Summary
Oikopleura dioica är en tunikatmodell organism inom olika biologiområden. Vi beskriver provtagningsmetoder, artidentifiering, odlingsinställningar och odlingsprotokoll för djur och algfoder. Vi lyfter fram nyckelfaktorer som bidragit till att stärka kultursystemet och diskutera eventuella problem och lösningar.
Abstract
Oikopleura dioica är en plankton ackordat med exceptionell filter-utfodring förmåga, snabb generationstid, bevaras tidig utveckling, och en kompakt arvsmassa. Av dessa skäl anses det vara en användbar modell organism för marina ekologiska studier, evolutionär utvecklingsbiologi och genomik. Eftersom forskning ofta kräver en stadig tillgång på animaliska resurser är det lämpligt att inrätta ett tillförlitligt kultursystem med lågt underhåll. Här beskriver vi en steg-för-steg-metod för att etablera en O. dioica kultur. Vi beskriver hur man väljer potentiella provtagningsplatser, insamlingsmetoder, måldjuridentifiering och upplägget av odlingssystemet. Vi ger felsökningsråd baserat på våra egna erfarenheter. Vi lyfter också fram kritiska faktorer som bidrar till att upprätthålla ett robust kultursystem. Även om kulturprotokollet som finns här är optimerat för O. dioica,hoppas vi att vår provtagningsteknik och kulturinställning kommer att inspirera till nya idéer för att upprätthålla andra ömtåliga pelagiska ryggradslösa djur.
Introduction
Modellorganismer har varit avgörande för att ta itu med många biologiska frågor, inklusive de som rör utveckling, genetik och fysiologi. Dessutom underlättar ytterligare modellorganismer nya upptäckter och är därför avgörande för att uppnå en större förståelse av naturen1,2. Marina zooplankton är olika grupper av organismer som spelar en viktig roll i havet ekosystem3,,4,,5,6. Trots sin överflöd och ekologiska betydelse, gelatinösa organismer såsom plankton manteldjur är ofta underrepresenterade i plankton biologisk mångfald studier eftersom deras öppenhet och bräcklighet gör fältinsamling och identifiering utmanande7,8. Anpassade provtagningstekniker och laboratorieodling möjliggör närmare observation av djuren in vitro, vilket har främjat kunskapen i biologin hos planktoniska manteldjur9,,10,,11,12.
Larvaceans (Appendicularians) är en klass av fri-simning marina manteldjur bestående av cirka 70 beskrivna arter över hela världen8,13. Eftersom de är en av de vanligaste grupperna inom zooplankton samhällen14,15,16,17, larvaktiga utgör en primär näringskälla för större plankton organismer såsom fisklarver18,19. Till skillnad från ascidians-den sessile mantel-larvaceans behålla en grodyngel-liknande morfologi och förbli planktonic hela livet20. Varje djur bor inuti en egenbyggd, invecklad filtermatningsstruktur som kallas ett hus. De ackumulerar partiklar i sina hus genom att skapa vattenströmmar genom böljande rörelse av deras svansar21. Igensatta hus kasseras hela dagen, varav några bildar kolaggregat och så småningom sjunka till havsbotten22; således larvaceans spelar en viktig roll i den globala kolflödet23. De flesta arter rapporteras leva i pelagiska zonen inom de övre 100 m av vattenpelaren13; Men den gigantiska larvacean Bathochordaeus är känd för att bebo djupet av 300 m24. En studie om Bathochordaeus i Monterey Bay, Kalifornien visade att djuren också fungera som en biologisk vektor av mikroplaster, vilket tyder på en potentiell betydelse för att förstå den roll som bihang i vertikal transport och distribution av mikroplaster i haven25.
Oikopleura dioica, en art av larvacean, har uppmärksammats under de senaste åren som en modell organism på grund av flera anmärkningsvärda egenskaper. Det rapporteras ofta över hela världens hav. Det är särskilt rikligt i kustvatten26, vilket möjliggör enkel provtagning från stranden. Långsiktig, stabil odling är möjlig med både naturligt och konstgjort havsvatten27,,28,29. Temperaturberoende generationstider är så korta som 4-9 dagar i laboratorieförhållanden. Den har hög fruktighet med varje hona som kan producera >300 ägg under hela året. Som en tunicate, upptar det en viktig fylogenetisk position för att förstå chordate evolution30,31. Vid 70 Mb har O. dioica det minsta identifierade genomet bland alla chordates32. Bland larvaceans, O. dioica är den enda beskrivna icke-hermafrodditiska arter hittills33.
