir efectivamente la regeneración deltendón 46. Las células madre derivadas adiposas podrían tratar eficazmente las tendinopatías equinas que conducen a una recuperación completa y a volver a la actividad normal en los caballos47. Juntos, había suficiente evidencia para sugerir que las células madre, excepto las ETDS, podían tratar la degeneración del tendón. Sin embargo, como nota de precaución, se ha demostrado que el trasplante de BMSC en tendones lesionados induce la diferenciación osteogénica ectópica en un modelo de conejo, lo que sugiere que las células madre de un tejido específico podrían tener una tendencia a diferenciarse en células no deseadas de su tejido de origen48. En investigaciones anteriores, el tratamiento de carga privada a las ETS podría dar lugar a osteogénesis también21, lo que llevó a la propuesta de que el método actual tiene el potencial de inducir la tenogénesis de otras células madre y evitar la osteogénesis con un régimen de carga específico. Es necesario realizar más investigaciones para explorar estos regímenes de carga específicos para otros tipos de células madre. Si este escenario se mantiene, habrá más fuente de células para tratar la tendinopatía.

Todavía hay algunas limitaciones que reconocer. En primer lugar, aunque se utilizó un material no corrosivo y autoclavable, el acero inoxidable, para construir el sistema de biorreactor, las condiciones de cultivo y el medio de cultivo todavía corroen la cámara, incluyendo el tornillo y el gancho. Por lo tanto, la inspección de rutina de la cámara y la eliminación oportuna de óxido son necesarias. En segundo lugar, para que el actual biorreactor sea económico y portátil, no existe un sistema de control ambiental y circulación media en él. Por lo tanto, el operador necesita transportar el biorreactor y abrir la cámara para intercambio medio cada 3 días, lo que aumenta el riesgo de contaminación. El operador siempre debe prestar atención para mantener el entorno de los TDSC estéril.

Para el tratamiento de la tendinopatía, es vital aclarar el proceso patológico desde una perspectiva no quirúrgica. En términos de tratamiento quirúrgico, un método eficaz es utilizar injertos autólogos de ingeniería. El proceso de estimular los TDSC para imitar la diferenciación in vivo es útil para la investigación del proceso patológico de tendinopatía. El tejido tendinoso sin andamios de ingeniería tiene la capacidad de promover la cicatrización del tendón en un modelo de lesión de ventana de tendón rotulista de rata. Además, trabajos anteriores demostraron que la carga mecánica podría mejorar las propiedades mecánicas del tendón cultivado. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método reproducible para la diferenciación dirigida de los TDSC en tejido similar a un tendón, de modo que pueda ser utilizado de forma sencilla y factible para el cultivo potencial de tendones de ingeniería.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La investigación se llevó a cabo mientras el autor estaba en la recepción de "una beca de tasa internacional de la Universidad de Australia Occidental y un premio de postgrado de la universidad en la Universidad de Australia Occidental". Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Medicina Número 162 Carga mecánica células madre derivadas del tendón tendinopatía biorreactor diferenciación tendón células madre
Aplicación de un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional para inducir la diferenciación tenogénica de células madre derivadas del tendón
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,… More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter