Summary
오이코플레우라 디오이카는 다양한 생물학 분야의 투니케이트 모델 유기체입니다. 동물 및 조류 사료에 대한 샘플링 방법, 종 식별, 배양 설정 및 배양 프로토콜을 설명합니다. 우리는 문화 시스템을 강화하고 가능한 문제와 해결에 대해 논의하는 데 도움이 되는 주요 요소를 강조합니다.
Abstract
Oikopleura 디오이카는 뛰어난 필터 공급 능력, 빠른 생성 시간, 보존 된 초기 개발 및 컴팩트 한 게놈을 갖춘 판자 코드입니다. 이러한 이유로, 그것은 해양 생태 학 연구, 진화 발달 생물학 및 유전체학에 대 한 유용한 모델 유기체로 간주 됩니다. 연구는 종종 동물 자원의 꾸준한 공급을 필요로하기 때문에, 신뢰할 수있는, 낮은 유지 보수 문화 시스템을 설정하는 것이 유용합니다. 여기서는 O. dioica 문화를 수립하기 위한 단계별 방법을 설명합니다. 잠재적인 샘플링 사이트, 수집 방법, 대상 동물 식별 및 배양 시스템의 설정을 선택하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 우리 자신의 경험을 기반으로 문제 해결 조언을 제공합니다. 또한 강력한 문화 시스템을 유지하는 데 도움이 되는 중요한 요소를 강조합니다. 여기에 제공되는 문화 프로토콜은 O. dioica에최적화되어 있지만, 우리는 우리의 샘플링 기술과 문화 설정이 다른 깨지기 쉬운 pelagic 무척추 동물을 유지하기위한 새로운 아이디어를 고무 할 수 있기를 바랍니다.
Introduction
모형 유기체는 발달, 유전학 및 생리학에 관련되었던 그 포함하여 많은 생물학 질문을 해결에 있는 중요한 역할을 했습니다. 또한, 추가 모델 유기체는 새로운 발견을 용이하게하고 따라서 자연1,,2의더 큰 이해를 달성하는 것이 중요합니다. 해양 동물 플랑크톤은,해양,생태계3,4,5,56에서중요한 역할을하는 다양한 생물 그룹입니다. 그들의 풍부하고 생태학적 중요성에도 불구하고, 플랑크토닉 성구와 같은 젤라틴 유기체는 그들의 투명성과 취약성이 필드 수집 및 식별 도전을 도전하기 때문에 플랑크톤 생물 다양성 연구에서 종종 과소 대표된다7,,8. 적응된 샘플링 기술과 실험실 배양은 발단성 우두골9,,10,,11,,12의생물학에 대한 지식을 발전시킨 시험관 내 동물의 면밀한 관찰을 가능하게 한다.
Larvaceans (부속) 약 70 개의 설명 된종으로구성된 무료 수영 해양 투운의 클래스입니다8,13. 그들은 동물 플랑크톤 지역 사회 내에서 가장 풍부한 그룹 중 하나이기 때문에14,,15,,16,,17,애벌레는 물고기 애벌레 와 같은 더 큰 플랑크토닉 생물에 대한 주요 식품 소스를 나타냅니다18,,19. ascidians와는 달리- 세실 tunicates-larvaceans는 올챙이 같은 형태를 유지하고 그들의 생활 내내 플랑크토닉 남아20. 각 동물은 집으로 알려진 자체 내장, 복잡한 필터 공급 구조 안에 살고있다. 그들은 그들의 꼬리의 기복 운동을 통해 수류를 만들어 자신의 집에 미립자를 축적(21). 막힌 집은 하루 종일 버려지며, 그 중 일부는 탄소 응재를 형성하고 결국 해저22로가라 앉습니다. 따라서, larvaceans는 글로벌 탄소 플럭스23에서중요한 역할을한다. 대부분의 종은 물 기둥13의상부 100m 내의 펠라기 구역에 사는 것으로 보고된다. 그러나 거대한 라바천 바토코르데우스는 300m24의깊이에 서식하는 것으로 알려져 있다. 캘리포니아 몬테레이 베이의 바토코르데우스(Bathochordaeus)에 대한 연구에 따르면 동물들은 미세 플라스틱의 생물학적 벡터역할을 하며, 이는해양에서미세 플라스틱의 수직 수송 및 분포에서 부속자의 역할을 이해하는 데 잠재적중요성을 시사한다.
라바천종인 오이코플레우라 디오이카는최근 몇 가지 놀라운 특성으로 인해 모델 유기체로서 주목받고 있다. 그것은 일반적으로 세계의 바다에 걸쳐 보고된다. 특히 해안해26에풍부하여 해안에서 쉽게 샘플링할 수 있습니다. 천연 및 인공 해수(27,,28,,29)를모두 통해 장기적이고 안정적인 배양이 가능하다.28 온도 종속 생성 시간은 실험실 조건에서 4-9일만큼 짧습니다. 일년 내내 달걀을 생산할 수 있는 각 여성과 높은 fecundity를 가지고 있습니다. 투니케이트로서, 그것은 화음 진화(30)31을이해하기위한 중요한 필로 유전학 위치를 차지한다., 70 Mb에서 O. dioica는 모든 chordates32사이에서 가장 작은 식별 된 게놈을 갖는다. 애벌레 중, O. 디오이카는 지금까지33까지유일하게 설명된 비 헤르마포디악 종이다.
실험실에서 재배된 미세조류를 사용한 최초의 성공적인 O. 디오이카 문화는 Paffenhöfer34에의해 보고되었다. 동기 모터와 패들을 사용한 최초의 배양 프로토콜은 Fenaux와 Gorsky35에 의해 개발되었으며 나중에 여러 실험실에서 채택되었습니다. 최근에는 후지이외(36)가 인공 해수에서 O. dioica 배양, 강력한 배양 시스템 및 현장 수집을 보고했으며,27일 부케 등에서 설명하고 단순화되고 저렴한 시스템을 위한 최적화된 프로토콜을 마티 솔란스 외29에보고했다. 전통적인 오이코플레우라 문화 시스템 외에도 이중 튜브 사육 탱크가 있는 새로 보고된 디자인도 오이코플레라 스프를 문화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 37.
우리는 해양 분자 생물학을위한 사스 국제 센터에서 주요 Oikopleura 연구 그룹에 의해 개발 된 프로토콜의 조합을 기반으로 O. dioica 단문화를 시작하기위한 자세한 프로토콜을 제시27,바르셀로나 대학29,오사카 대학28,우리 자신의 관찰. 이전에 발표된 문화 프로토콜에서는 조류 매체의 구성, 해안 샘플링 기술 및 Oikopleura 식별에 관한 자세한 정보는 대략적인 설명에 불과하여 많은 모호성을 남겼습니다. 여기에서는 비디오 프로토콜의 시각적 정보를 지원하여 O. dioica 문화를 처음부터 간단하고 단계별로 설정하는 데 필요한 모든 중요한 정보를 수집했습니다. 우리는 O. dioica를 가장 어려운 단계 중 하나인 다른 일반적으로 보고된 종인 O. longicauda와구별하는 방법을 설명합니다. 기존 문화 시스템은 전 세계적으로 O. dioica의 재배에 적용 할 수 있지만, 우리는 지역 환경 조건에 따라 프로토콜 조정의 중요성을 강조한다. 제시된 정보는 널리 게시된 데이터와 경험을 통해 얻은 지식을 결합합니다. 현재 프로토콜은 처음부터 문화를 확립하는 데 관심이있는 연구자에게 이상적입니다.
