Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tillämpa ett tredimensionellt enaxiskt enaxligt bioreaktorsystem för mekanisk stimulering för att inducera tenogen differentiering av sena stamceller

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Ett tredimensionellt enaxligt bioreaktorsystem för enaxlig mekanisk stimulering är ett idealiskt bioreaktor för tenogen-specifik differentiering av senhärledda stamceller och neo-senbildning.

Abstract

Tendinopati är en vanlig kronisk sena sjukdom som rör inflammation och degeneration i ett ortopediskt område. Med hög sjuklighet, begränsad självreparerande kapacitet och, viktigast av allt, inga definitiva behandlingar, påverkar tendinopati fortfarande patienternas livskvalitet negativt. Sena stamceller (TDSC), som primära prekursorceller av senceller, spelar en viktig roll i både utvecklingen av tendinopati och funktionell och strukturell restaurering efter tendinopati. En metod som kan in vitro efterlikna in vivo-differentiering av TDSC till senceller skulle därför vara användbar. Här beskriver det nuvarande protokollet en metod baserad på en tredimensionell (3D) enaxial stretching system för att stimulera TDSCs att differentiera till sena-liknande vävnader. Det finns sju stadier av det nuvarande protokollet: isolering av möss TDSCs, kultur och expansion av möss TDSCs, beredning av stimulering odling medium för cell arkbildning, cell ark bildas genom odling i stimulering medium, beredning av 3D senstamcell konstruktion, montering av uniaxial-stretching mekanisk stimulering komplex och utvärdering av den mekaniska stimuleras in vitro senor-liknande vävnad. Effektiviteten visades av histologi. Hela proceduren tar mindre än 3 veckor. För att främja extracellulära matris nedfall, 4.4 mg/mL askorbinsyra användes i stimulering odling mediet. En separerad kammare med linjär motor ger exakt mekanisk belastning och är bärbar och lättjusterad, som appliceras för bioreaktorn. Lastning regimen i det nuvarande protokollet var 6% stam, 0,25 Hz, 8 h, följt av 16 h vila i 6 dagar. Detta protokoll kan efterlikna cell differentiering i senan, vilket är till hjälp för undersökningen av den patologiska processen för tendinopati. Dessutom är senliknande vävnad potentiellt används för att främja sena läkning i sena skada som en konstruerad autolog graft. Sammanfattningsvis är det nuvarande protokollet enkelt, ekonomiskt, reproducerbart och giltigt.

Introduction

Tendinopati är en av de vanligaste idrottsskador. Det manifesteras främst av smärta, lokal svullnad, minskad muskelspänning i det drabbade området och dysfunktion. Förekomsten av tendinopati är hög. Förekomsten av Achilles tendinopati är vanligast för medel- och långdistanslöpare (upp till 29%), medan förekomsten av patellar tendinopati är också hög hos idrottare i volleyboll (45%), basket (32%), friidrott (23%), handboll (15%), och fotboll (13%)1,2,3,,4,5. Men på grund av den begränsade självläkande förmåga senan, och bristen på effektiva behandlingar, tendinopati påverkar fortfarande patienternas liv negativt6,7. Dessutom är patogenesen vid tendinopati fortfarande oklart. Det har gjorts många undersökningar om dess patogenes, främst inklusive "inflammation teori", "degeneration teori", "överanvändning teori", och så vidare8. För närvarande trodde många forskare att tendinopati berodde på den misslyckade självreparation till mikro-skador som orsakas av överdriven mekanisk belastning senan erfarenheter9,10.

Senhärledda stamceller (TDSC), som primära prekursorceller av senceller, spelar en viktig roll i både utvecklingen av tendinopati och funktionell och strukturell restaurering efter tendinopati11,12,13. Det rapporterades att mekanisk stressstimulering kan orsaka spridning och differentiering av osteocyter, osteoblater, glatta muskelceller, fibroblaster, mesenkymala stamceller och andra kraftkänsliga celler14,15,16,17,18. Därför kan TDSC, som en av de mekansokänsliga och multipotenta celler, på samma sätt stimuleras att skilja genom mekanisk belastning19,20.