Den första framgångsrika O. dioica kultur med laboratorieodlade mikroalger rapporterades av Paffenhöfer34. Det ursprungliga kulturprotokollet med synkronmotorer och paddlar utvecklades av Fenaux och Gorsky35 och antogs senare av flera laboratorier. På senare tid rapporterade Fujii et al.36 O. dioica odling i artificiellt havsvatten, en robust kultur system och fältsamling beskrevs av Bouquet et al.27 och ett optimerat protokoll för en förenklad, prisvärd system rapporterades av Marti-Solans et al.29. Bortsett från den traditionella Oikopleura kultursystem, en nyligen rapporterad design med en dubbel rör uppfödning tank har också potential att kultur Oikopleura sp. 37.Den har inte till någon del av
Vi presenterar ett detaljerat protokoll för att inleda en O. dioica monokultur baserad på en kombination av protokoll som utvecklats av stora Oikopleura forskargrupper vid Sars International Centre for Marine Molecular Biology27, Universitetet i Barcelona29, Osaka University28, och våra egna observationer. I tidigare publicerade kultur protokoll, detaljerad information om sammansättningen av alg media, land provtagning tekniker och Oikopleura identifiering beskrevs endast grovt, lämnar en hel del tvetydighet. Här, med hjälp av visuell information i videoprotokollet, har vi samlat all viktig information som behövs för att inrätta en O. dioica kultur från grunden på ett enkelt, steg-för-steg sätt. Vi beskriver hur man skiljer O. dioica från en annan vanligen rapporterade arter, O. longicauda, som är en av de mest utmanande stegen. Även om de befintliga kultursystemen är tillämpliga för odling av O. dioica över hela världen, betonar vi vikten av protokolljustering baserad på lokala miljöförhållanden. Den presenterade informationen kombinerar allmänt publicerade data samt kunskap som erhållits genom erfarenhet. Det nuvarande protokollet är idealiskt för forskare som är intresserade av att etablera en kultur från grunden.
Protocol
1. O. dioica kultur anläggning
- Vattenfiltersystem (figur 1)
- Samla naturligt havsvatten från en hamn på 2-3 m djup. Passera havsvattnet genom ett sandfilter (porstorlek 1,4 mm) och transport till en delad reservoartank i laboratoriet. Använd ett behållarefilter för att cirkulera vattnet för att bibehålla vattenkvaliteten i den delade reservoartanken.
- I ett kulturrum sätter du upp ett flerstegsfiltersystem bestående av en 100 L-reservoartank med en magnetdrivpump, 5 μm och 1 μm polypropylensårpatronfilter och en UV-autoklav (100 V) (figur 1).
- Överför havsvattnet från den delade reservoartanken till kulturrummets reservoartank. Passera havsvattnet genom en 25 μm filterenhet(figur 1A,B)innan du går in i odlingsrummets reservoartank. Cirkulera havsvattnet genom 5 och 1 μm filter över natten för att noggrant avlägsna partiklar som potentiellt kan hindra utvecklingen av djur.
ETT extra filter med större maskstorlek (25-50 μm) är användbart för att förhindra att större partiklar täpper till patronfiltren med mindre maskstorlekar. Det filtrerade havsvattnet (fSW) är klart för användning följande morgon.
-
Oikopleura odlingsenhet (figur 2)
- Underhåll djuren i 5 eller 10 L runda, genomskinliga plastbägare.
- Placera kulturbägare på en stadig, två-nivå rostfritt stål hyllor enhet (L x W x H = 150 cm x 45 cm x 90 cm) med en 5 mm tjock, transparent akryl yta ombord.
- Placera vita lysrör under akrylytan för att belysa djuren från bägarnas botten.
