Summary
Oikopleura dioica is een tunicate model organisme op verschillende gebieden van de biologie. We beschrijven bemonsteringsmethoden, soortenidentificatie, kweekopstelling en kweekprotocollen voor de dieren en algenvoer. We belichten belangrijke factoren die hebben bijgedragen aan de versterking van het cultuursysteem en het bespreken van de mogelijke problemen en oplossingen.
Abstract
Oikopleura dioica is een planktonische chordate met uitzonderlijke filter-voeding vermogen, snelle generatie tijd, bewaard vroege ontwikkeling, en een compact genoom. Om deze redenen wordt het beschouwd als een nuttig modelorganisme voor mariene ecologische studies, evolutionaire ontwikkelingsbiologie en genomica. Aangezien onderzoek vaak een gestage aanvoer van dierlijke hulpbronnen vereist, is het nuttig om een betrouwbaar, onderhoudsarm cultuursysteem op te zetten. Hier beschrijven we een stapsgewijze methode voor het opzetten van een O. dioica cultuur. We beschrijven hoe potentiële bemonsteringsplaatsen, verzamelmethoden, identificatie van dieren en de opzet van het kweeksysteem kunnen worden geselecteerd. We geven advies over het oplossen van problemen op basis van onze eigen ervaringen. We belichten ook kritische factoren die helpen om een robuust cultuursysteem in stand te houden. Hoewel het hier verstrekte cultuurprotocol is geoptimaliseerd voor O. dioica,hopen we dat onze samplingtechniek en cultuuropstelling nieuwe ideeën zullen inspireren voor het behoud van andere kwetsbare pelagische ongewervelde dieren.
Introduction
Modelorganismen hebben veel biologische vragen aangepakt, waaronder die met betrekking tot ontwikkeling, genetica en fysiologie. Bovendien vergemakkelijken aanvullende modelorganismen nieuwe ontdekkingen en zijn daarom van cruciaal belang om een beter begrip van de natuur te bereiken1,2. Marien zoöplankton zijn diverse groepen organismen die een belangrijke rol spelen in oceaanecosystemen3,4,5,6. Ondanks hun overvloed en ecologisch belang, gelatineachtige organismen zoals plankton manieten zijn vaak ondervertegenwoordigd in plankton biodiversiteit studies, omdat hun transparantie en kwetsbaarheid maken veld collectie en identificatie uitdagend7,8. Aangepaste bemonsteringstechnieken en laboratoriumculten maken een betere observatie van de dieren in vitro mogelijk, die de kennis in de biologie van planktonionische man enelegaten9,10,11,12heeft bevorderen .
Larvaceans (Appendicularians) zijn een klasse van vrij zwemmende mariene manudieren bestaande uit ongeveer 70 beschreven soorten wereldwijd8,13. Aangezien zij een van de meest voorkomende groepen binnen zoöplanktongemeenschappen14,15,16,17, larvaceans vormen een primaire voedselbron voor grotere planktonorganismen zoals vislarven18,19. In tegenstelling tot ascidians-de sessile manuici-larves behouden een kikkervis-achtige morfologie en blijven planktoniek gedurende hun hele leven20. Elk dier leeft in een zelfgebouwde, ingewikkelde filter-feeding structuur bekend als een huis. Ze accumuleren deeltjes in hun huizen door het creëren van waterstromen door de golvende beweging van hun staarten21. Verstopte huizen worden gedurende de dag weggegooid, waarvan sommige koolstofaggregaten vormen en uiteindelijk zinken naar de zeebodem22; larvaceans spelen dus een belangrijke rol in de wereldwijde koolstofflux23. De meeste soorten worden gemeld om in de pelagische streek binnen de hogere 100 m van de waterkolom13te leven; echter, de reus larvacean Bathochordaeus is bekend dat de diepten van 300 m24bewonen. Een studie over Bathochordaeus in Monterey Bay, Californië bleek dat de dieren ook dienen als een biologische vector van microplastics, wat wijst op een potentieel belang in het begrijpen van de rol van blinden in het verticale transport en de distributie van microplastics in de oceanen25.
Oikopleura dioica, een soort larvacïteïsche, heeft de afgelopen jaren de aandacht getrokken als modelorganisme vanwege een aantal opmerkelijke kenmerken. Het wordt vaak gemeld in de oceanen van de wereld. Het is vooral overvloedig in kustwateren26, waardoor gemakkelijk te proeven vanaf de kust. Langdurige, stabiele kweek is mogelijk met zowel natuurlijk als kunstmatig zeewater27,28,29. Temperatuur afhankelijke generatie tijden zijn zo kort als 4-9 dagen in laboratoriumomstandigheden. Het heeft een hoge haalbaarheid met elk vrouwtje in staat om te produceren >300 eieren het hele jaar door. Als een tunicate, het neemt een belangrijke fylogenetische positie voor het begrijpen van chordate evolutie30,31. Met 70 Mb heeft O. dioica het kleinste geïdentificeerde genoom onder alle chordates32. Onder larvaceans, O. dioica is de enige beschreven niet-hermafrodiet soorten tot nu toe33.
De eerste succesvolle O. dioica cultuur met laboratorium gekweekte microalgen werd gemeld door Paffenhöfer34. Het oorspronkelijke cultuurprotocol met synchrone motoren en peddels werd ontwikkeld door Fenaux en Gorsky35 en later overgenomen door meerdere laboratoria. Meer recent, Fujii et al.36 gemeld O. dioica culturing in kunstmatig zeewater, een robuuste cultuur systeem en veld collectie werden beschreven door Bouquet et al.27 en een geoptimaliseerd protocol voor een vereenvoudigd, betaalbaar systeem werd gemeld door Marti-Solans et al.29. Afgezien van de traditionele Oikopleura cultuur systeem, een nieuw gemeld ontwerp met een dubbele buis opfok tank heeft ook het potentieel om cultuur Oikopleura sp. 37.
We presenteren een gedetailleerd protocol voor het initiëren van een O. dioica monocultuur op basis van een combinatie van protocollen ontwikkeld door grote Oikopleura onderzoeksgroepen aan het Sars International Centre for Marine Molecular Biology27,de Universiteit van Barcelona29, Osaka University28, en onze eigen waarnemingen. In eerder gepubliceerde cultuurprotocollen werden gedetailleerde informatie over de samenstelling van algenmedia, kustbemonsteringstechnieken en Oikopleura-identificatie slechts ruwweg beschreven, waardoor er veel onduidelijkheid overblijft. Hier, met behulp van visuele informatie in het videoprotocol, hebben we alle kritieke informatie verzameld die nodig is om een O. dioica-cultuur van de grond af op een eenvoudige, stapsgewijze manier op te zetten. We beschrijven hoe je O. dioica onderscheidt van een andere vaak gerapporteerde soort, O. longicauda, wat een van de meest uitdagende stappen is. Hoewel de bestaande cultuursystemen wereldwijd van toepassing zijn op de teelt van O. dioica, benadrukken we het belang van protocolaanpassing op basis van lokale omgevingsomstandigheden. De gepresenteerde informatie combineert op grote schaal gepubliceerde gegevens en kennis opgedaan door ervaring. Het huidige protocol is bij uitstek geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het vestigen van een cultuur vanaf nul.