Olika mekaniska lastningsparametrar (lastningsstyrka, lastningsfrekvens, lastningstyp och lastningsperiod) kan dock leda till att TDSC-enheter differentieras till olika celler21. Således är en effektiv och giltig mekanisk lastning regim mycket betydande för tenogenesis. Dessutom finns det olika typer av bioreaktorer som stimuleringssystem som för närvarande används för att tillhandahålla mekanisk belastning till TDSC. Principerna för varje typ av bioreaktor är olika, så de mekaniska belastningsparametrarna som motsvarar olika bioreaktorer är också olika. Därför är ett enkelt, ekonomiskt och reproducerbart stimuleringsprotokoll efterfrågat, inklusive typ av bioreaktor, motsvarande stimuleringsmedium och den mekaniska belastningsregimen.

Denna artikel beskriver en metod baserad på en tredimensionell (3D) enaxial stretching system för att stimulera TDSCs att differentiera till senliknande vävnad. Det finns sju stadier av protokollet: isolering av möss TDSCs, kultur och expansion av möss TDSCs, beredning av stimulering odlingsmedium för cell arkbildning, cell ark bildas genom odling i stimulering medium, beredning av 3D senstamcell konstruktion, montering av uniaxial-stretching mekanisk stimulering komplex, och utvärdering av den mekaniska stimuleras in vitro senor-liknande vävnad. Hela proceduren tar mindre än 3 veckor att få 3D-cellkonstruktion, vilket är mycket mindre än vissa befintliga metoder22,23. Det nuvarande protokollet har visat sig kunna inducera TDSCs att differentiera till senvävnad, och det är mer tillförlitligt än den nuvarande vanligen använda tvådimensionella (2D) stretching system21. Effektiviteten visades av histologi. Kort sagt, det nuvarande protokollet är enkelt, ekonomiskt, reproducerbart och giltigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De metoder som beskrivs godkändes och utfördes i enlighet med riktlinjerna och föreskrifterna från University of Western Australia Animal Ethics Committee.

1. Isolering av möss TDSC

  1. Avliva 6-8 veckor gamla C57BL/6 möss genom livmoderhalscancer störningen.
  2. Harvest patellar senor24 och Hälsenor25.
  3. Digest senor från en med 6 ml typ I collagenase (3 mg/mL) för 3 h.
    OBS: Eftersom storleken på senan i musen är liten, bör alla senor som skördas från en mus användas i detta steg.
  4. Samla cellerna och kulturen i komplett Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) som innehåller 10% av fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% av streptomycin och penicillin blandning i 7 dagar.
  5. Identifiera TDSC med fluorescensaktiverad cellsortering efter flödescytometri (uttryck för cellytmarkörer inklusive CD44, CD90 och Sca-1; brist på uttryck för CD34 och CD45).
  6. Passage- och frysceller (passage 4 celler kommer att användas för ytterligare steg).

2. Kultur och expansion av möss TDSC

OBS: Utför alla steg i en steril biosäkerhetshuva.

  1. Ta de uppvärmda cellerna (möss TDSCs, 1 miljon celler, passage 4, till 37 °C).
  2. Tillsätt långsamt extra 4-5 ml komplett Minimal Essential Medium (Alpha-MEM).
  3. Överför blandningen till ett 15 ml centrifugrör med en pipett.
  4. Fyll på med medelstor till 8 ml totalt med en pipett.
    1. Förvärmsmedel i en 37 °C ugnskuvös.
  5. Placera röret i centrifug och balans.
  6. Centrifug- och pelletsceller vid 347 x g i 5 min.
  7. Ta ut efter centrifugen och kontrollera pelleten längst ner.
  8. Dekantera det iskalla mediet och återanvända cellerna försiktigt i 1-2 ml komplett medium (undvik att göra för många bubblor).
  9. Överför återuppstagda celler till en T-75-kolv med en pipett.
  10. Använd en pipett för att lägga till komplett Alpha-MEM Medium till kolven för att nå en total volym på 10 ml med slutlig koncentration på 13 000 celler/cm2.
  11. Placera kolven i inkubatorn och kulturen vid 37 °C med 5 % CO2.
  12. Byt medium var tredje dag.
  13. Observera och övervaka cellerna under ett mikroskop när du byter medium tills cellerna odlas till 100% sammanflödet (ca 40 000 celler/cm2).