Protocol
1. O. 디오이카 문화 시설
- 물 필터 시스템(그림 1)
- 2-3m 깊이의 항구에서 천연 해수를 수집합니다. 모래 필터(모공 크기 1.4mm)를 통해 바닷물을 통과하고 실험실의 공유 저수지 탱크로 운반합니다. 공유 저수지 탱크의 수질을 유지하기 위해 캐니스터 필터를 사용하여 물을 순환시하십시오.
- 배양실에서는 자기 구동 펌프가 있는 100L 저수지 탱크, 5 μm 및 1 μm 및 1 μm 폴리프로필렌 상처 카트리지 필터 및 UV 멸균기(도1)로구성된 다단계 필터 시스템을 설치합니다.
- 공유 저수지 탱크에서 문화실 저수지 탱크로 바닷물을 옮기. 배양실 저수지 탱크에 들어가기 전에 25 μm 필터유닛(그림 1A,B)을통해 바닷물을 통과합니다. 바닷물을 통해 5 및 1 μm 필터를 밤새 순환하여 동물의 발달을 방해할 수 있는 입자를 철저히 제거합니다.
참고: 메시 크기가 25-50 μm이 큰 추가 필터는 더 작은 메시 크기로 카트리지 필터를 막히는 것을 방지하는 데 유용합니다. 여과된 해수(fSW)는 다음 날 아침에 사용할 준비가 되어 있습니다.
-
오이코플레라 배양유닛(그림 2)
- 5 또는 10 L 원형, 투명 플라스틱 비커로 동물을 유지합니다.
- 5mm 두께의 투명한 아크릴 표면 보드를 갖춘 2층 스테인리스 스틸 선반 장치(L x W x H = 150cm x 45cm x 90cm)에 배양 비커를 배치합니다.
- 아크릴 표면 아래에 흰색 형광 등을 배치하여 비커 바닥에서 동물을 비춥시로 비추습니다.
- 비커 뒤에 검은 색 플라스틱 시트를 놓습니다. 검은 색 시트는 대비를 만들고 투명한 동물의 시각화를 향상시킵니다.
- 동기 전기 모터를 아크릴 패들(L x H = 8cm x 27cm)에 연결합니다(보충파일 2). 선반 유닛의 길이를 따라 달리는 평행 레일에서 배양 비커의 패들을 일시 중단합니다(그림2A).
- 모터를 켜서 15 RPM에서 비커에서 부드러운 원형 동작을 생성합니다.
참고 : 셀룰로오스 주택의 동물은 중립적으로 부력; 그러나, 물 순환은 계란, 애벌레, 조류 음식을 중단하고 문화 비커에 고르게 분배하는 데 도움이됩니다.
- 자동 도징 펌프(선택 사항)
참고: 자동 급식 장치는 특히 주말에 인력 요구 사항을 줄입니다.- 제조업체의 지시에 따라 자동 도징 펌프에서 디스펜싱 액체의 양을 보정합니다.
- 50mL 튜브를 조류 저수지로 사용하십시오.
- 50mL 튜브의 캡에 5mm 구멍 두 개를 드릴하여 항공사 튜브를 통과합니다. 하나의 튜브를 표준 수족관 공기 펌프에 연결하여 기포를 소개하고 다른 튜브를 투약펌프(도 2B)의입구 포트에 연결합니다.
참고: 얇은 기포 스트림을 도입하면 조류가 튜브 바닥에 침전되는 것을 방지할 수 있습니다. - 지정된 날에 분배할 조류 사료의 시간과 양을 프로그래밍합니다.
- 조류 역
- 선반 유닛(L x W x H = 90cm x 46cm x 115cm)을 사용하여 조류 작업 배양권이 포함된 4L 원형 바닥 플라스크를 배치합니다(2.1단계 참조).
- 플라스크 뒤에 형광등을 배치하여 작업 문화를 다시 조명합니다.
- 2홀 고무 스토퍼로 플라스크를 밀봉합니다.
- 고무 스토퍼를 통해 1mL 일회용 파이펫을 전달합니다. 항공사 튜빙을 사용하여 파이펫을 수족관 공기 펌프에 연결합니다. 플라스크에 기포스트림을 소개합니다.
2. 미세 갈식품
- 조류 문화 를 시들게
참고: 세 가지 미세항종, 채토세로스 칼시트랜스, 이소크리시스 스프., 코뿔소 망상,시아노박테리아 1종, 시에코코쿠스 스프에 대한 세 가지 문화(스톡, 서브, 작업 문화)를 유지한다. 스톡 및 하위 배양은 백업으로 사용됩니다. 작업 문화는 매일 먹이주기에 사용됩니다.- 미세 조류 및 시아노박테리아의 재배에 필요한 시약을 준비합니다(표1).
- 스톡 컬쳐를 개시하기 위해, 오토클레이브 (121 °C, 25 분) 60 – 100 mL Erlenmeyer 플라스크에서 fSW의 80 mL. 수정된 콘웨이배지(27)와 미세조류(표2)의정량은 부적시 접종한다. 예를 들어, C. calcitrans, autoclave 60 mL의 주식 배양을 접종하기 위해, 해수의 자동 클래브 60 mL, 무균 접종 30 μL 각각의 비타민과 용액 A, 15 μL 의 염좌 나트륨, 60 μL 의 연쇄상 구균, 및 C. calcitran의 30 μL 이전 주식 배양에서.
참고: R. 레티쿨라타는 너무 많은 빛에 노출되면 붉은 분홍색에서 오랑시 브라운으로 바뀝니다. 맑은 분홍색에서 밝은 분홍색으로 바뀌기 시작하면 빛에서 멀어지게 하십시오. - 연속 조명으로 17°C로 설정된 인큐베이터에서 스톡 컬쳐를 유지합니다. 약 10일 후, 배양은 조류 성장을 나타내기 위해 색을 바꾼다(그림3). 색상이 나타나면 최대 1개월 동안 장기 보관을 위해 4°C로 이동합니다.
- 깨끗한 벤치에, 무균 주식 문화에서 하위 문화를 접종(표 2). 연속 조명17 °C에서 인큐베이션. 조류 색이 나타나면 최대 2 주까지 인큐베이터에 보관하십시오.
- 하위 문화에서 작업 문화를 접종(표 2). 고무 캡으로 플라스크를 밀봉하고 1mL 일회용 파이펫을 삽입합니다. 플라스크를 조류 역으로 옮기고 8h 의 사진으로 실온에서 유지합니다. 일정한 폭기와 공급. 4일마다 근무 문화를 갱신합니다.
- 소용돌이에 의해 하루에 두 번 스톡과 하위 문화를 저어.
참고: 고체 매체및 냉동 보존에 대한 조류 문화의 장기 저장은 각각29개월,최대 3개월 및 1년까지 가능합니다.
- 조류 성장 곡선 만들기(선택 사항)
참고 : 공급 량의 정확한 평가는 O. 디오이카의안정적인 문화를 유지하기 위해 중요하다. 우리는 두 가지 주요 조류 식품 종, 채토세로스 calcitrans및 이소크리시스 스프에 대한 성장 곡선을 만들었습니다.- C. calcitrans 및 이소그리시스 sp. 작업 문화(표 2)를준비합니다.