Protocol
1. O. dioicacultuurfaciliteit
- Waterfiltersysteem (figuur 1)
- Verzamel natuurlijk zeewater uit een haven op 2-3 m diepte. Geef het zeewater door een zandfilter (poriegrootte 1,4 mm) en transport naar een gedeelde reservoirtank in het laboratorium. Gebruik een busfilter om het water te laten circuleren om de waterkwaliteit in de gedeelde reservoirtank te behouden.
- In een kweekruimte, het opzetten van een multi-step filter systeem bestaande uit een 100 L reservoir tank met een magnetische drive pomp, 5 μm en 1 μm polypropyleen wondcartridge filters, en een UV-sterilisator (100 V) (Figuur 1).
- Breng het zeewater van de gedeelde reservoirtank over naar de reservoirtank cultuurruimte. Geef het zeewater door een filtereenheid van 25 μm(figuur 1A,B)voordat u de reservoirtank van de kweekkamer binnengaat. Circuleert het zeewater 's nachts door 5 en 1 μm filters om deeltjes die mogelijk de ontwikkeling van dieren kunnen belemmeren grondig te verwijderen.
OPMERKING: Een extra filter met een grotere maaswijdte (25-50 μm) is handig om te voorkomen dat grotere deeltjes de cartridgefilters verstoppen met kleinere maaswijdten. Het gefilterde zeewater (fSW) is de volgende ochtend klaar voor gebruik.
-
Oikopleura kweekeenheid (Figuur 2)
- Houd dieren in 5 of 10 L ronde, transparante plastic bekers.
- Plaats kweekbekers op een stabiele, twee-niveau roestvrijstalen rekken unit (L x W x H = 150 cm x 45 cm x 90 cm) met een 5 mm dikke, transparante acryl oppervlak boord.
- Plaats witte tl-lampen onder het acryloppervlak om de dieren vanaf de onderkant van de bekers te verlichten.
- Plaats een zwart plastic vel achter de bekers. Het zwarte blad creëert contrast en verbetert de visualisatie van de transparante dieren.
- Sluit synchrone elektromotoren aan op acrylpeddels (L x H = 8 cm x 27 cm) (Supplemental File 2). Hang de peddels in de cultuurbekers op van parallelle rails die langs de lengte van de rekken lopen(figuur 2A).
- Schakel de motoren in om een zachte cirkelvormige beweging in de bekers bij 15 RPM te genereren.
OPMERKING: Dieren in hun cellulosehuizen zijn neutraal drijfvermogen; echter, watercirculatie helpt om eieren, larven en algen voedsel te houden worden opgehangen en gelijkmatig verdeeld in de cultuur bekers.
- Automatische doseerpomp (optioneel)
LET OP: Een automatische voerunit vermindert de personeelsbehoefte, vooral in het weekend.- Kalibreer het volume van de doseervloeistof uit een automatische doseerpomp volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik 50 mL buizen als algenreservoirs.
- Boor twee 5 mm gaten op de doppen van 50 mL buizen om door de buizen van de luchtvaartmaatschappij te gaan. Sluit de ene buis aan op een standaard aquariumluchtpomp om luchtbellen te introduceren, en de andere buis op de inlaatpoort van de doseerpomp(figuur 2B).
OPMERKING: De invoering van een dunne stroom luchtbellen helpt om te voorkomen dat algen zich op de bodem van de buizen nestelen. - Programmeer de tijd en het volume van algenvoer dat op een bepaalde dag moet worden afgegeven.
- Het post van de algen
- Gebruik een rekken (L x W x H = 90 cm x 46 cm x 115 cm) om vier ronde bodemkolven van 1 L te plaatsen die algenwerkculturen bevatten (zie stap 2.1).
- Verlicht de werkculturen door fluorescerende lichten achter de kolven te plaatsen.
- Sluit kolven af met rubberstoppers met twee gaten.
- Passeer een wegwerppipet van 1 mL door de rubberen stop. Gebruik de slang van de luchtvaartmaatschappij om de pipet aan te sluiten op een aquariumluchtpomp. Introduceer een stroom luchtbellen in de kolf.
2. Microalgal voedsel
- Het initiëren van algenculturen
OPMERKING: Onderhoud drie sets van culturen (voorraad, sub-, en werkculturen) voor drie microalgen soorten, Chaetoceros calcitrans, Isochrysis sp., Rhinomonas reticulata, en een soort cyanobacteriën, Synechococcus sp.. Voorraad- en subculturen worden gebruikt als back-ups. De werkcultuur wordt gebruikt voor dagelijkse voeding.- Bereid reagentia voor die nodig zijn voor de teelt van microalgen en cyanobacteriën (tabel 1).
- Om de voorraadcultuur te initiëren, autoclave (121 °C, 25 min) 60 – 80 mL fSW in een 100 mL Erlenmeyer kolf. Aseptisch inenting gespecificeerde hoeveelheid gemodificeerd Conway medium27 en microalgen (Tabel 2). Bijvoorbeeld om een voorraadcultuur van C. calcitrans te inenten, 60 mL zeewater te inenten, aseptisch 30 μL elk van de vitamine en oplossing A, 15 μL natriumsilicaat, 60 μL streptomycine en 30 μL C. calcitran uit de vorige voorraadcultuur.
OPMERKING: R. reticulata verandert van roodroze naar orang-bruin wanneer ze worden blootgesteld aan te veel licht. Verplaats ze uit de buurt van het licht zodra ze zijn begonnen te draaien van helder naar lichtroze. - Houd de voorraadcultuur in een couveuse op 17 °C met continue verlichting. Na ongeveer 10 dagen verandert de cultuur van kleur om algengroei aan te geven(figuur 3). Zodra de kleuren verschijnen, verplaats ze naar 4 °C voor langdurige opslag voor maximaal 1 maand.
- Op een schone bank, aseptisch inenten een subcultuur uit de voorraad cultuur (Tabel 2). Incubeer bij 17 °C met continue verlichting. Nadat algenkleuren zijn weergegeven, blijven ze tot 2 weken in de couveuse opslaan.
- Inenting werkcultuur uit subcultuur (Tabel 2). Sluit de kolf af met een rubberen dop en steek 1 mL wegwerppipet in. Verplaats de kolf naar het algenstation en houd op kamertemperatuur met een fotoperiode van 8 uur. Levering met constante beschatting. Vernieuw de werkcultuur elke 4 dagen.
- Roer bouillon en subculturen twee keer per dag door te wervelen.
OPMERKING: Langdurige opslag van algencultuur op solide media en cryopreservatie is mogelijk tot 3 maanden en 1 jaar, respectievelijk29.
- Algengroeicurven maken (optioneel)
OPMERKING: Nauwkeurige beoordeling van de hoeveelheid voeding is belangrijk om een stabiele cultuur van O. dioicate behouden. We creëerden groeicurven voor twee primaire algenvoedselsoorten, Chaetoceros calcitrans en Isochrysis sp.- Bereid C. calcitrans en Isochrysis sp. werkculturen voor (Tabel 2).
- Voor elke soort werkcultuur u drie afzonderlijke keren proeven en absorpties meten op 660 nm met behulp van een spectrofotometer. Neem de gemiddelde metingen van de drievouden van elke werkcultuur.
- Volgens de instructies van de fabrikant voor een geautomatiseerde celteller, bereid algenmonsters voor op het tellen. Tel elk monster drie keer. Neem het gemiddelde van drie tellingen om het totale aantal cellen in elk monster te bepalen.