- Placera en svart plastfolie bakom bägarna. Det svarta arket skapar kontrast och förbättrar visualiseringen av de genomskinliga djuren.
- Anslut synkrona elmotorer till akrylpaddlar (L x H = 8 cm x 27 cm) (Tilläggsfil 2). Häng upp paddlarna i kulturbägarna från parallella skenor som löper längs hyllorenhetens längd (figur 2A).
- Slå på motorerna för att generera en mild cirkelrörelse i bägarna vid 15 varv/min.
OBS: Djur i deras cellulosahus är neutralt flytande. Men vattencirkulationen hjälper till att hålla ägg, larver och algmat som ska avbrytas och fördelas jämnt i kulturbägarna.
- Automatisk doseringspump (tillval)
OBS: En automatisk matningsenhet minskar personalbehovet, särskilt under helgerna.- Kalibrera volymen av doseringsvätskan från en automatisk doseringspump enligt tillverkarens anvisningar.
- Använd 50 ml-rör som algreservoarer.
- Borra två 5 mm hål på locken på 50 ml-rör för att passera genom flygbolagsrör. Anslut ett rör till en vanlig akvarieluftpump för att införa luftbubblor, och det andra röret till inloppsporten för doseringspump (figur 2B).
OBS: Att införa en tunn ström av luftbubblor hjälper till att förhindra att algerna lägger sig på botten av rören. - Programmera tid och volym av algfoder som ska fördelas en viss dag.
- Algstation
- Använd en hyllenhet (L x B x H = 90 cm x 46 cm x 115 cm) för att placera fyra 1 L runda bottenflaskor som innehåller algbearbetningskulturer (se steg 2.1).
- Back-belysa arbetskulturerna genom att placera lysrör bakom kolvarna.
- Tätningsflaskor med tvåhåliga gummiproppar.
- Passera en 1 ml engångspipett genom gummiproppen. Använd flygbolagsrör för att ansluta pipetten till en akvarieluftpump. Sätt in en ström av luftbubblor i kolven.
2. Mikroalgrej livsmedel
- Initiera algkulturer
OBS: Upprätthålla tre uppsättningar kulturer (bestånd, sub-, och arbetskulturer) för tre mikroalgal arter, Chaetoceros calcitrans, Isochrysis sp., Rhinomonas reticulata, och en art av cyanobakterier, Synechococcus sp.. Lager och underkulturer används som back-ups. Folkbladet speglar dagligen den här kulturen och den inre sporten.- Bered reagenser som är nödvändiga för odling av mikroalger och cyanobakterier (tabell 1).
- För att initiera lagerodling, autoklav (121 °C, 25 min) 60 – 80 ml fSW i en 100 ml Erlenmeyerkolv. Aseptiskt inokulerar den angivna mängden modifierat Conway medium27 och mikroalger (tabell 2). Till exempel, för att inokulera en lagerodling av C. kalcitrans, autoklav 60 ml havsvatten, aseptiskt inokulera 30 μL vardera av vitamin och lösning A, 15 μL natriumsilikat, 60 μL streptomycin och 30 μL C. calcitran från den tidigare lagerkulturen.
OBS: R. reticulata förvandlas från rödrosa till orangish-brun när den utsätts för för mycket ljus. Flytta dem bort från ljus när de har börjat vända från klar till ljusrosa. - Behåll lagerkulturen i en inkubator inställd på 17 °C med kontinuerlig belysning. Efter ca 10 dagar ändrar kulturen färg för att indikera algtillväxt (Figur 3). När färgerna visas flyttar du dem till 4 °C för långtidslagring i upp till 1 månad.
- På en ren bänk, aseptiskt inokulera en subkultur från beståndet kultur (tabell 2). Inkubera vid 17 °C med kontinuerlig belysning. Efter algfärger visas, fortsätt att lagra dem i inkubatorn upp till 2 veckor.
- Inokulera arbetskulturen från underkultur (tabell 2). Täta kolven med ett gummilock och sätt i 1 ml engångspipette. Flytta kolven till algstationen och håll den i rumstemperatur med en 8 h fotoperiod. Leverera med konstant avering. Förnya arbetskulturen var fjärde dag.