- 작업 문화의 각 종에 대해, 세 번 샘플을 세 번 샘플링하고 분광계를 사용하여 660 nm에서 흡수성을 측정합니다. 각 작업 문화에서 삼중기의 평균 측정을 수행하십시오.
- 자동화된 셀 카운터에 대한 제조업체의 지침에 따라 계수시를 준비합니다. 각 샘플을 세 번 계산합니다. 각 샘플에 존재하는 세포의 총 수를 결정하기 위해 세 카운트의 평균을 가져 가라.
- 약 50개의 평균 측정이 기록될 때까지 매일 계속 계산합니다.
- 두 조류 종(그림 4)에대한 성장 곡선을 만듭니다.
3. 야생 오이코플레라 스프의 필드 컬렉션.
- 수정 된 플랑크톤 그물(그림 5)
참고: Oikopleura spp의 성공적인 샘플링의 열쇠는 가중치가 부여된 비 필터링 대구 끝이 있는 플랑크톤 그물의 느린 견인입니다. 도 5는 수정된 플랑크톤 그물의 회로도를 나타낸다.- 핸드 헬드 플랑크톤 그물의 대구 끝을 개조 된 500 mL 나사 탑 워시 병으로 교체하십시오.
- 물과 동물이 대구 끝에 들어갈 수 있도록 세척 병의 직경 4cm 직경 나사 상단에 3cm 직경 구멍을 드릴.
- 플랑크톤 그물 끝에 병 뚜껑을 맞춥시다. 전기 테이프로 단단히 감쌉니다. 스테인리스 스틸 호스 클램프로 캡을 더욱 확보하십시오.
- 수정된 대구 끝의 외부에 70g의 무게를 지퍼 넥타이로 부착합니다.
- 안전 끈을 부착하여 대구 끝을 더욱 보호합니다.
- 수집 사이트 선택(그림 6)
참고: 모든 샘플 수집은 OIST 현장 작업 안전 위원회의 승인을 받았습니다. 위치에 따라 Oikopleura spp의 존재에 계절적 변화가있을 수 있습니다(그림 6). 심한 폭풍우와 같은 극단적 인 기상 사건 직후 샘플링을 피하십시오.- 지도 웹 사이트의 위성 보기를 사용하여 잠재적인 샘플링 사이트를 식별합니다. 일본 오키나와 킨베이의 이시카와 항구(GPS: 26°25'39.3"N 127°49'56.6"E)의 이시카와 항구는 자동차로 쉽게 접근할 수 있는 항구와 낚시 부두에 집중했습니다.
- 잠재적인 샘플링 위치를 방문하여 각 사이트의 해안 접근성 과 안전을 평가합니다. 필요에 따라 지방 당국으로부터 수집 허가를 받으세요.
- 샘플링 절차
- 플랑크톤 그물을 바다에 던져 대구 끝이 수면 아래 1-2m 아래로 가라앉을 수 있도록 합니다.
- 50-100cm s-1에서손으로 그물을 수평으로 견인합니다. 2-5 분 동안 앞뒤로 걸어 서 계속 견인. 항구에 있는 식물플랑크톤의 풍부에 따라 견인 시간을 조정하고, 더 많은 식물성 플랑크톤이 있을 때 더 짧은 견인을 합니다.
참고: 라르바케안은 연약한 동물입니다. 그물의 빠른 견인 또는 반복 된 주조는 대구 끝에 갇혀 동물을 손상시킬 수 있습니다. - 부드럽게 그물을 들어 올립니다. 대구 끝의 내용물들을 500mL 원형 유리병으로 천천히 옮기는다. 기포를 피하기 위해 샘플 병을 바닷물로 완전히 채웁니다.
참고 : Oikopleura spp의 존재는 검은 배경에 대한 샘플 병을 보고 확인할 수 있습니다. 대부분의 동물은 수집되는 동안 자신의 집을 포기. 따라서 종 수준의 식별을 위해서는 현미경 관찰이 필요합니다. - 3개의 500mL 병이 수집될 때까지 샘플링을 반복합니다.
- CTD 프로파일러를 사용하여 염도, 온도 및 엽록소를 측정하여 동물이 자연적으로 존재하는 물리적 매개 변수의 범위를 기록합니다.
- 실험실 환경에서 동물을 적응시키기 위해 양동이에 10-15 L의 표면 해수를 수집합니다.
4. 동물 고립 및 식별(그림 7, 그림 8)
-
오이코플레라 spp. 식별
참고: 오이코플레우라 spp.를 닮은 다른 플랑크토닉 유기체는 채토냐스, 프리틸라리아 스PP. 선충, 노른자 주머니를 곁들인 생선 애벌레, 시오나 스프 애벌레를 포함합니다.- 동물을 실험실 조건에 적응시키기 위해 각 500mL 샘플을 샘플링 위치에서 1:1 의 표면 해수를 포함하는 10 L 비커로 전송하고 실험실에서 유지되는 여과된 해수(fSW)를실험실(그림 7A,B)한다. 플랑크톤 샘플의 농도에 따라 비커의 부피를 5-10 L로 조정합니다.
참고: 플랑크톤 샘플에 원치 않는 이물질이 포함되어 있는 경우 10L 비커로 전송하기 전에 거친 필터(메시 크기 ~600 μm)를 통과하십시오. - 동기 전기 모터 (15 RPM)에 부착 된 패들을 사용하고 플랑크톤을 하룻밤 동안 서스펜션 (1.2.5 단계)에 보관하십시오.
- 구형, 반투명 주택 안에 꼬리를 기복 1-2mm 길이, 올챙이 모양의 동물을 찾아 오이코플레라 spp. 일부 동물은 집없이 일시적으로 무료 수영 할 수 있습니다. 무딘 말투 파이펫을 사용하여 - 5 마리의 동물을 빈 페트리 접시에 부드럽게 옮기십시오.
- 속 식별을 위해, 부드럽게 전송 파이펫으로 집을 찌르고 자신의 집에서 동물을 퇴거.
- 20-40x 암암장 현미경으로 가옥없는 동물을 관찰하고 Oikopleura spp(그림 8)를확인합니다.
- 동물을 실험실 조건에 적응시키기 위해 각 500mL 샘플을 샘플링 위치에서 1:1 의 표면 해수를 포함하는 10 L 비커로 전송하고 실험실에서 유지되는 여과된 해수(fSW)를실험실(그림 7A,B)한다. 플랑크톤 샘플의 농도에 따라 비커의 부피를 5-10 L로 조정합니다.
-
O. 디오이카 식별
참고 : O. dioica는 완전히 성숙한 남성과 여성 또는 꼬리의 단면 절반에 위치한 두 개의 큰 하위 코드 세포의 존재에 의해 시각적으로 식별 될수있다. 두 개의 하위 코드 세포 사이의 거리는 개인마다 다를 수 있습니다.- 다음으로,계란(도 8A)또는 정자(도8B)로채워진 고나드가 있는 완전히 성숙한 오이코플레라가 있는지 확인합니다. 동물이 계란이나 정자만 소유하는 경우, O. 디오이카인것처럼 4.2.3 단계로 건너 뛰면 유일하게 설명된 비 헤르마포디악 종입니다.