3. Beredning av stimuleringsodlingsmedium för cellplåtsbildning

OBS: Utför alla steg i en steril biosäkerhetshuva.

  1. Häll 15 ml komplett Alpha-MEM-medium i ett 15 ml sterilt rör.
  2. Tillsätt 6 μl askorbinsyra (11 mg/ml) i 15 ml medium för en slutlig koncentration på 4,4 μg/ml.
    OBS: Dessutom lägga till 25 ng/mL bindväv tillväxtfaktor i stimulering odlingsmediet kan påskynda hela tillväxten och differentieringsprocessen.
  3. Blanda försiktigt genom att vända upp och ner.

4. Cellarkbildning genom odling i stimuleringsmedium

OBS: Utför alla steg i en steril biosäkerhetshuva.

  1. Kassera det normala hela alfa-MEM-mediet noggrant och undvik att vidröra cellerna som är fästa vid kolvens botten.
  2. Tillsätt 10 ml stimuleringsmedium långsamt och undvik att orsaka störningar i de helt konfluenta cellerna.
  3. Odla cellerna i stimuleringsmedium i 9 dagar (byt medium var tredje dag) så att cellen i tillräcklig utsträckning genererar cellen vid 37 °C med 5 % CO2.
    OBS: Extracellulär matris blir tjock och närvarande grumlig när den observeras från botten av kolven efter stimuleras av askorbinsyra, vilket innebär att cellen arket är tillräckligt genereras.

5. Beredning av 3D-sena stamceller konstruktion

OBS: Utför alla steg i en steril biosäkerhetshuva.

  1. Ta ut kolven ur inkubatorn.
  2. Kassera stimuleringsmediet helt.
  3. Tvätta enskiktscellarket med fosfatbuffertsaltlösning (PBS) genom att snurra kolven.
  4. Kassera PBS helt.
  5. Använd en pipett för att lägga till 1 ml 0,25 % trypsin i hörnet av kolven.
  6. Tryck på kolvens hörn för att avansluta enskiktscellarket tills cellarkets hörn är från botten av kolven.
  7. Lägg omedelbart till 9 ml komplett Alpha-MEM-medium för att stoppa trypsiniseringen.
  8. Fortsätt snurra kolven för att skala av enskiktscellarket helt.
  9. Häll det totala avslutna cellarket i en petriskål med medium.
  10. Använd en steril pincett för att plocka upp ett hörn av cellarket och rotera i medurs riktning i 15 gånger.
  11. Plocka upp en annan ände av cellarket och rotera i moturs riktning i 10 gånger för att stadigt generera en senliknande in vitro-konstruktion (figur 1A).

6. Montering av det enaxialsträckningsmekaniska stimuleringskomplexet i unik designad bioreaktor

OBS: Utför alla steg i en steril biosäkerhetshuva.

  1. Anslut krokarna med anslutaren och justera till önskat avstånd (2 cm) mellan två krokar.
  2. Försiktigt linda 3DSCs konstruera på den monterade kroken för 3 gånger på varje krok(figur 1B).
  3. Fäst krokarna med cellkonstruktion på bioreaktorns kammare genom att dra åt skruvarna i två ändar.
    OBS: Hela kammaren, inklusive skruvar och krokar, är steril (autoklav för 1,5 h vid 134 °C och ultravioletta strålar (UV) exponera i 24 timmar före användning). För metallhållaren av kammare exponeras UV-ljus i 48 timmar före användning.
  4. Fyll kammaren med komplett Alpha-MEM medium.
  5. Anslut ställdonet till kulturkammaren med kabel.
  6. Skär krokarna connecter med steril sax.
  7. Slå på ström och motsvarande kanalstyrenhet för att starta mekanisk stimulering.
  8. Lägg locket på kammaren.
  9. Kontrollera indikatorlamporna och se till att bioreaktorn kan fungera korrekt.
  10. Sätt bioreaktorn i inkubatorn och utsätt 3D-cellkonstruktionen på mekanisk sträckning i 6 dagar (6% stretching, 0,25 Hz, 8 h, följt av 16 h vila).