- Blijf dagelijks tellen tot ongeveer 50 gemiddelde metingen worden geregistreerd.
- Maak groeicurven voor beide algensoorten(figuur 4).
3. Veld collectie van wilde Oikopleura spp.
- Gemodificeerd planktonnet (figuur 5)
OPMERKING: De sleutel tot een succesvolle bemonstering van Oikopleura spp. is het langzaam slepen van een planktonnet met een gewogen, niet-filterende kabeljauw-end. Figuur 5 toont een schematisch diagram van een gemodificeerd planktonnet.- Vervang de kabeljauwkant van een handplanktonnet door een aangepaste 500 mL schroeftopwasfles.
- Boor een gat met een diameter van 3 cm in de schroeftop met een diameter van 4 cm van de wasfles om water en dieren in het kabeljauweinde te laten komen.
- Plaats de dop aan het einde van planktonnet. Wikkel het stevig met elektrische tape. Zet de dop verder vast met een roestvrijstalen slangklem.
- Bevestig een gewicht van 70 g aan de buitenkant van de gewijzigde kabeljauwzijde met ritsbanden.
- Bevestig de veiligheidsriem om de kabeljauwbest verder te bevestigen.
- Verzamelsites selecteren (figuur 6)
OPMERKING: Alle monsterverzamelingen zijn goedgekeurd door het OIST Fieldwork Safety Committee. Afhankelijk van de locatie(figuur 6)kan er seizoensgebonden variatie zijn in de aanwezigheid van Oikopleura spp. Vermijd bemonstering onmiddellijk na extreme weersomstandigheden, zoals ernstige regenbuien.- Gebruik de satellietweergave op een kaartwebsite om mogelijke bemonsteringssites te identificeren. We richtten ons op havens en vissteigers die gemakkelijk bereikbaar zijn met de auto en gelegen zijn in baaien of in de buurt van oceaandrop-offs waar plankton zich meestal ophoopt: De haven van Ishikawa in Kin Bay, Okinawa, Japan (GPS: 26°25'39.3"N 127°49'56.6"E).
- Bezoek potentiële bemonsteringslocaties om de toegankelijkheid en veiligheid van elke locatie te beoordelen. Indien nodig een inzamelvergunning aanvragen bij de lokale autoriteiten.
- Bemonsteringsprocedure
- Giet het planktonnet in de zee en laat de kabeljauw-end 1-2 m onder het wateroppervlak zinken.
- Sleep het net horizontaal met de hand op 50-100 cm s-1. Blijf slepen door 2-5 minuten heen en weer te lopen. Pas de trektijd aan op basis van de overvloed aan fytoplankton in de haven, met kortere sleeptouw wanneer er meer fytoplankton is.
OPMERKING: Larvaceans zijn kwetsbare dieren. Snelle slepen of herhaalde afgietsing van het net kan schade toebrengen aan dieren die gevangen zitten in de kabeljauwkant. - Til voorzichtig het net op. Breng de inhoud van de kabeljauw-end langzaam over in een ronde glazen fles van 500 mL. Vul de monsterfles volledig met zeewater om luchtbellen te voorkomen.
OPMERKING: De aanwezigheid van Oikopleura spp. kan worden bevestigd door monsterflessen te bekijken tegen een zwarte achtergrond. De meeste dieren verlaten hun huizen terwijl ze worden verzameld. Daarom is microscopisch observation nodig voor identificatie op soortenniveau. - Herhaal de bemonstering tot drie flessen van 500 mL worden verzameld.
- Meet het zoutgehalte, de temperatuur en chlorofyl a met behulp van een CTD-profiler om het bereik van fysieke parameters vast te leggen waar dieren van nature bestaan.
- Verzamel 10-15 L oppervlaktezeewater in een emmer om dieren te acclimatiseren in de laboratoriumomgeving.
4. Isolatie en identificatie van dieren (figuur 7, figuur 8)
-
Oikopleura spp. identificatie
OPMERKING: Andere planktonorganismen die op Oikopleura spp. op het eerste gezicht kunnen lijken, zijn chaetognaten, Fritillaria spp., nematoden, vislarven met dooierzakjes en Ciona spp. larven.- Om dieren te acclimatiseren aan laboratoriumomstandigheden, breng dan elk monster van 500 mL over naar een bekerglas van 10 L met een verhouding van 1:1 oppervlaktezeewater vanaf de bemonsteringslocatie en gefilterd zeewater (fSW) dat in het lab wordt onderhouden(figuur 7A,B). Pas het volume van het bekerglas aan op 5-10 L, afhankelijk van de concentratie planktonmonster.
OPMERKING: Als het planktonmonster ongewenst vuil bevat, moet u door een grof filter (maaswijdte ~ 600 μm) lopen voordat het naar een bekerglas van 10 L gaat. - Gebruik een peddel bevestigd aan een synchrone elektromotor (15 RPM) en houd het plankton 's nachts in vering (stap 1.2.5).
- Identificeer Oikopleura spp. door te zoeken naar 1-2 mm lange, kikkervisvormige dieren die hun staarten golven in een bolvormig, doorschijnend huis. Sommige dieren kunnen tijdelijk vrij zwemmen zonder de huizen. Breng ~5 dieren voorzichtig over op een lege petrischaal met behulp van een stompe pipet.
- Voor geslacht identificatie, uitzetting dieren uit hun huizen door zachtjes porren het huis met een transfer pipet.
- Observeer huisloze dieren onder een 20-40x donkere veldmicroscoop en bevestig Oikopleura spp(figuur 8).
- Om dieren te acclimatiseren aan laboratoriumomstandigheden, breng dan elk monster van 500 mL over naar een bekerglas van 10 L met een verhouding van 1:1 oppervlaktezeewater vanaf de bemonsteringslocatie en gefilterd zeewater (fSW) dat in het lab wordt onderhouden(figuur 7A,B). Pas het volume van het bekerglas aan op 5-10 L, afhankelijk van de concentratie planktonmonster.
-
O. dioica-identificatie
OPMERKING: O. dioica kan visueel worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van volledig volwassen mannetjes en vrouwtjes of twee grote subchorale cellen op de distale helft van hunstaarten . De afstand tussen twee subchordalcellen kan per individu verschillen.- Controleer vervolgens of er een volledig gerijpte Oikopleura is met een gonad gevuld met eieren(figuur 8A)of sperma(figuur 8B). Als het dier alleen eieren of sperma bezit, ga dan over naar stap 4.2.3 want het is O. dioica, de enige beschreven niet-hermafrodietische soort.
- Als het dier onvolwassen is (figuur 8C), zoek dan naar twee subchordalcellen aan het einde van zijn staart(figuur 8D).
- Zodra de soort is bevestigd, breng het naar een nieuwe petrischaal. Herhaal stappen 4.1.3-4.2.2 tot 10-20 individuen worden bevestigd op soortenniveau.
OPMERKING: Verdoven dieren in een petrischaaltje met 0,015% tricaine methanesulfonaat (MS222) in fSW. - Als er geen O. dioica worden gevonden, houd de bekers geschorst voor een extra dag of twee. Er kan onrijpe O. dioica die zal blijven groeien en gemakkelijker te detecteren. Als er na een week geen wordt weergegeven, verwijdert u het monster en probeert u opnieuw monsters te nemen.