- 동물이 미숙한경우(도 8C)는꼬리 끝에 있는 두 개의 아코드 세포를 찾습니다(도8D).
- 종이 확인되면, 새로운 페트리 접시로 전송합니다. 반복 단계 4.1.3-4.2.2 때까지 10-20 개인종 수준에서 확인.
참고: 쉽게 식별할 수 있도록 fSW의 0.015% 트리카인 메탄술포네이트(MS222)가 함유된 페트리 접시에 동물을 마취합니다. - O. dioica가 발견되지 않으면 비커를 하루 이틀 동안 일시 중단하십시오. 계속 성장하고 감지하기 쉬워질 미숙한 O. 디오이카가 있을 수 있습니다. 1주일 후에 나타나지 않으면 샘플을 버리고 다시 샘플링해 봅보십시오.
5. O. 디오이카에 대한 재배 프로토콜
- 수집된 현장에서 O. 디오이카 단문화를 시공(도7)
참고: 조류 음식은 작업 문화에서 매일 준비되며 각 단일 문화 비커는 하루에 세 번 오전 9시, 12 PM 및 오후 5시에 공급됩니다 (5 단계 참조). 동물은 23°C에서 유지됩니다. 이러한 조건하에서 오키나와 O. 디오이카 수명 주기는 4일(그림7C)입니다.- O. dioica의단일 문화를 시작하려면 120 마리의 동물을 분리하고 신선한 fSW(그림 7B, C)가들어있는 새로운 비커로 이송합니다.
- 다음 날 아침, 황금 구체로 나타나는 계란을 가진 노란 조나드와 암컷을 가진 완전히 성숙한 남성을 찾습니다(그림 8A, B).
- 5mL 무딘 말단 파이펫으로 2.5L의 신선한 fSW가 들어있는 새로운 비커로 15명의 남성과 30명의 암컷을 부드럽게 이송하여 산란 비커를 만드세요.
참고 : 남성과 여성이 충분하지 않은 경우, fSW의 1 L을 포함하는 비커에 가능한 한 많은 성인을 전송하고 자연스럽게 산란할 수 있습니다. 수동 전송 중에 동물에게 물리적 인 스트레스를 최소화하기 위해 천천히 siphoned하고 수면 아래에 방출해야합니다. - 동물이 다음 세대를 시작하기 위해 자연스럽게 생성하자. 꼬리 애벌레는 수정 후 약 3 시간 나타나야합니다.
참고 : 산란은 완전히 성숙한 동물이 집을 버리고 표면 물을 향해 수영하고 게임 테를 방출함으로써 수행됩니다. 성공적인 수정은 산란 비커의 바닥에서 5-10 mL의 바닷물을 추출하고 현미경으로 분열로 계란을 식별함으로써 확인할 수 있습니다. - 첫 번째 아침 산란 후 (1 일) 팽창 된 집을 가진 동물의 새로운 세대가 비커에 나타납니다. 500mL 핸드헬드 비커를 사용하여 산란 비커의 내용을 7.5L의 신선한 fSW가 들어있는 새로운 비커로 부드럽게 전달합니다(총 10L 만들기). 튀는 움직임을 피하기 위해 비스듬히 붓습니다.
- 둘째 날 아침(2일차)에는 150마리의 동물을 5L의 신선한 fSW가 들어있는 새로운 비커로 수동으로 옮기습니다.
- 셋째 날(3일차)에는 120마리의 동물을 5L의 신선한 fSW로 새 비커로 수동으로 옮기.
참고: 동물의 발달을 동기화하기 위해서는 2일과 3일에 수동 전송 중에 비슷한 크기의 개인을 선택하는 것이 중요합니다. 최대 10마리의 동물을 단일 이송으로 시폰할 수 있습니다. - 4일 아침(4일차)에는 완전히 성숙한 동물이 등장해야 합니다. 5.1.3 단계를 반복하여 수명 주기를 닫습니다.
참고: 자동화된 급유 펌프는 주말에 오후 5시에 동물에게 먹이를 주기 위해 직원이 없는 채 로 설정할 수 있습니다.
- 작업 문화에서 조류 식품의 매일 준비
- 660 nm에서 작업 문화의 흡수를 측정합니다.
- 일일 먹이 차트에 기초하여, 특정 크기의 동물에 대해 공급해야 할 조류 세포수를 알아보십시오(표 3).
- 조류 성장 곡선(도4)을사용하여, 주어진 날에 필요한 조류 식품(mL)의 양을 계산하기 위해 아래 방정식을 해결한다.
- 특정 일 및 먹이 시간에 필요한 특정 조류의 양을 계산하려면 다음 방정식을 사용합니다.
여기서 YA는 주어진 날에 조류 농도이고 A는 먹이 주기 당 필요한 조류의 양입니다. 더욱이, YA와 x사이의 선형 관계,가로채기(c)및경사(m)에대한 값은 도 4에도시된다. K 값에 대한 표 3을 참조하십시오. - 예를 들어, 5L 배양에서 유지된 3일차 동물의 오전 9시에 필요한 이소크리시스 스프의 부피를 계산하고, 조류 흡수율이 0.234(660nm로 측정됨)를 계산했다.
참고: 이러한 방정식을 스프레드시트에 저장하여 매일 수유량이 흡수도 측정, 동물의 크기 및 배양 해수의양(보충 파일 1)에따라 자동으로 계산되도록 합니다.
- 특정 일 및 먹이 시간에 필요한 특정 조류의 양을 계산하려면 다음 방정식을 사용합니다.
- 50mL 튜브로 조류의 계산된 부피를 전송하고, 원심분리기는 5000 x g에서 50°C에서 5분 동안 전송한다.
- 상부체를 제거합니다. 오래된 조류 미디어를 대체, 신선한 fSW로 원래 볼륨까지 튜브를 다시 채웁니다.
- 준비된 음식을 다음 사료에 사용할 때까지 냉장고에 보관하십시오. 다음 날 아침 새로운 음식이 준비된 후 오래된 조류 음식을 버리십시오.
- 활성탄(선택 사항)
참고: 각 배양비커에 활성탄 10g이 첨가되어 수질을 유지합니다. 숯은 최대 4회 재사용할 수 있습니다. 숯봉투를 천천히 열어 숯먼지가 문화비커에 들어가지 않도록 한다.- 용기에 활성 탄의 ~ 700 g을 전송합니다. 48시간 동안 담수(FW)에 담그고 바닥에 정착할 수 있도록 하십시오.
- FW로 헹구어 잔류 숯 먼지를 제거합니다.
- 15-20 분 동안 FW에 숯을 끓입니다.
- 대부분의 숯 먼지가 제거되고 물이 맑아질 때까지 헹구습니다.
- fSW가 들어있는 2 L 비커에 깨끗한 숯을 보관하십시오. 먼지가 유입되는 것을 방지하기 위해 비커를 덮습니다.
- 동물을 옮기기 전에 새로운 비커에 숯을 넣습니다.
Representative Results
Oikopleura는 비 필터링 대구 엔드(도 5)와100 μm 메쉬 플랑크톤 그물의 느리고 부드러운 견인에 의해 보트 또는 항구에서 수집 할 수 있습니다. 동물의 연약한 특성으로 인해, 시료 항아리에 갇힌 공기 포켓으로 인해 그물의 거친 취급이나 튀는 것과 같은 물리적 인 스트레스를 유발할 수있는 움직임을 피하는 것이 중요합니다.