7. Utvärdering av den mekaniska stimulerade in vitro-senor-liknande vävnad

  1. Lossa skruvarna med en skruvmejsel och ta av monteringen försiktigt.
  2. Sätt senliknande vävnad i 4% paraformaldehyd för fixering i 15 min.
  3. Placera den fasta senliknande vävnaden i en biopsikassett med biopsiskumkuddar.
  4. Process för att torka provet och slutligen utvärdera genom H & E histologiska färgning.
  5. Upprepa hela protokollet och extrahera RNA från senliknande vävnad för att utvärdera uttrycket av tenogena markörer med kvantitativ PCR (qPCR). Grundfärger för de utvalda generna listas i tabell 1.
    OBS: Histologi protokoll och qPCR protokoll är standard och efter en tidigare studie21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Före mekanisk stimulering odlades TDSC till 100% sammanflödet i komplett medium och visade en oorganiserad ultrastrukturell morfologi (figur 2A). Efter 6 dagar av enaxlig stretching mekanisk belastning, extracellulär matris (ECM) och cell justeringar var väl orienterade (figur 2B). Cellerna var väl befolkade och väl insvept i ECM efter mekanisk belastning. Cellmorfologi presenterades för att vara långsträckt och var mer lik normal sencell jämfört med den utan stretching (Figur 2C). Celldensitet i cellkonstruktion med lastning var högre än i den utan belastning. QPCR resultat visade att den nuvarande metoden ökade uttrycket av tenogena markörer inklusive Scleraxis, Mohawk, Tenomodulin och KOL1A1(Figur 3) jämfört med de som behandlas av statisk kultur.

Figure 1
Figur 1: Montering av tredimensionell (3D) cellkonstruktion över bioreaktorns krokar. (A)Allmän bild av 3D-cellkonstruktionen över krokarna. (B)Diagrammet för att montera 3D-cellkonstruktionen över krokarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Cellmorfologi före och efter mekanisk stimulering. (A)Sena stamceller odlades till 100% sammanflödet i komplett medium och visas en oorganiserad strukturella morfologi före mekanisk stimulering. (B) Histologic bilder visade H & E färgning av cellkonstruktion efter mekanisk stimulering. (C) Histologic bilder visade H & E färgning av en kontroll cell konstruktion odlas i bioreaktor i 6 dagar utan mekanisk stimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Uttrycksnivå för tenogenesismarkörer. Individuella gen-uttryck nivåer normaliserades först mot den interna kontrollen, 36B4, och sedan normaliserade mot gen-uttryck nivåer från statiska kulturer. Resultat från 3 experiment visas. De grundfärgssekvenser som används för qPCR-analys finns i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Det tredimensionella enaxiala bioreaktorsystemetför mekanisk stimulering . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Gen Primer sekvens
Framåt 5'->3' Omvänd 5'->3'
COL1A1 (PÅ ANDRA) TGACTGGAAGAGCGGAGAGT GTTCGGGCTGATGTACCAGT
Skleraxi CCCAAACAGATCTGCACCTT GGCTCTCCGTGACTCTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTAAG TCGCTGAGCTTTCCCCTTTA
Tenomodulin (1998) CCGCAGAAAAGCCTATTGAA GACCACCCATTGCTCATTCT
36B4 (36)4) CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tabell 1: Primersekvenser som används för qPCR-analys

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Senan är en mekanosensitive fibrös bindväv. Enligt tidigare forskning, överskott mekanisk belastning kan leda till osteogenic differentiering av senstamceller, medan otillräcklig belastning skulle leda till störd kollagen fiberstruktur under sendifferentiering21.