5. Teeltprotocol voor O. dioica
- Het initiëren van een O. dioica monocultuur uit een door het veld verzamelde monster (figuur 7)
OPMERKING: Algenvoedsel wordt dagelijks bereid uit werkculturen en elk monocultuurbekerglas wordt drie keer per dag gevoed om respectievelijk 9 uur' s avonds, 12 uur en 17.00 uur (zie stap 5.2). De dieren worden gehandhaafd bij 23 °C. Onder deze omstandigheden is de Okinawa O. dioica levenscyclus 4 dagen (figuur 7C).- Om een monocultuur van O. dioicate initiëren, isoleer 120 dieren en breng je over op een nieuw bekerglas met 5 L verse fSW (figuur 7B,C).
- De volgende ochtend, kijk voor volledig volwassen mannetjes met gele geslachtsgenoten en vrouwtjes met eieren die verschijnen als gouden bollen (Figuur 8A,B).
- Maak een paaibeker door voorzichtig 15 mannetjes en 30 vrouwtjes over te brengen naar een nieuw bekerglas met 2,5 L verse fSW met een 5 mL stompe pipet.
OPMERKING: Als er niet genoeg mannetjes en vrouwtjes zijn, breng dan zoveel mogelijk volwassenen over naar een beker met 1 L fSW en laat ze op natuurlijke wijze paaien. Om fysieke stress voor dieren tijdens handmatige overdracht te minimaliseren, moeten ze langzaam worden overgeheveld en onder het wateroppervlak worden vrijgegeven. - Laat de dieren op natuurlijke wijze paaien om de volgende generatie te initiëren. Staartlarven moeten ongeveer 3 uur na de bevruchting verschijnen.
OPMERKING: Paaien wordt uitgevoerd door volledig gerijpte dieren verlaten hun huizen, zwemmen naar het oppervlaktewater, en het vrijgeven van hun gameten. Succesvolle bevruchting kan worden bevestigd door het extraheren van 5-10 mL zeewater uit de bodem van het paaibeker en het identificeren van eieren met decolletés onder een microscoop. - Op de eerste ochtend na het paaien (dag 1) moet een nieuwe generatie dieren met opgeblazen stallen in het bekerglas verschijnen. Gebruik een handbeker van 500 mL om de inhoud van de paaibeker voorzichtig over te zetten in een nieuw bekerglas met 7,5 L verse fSW (in totaal 10 L). Giet onder een hoek om een spetterende beweging te voorkomen.
- Breng op de tweede ochtend (dag 2) handmatig 150 dieren over naar een nieuw bekerglas met 5 L verse fSW.
- Breng op de derde ochtend (dag 3) handmatig 120 dieren over naar een nieuw bekerglas met 5 L verse fSW.
OPMERKING: Om de ontwikkeling van dieren te synchroniseren, is het belangrijk om personen met vergelijkbare grootte te selecteren tijdens de handmatige overdracht op dag 2 en 3. Maximaal 10 dieren kunnen in één overdracht worden overgeheveld. - Op de vierde ochtend (dag 4) moeten volledig gerijpte dieren verschijnen. Herhaal stap 5.1.3 om de levenscyclus te sluiten.
OPMERKING: Een geautomatiseerde voerpomp kan worden ingesteld om de dieren te voeden om 5 uur in het weekend zonder de aanwezigheid van culturing personeel.
- Dagelijkse bereiding van algenvoedsel uit de werkcultuur
- Meet de absorptie van de werkcultuur op 660 nm.
- Op basis van de Daily Feeding Chart, ontdek hoeveel algencellen moeten worden gevoed voor de dieren van specifieke grootte(tabel 3).
- Met behulp van de algengroeicurven (figuur 4) los de onderstaande vergelijkingen op om het volume van algenvoedsel (mL) te berekenen dat op een bepaalde dag vereist is.
- Gebruik de volgende vergelijking om het volume van een bepaalde algen te berekenen die nodig zijn voor een specifieke dag en voedertijd:
Waar YA is de algenconcentratie op een bepaalde dag en A is het volume van algen die nodig zijn per voeding. Bovendien wordt de lineaire relatie tussen YA tot x, de waarden voor onderschepping (c) en helling(m) weergegeven in figuur 4. Raadpleeg tabel 3 voor K-waarden. - Om bijvoorbeeld het volume isochryse sp. te berekenen dat nodig is bij een 9 UUR voederen van dag 3 dieren die in een 5 L-cultuur worden gehouden en met de algenabsorbering van 0,234 (gemeten op 660 nm), werd het volgende berekend:
OPMERKING: Bewaar deze vergelijkingen in een spreadsheet, zodat de dagelijkse voerhoeveelheid automatisch wordt berekend op basis van absorptiemetingen, de grootte van de dieren en het volume van het kweekzeewater (Supplemental File 1).
- Gebruik de volgende vergelijking om het volume van een bepaalde algen te berekenen die nodig zijn voor een specifieke dag en voedertijd:
- Breng het berekende volume algen over op buizen van 50 mL, centrifuge bij 5000 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C.
- Verwijder de supernatant. Vul de buizen terug naar het oorspronkelijke volume met verse fSW, ter vervanging van oude algenmedia.
- Bewaar bereid voedsel in de koelkast tot klaar om te worden gebruikt voor de volgende feed. Gooi het oude algenvoedsel weg nadat er de volgende ochtend nieuw voedsel is bereid.
- Actieve kool (optioneel)
LET OP: Aan elke cultuurbeker wordt 10 g actieve kool toegevoegd om de waterkwaliteit te behouden. De houtskool kan tot vier keer worden hergebruikt. Open de houtskoolzak langzaam om te voorkomen dat houtskoolstof de cultuurbekers binnendringt.- Breng ~700 g actieve kool in een container. Weken in zoet water (FW) voor 48 uur en laat ze zich vestigen op de bodem.
- Spoel af met FW om resthout te verwijderen.
- Kook houtskool in FW voor 15-20 min. Haal van het vuur en laat afkoelen.
- Spoel tot de meeste houtskool stof is verwijderd, en het water wordt duidelijk.
- Bewaar schone houtskool in 2 L beker met fSW. Bedek het bekerglas om te voorkomen dat er stof binnenkomt.
- Voeg houtskool toe aan elke nieuwe beker voordat u de dieren overzet.
Representative Results
Oikopleura kan worden opgehaald van een boot of uit een haven door langzaam, zacht slepen van een 100 μm mesh plankton net met een niet-filtering kabeljauw-end (Figuur 5). Vanwege het fragiele karakter van de dieren is het belangrijk om elke beweging te vermijden die fysieke stress kan veroorzaken, zoals ruwe behandeling van het net of spatten als gevolg van een gevangen luchtzak in de monsterpot.
Het is belangrijk om het seizoensgebonden patroon van lokale Oikopleura-populaties te begrijpen, evenals de bijbehorende schommelingen in de fysieke kenmerken van het water op een bemonsteringsplaats. De bemonstering tussen 2015 en 2019 bracht consistente seizoensvariatie aan het licht in de aanwezigheid van O. dioica in Ishikawa en Kin-havens in Okinawa (figuur 6). Oppervlakte zeewater temperatuur lijkt een belangrijke factor. O. dioica was de dominante soort toen het oppervlaktezeewater ≥28 °C bereikte, en O. longicauda naast elkaar bestond met O. dioica bij temperaturen tussen 24 °C en 27 °C; O. longicauda domineerde echter onder de 23 °C (figuur 6A). Geleidelijke verandering in het zoutgehalte na enkele opeenvolgende dagen van zware regen niet correleren met de overvloed van O. dioica (Figuur 6B).