현지 오이코플레라 인구의 계절적 패턴뿐만 아니라 샘플링 사이트에서 물의 물리적 특성에 따른 변동을 이해하는 것이 중요합니다. 2015년과 2019년 사이 샘플링은 오키나와의 이시카와 킨 하버에서 O. 디오리카와 킨 하버의 존재에 일관된 계절 적 변화를 밝혀(그림 6). 표면 해수 온도가 주요 요인으로 보입니다. O. 디오이카는 표면 해수가 ≥28°C에 도달했을 때 지배적인 종이었고, O. longicauda는 24°C와 27°C 사이의 온도에서 O. 디오이카와 공존하였다. 그러나, O. longicauda 23 °C(그림 6A)아래 지배. 폭우의 며칠 연속 후 신의 점진적 변화는 O. 디오이카 (도 6B)의풍부와 상관 관계가 없었다.
위에서 설명한 샘플링 절차를 사용하여, 우리가 회수한 대부분의 O. 디오이카는 4일 수명주기(그림 7C)의2일과 3일 사이에 있었습니다. 성숙한 수컷은 조나드의 노란 색칠에 의해 인식된 반면 암컷 조나드는 직경 70-80 μm인 계란으로부터 금을 반짝였다(그림8A, B). 미숙한 O. 디오이카는 꼬리에 두 개의 서브코드 세포에 의해확인되었다(도 8D). 지역 해역의 또 다른 지배적 인 종인 O. longicauda는크기와 형태면에서 유사했습니다. ,우리는 O. dioica38, 39,40: 꼬리에 하위 코드 세포의부족,39트렁크에 벨럼의 존재, 헤르마로디테 고나드(그림 8E, F)의존재를 구별하기 위해 다음과 같은 기준을 사용했다. 다른 꼬리 형태는 O. 디오이카에서 O. longicauda를 구별하는 데에도 유용합니다. 집이 없는 벌거벗은 동물이 측면으로 향했을 때, O. longicauda의 꼬리는 곡률이 적어 더 똑바른 모습이었기 때문에 O. dioica에비해 "딱딱한" 외관을 제공했습니다.
안정적인 Oikopleura 문화 시스템을 구축하기위한 세 가지 가장 중요한 요소는 (i) 높은 수질을 유지, (ii) 최적의 공급 정권을 식별하고, (iii) 남성과 여성의 충분한 수와 산란 비커를 설정. 다단계 필터시스템(도 1)의도입으로 배문화의 수질과 안정성이 향상되었습니다. 인공 바닷물에 는 여과 시스템이 필요하지 않습니다. 그러나 천연 해수의 비용, 가용성 및 편리함은 해안 근처에 위치한 실험실에 더 나은 옵션입니다. 수유 체제를 확립하려면 온도와 조명 조건이 크게 다르기 때문에 개별 실험실 설정에 적용되는 조류 성장 곡선을 측정하는 것이 좋습니다. 우리는 조류 사료 농도 및 조성물을 최적화하기 위해 이전에 발표 된 공급 일정과 성장 곡선을 결합하여27 (그림 4). 우리는 또한 조류 식품의 신선한 공급을 유지하기 위해 엄격한 조류 접종 일정을 따릅니다(표 2). 자동 급식 시스템은 배양 직원의 존재없이 일관된 일일 먹이 일정을 유지할 수 있습니다(그림 2B).
최적의 바닷물과 수유 조건이 달성되면, fSW의 2.5 L에서 15 명의 남성과 30 명의 암컷을 가진 산란 비커를 만들어 새로운 세대를 시작하는 것이 중요합니다. 이는 다음 날 아침 1일째 동물의 집중력을 보장하며, 산란을 위해 4일째에는 2일째, 120일, 45일째에 는 150마리의 동물을 고립시키기에 충분합니다. 4일째에 남성과 여성이 충분하지 않다면, 가능한 한 많은 성숙한 개인을 fSW 1L로 모으고 이송하고 다음 세대를 이어갈 충분한 애벌레가 있기를 바라며 자연스럽게 생성하게 하십시오. 제공된 프로토콜에 따라 O. dioica의 수명 주기는 23°C(도7C)에서4일입니다. 우리는 안정적으로 20 세대 이상 지속 O. dioica의여섯 독립적 인 야생 인구를 설립했다.
그림 1: 해수 필터 시스템의 회로도.
(A와 B) 해수는 저수지 탱크(C)용기 탱크에서 바닷물을 그리는 데 사용되는 자기 구동 펌프를 사용하기 전에 25 μm 필터 장치를 통해 처음에 여과된다. 바닷물은 저수지 탱크로 돌아가기 전에 두 개의 폴리 프로필렌 필터와 UV 멸균기를 통해 밀려나게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: O. 디오이카문화시스템.
(A)자동 투약 펌프용 동기모터 및 조류 저수지의 클로즈업뷰(B)개요. 실리콘 튜브 A와 B의 내부 직경은 각각 2mm 및 4mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: O. 디오이카의주식 문화.
왼쪽부터, C. calcitrans 이소크리시스 스프., 시에코코커스 스프., 및 R. 레티쿨라타에서 17°C에서 재배된 후 ~10일 동안 연속광하에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 주요 식품 종 인 C. calcitrans 및 Isochrysis sp.의 두 가지에 대한 조류 성장 곡선.
광학 밀도(OD)의 분산 플롯은 660nm에서 총 세포 농도(A) C. calcitrans 및(B) 이소크리시스 스프.. 각 점은 세 측정의 평균을 나타냅니다. 세포 카운터는 실행 가능한 세포 및 총 세포 농도(cells/mL)의 백분율을 결정하기 위해 사용되었다. 측정값은 20일 동안 기록되었다(n = 47). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 오이코플레라 샘플링을 위한 수정된 플랑크톤 그물.
핸드헬드 플랑크톤 그물(100 μm 메쉬)의 대구 끝이 500mL 워시병으로 대체된다. 70g 의 무게가 대구 단면에 부착됩니다. 약 5m의 밧줄이 키 링에 부착되어 있습니다. 대구 끝을 더욱 확보하기 위해 안전 끈이 부착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 오키나와의 O. 디오이카의 계절성.
O. dioica와 O. longicauda의 존재와 계절 변화에 관하여(A)온도 및(B)이시카와항구에서 염분 (26°25'39.3"N 127°49'56.6"E) 및 킨 (26°26'40.2"N 127°55'00 사이 20.20". 50마리 이상의 동물이 수동으로 계산된 경우 각 종은 현재로 기록되었다. 표면수의 온도 및 아일린성 측정이 기록되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: O. 디오이카 단독 문화를 시동하기 위한 플로우 차트.