- Rör om lager och subkulturer två gånger om dagen genom att snurra.
OBS: Långtidslagring av algodling på fasta medier och kryobevarande är möjliga upp till 3 månader respektive 1år, respektive 29.
- Skapa algtillväxtkurvor (valfritt)
OBS: Noggrann bedömning av utfodring kvantitet är viktigt att upprätthålla en stabil kultur av O. dioica. Vi skapade tillväxtkurvor för två primära algmatsarter, Chaetoceros calcitrans och Isochrysis sp.- Förbered C. calcitrans och Isochrysis sp. arbetskulturer (tabell 2).
- För varje arbetskulturslag provsätts tre separata tider och mät absorbanser vid 660 nm med hjälp av en spektrofotometer. Ta de genomsnittliga mätningarna av tre exemplar från varje arbetskultur.
- Enligt tillverkarens anvisningar för en automatiserad cellräknare, förbereda algprover för räkning. Räkna varje prov tre gånger. Ta medelvärdet av tre antal för att bestämma det totala antalet celler som finns i varje prov.
- Fortsätt att räkna dagligen tills cirka 50 genomsnittliga mätningar registreras.
- Skapa tillväxtkurvor för båda algarterna (figur 4).
3. Fältsamling av vilda Oikopleura spp.
- Modifierat planktonnät (figur 5)
OBS: Nyckeln till framgångsrik provtagning av Oikopleura spp. är den långsamma bogsering av en plankton netto med en viktad, icke-filtrering cod-end. Figur 5 visar ett schema med ett modifierat planktonnät.- Byt ut lyftet på ett handhållet planktonnät mot en modifierad 500 ml skruvskiva.
- Borra ett hål med diametern 3 cm i tvättflaskans 4 cm diameter för att låta vatten och djur komma in i lyftet.
- Montera flasklocket i slutet av planktonnätet. Linda den tätt med eltejp. Säkra locket ytterligare med en slangklämma i rostfritt stål.
- Fäst en vikt på 70 g på utsidan av den modifierade lyftet med dragkedjor.
- Fäst säkerhetskopplet för att ytterligare säkra lyftet.
- Välja insamlingsplatser (bild 6)
ALLA provsamlingar har godkänts av OIST Fieldwork Safety Committee. Det kan finnas säsongsvariationer i förekomsten av Oikopleura spp. beroende på plats (figur 6). Undvik provtagning omedelbart efter extrema väderförhållanden som kraftiga regnoväder.- Använd satellitvyn på en kartwebbplats för att identifiera potentiella provtagningsplatser. Vi fokuserade på hamnar och fiskebryggor som är lättillgängliga med bil och ligger inne i vikar eller nära havet drop-offs där plankton tenderar att ackumuleras: Ishikawa hamn i Kin Bay, Okinawa, Japan (GPS: 26 ° 25'39.3 "N 127 ° 49'56.6"E).
- Besök potentiella provtagningsplatser för att bedöma tillgängligheten och säkerheten på varje plats. Få inkassotillstånd från lokala myndigheter efter behov.
- Provtagningsförfarande
- Kasta planktonnätet i havet och låt lyftet sjunka 1-2 m under vattenytan.
- Släp nätet horisontellt för hand vid 50-100 cm s-1. Fortsätt bogsera genom att gå fram och tillbaka i 2-5 minuter. Justera bogseringstiden enligt överflödet av fytoplankton i hamnen, med kortare bogsering när det finns mer fytoplankton.
OBS: Larvaceans är ömtåliga djur. Snabb bogsering eller upprepad gjutning av nätet kan skada djur som fastnat i lyftet. - Lyft försiktigt nätet. Överför långsamt torskändens innehåll till en 500 ml rund glasflaska. Fyll provflaskan helt med havsvatten för att undvika luftbubblor.
OBS: Förekomsten av Oikopleura spp. kan bekräftas genom att visa provflaskor mot en svart bakgrund. De flesta djur överger sina hus samtidigt som de samlas in. Därför behövs mikroskopisk observation för identifiering på artnivå. - Upprepa provtagningen tills tre 500 ml-flaskor samlas in.