Met behulp van de hierboven beschreven bemonsteringsprocedures waren de meeste O. dioica die we hebben hersteld tussen dag 2 en 3 van hun 4-daagse levenscyclus(figuur 7C). Volwassen mannetjes werden herkend door de gele kleur van geslachtshoofden terwijl vrouwelijke geslachtshoofden goud glinsterden van eieren met een diameter van 70-80 μm (figuur 8A,B). Onrijpe O. dioica werden bevestigd door twee subchordalcellen op hun staarten (figuur 8D). Een andere dominante soort in de lokale wateren, O. longicauda, waren vergelijkbaar in grootte en morfologie. We gebruikten de volgende criteria om O. longicauda te onderscheiden van O. dioica38,39,40: een gebrek aan subchordalcellen in de staart, de aanwezigheid van velum in de stam en de aanwezigheid van een hermafrodiete gonad ( figuur8E,F). De verschillende staartmorfologieën zijn ook nuttig voor het onderscheiden van O. longicauda van O. dioica. Wanneer een intact naakt dier zonder het huis zijdelings werd georiënteerd, was de staart van O. longicauda meer recht met minder kromming, waardoor het een "stijver" uiterlijk in vergelijking met die van O. dioica.
De drie belangrijkste factoren voor het opzetten van een stabiel Oikopleura cultuursysteem zijn (i) het handhaven van een hoge waterkwaliteit, (ii) het identificeren van het optimale voerregime en (iii) het opzetten van een paaibeker met voldoende aantallen mannetjes en vrouwtjes. De invoering van een multi-step filtersysteem (figuur 1) verbeterde de waterkwaliteit en stabiliteit van de cultuur. Een filtratiesysteem is niet nodig voor kunstmatig zeewater; echter, de kosten, beschikbaarheid en het gemak van natuurlijk zeewater maakt het een betere optie voor laboratoria gelegen in de buurt van de kust. Om het voerregime vast te stellen, raden we aan om algengroeicurven te meten die van toepassing zijn op individuele laboratoriumomgevingen, omdat de temperatuur en lichtomstandigheden sterk variëren. We combineerden de groeicurven met eerder gepubliceerde voerschema's om algenvoerconcentraties en composities27 (figuur 4) te optimaliseren. We volgen ook een strikt algeninentingsschema om een verse aanvoer van algenvoedsel te behouden(tabel 2). Het geautomatiseerde voersysteem stelt ons in staat om een consistent dagelijks voedingsschema te handhaven zonder de aanwezigheid van kweekpersoneel(figuur 2B).
Zodra optimale zeewater- en voederomstandigheden zijn bereikt, is het belangrijk om nieuwe generaties te initiëren door een paaibeker te maken met 15 mannetjes en 30 vrouwtjes in 2,5 L fSW. Dit zorgt voor een goede concentratie van dag 1 dieren de volgende ochtend, wat voldoende is om 150 dieren te isoleren op dag 2, 120 op dag 3 en 45 volwassen volwassenen op dag 4 om te paaien. Als er niet genoeg mannetjes en vrouwtjes op dag 4 zijn, verzamel en breng zoveel mogelijk volwassen individuen over naar 1 L van fSW en laat ze natuurlijk paaien in de hoop dat er genoeg larven zullen zijn om de volgende generatie door te geven. Volgens het verstrekte protocol bedraagt de levenscyclus van O. dioica 4 dagen bij 23 °C (figuur 7C). We hebben op betrouwbare wijze zes onafhankelijke wilde populaties van O. dioica,die allemaal meer dan 20 generaties duurden, op betrouwbare wijze opgericht.
Figuur 1: Schematisch zeewaterfiltersysteem.
(A en B) Zeewater wordt in eerste instantie gefilterd door een filtereenheid van 25 μm voordat het reservoirtank binnenkomt(C)Een magnetische aandrijving wordt gebruikt om zeewater uit de reservoirtank te halen. Het zeewater wordt vervolgens door twee polypropyleenfilters en een UV-sterilisator geduwd voordat het terugkeert naar de reservoirtank. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Cultuursysteem voor O. dioica.
(A) Overzicht van het kweeksysteem (B) Close-up weergave van synchrone motor- en algenreservoir voor de geautomatiseerde doseerpomp. Binnendiameters van siliciumbuis A en B zijn respectievelijk 2 mm en 4 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Voorraadculturen voor O. dioica.
Van links- C. calcitrans, Isochrysis sp., Synechococcus sp., en R. reticulata na te zijn geteeld bij 17 °C onder continu licht gedurende ~ 10 dagen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Algengroeicurve voor twee van de belangrijkste voedselsoorten, C. calcitrans en Isochrysis sp..
Strooipercelen van optische dichtheid (OD) bij 660 nm en totale celconcentraties voor (A) C. calcitrans en (B) Isochrysis sp.. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde van drie metingen. Een celteller werd gebruikt om het percentage levensvatbare cellen en de totale celconcentraties (cellen/mL) te bepalen. Metingen werden gedurende 20 dagen geregistreerd (n = 47). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Gemodificeerd planktonnet voor Oikopleura-bemonstering.
De kabeljauwkant van een handplanktonnet (100 μm mesh) wordt vervangen door een wasfles van 500 mL. Aan de kabeljauwkant is een gewicht van 70 g bevestigd. Aan de sleutelhanger is ongeveer 5 m touw bevestigd. Een veiligheidsriem is bevestigd om de kabeljauw-end verder te beveiligen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Seizoensgebondenheid van O. dioica in Okinawa.
Aanwezigheid en afwezigheid van O. dioica en O. longicauda in relatie tot seizoensveranderingen in (A) temperatuur en (B) zoutgehalte in havens in Ishikawa (26°25'39.3"N 127°49'56.) 6"E) en Kin (26°26'40.2"N 127°55'00.3"E) tussen 2015-2019. Elke soort werd geregistreerd als aanwezig als meer dan 50 dieren handmatig werden geteld. Temperatuur- en zoutgehaltemetingen van oppervlaktewater werden geregistreerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Stroomschema voor het initiëren van O. dioica monocultuur.
(A) Drie planktonmonsters van 500 mL worden verzameld op een bemonsteringsplaats (B) Elke monsterpot wordt verdund en O. dioica wordt geïsoleerd van de rest van plankton (C) Een monocultuur van O. dioica wordt geïnitieerd door 120 Dag 3 dieren handmatig over te brengen naar een nieuw bekerglas met 5 L vers gefilterd zeewater (fSW). Zet een paaibeker op met 30 vrouwtjes, 15 mannetjes en 2,5 L verse fSW. De eerste ochtend na het paaien (Day1), maak het paaibeker met de nieuwe generatie dieren voorzichtig leeg in een beker met 7,5 L verse fSW. Op de tweede dag na het paaien (dag 2) breng je 150 dieren over in een beker met 5 L verse fSW. Breng op de derde dag na het paaien (dag 3) 120 dieren over in een beker met 5 L verse fSW. Op de laatste dag (dag 4) een nieuw paaibeker met 30 vrouwtjes, 15 mannetjes en 2,5 L verse fSW ter voorbereiding van de volgende generatie. De dieren hebben een levenscyclus van 4 dagen bij 23 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Identificatie van Oikopleura spp. (A-D: O. dioica, E en F: O. longicauda).
aA) Vrouwelijke O. dioica met eieren (B) Mannelijke O. dioica met sperma (C) Laterale weergave van onrijpe O. dioica (D) Ventrale weergave van onrijpe O. dioica met twee subchorale cellen aangegeven met witte pijlen (E) Ventrale weergave van volwassen O. longicauda die eieren (pijl 1) en sperma (pijl 1) en sperma (pijl 2) (F) Laterale weergave van O. longicauda met velum (pijl 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Reagentia | Chemische producten | Bedrag | Final vol. (mL) | Sterilisatie | Voorraad / Geopend |
| Oplossing A | Na2EDTA | 45 g | 1000 | Autoclaaf | -20 °C / 4 °C |
| NaNO3 | 100 g | ||||
| H3BO3 | 33,6 g | ||||
| NaH2PO4 | 20 g | ||||
| MnCl2·4H2O | 0,36 g | ||||
| FeCl3·6H2O | 1,3 g | ||||
| Oplossing B | 1,0 mL | ||||
| Oplossing B | ZnCl2 | 2,1 g | 1000 | Autoclaaf | 4 °C / 4 °C |
| CoCl2·6H2O | 2,0 g | ||||
| (NH4)6Mo7O24·4H2O | 0,9 g | ||||
| CuSO4·5H2O | 2,0 g | ||||
| *HCl | -- mL | ||||
| Vitamine | Thiamine (B1) · Hcl | 200 mg | 1000 | Autoclaaf | -20 °C / 4 °C |
| Biotine | 1 mg | ||||
| Kobalamine (B12) | 1 mg | ||||
| Natriumsilicaat | Na2SiO3 | 5% | 1000 | 0,22 μm filter | 4 °C / 4 °C |
| Streptomycine | C21H39N7O12 | 25 mg/mL | 50 | 0,22 μm filter | -20 °C / -20 °C |
Tabel 1: Recept van reagentia die nodig zijn voor het onderhoud van algenvoedsel. Na het oplossen van alle chemische stoffen die voor oplossing B zijn vermeld, wordt HCl toegevoegd totdat de oplossing duidelijk wordt zonder troebelheid. Alle reagentia worden gesteriliseerd door autoclaving (120 °C, 25 min) of door gebruik te maken van een filter van 0,22 m. Alle reagentia behalve de vitaminevoorraden worden gesteriliseerd na toevoeging van gespecificeerde chemische stof. Voor de vitamine voorraden, autoclave het water eerst, en vervolgens oplossen van de beursgenoteerde chemische stof. Opslagtemperaturen voor voorraad en geopende reagentia worden vermeld.
| Cultuurtype | Algen spp. | ASW (mL) | Vitamine | Oplossing A | Natriumsilicaat | Streptomycine | Algen (mL) / Cultuurtype | Incubate / Winkel | Frequentie |
| Voorraadcultuur | Chaeto Chaeto | 60 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Alleen Chaeto) |
1/1000 (Alles behalve Syn) |
0,03 / voorraad | 17°C / 4°C | Tweewekelijkse |
| Iso | 60 | 0,03 / voorraad | |||||||
| Rhino | 80 | 0,06 / voorraad | |||||||
| Syn | 60 | 0,03 / voorraad | |||||||
| Subcultuur | Chaeto Chaeto | 500 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Alleen Chaeto) |
1/1000 (Alles behalve Syn) |
10 / voorraad | 17°C / 17°C | Wekelijkse |
| Iso | 500 | 10 / voorraad | |||||||
| Rhino | 500 | 20 / voorraad | |||||||
| Syn | 500 | 10 / voorraad | |||||||
| Werkcultuur | Chaeto Chaeto | 400 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Alleen Chaeto) |
1/1000 (Alles behalve Syn) |
100 / sub | RM / RM | Elke 4 dagen |
| Iso | 400 | 100 / sub | |||||||
| Rhino | 400 | 150 / sub | |||||||
| Syn | 400 | 100 / sub |
Tabel 2: Instructie voor het onderhoud van drie algencultuurtypes. Voeg de opgegeven hoeveelheid supplementen toe aan kolven die autoclaved zeewater bevatten. Inenting elke fles met bepaalde hoeveelheid algencultuur. Uitbroeden en opslaan van algen culturen bij bepaalde temperaturen. Inenting nieuwe voorraadcultuur en subcultuur uit de vorige voorraadcultuur, en nieuwe werkcultuur uit de vorige subcultuur. Inenting nieuwe voorraad cultuur, sub-cultuur, en werkcultuur om de twee weken, een week, en vier dagen, respectievelijk. Dit schema biedt genoeg voedsel voor ongeveer 10 bekers van O. dioica cultuur. Onderhoud 2 – 3 sets van elk algencultuurtype als back-ups. RM – kamertemperatuur.
| Dag | Algen spp. | 9.00 en 17.00 uur | 12:00 UUR |
| 1 | Chaeto Chaeto | — | — |
| Iso | 1000 | 2000 | |
| Syn | 20,000 | 40,000 | |
| 2 | Chaeto Chaeto | 1000 | 2000 |
| Iso | 2000 | 2000 | |
| Rhino | 1000 | 1000 | |
| 3 | Chaeto Chaeto | 3000 | 4000 |
| Iso | 3000 | 4000 | |
| Rhino | 1500 | 1500 | |
| 4 | Chaeto Chaeto | 1000 | 2000 |
| Iso | 1000 | 2000 | |
| Rhino | 1000 | 1000 |
Tabel 3: Algenconcentratie per voeding, gewijzigd ten opzichte van Bouquet et al.27. Algenconcentraties (cellen mL-1)en algensoorten die worden gebruikt voor dagelijkse voeding tijdens de 4-daagse levenscyclus van Okinawa O. dioica.
Supplementisch bestand 1: Dagelijkse voedingsgrafiek. Dagelijkse voederhoeveel voor elk kweekbeker wordt automatisch berekend na het invoeren van dagelijkse algenabsorberendheidsmetingen (OD), de grootte van de dieren (Dag) en het volume van zeewater (SW vol.) in elke kweekbeker. Groeicurven van R. reticulata en Synechococcus sp. werden aangepast van Bouquet et al.27. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Supplemental File 2: Hoe synchrone motor aan te sluiten op acryl peddel. Stevig schroef op de peddel aan de motor met behulp van een zeshoek moersleutel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Om de flexibiliteit bij de vestiging van de O. dioicacultuur te vergemakkelijken, is het belangrijk om de natuurlijke habitat van de dieren te begrijpen. Seizoensgegevens geven informatie over het bereik van fysieke parameters, die kunnen worden gebruikt om laboratoriumcultusomstandigheden te begeleiden. Het helpt ook bij het begrijpen van seizoensgebonden schommelingen in de overvloed aan dieren. In Okinawa, O. dioica is het meest betrouwbaar gevonden van juni tot oktober. Echter, in De baai van Tokio, bevolking piek in februari en41oktober . Hoewel het kweken van O. dioica vaak wordt gemeld bij 20 °C of lager27,28,29, toont Okinawan O. dioica een betere overleving bij temperaturen boven de 20 °C; dit kan worden verklaard door het feit dat de minimumtemperatuur aan zeewater in Okinawa ~20 °C is (figuur 6). De overvloed aan O. dioica kan ook worden beïnvloed door fytoplanktonbloei42 en roofdierovervloed43,44. Ongeacht waar O. dioica worden verzameld, het begrijpen van de seizoensgebondenheid van de lokale bevolking maximaliseert de kans op bemonstering en het kweken van succes.