(A)3, 500mL 플랑크톤 샘플은 샘플링부위(B)각 샘플 항아리가 희석되고 O. 디오이카는 플랑크톤의 나머지 O. dioica 부분에서 분리되어C120일 3일 의 동물을 담근 해수(fSW)를 포함하는 새로운 비커로 수동으로 이송하여 시작된다. 30 명의 여성, 15 명의 남성 및 2.5 L의 신선한 fSW가 들어있는 산란 비커를 설정하십시오. 첫 번째 아침 산란 후 (Day1), 조심스럽게 신선한 fSW의 7.5 L을 포함하는 비커에 동물의 새로운 세대와 산란 비커를 비웁라. 둘째 날(2일차)에는 150마리의 동물을 5L 프레시 fSW가 들어 있는 비커로 옮기게 한다. 3일째(3일차)에는 120마리의 동물을 5L 프레시 fSW가 들어 있는 비커로 옮기게 한다. 마지막 날(4일)에는 다음 세대를 준비하기 위해 여성 30명, 남성 15명, 신선한 fSW 2.5L을 포함한 새로운 산란 비커를 설치했습니다. 동물은 23 °C에서 4 일 수명 주기를 갖는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 오이코플레우라 spp.(A-D: O. 디오이카,E 및 F: O. longicauda)의식별
(A)암컷B O. 디오이카와 O. dioica 정자(C)미숙한 O. 디오이카의 측면 보기(D)미숙한 O. 디오이카의 복부 보기 백색 화살표로 표시된 두 개의 서브 코드 세포(E)성숙한 O. longicauda 운반 계란 (화살표 1) 및 정자 (화살표 2) (F) 긴 화살표(F) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 화학 제품 | 금액 | 최종 vol. (mL) | 살 균 | 재고 /오픈 |
| 솔루션 A | 나2EDTA | 45 g | 1000 | 오토 클레이 브 | -20°C/4°C |
| 나노3 | 100 g | ||||
| H3BO3 | 33.6 g | ||||
| NaH2PO4 | 20 g | ||||
| MnCl2·4H2O | 0.36 g | ||||
| FeCl3·6H2O | 1.3 g | ||||
| 솔루션 B | 1.0 mL | ||||
| 솔루션 B | ZnCl2 | 2.1 g | 1000 | 오토 클레이 브 | 4°C/4°C |
| CoCl2·6H2O | 2.0 g | ||||
| (NH4)6Mo7O24·4H2O | 0.9 g | ||||
| CuSO4·5H2O | 2.0 g | ||||
| *HCl | -- mL | ||||
| 비타민 | 티아민 (B1)· Hcl | 200 mg | 1000 | 오토 클레이 브 | -20°C/4°C |
| 비오 틴 | 1 mg | ||||
| 코발라민 (B12) | 1 mg | ||||
| 규산염 나트륨 | 나2시오3 | 5% | 1000 | 0.22 μm 필터 | 4°C/4°C |
| 연쇄상 구균 | C21H39N7O12 | 25 mg/mL | 50 | 0.22 μm 필터 | -20°C/ -20°C |
표 1: 조류 식품의 유지 보수에 필요한 시약 레시피. 용액 B에 나열된 모든 화학 물질을 용해 한 후, 용액이 탁도 없이 명확해질 때까지 HCl이 추가됩니다. 모든 시약은 오토클레이브(120°C, 25분) 또는 0.22m 필터를 사용하여 멸균된다. 비타민 스톡을 제외한 모든 시약은 지정된 화학 물질을 첨가한 후 살균된다. 비타민 주식의 경우 먼저 물을 자동화한 다음 나열된 화학 물질을 용해하십시오. 재고 및 개방 시약의 보관 온도가 나열됩니다.
| 문화 유형 | 조류 spp. | ASW (mL) | 비타민 | 솔루션 A | 규산염 나트륨 | 연쇄상 구균 | 조류 (mL) / 문화 유형 | 인큐베이터 / 스토어 | 주파수 |
| 주식 문화 | 채토 (채토) | 60 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (채토만) |
1/1000 (Syn을 제외한 모든 것) |
0.03/주식 | 17°C / 4°C | 격주 |
| Iso | 60 | 0.03/주식 | |||||||
| Rhino | 80 | 0.06/주식 | |||||||
| Syn | 60 | 0.03/주식 | |||||||
| 하위 문화권 | 채토 (채토) | 500 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (채토만) |
1/1000 (Syn을 제외한 모든 것) |
10/스톡 | 17°C / 17°C | 주간 |
| Iso | 500 | 10/스톡 | |||||||
| Rhino | 500 | 20/스톡 | |||||||
| Syn | 500 | 10/스톡 | |||||||
| 작업 문화 | 채토 (채토) | 400 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (채토만) |
1/1000 (Syn을 제외한 모든 것) |
100/서브 | RM / RM | 4일마다 |
| Iso | 400 | 100/서브 | |||||||
| Rhino | 400 | 150/서브 | |||||||
| Syn | 400 | 100/서브 |
표 2: 세 가지 조류 배양 유형의 유지 보수에 대한 지침입니다. 오토클레이브 바닷물이 들어 있는 플라스크에 지정된 양의 보충제를 추가합니다. 각 플라스크를 지정된 양의 조류 배양으로 접종합니다. 지정된 온도에서 조류 문화를 배양하고 저장합니다. 이전 주식 문화에서 새로운 주식 문화와 하위 문화를 접종하고, 이전 하위 문화에서 새로운 노동 문화를 접종. 2주, 1주일, 4일에 한 번씩 새로운 주식 문화, 하위 문화, 근로문화를 접종합니다. 이 일정은 O. 디오이카 문화의 약 10 부커에 충분한 음식을 제공합니다. 백업으로 각 조류 문화 유형의 2 - 3 세트를 유지합니다. RM – 실온.
| 하루 | 조류 spp. | 오전 9시 및 오후 5시 | 오후 12시 |
| 1 | 채토 (채토) | — | — |
| Iso | 1000 | 2000 | |
| Syn | 20,000 | 40,000 | |
| 2 | 채토 (채토) | 1000 | 2000 |
| Iso | 2000 | 2000 | |
| Rhino | 1000 | 1000 | |
| 3 | 채토 (채토) | 3000 | 4000 |
| Iso | 3000 | 4000 | |
| Rhino | 1500 | 1500 | |
| 4 | 채토 (채토) | 1000 | 2000 |
| Iso | 1000 | 2000 | |
| Rhino | 1000 | 1000 |
표 3: 수유당 조류 농도- 꽃다발 등으로부터 수정.27. 오키나와 O. 디오이카의 4일 수명 주기 동안 매일 수유에 사용되는 조류 농도(세포mL-1)및 조류 종.
보충 파일 1: 일일 급식 차트. 각 배양비커에 대한 일일 수유량은 매일 조류 흡수량 측정(OD), 동물의 크기(일), 각 배양 비커에 해수(SW vol.)의 부피를 입력한 후 자동으로 계산됩니다. R. 레티쿨라타와 시에코코쿠스 스프의 성장 곡선은 부케 외27에서적응되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 동기 모터를 아크릴 패들과 연결하는 방법. 육각형 렌치를 사용하여 패들을 모터에 단단히 나사로 고정합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
O. dioica 문화의 설립에 유연성을 촉진하기 위해, 동물의 자연 서식지를 이해하는 것이 중요하다. 계절 데이터는 실험실 배양 조건을 안내하는 데 사용할 수있는 물리적 매개 변수의 범위에 대한 정보를 제공합니다. 또한 풍부한 동물의 계절 적 변동을 이해하는 데 도움이됩니다. 오키나와에서는 6월부터 10월까지 O. 디오이카가 가장 안정적으로 발견됩니다. 그러나 도쿄만에서는 2월과 10월41일에인구가 정점에 달합니다. O. 디오이카의 배양은 종종 20 °C 또는 27이하,28,,29에서보고되지만, 오키나와 O. 디오이카는 20 ° C 이상의 온도에서 더 나은 생존을 보여줍니다;27 이는 오키나와의 최소 지표해수 온도가 ~20°C(도6)라는사실에 의해 설명될 수 있다. O. 디오이카의 풍요로움은 또한 식물성 플랑크톤 꽃42및 육식 동물 풍부43,,44에의해 영향을받을 수 있습니다. O. dioica가 수집되는 위치에 관계없이 지역 주민의 계절성을 이해하면 샘플링 및 배양 성공의 기회를 극대화합니다.