En vanlig uppfattning är att nyckeln till en idealisk bioreaktor är förmågan att simulera in vitro-cellulär mikromiljö som cellerna in vivo genomgår. Därför, härma in vivo normal stress miljö in vitro är nyckeln till att stimulera enkel-härstamning differentiering av TDSCs i sena celler. I det nuvarande protokollet var bredden på TDSC konstruktionen 2 cm, och rörelseområdet för kroken var 0,12 cm, vilket innebär att stammen var 0,12/2 (%). Sammanfattningsvis stimulerades TDSC mekaniskt i en bioreaktor i 6 dagar (6%, 0,25 Hz, 8 h, följt av 16 h vila) i detta protokoll. Efter utvärdering, de mekaniska lastning parametrar som används i detta protokoll har visat sig inducera TDSCs att generera sena-liknande vävnad. Det bör noteras att bioreaktorparametrarna särskilt bör matcha motsvarande typ av stretchingsystem. Till exempel skiljer sig rätt parametrar för enskiktad cellsträckning från det nuvarande 3D-cellarket som sträcker sig26,27. En möjlig orsak är de olika kraftlägena21. I 2D monolayer stretching system, celler fäster vid kultursubstratet genom fokal sammanväxningar längst ner och ansluta till varandra via cell-cell korsningar. Men i en 3D-cell ark, det finns också många fler cell-ECM anslutningar bildas som ett resultat av 3D-nisch, vilket innebär att cellerna är under tryck förutom stretching.

Effektiviteten av det nuvarande protokollet visades genom morfologi och uttrycket nivå av tenogenic markörer. När det gäller morfologi, bortsett från histologi, med konfokal immunofluorescensmikroskopi för att upptäcka kollagen jag är ett vanligt sätt att karakterisera kollagen organisationen och sedan utvärdera ECM anpassning. Tidigare studie bekräftade väl anpassade kollagen typ I bunt bildning i TDSC konstruktion med 6% enaxial mekanisk stimulering för 6 dagar men inte i en utan lastning21. Tenogenic markörer användes för att identifiera senceller, inklusive Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) och COL1A1. Endast TNMD var en icke-transkriptionsfaktor, och resten av dem är transkriptionsfaktorer28. De var alla väl erkända. SCX kunde reglera senutveckling i embryonala steg29, medan MKX kunde reglera sendifferentiering och mognad i postnatala steg30. Dessutom har de mekaniska egenskaperna (max belastning och styvhet) i senliknande vävnad utvärderats i tidigare studie också, och det visade de mekaniska egenskaperna hos TDSC konstruera med lastning var bättre än i en utanlastning 21.

Mediet kan påverka celltillväxt och differentiering. I detta protokoll, för att bilda cellarket på ett korrekt sätt, var TDSCs odlas till 100% sammanflödet i standard obelagda plastflaskor i komplett medium, och sedan TDSCs stimulerades att främja ECM nedfall genom att lägga till 4,4 mg/ml askorbinsyra för 6 d. Flera tillväxtfaktorer, inklusive insulin-liknande tillväxtfaktor I, vaskulär endotel tillväxtfaktor, trombocyt-härledda tillväxtfaktor, grundläggande fibroblast tillväxtfaktor, omvandla tillväxtfaktor, och tillväxt differentiering faktor 5, spelade en viktig roll i senbildning och helande31,,32,33,34. Dessutom lägga till 25 ng/mL bindväv tillväxtfaktor i stimulering odling medium som Ni et al. rapporterade kan påskynda hela tillväxten och differentiering processen35.

För närvarande är 2D-cellar, även känd som den monolayered cellen, det vanligaste systemet som används för mekaniska undersökningar. Biaxial sträcka ger multidirectional spänning, både longitudinellt och i sidled, eftersom den enaxliga sträckan endast ger längsgående spänning36. Således kan monolayered cell kultur med biaxial stretch efterlikna tillväxtmiljön av vissa typer av celler, såsom kardiomyocyter och epidermal celler. Emellertid, 3D-cellen konstruktion är mer lik den verkliga formen av en sena, och uniaxial stretch är mer lik stressegenskaperna hos senceller, jämfört med 2D-cellark och biaxial stretch. Således är kombinationen av 3D-cellkonstruktionen och den uniaxial stretching mer kompetent för bättre förståelse av senan och dess mekaniska mikro-miljö. Detta ger en teoretisk grund för att använda ett 3D uniaxial stretching system för att stimulera differentiering av TDSCs. Således var 2D cell blad slutligen rullas in i en 3D-cell konstruktion och genomgick en uniaxial sträcka i det aktuella protokollet.