Gezien het juiste seizoen en de juiste locatie, netto bemonstering is een effectieve manier om grote aantallen Oikopleura te verzamelen met minimale inspanning. Planktonnetten met een kleinere maaswijdte (60-70 μm) kunnen ook worden gebruikt om alle stadia van de dieren te verzamelen. Volledig volwassen dieren worden zelden in het net aangetroffen, misschien vanwege hun kwetsbaarheid aan het einde van de levenscyclus. Daarom wordt de identificatie van soorten gevolgd door bemonstering bereikt door microscopische observatie van subchordalcellen. Volwassen individuen verschijnen meestal een of twee dagen na de bemonstering als dieren blijven groeien in het laboratorium. Hoewel de nettobemonstering efficiënt is, kunnen in verschillende omstandigheden alternatieve bemonsteringsmethoden nodig zijn. Bijvoorbeeld, netto bemonstering in de buurt van stedelijke gebieden kan verzamelen grote aantallen fytoplankton, waardoor het moeilijk is om Oikopleurate isoleren . In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om eenvoudige emmerbemonstering te verzamelen om oppervlaktezeewater of bootbemonstering te verzamelen uit gebieden buiten de haven. De resultaten toonden aan dat de geleidelijke verandering in het zoutgehalte als gevolg van opeenvolgende regendagen geen invloed had op de overvloed aan O. dioica; echter, kust bemonstering onmiddellijk na extreme weersomstandigheden zoals tropische cyclonen moeten worden vermeden. Deze gebeurtenissen veroorzaken plotselinge en drastische biogeochemische veranderingen in een beschut waterlichaam45,46. De afvoer van hemelwater kan verontreinigende stoffen, sedimenten en overtollige voedingsstoffen vervoeren, die troebelheid en lagere waterkwaliteit verhogen47. Filtervoedend plankton, zoals Oikopleura,kan bijzonder gevoelig zijn voor deze veranderingen als gevolg van hun wijze van voeding en beperkte mobiliteit. In een dergelijke omstandigheid raden we aan de bemonstering een paar dagen uit te stellen totdat de lokale omstandigheden weer normaal zijn.
De invoering van een multi-step filtersysteem is essentieel voor het behoud van kleine, filter-voedende organismen zoals O. dioica. Met behulp van slecht gefilterd zeewater (bijvoorbeeld een 25 μm mesh in het vorige cultuursysteem) was de cultuur vaak instabiel, vooral in de zomer, mogelijk door de hogere overvloed aan fytoplankton. Hoewel sommige fytoplankton gunstig zijn voor o. dioica groei, produceren anderen biotoxines die abnormale ontwikkeling van O. dioica embryo's kunnen veroorzaken48. Bovendien is een hoge concentratie diatomeeën zoals Chaetoceros spp. potentieel schadelijk voor o. dioica groei als ze kunnen beschikken over lange setae die het huis kan verstoppen en te voorkomen dat efficiënte voeding49. We zagen vaak huizen van kleine dieren verstopt door C. calcitrans setae; daarom voeren we C. calcitrans nu alleen aan dieren op dag 2 en ouder(tabel 3).
Hoewel het hier geen probleem was, kan kleinschalige langdurige culturing van O. dioica plotselinge dalingen in bevolkingsomvang ervaren als gevolg van een genetisch knelpunt; in dergelijke gevallen, Martí-Solans et al.29 raden het toevoegen van nieuwe wilde individuen aan de cultuur om de 20 generaties.
Het Oikopleura cultuursysteem is flexibel. Binnen een week kan een stabiele cultuur tot stand komen. Lange termijn culturing van O. dioica is mogelijk op een bescheiden budget met niet-gespecialiseerde apparatuur. De dagelijkse inspanning die nodig is voor het onderhoud van 5-10 bekers van Oikopleura is over het algemeen minder dan 2 uur met 2 personen. O. dioica kan ook worden gehandhaafd in kunstmatig zeewater, wat gunstig is voor mensen zonder toegang tot natuurlijk zeewater28. Langdurige opslag van algenvoedsel is mogelijk met behulp van vaste cultuur en cryopreservatie29. Bovendien kan O. dioica sperma worden cryopreserved, en levensvatbaar blijven voor meer dan een jaar50. Al deze factoren betekenen dat culturen gemakkelijk kunnen worden hersteld. Tot slot, verleden ervaring met toevallige culturing van Pleurobrachia sp. kan suggereren dat het voor Oikopleura ontwikkelde kweeksysteem mogelijk kan worden uitgebreid tot een bredere gemeenschap van kwetsbare pelagische organismen.
O. dioica blijft krachtige inzichten bieden in verschillende biologische gebieden. Een goed begrip van lokale seizoensgebondenheid, een nauwgezet cultuursysteem en een paar toegewijde individuen maken het mogelijk om effectieve cultuur met weinig inspanning tot stand te brengen. Oikopleura cultuursysteem biedt de basismiddelen om een breed scala van biologische gebieden met betrekking tot ecologie, ontwikkeling, genomica, en de evolutie van deze unieke mariene chordaat te onderzoeken.
Disclosures
De auteur heeft niets te verklaren.
Acknowledgments
We zijn Garth Ilsley dankbaar voor zijn steun bij het opzetten van het cultuursysteem. We erkennen de bijdragen van Ritsuko Suyama en Sylvain Guillot aan vroege inspanningen op het nemen van monsters en soortenidentificatie. Speciale dank is te danken aan Hiroki Nishida, Takeshi Onuma, en Tatsuya Omotezako voor hun genereuze steun en begeleiding in de hele, met inbegrip van de eerste oprichting van de lokale kweeksysteem en het delen van dieren en microalgal cultuur. We danken ook Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro en Alfonso Ferrández-Roldán voor het delen van hun expertise op het gebied van sampling en culturing. Jai Denton, Charles Plessy en Jeffrey Jolly gaven waardevolle feedback over het manuscript. Charlotte West formuleerde een algemene vergelijking voor algenberekening. Tot slot danken we OIST voor de financiering, Mary Collins en het OIST Fieldwork Safety Committee voor advies over veilige bemonsteringsprocedures, het personeel van OIST-machinewinkel voor de bouw van kweek- en bemonsteringsapparatuur, en Koichi Toda voor het leveren van zeewater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
| Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
| Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
| Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
| Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
| Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
| Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
| Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
| Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
| TCW-5N-PPS | |||
| TCW-1N-PPS | |||
| Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
| Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
| Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
| Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
| Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
| UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
| Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |
References
- Travis, J. Is It What We Know or Who We Know? Choice of Organism and Robustness of Inference in Ecology and Evolutionary Biology (American Society of Naturalists Presidential Address). The American Naturalist. 167 (3), 303-314 (2006).
- Jenner, R. A., Wills, M. A. The choice of model organisms in evo-devo. Nature Reviews Genetics. 8 (4), 311-314 (2007).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wilson, S., Ruhl, H., Smith, J. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Steinberg, D. K., Lomas, M. W., Cope, J. S. Long-term increase in mesozooplankton biomass in the Sargasso Sea: Linkage to climate and implications for food web dynamics and biogeochemical cycling. Global Biogeochemical Cycles. 26 (1), 1004 (2012).
- Lombard, F., Kiørboe, T. Marine snow originating from appendicularian houses: Age-dependent settling characteristics. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. 57 (10), 1304-1313 (2010).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 251-264 (1998).
- Hopcroft, R. R. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 45-57 (2005).
- Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e59832 (2019).
- Deibel, D. Feeding mechanism and house of the appendicularian Oikopleura vanhoeffeni. Marine Biology. 93 (3), 429-436 (1986).
- Spada, F., et al. Molecular patterning of the oikoplastic epithelium of the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 20624-20632 (2001).
- Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , Contemporaty Publishing International. 59-85 (2005).
- Tokioka, T. Studies on the distribution of appendicularians and some thaliaceans of the North Pacific, with some morphological notes. Publication of the Seto Marine Biological Laboratory. (8), 351-443 (1960).
- Alldredge, A. L. Discarded appendicularian houses as sources of food, surface habitats, and particulate organic matter in planktonic environments. Limnology and Oceanography. 21 (1), 14-24 (1976).
- Clarke, C., Roff, J. C. Abundance and biomass of herbivorous zooplankton off Kingston, Jamaica, with estimates of their annual production. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 31 (4), 423-437 (1990).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Zooplankton growth rates: extraordinary production by the larvacean Oikopleura dioica in tropical waters. Journal of Plankton Research. 17 (2), 205-220 (1995).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Production of tropical larvaceans in Kingston Harbour, Jamaica: are we ignoring an important secondary producer. Journal of Plankton Research. 20 (3), 557-569 (1998).
- Mochioka, N., Iwamizu, M. Diet of anguilloid larvae: leptocephali feed selectively on larvacean houses and fecal pellets. Marine Biology. 125 (3), 447-452 (1996).
- Sakaguchi, S. O., et al. Morphological identity of a taxonomically unassigned cytochrome c oxidase subunit i sequence from stomach contents of juvenile chum salmon determined using polymerase chain reaction. Fisheries Science. 83 (5), 757-765 (2017).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 25-34 (1998).
- Sato, R., Tanaka, Y., Ishimaru, T. House production by Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) under laboratory conditions. Journal of Plankton Research. 23 (4), 415-423 (2001).
- Flood, R., Deibel, D. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 105-124 (1998).
- Alldredge, A. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 309-326 (2005).
- Katija, K., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. New technology reveals the role of giant larvaceans in oceanic carbon cycling. Science Advances. 3 (5), 1602374 (2017).
- Katija, K., Choy, C. A., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. From the surface to the seafloor: How giant larvaceans transport microplastics into the deep sea. Science Advances. 3 (8), 1700715 (2017).
- Hidaka, K. Species composition and horizontal distribution of the appendicularian community in waters adjacent to the Kuroshio in winter-early spring. Plankton and Benthos Research. 3 (3), 152-164 (2008).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359-370 (2009).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: culture, genome, and cell lineages. Development, Growth & Differentiation. 50, 239-256 (2008).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica culturing made easy: A Low-Cost facility for an emerging animal model in Evo Devo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), 146-152 (2016).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Seo, H. C., et al. Miniature genome in the marine chordate Oikopleura dioica. Science. 294 (5551), 2506 (2001).
- Fredriksson, G., Olsson, R. The subchordal cells of Oikopleura dioica and O. albicans (Appendicularia, Chordata). Acta Zoologica. 72 (4), 251-256 (1991).
- Paffenhöfer, G. A. The cultivation of an appendicularian through numerous generations. Marine Biology. 22 (2), 183-185 (1973).
- Fenaux, R., Gorsky, G. Nouvelle technique d'élevage des appendiculaires. Rapports et Procés-Verbaux des Réunions-Commission Internationale pour l'Exploration Scientifique de la Mer Méditerranée. 29, 291-292 (1985).
- Fujii, S., Nishio, T., Nishida, H. Cleavage pattern, gastrulation, and neurulation in the appendicularian, Oikopleura dioica. Development Genes and Evolution. 218 (2), 69-79 (2008).
- Patry, W. L., Bubel, M., Hansen, C., Knowles, T. Diffusion tubes: a method for the mass culture of ctenophores and other pelagic marine invertebrates. PeerJ. 8, 8938 (2020).
- Fenaux, R. The classification of Appendicularia (Tunicata): history and current state. Memoires de I'Institut oceanographique. , (1993).
- Shiga, N. Illustrated Guide to Marine Plankton in Japan. Chihara, M., Murano, M. , Tokai University Press. 1393-1414 (1997).
- Gorsky, G., Castellani, C. Marine Plankton: A practical guide to ecology, methodology, and taxonomy. Castellani, C., Edwards, M. , Oxford University Press. 599-606 (2017).
- Sato, R., Ishibashi, Y., Tanaka, Y., Ishimaru, T., Dagg, M. J. Productivity and grazing impact of Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) in Tokyo Bay. Journal of Plankton Research. 30 (3), 299-309 (2008).
- Nakamura, Y., Suzuki, K., Suzuki, S. Y., Hiromi, J. Production of Oikopleura dioica (Appendicularia) following a picoplankton 'bloom'in a eutrophic coastal area. Journal of Plankton Research. 19 (1), 113-124 (1997).
- Nakamura, Y. Blooms of tunicates Oikopleura spp. and Dolioletta gegenbauri in the Seto Inland Sea, Japan, during summer. Hydrobiologia. 385 (1-3), 183-192 (1998).
- Uye, S. I., Ichino, S. Seasonal variations in abundance, size composition, biomass and production rate of Oikopleura dioica (Fol)(Tunicata: Appendicularia) in a temperate eutrophic inlet. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 189 (1-2), 1-11 (1995).
- Tsuchiya, K., et al. Phytoplankton community response and succession in relation to typhoon passages in the coastal waters of Japan. Journal of Plankton Research. 36 (2), 424-438 (2014).
- Lopez-Lopez, L., et al. Effects of typhoons on gelatinous carnivore zooplankton off Northern Taiwan. Cahiers de Biologie Marine. 53, 349-355 (2012).
- Ares, Á, et al. Extreme storm-induced run-off causes rapid, context-dependent shifts in nearshore subtropical bacterial communities. bioRxiv. , (2019).
- Torres-Águila, N. P., et al. Diatom bloom-derived biotoxins cause aberrant development and gene expression in the appendicularian chordate Oikopleura dioica. Communications Biology. 1 (1), 1-11 (2018).
- Troedsson, C., Frischer, M. E., Nejstgaard, J. C., Thompson, E. M. Molecular quantification of differential ingestion and particle trapping rates by the appendicularian Oikopleura dioica as a function of prey size and shape. Limnology and Oceanography. 52 (1), 416-427 (2007).
- Ouchi, K., Nishino, A., Nishida, H. Simple procedure for sperm cryopreservation in the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Zoological Science. 28 (1), 8-11 (2011).