적절한 계절과 위치를 감안할 때, 그물 샘플링은 최소한의 노력으로 많은 수의 Oikopleura를 수집하는 효과적인 방법입니다. 작은 메쉬 크기 (60-70 μm)를 가진 플랑크톤 그물은 또한 동물의 모든 단계를 수집하는 데 사용될 수있다. 완전히 성숙한 동물은 거의 그물에서 찾을 수 있습니다, 아마도 때문에 수명 주기의 끝에 그들의 취약성. 따라서, 샘플링에 이어 종 식별은 하위 코드 세포의 현미경 관찰에 의해 달성된다. 성숙한 개별은 일반적으로 동물이 실험실에서 성장하는 것을 계속으로 1 또는 2 일 후에 샘플링 후에 나타납니다. 순 샘플링은 효율적이지만 다른 상황에서는 대체 샘플링 방법이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 도시 지역 근처의 순 샘플링은 많은 양의 식물성 플랑크톤을 수집할 수 있으므로 Oikopleura를분리하기가 어렵습니다. 이러한 경우 항구 너머 지역에서 표면 해수 또는 보트 샘플링을 수집하는 간단한 버킷 샘플링을 권장합니다. 그 결과, 연속적인 비로 인한 신분적 변화는 O. 디오이카의풍요로움에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주었다. 그러나 열대 저기압과 같은 극단적 인 기상 사건 직후 해안 샘플링을 피해야합니다. 이러한 사건은 물45,,46의보호 된 몸에 갑작스럽고 과감한 생화학적 변화를 일으킨다. 우수 유출은 오염물질, 퇴적물 및 과잉 영양소를 운반할 수 있으며, 이는 탁도를 높이고 수질이낮아진다(47). 오이코플레우라와같은 필터 공급 플랑크톤은 먹이주기 모드와 제한된 이동성으로 인해 이러한 변화에 특히 취약할 수 있습니다. 이러한 상황에서는 현지 조건이 정상으로 돌아올 때까지 며칠 동안 샘플링을 연기하는 것이 좋습니다.
다단계 필터 시스템의 도입은 O. dioica와같은 작은 필터 공급 유기체를 유지하는 데 필수적입니다. 제대로 여과된 바닷물(예: 이전 배양 시스템에서 25 μm 메쉬)을 사용하면 특히 여름에는 식물성 플랑크톤의 풍부가 높기 때문에 문화가 불안정했습니다. 일부 식물성 플랑크톤은 O. dioica 성장에 유익하지만, 다른 사람들은 O. dioica 배아48의 비정상적인 발달을 일으킬 수있는 바이오 톡신을 생산한다.48 또한, 채토세로스 spp와 같은 고농도의 규음은 집을 막아 효율적인수유를방지할 수 있는 긴 세태를 소유할 수 있기 때문에 O. 디오이카 성장에 잠재적으로 해롭다. 우리는 종종 C. calcitrans setae에 의해 막히는 작은 동물의 집을 관찰; 따라서, 우리는 지금 2 일 이상(표 3)에서동물에게만 C. calcitrans를 공급합니다.
여기서는 문제가 되지 않았지만, O. dioica의 소규모 장기 배양은 유전 병목 현상으로 인해 인구 규모에 급격한 하락을 경험할 수 있습니다. 이러한 경우, Martí-Solans외. 29 는 20 세대마다 문화에 새로운 야생 개인을 추가하는 것이 좋습니다.
오이코플레라 문화 시스템은 유연합니다. 안정적인 문화는 1주일 이내에 확립될 수 있습니다. O. dioica의 장기 배양은 비 전문 장비와 겸손한 예산에 가능하다. 오이코플레라의 5-10 부커의 유지 보수에 필요한 일일 노력은 일반적으로 2 명으로 2 시간 미만입니다. O. 디오이카는 또한 천연 바닷물에 접근하지 않는 사람들에게 유익한 인공 해수에서 유지 될수있다(28). 고체 배양및냉동보존(29)을이용하여 조류식품의 장기 보관이 가능하다. 더욱이, O. 디오이카 정자는 극저온 보존될 수 있고, 1년 이상50년이상 생존할 수 있다. 이러한 모든 요인은 문화를 쉽게 재확립할 수 있음을 의미합니다. 마지막으로, Pleurobrachia Sp의우발적 인 배양과 과거의 경험. Oikopleura를 위해 개발된 배양 시스템이 잠재적으로 깨지기 쉬운 펠라기 유기체의 광범위한 지역 사회로 확장 될 수 있음을 제안 할 수 있습니다.
O. 디오이카는 다양한 생물학적 분야에 대한 강력한 통찰력을 지속적으로 제공하고 있습니다. 지역 계절성, 세심한 문화 시스템, 그리고 소수의 헌신적인 개인에 대한 이해는 약간의 노력으로 효과적인 문화를 확립할 수 있도록 합니다. Oikopleura 배양 시스템은 생태, 발달, 유전체학 및 이 독특한 해양 화음의 진화와 관련된 광범위한 생물학적 분야를 조사하기 위한 기준자원을 제공합니다.
Disclosures
저자는 선언할 것이 없습니다.
Acknowledgments
가르트 일슬리가 문화체계 구축을 지원해 주신 것에 감사드립니다. 스야마 리츠코와 실뱅 길롯이 조기 샘플링 과 종 식별 노력에 기여한 것을 인정합니다. 니시다 히로키, 오누마 다케시, 오모테자코 다츠야가 지역 배양 시스템 초기 구축, 동물 및 미세골 문화 공유 등 다양한 지원과 지도를 해주셔서 특별한 감사를 드립니다. 또한 다니엘 추루, 장 마리 부케, 앤 아조르드, 크리스티안 카네스트로, 알폰소 페란데스-롤단이 샘플링과 배양에 대한 전문 지식을 공유해 주신 것에 대해 서도 감사드립니다. 제이 덴튼, 찰스 플레시, 제프리 졸리는 원고에 대한 귀중한 피드백을 제공했다. 샬롯 웨스트는 조류 계산을위한 일반화 방정식을 공식화. 마지막으로, 안전한 샘플링 절차에 대한 조언을 제공하는 자금 조달에 대한 OIST, 메리 콜린스와 OIST 현장 작업 안전위원회, 배양 및 샘플링 장비의 건설을위한 OIST 기계 공장의 직원, 그리고 바닷물을 제공하는 고이치 토다에 대한 조언을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
| Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
| Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
| Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
| Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
| Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
| Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
| Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
| Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
| TCW-5N-PPS | |||
| TCW-1N-PPS | |||
| Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
| Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
| Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
| Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
| Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
| UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
| Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |
References
- Travis, J. Is It What We Know or Who We Know? Choice of Organism and Robustness of Inference in Ecology and Evolutionary Biology (American Society of Naturalists Presidential Address). The American Naturalist. 167 (3), 303-314 (2006).
- Jenner, R. A., Wills, M. A. The choice of model organisms in evo-devo. Nature Reviews Genetics. 8 (4), 311-314 (2007).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wilson, S., Ruhl, H., Smith, J. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Steinberg, D. K., Lomas, M. W., Cope, J. S. Long-term increase in mesozooplankton biomass in the Sargasso Sea: Linkage to climate and implications for food web dynamics and biogeochemical cycling. Global Biogeochemical Cycles. 26 (1), 1004 (2012).
- Lombard, F., Kiørboe, T. Marine snow originating from appendicularian houses: Age-dependent settling characteristics. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. 57 (10), 1304-1313 (2010).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 251-264 (1998).
- Hopcroft, R. R. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 45-57 (2005).
- Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e59832 (2019).
- Deibel, D. Feeding mechanism and house of the appendicularian Oikopleura vanhoeffeni. Marine Biology. 93 (3), 429-436 (1986).
- Spada, F., et al. Molecular patterning of the oikoplastic epithelium of the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 20624-20632 (2001).
- Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , Contemporaty Publishing International. 59-85 (2005).
- Tokioka, T. Studies on the distribution of appendicularians and some thaliaceans of the North Pacific, with some morphological notes. Publication of the Seto Marine Biological Laboratory. (8), 351-443 (1960).
- Alldredge, A. L. Discarded appendicularian houses as sources of food, surface habitats, and particulate organic matter in planktonic environments. Limnology and Oceanography. 21 (1), 14-24 (1976).
- Clarke, C., Roff, J. C. Abundance and biomass of herbivorous zooplankton off Kingston, Jamaica, with estimates of their annual production. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 31 (4), 423-437 (1990).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Zooplankton growth rates: extraordinary production by the larvacean Oikopleura dioica in tropical waters. Journal of Plankton Research. 17 (2), 205-220 (1995).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Production of tropical larvaceans in Kingston Harbour, Jamaica: are we ignoring an important secondary producer. Journal of Plankton Research. 20 (3), 557-569 (1998).
- Mochioka, N., Iwamizu, M. Diet of anguilloid larvae: leptocephali feed selectively on larvacean houses and fecal pellets. Marine Biology. 125 (3), 447-452 (1996).
- Sakaguchi, S. O., et al. Morphological identity of a taxonomically unassigned cytochrome c oxidase subunit i sequence from stomach contents of juvenile chum salmon determined using polymerase chain reaction. Fisheries Science. 83 (5), 757-765 (2017).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 25-34 (1998).
- Sato, R., Tanaka, Y., Ishimaru, T. House production by Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) under laboratory conditions. Journal of Plankton Research. 23 (4), 415-423 (2001).
- Flood, R., Deibel, D. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 105-124 (1998).
- Alldredge, A. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 309-326 (2005).
- Katija, K., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. New technology reveals the role of giant larvaceans in oceanic carbon cycling. Science Advances. 3 (5), 1602374 (2017).
- Katija, K., Choy, C. A., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. From the surface to the seafloor: How giant larvaceans transport microplastics into the deep sea. Science Advances. 3 (8), 1700715 (2017).
- Hidaka, K. Species composition and horizontal distribution of the appendicularian community in waters adjacent to the Kuroshio in winter-early spring. Plankton and Benthos Research. 3 (3), 152-164 (2008).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359-370 (2009).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: culture, genome, and cell lineages. Development, Growth & Differentiation. 50, 239-256 (2008).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica culturing made easy: A Low-Cost facility for an emerging animal model in Evo Devo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), 146-152 (2016).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Seo, H. C., et al. Miniature genome in the marine chordate Oikopleura dioica. Science. 294 (5551), 2506 (2001).
- Fredriksson, G., Olsson, R. The subchordal cells of Oikopleura dioica and O. albicans (Appendicularia, Chordata). Acta Zoologica. 72 (4), 251-256 (1991).
- Paffenhöfer, G. A. The cultivation of an appendicularian through numerous generations. Marine Biology. 22 (2), 183-185 (1973).
- Fenaux, R., Gorsky, G. Nouvelle technique d'élevage des appendiculaires. Rapports et Procés-Verbaux des Réunions-Commission Internationale pour l'Exploration Scientifique de la Mer Méditerranée. 29, 291-292 (1985).
- Fujii, S., Nishio, T., Nishida, H. Cleavage pattern, gastrulation, and neurulation in the appendicularian, Oikopleura dioica. Development Genes and Evolution. 218 (2), 69-79 (2008).
- Patry, W. L., Bubel, M., Hansen, C., Knowles, T. Diffusion tubes: a method for the mass culture of ctenophores and other pelagic marine invertebrates. PeerJ. 8, 8938 (2020).
- Fenaux, R. The classification of Appendicularia (Tunicata): history and current state. Memoires de I'Institut oceanographique. , (1993).
- Shiga, N. Illustrated Guide to Marine Plankton in Japan. Chihara, M., Murano, M. , Tokai University Press. 1393-1414 (1997).
- Gorsky, G., Castellani, C. Marine Plankton: A practical guide to ecology, methodology, and taxonomy. Castellani, C., Edwards, M. , Oxford University Press. 599-606 (2017).
- Sato, R., Ishibashi, Y., Tanaka, Y., Ishimaru, T., Dagg, M. J. Productivity and grazing impact of Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) in Tokyo Bay. Journal of Plankton Research. 30 (3), 299-309 (2008).
- Nakamura, Y., Suzuki, K., Suzuki, S. Y., Hiromi, J. Production of Oikopleura dioica (Appendicularia) following a picoplankton 'bloom'in a eutrophic coastal area. Journal of Plankton Research. 19 (1), 113-124 (1997).
- Nakamura, Y. Blooms of tunicates Oikopleura spp. and Dolioletta gegenbauri in the Seto Inland Sea, Japan, during summer. Hydrobiologia. 385 (1-3), 183-192 (1998).
- Uye, S. I., Ichino, S. Seasonal variations in abundance, size composition, biomass and production rate of Oikopleura dioica (Fol)(Tunicata: Appendicularia) in a temperate eutrophic inlet. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 189 (1-2), 1-11 (1995).
- Tsuchiya, K., et al. Phytoplankton community response and succession in relation to typhoon passages in the coastal waters of Japan. Journal of Plankton Research. 36 (2), 424-438 (2014).
- Lopez-Lopez, L., et al. Effects of typhoons on gelatinous carnivore zooplankton off Northern Taiwan. Cahiers de Biologie Marine. 53, 349-355 (2012).
- Ares, Á, et al. Extreme storm-induced run-off causes rapid, context-dependent shifts in nearshore subtropical bacterial communities. bioRxiv. , (2019).
- Torres-Águila, N. P., et al. Diatom bloom-derived biotoxins cause aberrant development and gene expression in the appendicularian chordate Oikopleura dioica. Communications Biology. 1 (1), 1-11 (2018).
- Troedsson, C., Frischer, M. E., Nejstgaard, J. C., Thompson, E. M. Molecular quantification of differential ingestion and particle trapping rates by the appendicularian Oikopleura dioica as a function of prey size and shape. Limnology and Oceanography. 52 (1), 416-427 (2007).
- Ouchi, K., Nishino, A., Nishida, H. Simple procedure for sperm cryopreservation in the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Zoological Science. 28 (1), 8-11 (2011).