Den bioreaktor som användes i det nuvarande protokollet bestod av ställdon och odlingskammare (figur 4). Detaljerna för den nuvarande bioreaktorn finns i en tidigare studie37. För närvarande, de vanligaste ställdon som används för senan ingår pneumatiska ställdon, linjära motorer och steg motorball skruvar38,39,40. Avdelningar inkluderade integrerade och separerade kammare41,,42. Bland dem, en separerad kammare med en linjär motor som noggrann mekanisk belastning och var portabel och lätt att justeras43.

Förutom TDSC kan andra typer av stamceller vara en potentiell cellkälla som ska användas i den nuvarande metoden. Tidigare forskning har visat att andra typer av stamceller kan ha potentiell terapeutisk förmåga och kan förbättra senregenerering. Jämfört med skadade hästsenor som behandlades med konventionell icke-cellulär hantering var skadefrekvensen för senor som behandlades av BMSC lägre44,,45. Dessutom kan intratendinous injektion av BMSCs i en tendinopati modell effektivt inducera sena regenerering46. Fetthärledda stamceller skulle effektivt kunna behandla häst tendinopatier som leder till fullständig återhämtning och återgång till normal aktivitet hos hästar47. Tillsammans fanns det tillräckligt med bevis som tyder på att stamceller, utom TDSCs, kunde behandla sendegeneration. Som en varnande anmärkning har transplantation av BMSCs till skadade senor visat sig inducera ectopic osteogenic differentiering i en kanin modell, vilket tyder på att stamceller från en viss vävnad kan ha en tendens att skilja till oönskade celler av deras vävnad ursprung48. I tidigare forskning, lastning-berövad behandling till TDSCs kan resultera i osteogenesis samt21, vilket ledde till förslaget att den nuvarande metoden har potential att inducera tenogenesis av andra stamceller och undvika osteogenesis med särskilda lastning regim. Ytterligare forskning är nödvändig för att undersöka dessa särskilda lastningssystem för andra typer av stamceller. Om det här scenariot finns, mer cellkälla för att behandla tendinopati kommer att vara tillgänglig.

Det finns fortfarande vissa begränsningar som måste erkännas. För det första, även om ett icke-korrosivt och autoklaverbart material, rostfritt stål, användes för att bygga bioreaktorsystemet, korroderar odlingsförhållandena och odlingsmediet fortfarande kammaren inklusive skruven och kroken. Således är rutinmässig inspektion av kammaren och snabb rostborttagning nödvändig. För det andra, för att göra den nuvarande bioreaktorn ekonomisk och bärbar, finns det inte ett miljökontrollsystem och medelcirkulationssystem i den. Således måste operatören transportera bioreaktorn och öppna kammaren för medelstort utbyte var tredje dag, vilket ökar risken för kontaminering. Operatören måste alltid vara uppmärksam på att hålla TDSCs miljön steril .

För behandling av tendinopati är det viktigt att klargöra den patologiska processen ur ett icke-kirurgiskt perspektiv. När det gäller kirurgisk behandling är en effektiv metod att använda konstruerade autologa transplantat. Processen att stimulera TDSCs att efterlikna differentiering in vivo är till hjälp för undersökningen av patologiska processen för tendinopati. Den konstruerade byggnadsställning-fri sena vävnad har förmågan att främja sena läkning i en råtta patellar sena fönster skada modell. Dessutom visade tidigare arbete den mekaniska belastningen kan förbättra de mekaniska egenskaperna hos odlade sena. Således ger detta protokoll en reproducerbar metod för riktad differentiering av TDSCs i senliknande vävnad så att den kan användas enkelt och genomförbart för potentiella konstruerad sena kultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Forskningen genomfördes medan författaren var i mottagandet av "en University of Western Australia International Fee Scholarship och en University Postgraduate Award vid University of Western Australia". Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Medicin Utgåva 162 Mekanisk belastning senhärledd stamceller tendinopati bioreaktor differentiering sen stamceller
Tillämpa ett tredimensionellt enaxiskt enaxligt bioreaktorsystem för mekanisk stimulering för att inducera tenogen differentiering av sena stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,… More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter