Summary
Oikopleura dioica biyolojinin çeşitli alanlarında bir tunicate model organizmadır. Biz örnekleme yöntemleri, türlerin belirlenmesi, kültür kurulum ve hayvanlar ve alg yem için culturing protokolleri açıklar. Kültür sisteminin güçlendirilmesine yardımcı olan temel faktörleri vurguluyor ve olası sorunları ve çözümleri tartışıyoruz.
Abstract
Oikopleura dioica olağanüstü filtre besleme yeteneği, hızlı üretim süresi, korunmuş erken gelişim ve kompakt genom ile bir planktonik akorat olduğunu. Bu nedenlerden dolayı, deniz ekolojik çalışmaları, evrimsel gelişimbiyolojisi ve genomik için yararlı bir model organizma olarak kabul edilir. Araştırma genellikle hayvan kaynaklarının sürekli bir kaynağı gerektirir gibi, güvenilir, düşük bakım kültür sistemi kurmak için yararlıdır. Burada bir O. dioica kültürü oluşturmak için adım adım yöntemi açıklar. Potansiyel örnekleme alanlarının nasıl seçiliş yöntemini, toplama yöntemlerini, hedef hayvan tanımlamasını ve kültür sisteminin kurulumlarını açıklarız. Kendi deneyimlerimize dayalı olarak sorun giderme önerileri sayılmaktayız. Ayrıca, sağlam bir kültür sisteminin sürdürülmesine yardımcı olan kritik faktörleri de vurguluyoruz. Burada sağlanan kültür protokolü O. dioicaiçin optimize edilmiş olsa da, örnekleme tekniğimizin ve kültür kurulumuzun diğer kırılgan pelajik omurgasızları korumak için yeni fikirlere ilham vermesini umuyoruz.
Introduction
Model organizmalar, gelişim, genetik ve fizyoloji ile ilgili olanlar da dahil olmak üzere birçok biyolojik sorunun ele alınmasında etkili olmuştur. Ayrıca, ek model organizmalar yeni keşifler kolaylaştırmak ve bu nedenle doğanın daha büyük bir anlayış elde etmek için çok önemlidir1,2. Deniz zooplankton okyanus ekosistemleriönemlibir rol oynayan organizmaların çeşitli gruplar 3,4,5,6. Onların bolluk ve ekolojik önemine rağmen, planktonik tunicates gibi jelatinimsi organizmalar genellikle altında plankton biyolojik çeşitlilik çalışmalarında temsil edilmektedir çünkü şeffaflık ve kırılganlık alan toplama ve kimlik meydan yapmak7,8. Adapte örnekleme teknikleri ve laboratuvar culturing planktonik tunicates9,10,11,12biyoloji bilgi ilerletmiştir in vitro, hayvanların daha yakından gözlem sağlar.
Larvaceans (Apendicularians) dünya çapında yaklaşık 70 tanımlanan türler 8 oluşan serbest yüzme deniz tunicates bir sınıftır8,13. Onlar zooplankton topluluklar içinde en bol gruplardan biri olduğu gibi14,15,16,17, larvaceans balık larvaları gibi büyük planktonik organizmalar için birincil besin kaynağı temsil18,19. Ascidians aksine-sessile tunicates-larvaceans bir kurbağa yavrusu gibi morfoloji korumak ve yaşamları boyunca planktonik kalır20. Her hayvan, ev olarak bilinen kendi kendini inşa edilmiş, karmaşık bir filtre besleme yapısı içinde yaşar. Kuyruklarının dalgalı hareketi ile su akıntıları oluşturarak evlerinde partiküller birikirler21. Tıkanmış evler gün boyunca atılır, bazıları karbon agregaları oluşturur ve sonunda deniz tabanına22lavabo; böylece, larvaceans küresel karbon akısı önemli bir rol oynamaktadır23. Çoğu türün13no'lsu su sütununun üst 100 m'si içinde pelajik bölgede yaşadığı bildirilir; ancak, dev larvacean Bathochordaeus 300 m24derinliklerinde yaşadığı bilinmektedir. Monterey Bay Bathochordaeus bir çalışma, Kaliforniya hayvanların da mikroplastik biyolojik bir vektör olarak hizmet ortaya, okyanuslarda mikroplastikdikey taşıma ve dağılımında apandisisitlerin rolünü anlamada potansiyel bir önem düşündüren25.
Oikopleura dioica, larvacean bir tür, birkaç dikkat çekici özellikleri nedeniyle bir model organizma olarak son yıllarda dikkat çekti. Genellikle dünya okyanuslarında rapor edilir. Özellikle kıyı sularında bol miktarda bulunur26, kıyıdan kolay örnekleme sağlar. Uzun süreli, stabil kültür hem doğal hem de yapay deniz suyu27,,28,29ile mümkündür. Sıcaklık bağımlı üretim süreleri laboratuvar koşullarında 4-9 gün kadar kısadır. Yıl boyunca >300 yumurta üretebilen her dişi ile yüksek bir fecundity vardır. Bir tunicate olarak, kordevrim30,31anlamak için önemli bir filogenetik konuma sahiptir. 70 Mb'de, O. dioica tüm kordates32arasında en küçük tanımlanmış genoma sahiptir. Larvaceans arasında, O. dioica şimdiye kadar açıklanan tek non-hermafrodit türler33.
Laboratuvar yetiştirilen mikroalg ile ilk başarılı O. dioica kültürü Paffenhöfer34tarafından bildirilmiştir . Senkron motorlar ve kürekler kullanılarak orijinal kültür protokolü Fenaux ve Gorsky35 tarafından geliştirilmiş ve daha sonra birden fazla laboratuvar tarafından kabul edilmiştir. Daha yakın zamanda, Fujii ve ark36 yapay deniz suyunda O. dioica culturing bildirdi, sağlam bir kültür sistemi ve alan koleksiyonu Buket ve ark.27 tarafından tarif edildi ve basitleştirilmiş için optimize edilmiş bir protokol, uygun fiyatlı sistem Marti-Solans ve ark.29tarafından bildirilmiştir . Kenara geleneksel Oikopleura kültür sistemi, bir çift tüp yetiştirme tankı ile yeni bildirilen tasarım da kültür Oikopleura sp potansiyeline sahiptir. 37'ye kadar.
Biz Sars Uluslararası Deniz Moleküler Biyoloji Merkezi27büyük Oikopleura araştırma grupları tarafından geliştirilen protokollerin bir arada dayalı bir O. dioica monokültür başlatmak için ayrıntılı bir protokol salıyoruz , Barselona Üniversitesi29, Osaka Üniversitesi28, ve kendi gözlemler. Daha önce yayınlanmış kültür protokollerinde, alg medyasının bileşimi, kıyı örnekleme teknikleri ve Oikopleura tanımlaması ile ilgili ayrıntılı bilgiler kabaca açıklanmış ve bu da çok fazla belirsizlik bırakarak tanımlanmıştır. Burada, video protokolündeki görsel bilgilerin yardımıyla, bir O. dioica kültürünü sıfırdan kurmak için gereken tüm kritik bilgileri adım adım basit bir şekilde bir araya getirdik. Biz nasıl başka bir yaygın olarak bildirilen türler, O. longicauda,en zorlu adımlardan biridir O. dioica ayırt etmek için açıklar. Mevcut kültür sistemleri dünya çapında O. dioica ekimi için geçerli olmasına rağmen, yerel çevre koşullarına dayalı protokol ayarlamasının önemini vurguluyoruz. Sunulan bilgiler, yaygın olarak yayınlanan verilerin yanı sıra deneyimle kazanılan bilgileri de birleştirir. Mevcut protokol, sıfırdan bir kültür oluşturmak isteyen araştırmacılar için idealdir.
Protocol
1. O. dioica kültür tesisi
- Su filtre sistemi (Şekil 1)
- 2-3 m derinlikteki bir limandan doğal deniz suyu toplayın. Deniz suyunu bir kum filtresinden (gözenek boyutu 1,4 mm) geçirin ve laboratuvardaki ortak rezervuar tankına taşıyın. Paylaşılan rezervuar tankındaki su kalitesini korumak için suyu sirküle etmek için bir kutu filtre kullanın.
- Bir kültür odasında, manyetik tahrik pompası, 5 μm ve 1 μm polipropilen yara kartuş filtreleri ve UV sterilizatörü (100 V)(Şekil 1)ile 100 L rezervuar tankından oluşan çok aşamalı bir filtre sistemi kurulur.
- Deniz suyunu ortak rezervuar tankından kültür odası rezervuar tankına aktarın. Kültür odası rezervuar tankına girmeden önce deniz suyunu 25 m'lik bir filtre ünitesinden(Şekil 1A,B)geçirin. Deniz suyunu bir gecede 5 ve 1 μm filtreler arasında dolaştırarak hayvanların gelişimini engelleyebilecek parçacıkları iyice temizleyin.
NOT: Daha büyük kafes boyutuna (25-50 μm) sahip ek bir filtre, daha büyük partiküllerin kartuş filtrelerini daha küçük kafes boyutlarıyla tıkamasını önlemek için yararlıdır. Filtrelenmiş deniz suyu (fSW) ertesi sabah kullanıma hazırdır.
-
Oikopleura kültür ünitesi (Şekil 2)
- 5 veya 10 L yuvarlak, şeffaf plastik gagalar hayvanları korumak.
- 5 mm kalınlığında, şeffaf akrilik yüzey tahtası ile sabit, iki seviyeli paslanmaz çelik raf ünitesi (L x W x H = 150 cm x 45 cm x 90 cm) üzerine kültür gagaları yerleştirin.
- Beyaz floresan ışıkları akrilik yüzeyin altına yerleştirin ve hayvanları gagaların altından aydınlatın.
- Gagaların arkasına siyah plastik bir tabaka yerleştirin. Siyah sayfa kontrast oluşturur ve saydam hayvanların görselleştirme geliştirir.
- Senkron elektrik motorlarını akrilik küreklere bağlayın (L x H = 8 cm x 27 cm)(Ek Dosya 2). Raf ünitesi(Şekil 2A)uzunluğu boyunca uzanan paralel raylar gelen kültür gagaları kürekler askıya.
- 15 RPM'de gagalarda hafif dairesel hareket oluşturmak için motorları açın.
NOT: Selüloz evlerinde ki hayvanlar nötr olarak yüzer; ancak, su sirkülasyonu yumurta, larva ve alg gıda askıya alınması ve eşit kültür gagaları dağıtılan tutmaya yardımcı olur.
- Otomatik dosing pompası (İsteğe bağlı)
NOT: Otomatik besleme ünitesi, özellikle hafta sonları personel gereksinimlerini azaltır.- Otomatik dozlama pompasından dağıtım sıvısının hacmini üreticinin talimatlarına göre kalibre edin.
- Alg rezervuarları olarak 50 mL tüpler kullanın.
- Havayolu tüpünden geçmek için 50 mL'lik tüplerin kapaklarında 5 mm'lik iki delik delin. Hava kabarcıkları tanıtmak için standart bir akvaryum hava pompası bir tüp bağlayın, ve dosing pompa giriş noktasına diğer tüp(Şekil 2B).
NOT: İnce bir hava kabarcıkları akışı getirilmesi, alglerin tüplerin dibine yerleşmesini önlemeye yardımcı olur. - Belirli bir günde dağıtılacak alg yemlerinin zamanını ve hacmini programla.
- Yosun istasyonu
- Alg çalışma kültürleri içeren dört adet 1 L yuvarlak alt şişeyi yerleştirmek için bir raf ünitesi (L x W x H = 90 cm x 46 cm x 115 cm) kullanın (Bkz. adım 2.1).
- Şişelerin arkasına floresan ışıklar yerleştirerek çalışma kültürlerini arkadan aydınlatın.
- İki delikli kauçuk durdurucuile mühür şişeleri.
- Kauçuk durdurucudan 1 mL tek kullanımlık pipet geçirin. Bir akvaryum hava pompası pipet bağlamak için havayolu boru kullanın. Şişedeki hava kabarcıkları akışını tanıtın.
2. Mikroalgal gıda
- Alg kültürlerinin başlatılması
NOT: Üç mikroalgal türü, Chaetoceros calcitrans, Isochrysis sp., Rhinomonas reticulatave siyanobakteriler, Synechococcus sp. Stok ve alt kültürler yedek olarak kullanılır. Çalışma kültürü günlük beslenme için kullanılır.- Mikroalg ve siyanobakterilerin yetiştirilmesi için gerekli reaktifleri hazırlayın(Tablo 1).
- Stok kültürünü başlatmak için, otoklav (121 °C, 25 dk) 60 – 100 mL Erlenmeyer şişesinde fSW'nin 80 mL'si. Modifiye Conway orta27 ve mikroalg(Tablo 2)belirtilen miktarda aseptik inoculate . Örneğin, C. calcitrans, otoklav 60 mL deniz suyu, aseptik olarak 30 μL vitamin ve çözelti A, 15 μL sodyum silikat, 60 μL streptomisin ve 30 μL C. kalsitran bir stok kültürü aşılamak için önceki stok kültüründen.
NOT: R. reticulata çok fazla ışığa maruz kaldığında kırmızımsı-pembeden orangish-kahverengiye dönüşür. Açıktan açık pembeye dönmeye başladıktan sonra onları ışıktan uzaklaştırın. - Stok kültürünü 17 °C'de sürekli aydınlatma ile ayarlanmış bir kuluçka makinesinde koruyun. Yaklaşık 10 gün sonra kültür alg büyümesini göstermek için renk değiştirir (Şekil 3). Renkler göründükten sonra, 1 aya kadar uzun süreli depolama için 4 °C'ye taşıyın.
- Temiz bir bankta, stok kültüründen bir alt kültürü aseptik olarak aşılamak(Tablo 2). Sürekli aydınlatma ile 17 °C'de kuluçkaya yatırın. Alg renkleri göründükten sonra, 2 haftaya kadar kuvözde saklamaya devam edin.
- Alt kültürden çalışma kültürünü aşılamak (Tablo 2). Şişeyi kauçuk bir kapakla kapatın ve 1 mL tek kullanımlık pipet takın. Şişeyi yosun istasyonuna taşıyın ve 8 saat lik bir fotoperiyotla oda sıcaklığında koruyun. Sürekli havalandırma ile tedarik. Çalışma kültürünü her 4 günde bir yenileyin.
- Girdap yaparak günde iki kez stok ve alt kültürleri karıştırın.
NOT: Alg kültürünün katı ortamda uzun süreli depolanması ve kriyoprezervasyon, sırasıyla29,3 ay ve 1 yıla kadar mümkündür.
- Alg büyüme eğrileri oluşturma (İsteğe bağlı)
NOT: Beslenme miktarının doğru değerlendirilmesi, O. dioica'nınistikrarlı bir kültürünü korumak için önemlidir. Biz iki birincil alg gıda türleri, Chaetoceros calcitrans ve Isochrysis sp için büyüme eğrileri oluşturdu.- Hazırlamak C. calcitrans ve Isochrysis sp. çalışma kültürleri (Tablo 2).
- Çalışma kültürünün her türü için, bir spektrofotometre kullanarak 660 nm'de üç ayrı kez örnek alın ve emicilikleri ölçün. Her çalışma kültüründen üç aylık ların ortalama ölçümlerini alın.
- Otomatik bir hücre sayacı için üreticinin talimatlarına uyun, saymak için alg örnekleri hazırlayın. Her örneği üç kez sayın. Her örnekte bulunan toplam hücre sayısını belirlemek için üç sayım ortalamasını alın.
- Yaklaşık 50 ortalama ölçüm kaydedilene kadar günlük olarak saymaya devam edin.
- Her iki alg türü için de büyüme eğrileri oluşturun (Şekil 4).
3. Vahşi Oikopleura spp Alan koleksiyonu.
- Modifiye plankton net (Şekil 5)
NOT: Oikopleura spp. başarılı örnekleme anahtarı ağırlıklı, filtreolmayan morina ucu ile bir plankton net yavaş çekme olduğunu. Şekil 5 değiştirilmiş plankton ağın şematik diyagramını gösterir.- El plankton ağındaki morina ucunu modifiye edilmiş 500 mL vidalı üstlü yıkama şişesiyle değiştirin.
- Su ve hayvanların morina ucuna girmesini sağlamak için yıkama şişesinin 4 cm çapında vida-top 3 cm çapında delik delin.
- Şişe kapağını plankton ağının sonuna sığdırın. Elektrikli bantla sıkıca sarın. Paslanmaz çelik hortum kelepçesi ile kapağı daha da sabitlayın.
- Zip bağları ile modifiye morina ucu nun dışına 70 g ağırlık takın.
- Morina ucunu daha da sabitlemek için emniyet tasmasını takın.
- Toplama siteleri seçme (Şekil 6)
NOT: Tüm numune koleksiyonları OIST Saha Çalışması Güvenliği Komitesi tarafından onaylanmıştır. Konuma bağlı olarak Oikopleura spp. varlığında mevsimsel farklılıklar olabilir (Şekil 6). Şiddetli yağmur fırtınaları gibi aşırı hava olaylarından hemen sonra örnekleme kaçının.- Olası örnekleme sitelerini belirlemek için harita web sitesindeki uydu görünümünü kullanın. Biz limanlar ve kolayca araba ile erişilebilir ve koylar içinde veya plankton birikir eğilimindedir okyanus bırakma yakınında bulunan balıkçı iskeleleri üzerinde duruldu: Kin Bay Ishikawa liman, Okinawa, Japonya (GPS: 26 °25'39.3"N 127°49'56.6"E).
- Her sitenin kıyı erişilebilirliğini ve güvenliğini değerlendirmek için potansiyel örnekleme yerlerini ziyaret edin. Gerektiğinde yerel makamlardan toplama izni alın.
- Örnekleme prosedürü
- Planktonu denize atın ve morina ucunun su yüzeyinin 1-2 m altına batmasını bekleyin.
- 50-100 cm s-1'deağı yatay olarak çekerek . 2-5 dakika ileri geri yürüyerek çekme devam edin. Daha fitoplankton olduğunda kısa çekme ile limanda fitoplankton bolluğuna göre çekme zamanı ayarlayın.
NOT: Larvaceans kırılgan hayvanlardır. Hızlı çekme veya net tekrarlanan döküm morina ucunda sıkışıp hayvanlara zarar verebilir. - Ağı yavaşça kaldır. Morina ucunun içeriğini yavaşça 500 mL yuvarlak cam şişeye aktarın. Tamamen hava kabarcıkları önlemek için deniz suyu ile örnek şişe doldurun.
NOT: Oikopleura spp. varlığı siyah bir arka plan karşı örnek şişeler görüntüleyerek teyit edilebilir. Çoğu hayvan toplanırken evlerini terk ederler. Bu nedenle tür düzeyinde tanımlama için mikroskobik gözleme ihtiyaç vardır. - Üç 500 mL şişe toplanana kadar tekrar örnekleme.
- Hayvanların doğal olarak var olduğu fiziksel parametrelerin aralığını kaydetmek için CTD profilleyicikullanarak tuzluluk, sıcaklık ve klorofil ölçün.
- Laboratuvar ortamında hayvanları alışmak için bir kova içinde yüzey deniz suyu 10-15 L toplayın.
4. Hayvan izolasyonu ve tanımlaması (Şekil 7, Şekil 8)
-
Oikopleura spp. tanımlama
NOT: İlk bakışta Oikopleura spp.'ye benzeyen diğer planktonik organizmalar arasında chaetognaths, Fritillaria spp., nematodlar, sarısı keseli balık larvaları ve Ciona spp. larvalar sayılabilir.- Hayvanları laboratuvar koşullarına alıştırmak için, her 500 mL numuneyi numune alma konumundan yüzey deniz suyunun 1:1 oranına ve laboratuvarda tutulan filtrelenmiş deniz suyu (fSW) içeren 10 L kabına aktarın(Şekil 7A,B). Plankton numunesinin konsantrasyonuna bağlı olarak kabın hacmini 5-10 L olarak ayarlayın.
NOT: Plankton numunesi istenmeyen enkaz içeriyorsa, 10 L kabına aktarmadan önce kaba bir filtreden (örgü boyutu ~600 μm) geçirin. - Senkron bir elektrik motoruna (15 RPM) bağlı bir kürek kullanın ve planktonu bir gecede süspansiyonda tutun (adım 1.2.5).
- Oikopleura spp. 1-2 mm uzunluğunda, iribaş şeklindeki hayvanları küresel, yarı saydam bir evin içinde kuyruklarını dalgalandırarak tanımlayın. Bazı hayvanlar evler olmadan geçici olarak serbestçe yüzebilirler. ~5 hayvanı künt uçlu bir pipet kullanarak boş bir Petri kabına yavaşça aktarın.
- Cins tanımlaması için, evi bir transfer pipetiyle hafifçe dürterek hayvanları evlerinden tahliye edin.
- 20-40x karanlık alan mikroskobu altında evsiz hayvanları gözlemleyin ve Oikopleura spp(Şekil 8)onaylamak.
- Hayvanları laboratuvar koşullarına alıştırmak için, her 500 mL numuneyi numune alma konumundan yüzey deniz suyunun 1:1 oranına ve laboratuvarda tutulan filtrelenmiş deniz suyu (fSW) içeren 10 L kabına aktarın(Şekil 7A,B). Plankton numunesinin konsantrasyonuna bağlı olarak kabın hacmini 5-10 L olarak ayarlayın.
-
O. dioica tanımlama
NOT: O. dioica, tam olgun erkek ve dişilerin varlığı veya kuyruklarının distal yarısında bulunan iki büyük subrakkoral hücrenin varlığı ile görsel olaraktanımlanabilir. İki subkord hücreleri arasındaki mesafe bireyler arasında değişebilir.- Daha sonra, yumurta(Şekil 8A)veya sperm(Şekil 8B)ile dolu bir gonad ile tam olgunlaşmış Oikopleura olup olmadığını kontrol edin. Hayvan sadece yumurta veya sperm sahipise, adım atlayın 4.2.3 O. dioicaolduğu gibi , sadece tanımlanan olmayan hermafrodit türler.
- Eğer hayvan olgunlaşmamışsa(Şekil 8C),kuyruğunun ucunda iki alt kornere hücresi arayın (Şekil 8D).
- Türler onaylandıktan sonra, yeni bir Petri kabına aktarın. Tekrar adımları 4.1.3-4.2.2 kadar 10-20 bireyler tür düzeyinde teyit edilir.
NOT: Daha kolay tanımlama için fSW'de %0.015 trikotin metansülfonat (MS222) içeren petri kabındaki hayvanları anestezi edin. - Hiçbir O. dioica bulunursa, bir ya da iki gün için askıya beaers tutun. Büyümeye devam edecek ve tespit edilmesi daha kolay hale gelecek olgunlaşmamış O. dioica olabilir. Bir hafta sonra hiçbiri görünmüyorsa, örneği atın ve yeniden örneklemeyi deneyin.
5. O. dioica için yetiştirme protokolü
- Toplanan bir alandan O. dioica monokültürünün başlatılması (Şekil 7)
NOT: Algal yemekleri her gün çalışma kültürlerinden hazırlanır ve her monokültür kabı günde üç kez 09:00, 12 PM ve 17:00'de beslenir (Bkz. adım 5.2). Hayvanlar 23 °C'de korunur. Bu koşullar altında, Okinawa O. dioica yaşam döngüsü 4 gündür (Şekil 7C).- O. dioicamonokültür başlatmak için, 120 hayvan izole ve taze fSW 5 L içeren yeni bir beher transfer(Şekil 7B,C).
- Ertesi sabah, sarı gonadlar ve altın küreler olarak görünen yumurta ile dişiler ile tam olgun erkek arayın(Şekil 8A,B).
- 15 erkek ve 30 dişinin 5 mL künt uçlu pipetle 2,5 L taze fSW içeren yeni bir kabına yavaşça aktararak yumurtlama kabı yapın.
NOT: Eğer yeterli erkek ve kadın yoksa, fSW 1 L içeren bir beher mümkün olduğunca çok yetişkin transfer ve onları doğal olarak yumurtlamak sağlar. Elle transfer sırasında hayvanlara fiziksel stresi en aza indirmek için, yavaş yavaş emdirilmiş ve su yüzeyinin altında serbest bırakılmalıdır. - Hayvanların bir sonraki nesli başlatmak için doğal olarak yumurtlamasına izin verin. Kuyruklu larvalar döllenmeden yaklaşık 3 saat sonra görünmelidir.
NOT: Yumurtlama, evlerini terk eden, yüzey suyuna doğru yüzen ve gametlerini serbest bırakan tam olgunlaşmış hayvanlar tarafından gerçekleştirilir. Başarılı döllenme, yumurtlama kabının altından 5-10 mL deniz suyu çıkarılarak ve mikroskop altında dekolteli yumurtaların tanımlanması ile doğrulanabilir. - İlk sabah yumurtlama sonrası (Gün 1), şişirilmiş evler ile hayvanların yeni nesil beher görünmelidir. Yumurtlayan kabın içeriğini 7,5 L taze fSW içeren yeni bir kabın içine nazikçe aktarmak için 500 mL el kabı kullanın (toplam 10 L yapma). Bir sıçrama hareketi önlemek için bir açıyla dökün.
- İkinci sabah (Gün 2), el ile taze fSW 5 L içeren yeni bir beher için 150 hayvan aktarın.
- Üçüncü sabah (Gün 3), el ile taze fSW 5 L ile yeni bir beher için 120 hayvan aktarın.
NOT: Hayvanların gelişimini senkronize etmek için, 2 ve 3. Tek bir transferde en fazla 10 hayvan emilebilir. - Dördüncü sabah (Gün 4), tamamen olgunlaşmış hayvanlar görünmelidir. Yaşam döngüsünü kapatmak için adım 5.1.3'u tekrarlayın.
NOT: Otomatik besleme pompası, hafta sonları saat 17:00'de, kültür personeli olmadan hayvanları beslemek için ayarlanabilir.
- Çalışma kültüründen alg gıdagünlük hazırlanması
- Çalışma kültürünün absorbe sini 660 nm olarak ölçün.
- Günlük Beslenme Tablosuna dayanarak, belirli büyüklükteki hayvanlar için kaç alg hücresinin beslenmesi gerektiğini öğrenin(Tablo 3).
- Alg büyüme eğrilerini kullanarak(Şekil 4),belirli bir günde gerekli olan alg gıdasının (mL) hacmini hesaplamak için aşağıdaki denklemleri çözün.
- Belirli bir gün ve besleme süresi için gereken belirli bir yosun hacmini hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
YA'nın belirli bir günde yosun konsantrasyonu olduğu ve A'nın beslenme başına ihtiyaç duyulan alg hacmi olduğu yerdir. Ayrıca, YA ile xarasındaki doğrusal ilişki , kesme (c) ve eğim (m) değerleri Şekil 4'tegösterilmiştir. K değerleri için Tablo 3'e bakın. - Örneğin, 5 L kültüründe ve 0,234 (660 nm olarak ölçülen) alg absorbance ile tutulan Gün 3 hayvanların 9 besleme gerekli Isochrysis sp hacmini hesaplamak için, aşağıdaki hesaplandı:
NOT: Günlük besleme miktarı emici ölçümlere, hayvanların büyüklüğüne ve kültür deniz suyunun hacmine göre otomatik olarak hesaplanacak şekilde bu denklemleri bir elektronik tabloda saklayın(Ek Dosya 1).
- Belirli bir gün ve besleme süresi için gereken belirli bir yosun hacmini hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
- Hesaplanan yosun hacmini 50 mL tüplere, 5000 x g'de 20 °C'de 5 dk'ya aktarın.
- Supernatant çıkarın. Tüpleri orijinal sese kadar taze fSW ile doldurun ve eski alg ortamlarının yerini alayın.
- Hazırlanan yiyecekleri bir sonraki yem için hazır olana kadar buzdolabında saklayın. Yeni gıda ertesi sabah hazırlandıktan sonra eski alg gıda atın.
- Aktif kömür (İsteğe bağlı)
NOT: Su kalitesini korumak için her kültür kabına 10 g aktif kömür eklenir. Kömür en fazla dört kez yeniden kullanılabilir. Kömür tozunun kültür gagalarına girmesini önlemek için kömür torbasını yavaşça açın.- Bir kapta aktif kömür ~700 g aktarın. 48 saat boyunca tatlı suda (FW) bekletin ve alt yerleşmek için izin verin.
- Artık kömür tozunu temizlemek için FW ile durulayın.
- 15-20 dk. Sıcaktan çıkarın ve soğumasını bekleyin FW kaynatın kömür.
- En kömür tozu çıkarılana kadar durulayın ve su berraklaşır.
- Temiz kömürü fSW içeren 2 L kabında saklayın. Tozun girmesini önlemek için kabın üzerini kapatın.
- Hayvanları transfer etmeden önce her yeni beher kömür ekleyin.
Representative Results
Oikopleura bir tekneden veya limandan, filtreleme yapmayan bir morina ucuile 100 μm mesh plankton ağın yavaş ve nazik bir şekilde çekilerek toplanabilir(Şekil 5). Hayvanların kırılgan doğası nedeniyle, fiziksel strese neden olabilecek herhangi bir hareketten kaçınmak önemlidir, örneğin kavanozda sıkışıp kalmış bir hava cebi nedeniyle ağın kabaca kullanımı veya sıçraması gibi.
Yerel Oikopleura popülasyonlarının mevsimsel desenini ve bir örnekleme yerindeki suyun fiziksel özelliklerindeki buna eşlik eden dalgalanmaları anlamak önemlidir. 2015 ve 2019 yılları arasında örnekleme, Ishikawa'daki O. dioica ve Okinawa'daki Kin limanlarında tutarlı mevsimsel farklılıklar ortaya koymuştur(Şekil 6). Yüzey deniz suyu sıcaklığı önemli bir faktör gibi görünüyor. O. dioica, yüzey suyu ≥28 °C'ye ulaştığında baskın türdü ve O. longicauda 24 °C ile 27 °C arasındaki sıcaklıklarda O. dioica ile bir arada ydı; ancak, O. longicauda 23 °C 'nin altında hakimdir (Şekil 6A). Şiddetli yağmur birkaç gün sonra tuzluluk kademeli değişim O. dioica bolluğu ile ilişkili değildi (Şekil 6B).
Yukarıda açıklanan örnekleme prosedürlerikullanılarak, kurtardığımız O. dioica'nın çoğu 4 günlük yaşam döngülerinin 2 ve 3.Figure 7C Olgun erkekler gondadların sarı renklendirmesi ile tanınırken, dişi gonadlar 70-80 m çapında yumurtalardan altın parıldadı(Şekil 8A,B). Olgunlaşmamış O. dioica kuyruklarında iki subrakonal hücre tarafından doğrulandı(Şekil 8D). Yerel sularda bir diğer baskın tür, O. longicauda, boyut ve morfoloji benzerdi. O. longicauda'yı O. dioica38,39,40'tanayırmak için aşağıdaki kriterleri kullandık: kuyrukta subkorneder hücrelerin eksikliği, gövdede velum varlığı ve hermafrodit gonad varlığı ( Şekil8E,F). Farklı kuyruk morfolojileri de O. longicauda O. dioicaayırt etmek için yararlıdır. Ne zaman ev olmadan bozulmamış bir çıplak hayvan yanal odaklı oldu, O. longicauda kuyruğu daha az eğrilik ile düz oldu, O. dioicagöre bir "sert" bir görünüm vererek .
Kararlı bir Oikopleura kültür sistemi kurmak için en önemli üç faktör (i) yüksek su kalitesini korumak, (ii) optimal beslenme rejimini belirlemek ve (iii) yeterli sayıda erkek ve dişiye sahip bir yumurtlama kabı kurmaktır. Çok aşamalı bir filtre sisteminin(Şekil 1)piyasaya sürülmesi kültürün su kalitesini ve stabilitesini iyileştirmiştir. Yapay deniz suyu için filtrasyon sistemi gerekli değildir; ancak, doğal deniz suyunun maliyeti, kullanılabilirliği ve rahatlığı onu kıyıya yakın laboratuvarlar için daha iyi bir seçenek haline getirir. Besleme rejimini oluşturmak için, sıcaklık ve ışık koşulları büyük ölçüde değiştiğinden, bireysel laboratuvar ortamlarına uygulanan alg büyüme eğrilerinin ölçülmesini öneririz. Büyüme eğrilerini daha önce yayınlanmış beslenme programlarıyla birleştirip yosun yem konsantrasyonlarını ve bileşimlerini optimize ettik27 (Şekil 4). Biz de alg gıda(Tablo 2)taze bir kaynağı korumak için sıkı bir alg aşılama programı izleyin. Otomatik besleme sistemi, kültür personeli(Şekil 2B)olmadan tutarlı bir günlük besleme programı sürdürmemizi sağlar.
Optimum deniz suyu ve beslenme koşulları sağlandıktan sonra, 2,5 L fSW'de 15 erkek ve 30 dişi ile yumurtlama kabı oluşturarak yeni nesillere başlamak önemlidir. Bu gün 1 hayvanların iyi bir konsantrasyon sağlar ertesi sabah, Hangi Gün 2 150 hayvan izole etmek için yeterli, 120 Gün 3 ve 45 yetişkin Gün 4 yumurtlama için. 4. Günde yeterli erkek ve kadın yoksa, fSW'nin 1 L'sine mümkün olduğunca çok sayıda olgun bireytoplayıp transfer edin ve bir sonraki nesle devam edecek kadar larva olması umuduyla doğal yollarla yumurtlamalarına izin verin. Verilen protokolütaki o. O. dioica'nın yaşam döngüsü 23 °C'de 4 gündür (Şekil 7C). O. dioica'nın20'den fazla nesil süren altı bağımsız vahşi popülasyonu güvenilir bir şekilde oluşturduk.
Şekil 1: Deniz suyu filtre sisteminin şeması.
(A ve B) Deniz suyu, rezervuar tankına girmeden önce başlangıçta 25 μm'lik bir filtre ünitesinden süzülür (C) Rezervuar tankından deniz suyu çekmek için manyetik tahrik pompası kullanılır. Deniz suyu daha sonra rezervuar tankına dönmeden önce iki polipropilen filtre ve bir UV sterilizatörü ile itilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: O. dioicaiçin kültür sistemi .
(A) Kültür sistemine genel bakış (B) Otomatik dozlama pompası için senkron motor ve yosun rezervuarının yakın çekim görünümü. Silikon tüp A ve B'nin iç çapları sırasıyla 2 mm ve 4 mm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: O. dioicaiçin stok kültürleri.
Soldan- C. calcitrans, Isochrysis sp., Synechococcus sp., ve R. reticulata ~ 10 gün boyunca sürekli ışık altında 17 °C'de büyüdükten sonra. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Başlıca besin türlerinin ikisi olan C. calcitrans ve Isochrysis sp...
660 nm'de optik yoğunluk (OD) dağılım ları ve toplam hücre konsantrasyonları için (A) C. calcitrans ve (B) Isochrysis sp... Her nokta üç ölçümün ortalamasını temsil eder. Canlı hücrelerin ve toplam hücre konsantrasyonlarının (hücre/mL) yüzdesini belirlemek için bir hücre sayacı kullanıldı. Ölçümler 20 gün boyunca kaydedildi (n = 47). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Oikopleura örneklemesi için modifiye plankton ağı.
El plankton ağının (100 μm mesh) morina ucu 500 mL yıkama şişesi ile değiştirilir. Morina ucuna 70 g ağırlık eklenir. Anahtarlık yaklaşık 5 m ip takılır. Morina ucunu daha da güvenli hale getirmek için bir emniyet tasma takılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Okinawa'da O. dioica mevsimselliği.
Ishikawa limanlarında (26°25'39.3"N 127°49'56.6"E) ve Kin (26°26'40.2"N 127°55'00.3"E) 2015-2019-2019 yılları arasında mevsimsel değişikliklere göre O. dioica veA O. longicauda varlığı ve yokluğu.B 50'den fazla hayvan elle sayıldıysa her tür mevcut olarak kaydedildi. Yüzey suyunun sıcaklık ve tuzluluk ölçümleri kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: O. dioica monokültürünü başlatmak için akış şeması.
(A) Üç, 500 mL plankton örnekleri bir örnekleme alanından toplanır (B) Her numune kavanozu seyreltilir ve O. dioica plankton geri kalanından izole edilir (C) O. dioica monokültür el ile 120 Gün 3 hayvan taze filtreli deniz suyu (fSW) içeren yeni bir beaker aktarılarak başlatılır. 30 kadın, 15 erkek ve taze fSW 2.5 L içeren bir yumurtlama kabı ayarlayın. İlk sabah post-yumurtlama (Day1), dikkatle taze fSW 7.5 L içeren bir beher içine hayvanların yeni nesil ile yumurtlama beher boş. İkinci gün yumurtlama sonrası (Gün 2), 5 L taze fSW içeren bir beher içine 150 hayvan aktarın. Üçüncü gün yumurtlama sonrası (Gün 3), 5 L taze fSW içeren bir beher içine 120 hayvan aktarın. Son gün (Gün 4), yeni nesil hazırlanmasında 30 kadın, 15 erkek ve 2,5 L taze fSW içeren yeni bir yumurtlama beher kurmak. Hayvanların 23 °C'de 4 günlük yaşam döngüsü var. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Oikopleura spp. (A-D: O. dioica, E ve F: O. longicauda) tanımlaması.
(A) Yumurtalı Kadın O. dioica (B) Erkek O. dioica spermli (C) Olgunlaşmamış O. dioica'nın lateral görünümü o. dioica (D) Beyaz oklarla endike iki subkordal hücreli o. dioica'nın ventral görünümü (E) Olgun O. longicauda yumurta taşıyan ventral görünümü (ok 1) ve sperm (ok 2) (F) O. longicauda'nın lateral görünümü velum (3 ok). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Kimyasal ürünler | Tutar | Son cilt (mL) | Sterilizasyon | Stok / Açıldı |
| Çözüm A | Na2EDTA | 45 g | 1000 | Otoklav | -20 °C / 4 °C |
| NaNO3 | 100 g | ||||
| H3BO3 | 33.6 g | ||||
| NaH2PO4 | 20 g | ||||
| MnCl2·4H2O | 0,36 g | ||||
| FeCl3·6H2O | 1.3 g | ||||
| Çözelti B | 1.0 mL | ||||
| Çözelti B | ZnCl2 | 2.1 g | 1000 | Otoklav | 4 °C / 4 °C |
| CoCl2·6H2O | 2.0 g | ||||
| (NH4)6Mo7O24·4H2O | 0,9 g | ||||
| CuSO4·5H2O | 2.0 g | ||||
| *HCl | -- mL | ||||
| Vitamini | Tiamin (B1) · Hcl | 200 mg | 1000 | Otoklav | -20 °C / 4 °C |
| Biotin | 1 mg | ||||
| Kobalamin (B12) | 1 mg | ||||
| Sodyum silikat | Na2SiO3 | 5% | 1000 | 0,22 μm filtre | 4 °C / 4 °C |
| Streptomisin | C21H39N7O12 | 25 mg/mL | 50 | 0,22 μm filtre | -20 °C / -20 °C |
Tablo 1: Alg gıda bakımı için gerekli reaktifler Tarifi. B çözeltisi için listelenen tüm kimyasalları erittikten sonra, çözelti bulanıklık olmadan netleşene kadar HCl eklenir. Tüm reaktifler otoklavlama (120 °C, 25 dk) veya 0,22 m filtre ile sterilize edilir. Vitamin stokları hariç tüm reaktifler belirtilen kimyasal ilave edildikten sonra sterilize edilir. Vitamin stokları için, önce suyu otoklavlayın, sonra listelenen kimyasalı çözün. Stok ve açılan reaktifler için depolama sıcaklıkları listelenir.
| Kültür türü | Algal spp. | ASW (mL) | Vitamini | Çözüm A | Sodyum silikat | Streptomisin | Yosun (mL) / Kültür türü | Kuluçka / Mağaza | Frekans |
| Stok kültürü | Chaeto | 60 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Sadece Chaeto) |
1/1000 (Syn hariç tüm) |
0.03 / hisse senedi | 17°C / 4°C | İki haftada bir |
| ıso | 60 | 0.03 / hisse senedi | |||||||
| Gergedan | 80 | 0.06 / hisse senedi | |||||||
| Eşanlamlı | 60 | 0.03 / hisse senedi | |||||||
| Alt kültür | Chaeto | 500 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Sadece Chaeto) |
1/1000 (Syn hariç tüm) |
10 / hisse senedi | 17°C / 17°C | Hafta -lık |
| ıso | 500 | 10 / hisse senedi | |||||||
| Gergedan | 500 | 20 / hisse senedi | |||||||
| Eşanlamlı | 500 | 10 / hisse senedi | |||||||
| Çalışma kültürü | Chaeto | 400 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Sadece Chaeto) |
1/1000 (Syn hariç tüm) |
100 / alt | RM / RM | Her 4 günde bir |
| ıso | 400 | 100 / alt | |||||||
| Gergedan | 400 | 150 / alt | |||||||
| Eşanlamlı | 400 | 100 / alt |
Tablo 2: Üç alg kültür türünün bakımı için yönerge. Otoklavlı deniz suyu içeren şişelere belirtilen miktarda takviye ekleyin. Her şişeyi belirli miktarda alg kültürüyle aşılama. Yosun kültürlerini belirli sıcaklıklarda kuluçkaya yatırın ve saklayın. Önceki stok kültüründen yeni stok kültürü ve alt kültür ve önceki alt kültürden yeni çalışma kültürü aşılamak. Yeni stok kültürünü, alt kültürü ve çalışma kültürünü sırasıyla iki haftada bir, bir hafta ve dört günde bir aşılamak. Bu program, O. dioica kültürüne ait yaklaşık 10 gagaya yetecek kadar yiyecek sağlamaktadır. Yedekleme olarak her alg kültür türü 2 - 3 setleri koruyun. RM – oda sıcaklığı.
| Gün | Algal spp. | 09:00 ve 17:00 | SAAT 12:00 |
| 1 | Chaeto | — | — |
| ıso | 1000 | 2000 | |
| Eşanlamlı | 20,000 | 40,000 | |
| 2 | Chaeto | 1000 | 2000 |
| ıso | 2000 | 2000 | |
| Gergedan | 1000 | 1000 | |
| 3 | Chaeto | 3000 | 4000 |
| ıso | 3000 | 4000 | |
| Gergedan | 1500 | 1500 | |
| 4 | Chaeto | 1000 | 2000 |
| ıso | 1000 | 2000 | |
| Gergedan | 1000 | 1000 |
Tablo 3: Buket ve ark.27'dendeğiştirilen besleme başına alg konsantrasyonu. Okinawa O. dioica'nın 4 günlük yaşam döngüsü boyunca alg konsantrasyonları (mL-1hücreleri) ve günlük beslenmeiçin kullanılan alg türleri.
Ek Dosya 1: Günlük besleme grafiği. Her kültür kabı için günlük beslenme miktarları, günlük alg emici ölçümleri (OD), hayvanların büyüklüğü (Gün) ve her kültür kabındaki deniz suyu (SW vol.) hacmi girdikten sonra otomatik olarak hesaplanır. R. reticulata ve Synechococcus sp.'nin büyüme eğrileri Buket ve ark.27'denuyarlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Dosya 2: Senkron motorakrilik kürek nasıl bağlanır. Altıgen bir anahtar kullanarak raket üzerinde sıkıca vidalayın. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
O. dioica kültürünün kurulmasında esnekliği kolaylaştırmak için hayvanların doğal yaşam alanlarını anlamak önemlidir. Mevsimsel veriler, laboratuvar culturing koşullarına rehberlik etmek için kullanılabilecek fiziksel parametrelerin aralıkları hakkında bilgi sağlar. Aynı zamanda hayvan bolluğu mevsimsel dalgalanmalar anlamada yardımcı olur. Okinawa'da, O. dioica en güvenilir Haziran-Ekim arasında bulunur. Ancak, Tokyo koyunda, nüfus Şubat ve Ekim41'dezirve . O. dioica'nın kültüretür genellikle 20 °C veya daha düşük27,28,29, Okinawan O. dioica 20 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda daha iyi sağkalım gösterir; Bu durum Okinawa'daki minimum yüzey deniz suyu sıcaklığının ~20 °C(Şekil 6)olmasıyla açıklanabilir. O. dioica bolluğu da fitoplankton çiçek42 ve yırtıcı bolluk43,,44etkilenmiş olabilir. O. dioica'nın nerede toplandığına bakılmaksızın, yerel popülasyonların mevsimselliğini anlamak örnekleme ve başarı yıkma şansını en üst düzeye çıkarır.
Uygun sezon ve konum göz önüne alındığında, net örnekleme en az çaba ile Oikopleura çok sayıda toplama etkili bir yoludur. Hayvanların tüm aşamalarını toplamak için daha küçük ağ boyutuna (60-70 μm) sahip plankton ağları da kullanılabilir. Tamamen olgun hayvanlar nadiren net bulunur, belki de yaşam döngüsünün sonunda kırılganlık nedeniyle. Bu nedenle, örnekleme ile takip edilen türlerin tanımlanması subkord hücrelerinin mikroskobik gözlemi ile elde edilir. Hayvanlar laboratuvarda büyümeye devam ettikçe olgun bireyler genellikle örnekleme sonrası bir veya iki gün görünürler. Net örnekleme verimli olmasına rağmen, farklı durumlarda alternatif örnekleme yöntemleri gerekebilir. Örneğin, kentsel alanlarda yakın net örnekleme fitoplankton çok sayıda toplayabilir, zor Oikopleuraizole etmek için yapım . Bu gibi durumlarda, liman dışındaki alanlardan yüzey deniz suyu veya tekne örneklemetoplamak için basit kova örneklemesi önerilir. Sonuçlar, yağmur ardışık gün nedeniyle tuzluluk kademeli değişim O. dioicabolluğu etkilemediğini gösterdi ; ancak tropikal siklonlar gibi aşırı hava olaylarından hemen sonra kıyı örneklemesi önlenmelidir. Bu olaylar su korunaklı bir vücutta ani ve şiddetli biyojeokimyasal değişikliklere neden45,46. Yağmur suyu akıntısı kirleticiler, tortular ve bulanıklık ve düşük su kalitesini artırmak aşırı besin taşıyabilir47. Filtre besleme planktonları, Oikopleuragibi , özellikle beslenme ve sınırlı hareketlilik onların modu nedeniyle bu değişikliklere duyarlı olabilir. Böyle bir durumda, yerel koşullar normale dönene kadar örneklemenin birkaç gün ertelenmesini öneririz.
O. dioicagibi küçük, filtre beslemeli organizmaları korumak için çok aşamalı bir filtre sisteminin devreye girmesi esastır. Kötü filtrelenmiş deniz suyu (örneğin, önceki kültür sisteminde 25 μm örgü) kullanarak, kültür genellikle özellikle yaz aylarında kararsız, potansiyel fitoplankton yüksek bolluk nedeniyle. Bazı fitoplanktonlar O. dioica büyüme için yararlı olmasına rağmen, diğerleri O. dioica embriyoların anormal gelişimine neden olabilir biyotoksinler üretmek48. Buna ek olarak, Chaetoceros spp. gibi diatomların yüksek konsantrasyonda onlar ev tıkanmak ve verimli besleme önlemek uzun setae sahip olabilir gibi O. dioica büyüme için potansiyel olarakzararlıdır 49. C. calcitrans setae tarafından tıkanmış küçük hayvanların evlerini sık sık gözlemledik; bu nedenle, şimdi C. calcitrans sadece Gün 2 ve daha büyük hayvanlara beslemek (Tablo 3).
Burada bir sorun olmamasına rağmen, O. dioica küçük ölçekli uzun vadeli culturing genetik bir darboğaz nedeniyle nüfus boyutunda ani düşüşler yaşayabilir; bu gibi durumlarda, Martí-Solans ve ark.29 kültüre her 20 nesilde bir yeni vahşi bireyler eklemeyi önerir.
Oikopleura kültür sistemi esnektir. Bir hafta içinde istikrarlı bir kültür kurulabilir. O. dioica uzun vadeli culturing olmayan uzman ekipman ile mütevazı bir bütçe ile mümkündür. Oikopleura 5-10 beaers bakımı için gerekli günlük çaba genellikle 2 kişi ile 2 saatten azdır. O. dioica da doğal deniz suyuna erişimi olmayanlar için yararlı yapay deniz suyu,28muhafaza edilebilir. Alg gıdauzun uzun süreli depolanması katı kültür ve kriyopreservation29kullanılarak mümkündür. Ayrıca, O. dioica sperm kriyoopreserved olabilir, ve bir yıldan fazla canlı kalır50. Tüm bu faktörler kültürlerin kolayca yeniden kurulabileceği anlamına gelir. Son olarak, Pleurobrachia spkazara culturing ile geçmiş deneyim . Oikopleura için geliştirilen kültür sisteminin potansiyel olarak daha geniş bir kırılgan pelajik organizma topluluğuna genişletilebileceği düşündürebilir.
O. dioica çeşitli biyolojik alanlarda güçlü anlayışlar sağlamaya devam etmektedir. Yerel mevsimsellik anlayışı, titiz bir kültür sistemi ve birkaç adanmış bireyler, az çabayla etkili bir kültürün kurulmasına olanak sağlar. Oikopleura kültür sistemi, ekoloji, geliştirme, genomik ve bu eşsiz deniz kordatevrimi ile ilgili çok çeşitli biyolojik alanları araştırmak için temel kaynaklar sağlar.
Disclosures
Yazarın beyan edecek bir şeyi yok.
Acknowledgments
Garth Ilsley'e kültür sisteminin kurulmasına verdiği destek ten dolayı minnettarız. Ritsuko Suyama ve Sylvain Guillot'un erken örnekleme ve türlerin tanımlanması çabalarına katkılarını kabul ediyoruz. Özel teşekkür Hiroki Nishida, Takeshi Onuma ve Tatsuya Omotezako onların cömert destek ve rehberlik boyunca, yerel kültür sisteminin ilk kurulması ve hayvan ve mikroalgal kültürünün paylaşımı da dahil olmak üzere kaynaklanmaktadır. Ayrıca Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro ve Alfonso Ferrández-Roldán'a örnekleme ve kültür çıkarma konusundaki uzmanlıklarını paylaştıkları için teşekkür ederiz. Jai Denton, Charles Plessy ve Jeffrey Jolly el yazması hakkında paha biçilmez geribildirim sağladı. Charlotte West alg hesaplaması için genelleştirilmiş bir denklem formüle etti. Son olarak, finansman için OIST teşekkür, Mary Collins ve Güvenli örnekleme prosedürleri tavsiye için OIST Fieldwork Güvenlik Komitesi, kültür ve örnekleme ekipmanları inşaatı için OIST makine mağazası personeli ve deniz suyu teslim için Koichi Toda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
| Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
| Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
| Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
| Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
| Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
| Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
| Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
| Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
| TCW-5N-PPS | |||
| TCW-1N-PPS | |||
| Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
| Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
| Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
| Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
| Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
| UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
| Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |
References
- Travis, J. Is It What We Know or Who We Know? Choice of Organism and Robustness of Inference in Ecology and Evolutionary Biology (American Society of Naturalists Presidential Address). The American Naturalist. 167 (3), 303-314 (2006).
- Jenner, R. A., Wills, M. A. The choice of model organisms in evo-devo. Nature Reviews Genetics. 8 (4), 311-314 (2007).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wilson, S., Ruhl, H., Smith, J. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Steinberg, D. K., Lomas, M. W., Cope, J. S. Long-term increase in mesozooplankton biomass in the Sargasso Sea: Linkage to climate and implications for food web dynamics and biogeochemical cycling. Global Biogeochemical Cycles. 26 (1), 1004 (2012).
- Lombard, F., Kiørboe, T. Marine snow originating from appendicularian houses: Age-dependent settling characteristics. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. 57 (10), 1304-1313 (2010).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 251-264 (1998).
- Hopcroft, R. R. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 45-57 (2005).
- Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e59832 (2019).
- Deibel, D. Feeding mechanism and house of the appendicularian Oikopleura vanhoeffeni. Marine Biology. 93 (3), 429-436 (1986).
- Spada, F., et al. Molecular patterning of the oikoplastic epithelium of the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 20624-20632 (2001).
- Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , Contemporaty Publishing International. 59-85 (2005).
- Tokioka, T. Studies on the distribution of appendicularians and some thaliaceans of the North Pacific, with some morphological notes. Publication of the Seto Marine Biological Laboratory. (8), 351-443 (1960).
- Alldredge, A. L. Discarded appendicularian houses as sources of food, surface habitats, and particulate organic matter in planktonic environments. Limnology and Oceanography. 21 (1), 14-24 (1976).
- Clarke, C., Roff, J. C. Abundance and biomass of herbivorous zooplankton off Kingston, Jamaica, with estimates of their annual production. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 31 (4), 423-437 (1990).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Zooplankton growth rates: extraordinary production by the larvacean Oikopleura dioica in tropical waters. Journal of Plankton Research. 17 (2), 205-220 (1995).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Production of tropical larvaceans in Kingston Harbour, Jamaica: are we ignoring an important secondary producer. Journal of Plankton Research. 20 (3), 557-569 (1998).
- Mochioka, N., Iwamizu, M. Diet of anguilloid larvae: leptocephali feed selectively on larvacean houses and fecal pellets. Marine Biology. 125 (3), 447-452 (1996).
- Sakaguchi, S. O., et al. Morphological identity of a taxonomically unassigned cytochrome c oxidase subunit i sequence from stomach contents of juvenile chum salmon determined using polymerase chain reaction. Fisheries Science. 83 (5), 757-765 (2017).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 25-34 (1998).
- Sato, R., Tanaka, Y., Ishimaru, T. House production by Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) under laboratory conditions. Journal of Plankton Research. 23 (4), 415-423 (2001).
- Flood, R., Deibel, D. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 105-124 (1998).
- Alldredge, A. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 309-326 (2005).
- Katija, K., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. New technology reveals the role of giant larvaceans in oceanic carbon cycling. Science Advances. 3 (5), 1602374 (2017).
- Katija, K., Choy, C. A., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. From the surface to the seafloor: How giant larvaceans transport microplastics into the deep sea. Science Advances. 3 (8), 1700715 (2017).
- Hidaka, K. Species composition and horizontal distribution of the appendicularian community in waters adjacent to the Kuroshio in winter-early spring. Plankton and Benthos Research. 3 (3), 152-164 (2008).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359-370 (2009).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: culture, genome, and cell lineages. Development, Growth & Differentiation. 50, 239-256 (2008).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica culturing made easy: A Low-Cost facility for an emerging animal model in Evo Devo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), 146-152 (2016).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Seo, H. C., et al. Miniature genome in the marine chordate Oikopleura dioica. Science. 294 (5551), 2506 (2001).
- Fredriksson, G., Olsson, R. The subchordal cells of Oikopleura dioica and O. albicans (Appendicularia, Chordata). Acta Zoologica. 72 (4), 251-256 (1991).
- Paffenhöfer, G. A. The cultivation of an appendicularian through numerous generations. Marine Biology. 22 (2), 183-185 (1973).
- Fenaux, R., Gorsky, G. Nouvelle technique d'élevage des appendiculaires. Rapports et Procés-Verbaux des Réunions-Commission Internationale pour l'Exploration Scientifique de la Mer Méditerranée. 29, 291-292 (1985).
- Fujii, S., Nishio, T., Nishida, H. Cleavage pattern, gastrulation, and neurulation in the appendicularian, Oikopleura dioica. Development Genes and Evolution. 218 (2), 69-79 (2008).
- Patry, W. L., Bubel, M., Hansen, C., Knowles, T. Diffusion tubes: a method for the mass culture of ctenophores and other pelagic marine invertebrates. PeerJ. 8, 8938 (2020).
- Fenaux, R. The classification of Appendicularia (Tunicata): history and current state. Memoires de I'Institut oceanographique. , (1993).
- Shiga, N. Illustrated Guide to Marine Plankton in Japan. Chihara, M., Murano, M. , Tokai University Press. 1393-1414 (1997).
- Gorsky, G., Castellani, C. Marine Plankton: A practical guide to ecology, methodology, and taxonomy. Castellani, C., Edwards, M. , Oxford University Press. 599-606 (2017).
- Sato, R., Ishibashi, Y., Tanaka, Y., Ishimaru, T., Dagg, M. J. Productivity and grazing impact of Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) in Tokyo Bay. Journal of Plankton Research. 30 (3), 299-309 (2008).
- Nakamura, Y., Suzuki, K., Suzuki, S. Y., Hiromi, J. Production of Oikopleura dioica (Appendicularia) following a picoplankton 'bloom'in a eutrophic coastal area. Journal of Plankton Research. 19 (1), 113-124 (1997).
- Nakamura, Y. Blooms of tunicates Oikopleura spp. and Dolioletta gegenbauri in the Seto Inland Sea, Japan, during summer. Hydrobiologia. 385 (1-3), 183-192 (1998).
- Uye, S. I., Ichino, S. Seasonal variations in abundance, size composition, biomass and production rate of Oikopleura dioica (Fol)(Tunicata: Appendicularia) in a temperate eutrophic inlet. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 189 (1-2), 1-11 (1995).
- Tsuchiya, K., et al. Phytoplankton community response and succession in relation to typhoon passages in the coastal waters of Japan. Journal of Plankton Research. 36 (2), 424-438 (2014).
- Lopez-Lopez, L., et al. Effects of typhoons on gelatinous carnivore zooplankton off Northern Taiwan. Cahiers de Biologie Marine. 53, 349-355 (2012).
- Ares, Á, et al. Extreme storm-induced run-off causes rapid, context-dependent shifts in nearshore subtropical bacterial communities. bioRxiv. , (2019).
- Torres-Águila, N. P., et al. Diatom bloom-derived biotoxins cause aberrant development and gene expression in the appendicularian chordate Oikopleura dioica. Communications Biology. 1 (1), 1-11 (2018).
- Troedsson, C., Frischer, M. E., Nejstgaard, J. C., Thompson, E. M. Molecular quantification of differential ingestion and particle trapping rates by the appendicularian Oikopleura dioica as a function of prey size and shape. Limnology and Oceanography. 52 (1), 416-427 (2007).
- Ouchi, K., Nishino, A., Nishida, H. Simple procedure for sperm cryopreservation in the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Zoological Science. 28 (1), 8-11 (2011).