- Mät salthalt, temperatur och klorofyll a med hjälp av en CTD profiler för att registrera de olika fysiska parametrar där djur naturligt finns.
- Samla 10-15 L ytvatten i en hink för att acklimatisera djur i laboratoriemiljön.
4. Isolering och identifiering av djur (figur 7, figur 8)
-
Oikopleura spp. identifiering
OBS: Andra planktoniska organismer som kan likna Oikopleura spp. vid första anblicken inkluderar chaetognaths, Fritillaria spp., nematoder, fisklarver med gulaktiga-säckar och Ciona spp. larver.- För att acklimatisera djur till laboratorieförhållanden, överför varje 500 ml-prov till en 10 L-bägare som innehåller 1:1 förhållandet mellan ytvatten från provtagningsplatsen och filtrerat havsvatten (fSW) som upprätthålls i laboratoriet (figur 7A,B). Justera bägarens volym till 5-10 L beroende på koncentrationen av planktonprov.
OBS: Om planktonprovet innehåller oönskat skräp, kör genom ett grovt filter (maskstorlek ~600 μm) innan du överför till en 10 L-bägare. - Använd en paddel fäst vid en synkron elmotor (15 RPM) och håll plankton i fjädring över natten (steg 1.2.5).
- Identifiera Oikopleura spp. genom att leta efter 1-2 mm långa, grodyngelformade djur som böljar svansarna inuti ett sfäriskt, genomskinligt hus. Vissa djur kan vara tillfälligt frisimning utan husen. Överför försiktigt ~5 djur till en tom petriskål med hjälp av en trubbig pipett.
- För genusidentifiering, vräka djur från sina hus genom att försiktigt peta huset med en överföring pipett.
- Observera hushållslösa djur under ett 20-40x mörkfältsmikroskop och bekräfta Oikopleura spp (figur 8).
- För att acklimatisera djur till laboratorieförhållanden, överför varje 500 ml-prov till en 10 L-bägare som innehåller 1:1 förhållandet mellan ytvatten från provtagningsplatsen och filtrerat havsvatten (fSW) som upprätthålls i laboratoriet (figur 7A,B). Justera bägarens volym till 5-10 L beroende på koncentrationen av planktonprov.
-
O. dioica identifiering
OBS: O. dioica kan identifieras visuellt genom närvaron av fullt mogna hanar och honor eller två stora subchordal celler som ligger på den distala halvan av svansen. Avståndet mellan två subchordal celler kan variera mellan individer.- Kontrollera sedan om det finns en fullt mogen Oikopleura med en gonad fylld med ägg (figur 8A) eller spermier (figur 8B). Om djuret bara har ägg eller spermier, hoppa till steg 4.2.3 eftersom det är O. dioica, den enda beskrivna icke-hermafrodditiska arter.
- Om djuret är omogen (figur 8C), leta efter två subchordal celler i slutet av svansen (figur 8D).
- När arten har bekräftats, överföra den till en ny petriskål. Upprepa steg 4.1.3-4.2.2 tills 10-20 individer bekräftas på artnivå.
OBS: För enklare identifiering, söva djur i en petriskål som innehåller 0,015% tricainemetansulfonat (MS222) i fSW. - Om ingen O. dioica hittas, håll bägarna upphängda en extra dag eller två. Det kan finnas omogna O. dioica som kommer att fortsätta växa och bli lättare att upptäckas. Om ingen visas efter en vecka, ignorera provet och försök provtagning igen.
5. Odlingsprotokoll för O. dioica
- Initiera en monokultur av o. dioica från ett fält som samlats in(figur 7)
Obs: Algmat tillagas dagligen från arbetskulturer och varje monokulturbägare matas tre gånger om dagen klockan 9.00, 12.00 respektive 17.00 (se steg 5.2). Djuren underhålls vid 23 °C.Djuren behålls vid °C 23. Under dessa förhållanden är Okinawa O. dioica livscykel 4 dagar (Figur 7C).- För att initiera en monokultur av O. dioica,isolera 120 djur och överför till en ny bägare som innehåller 5 L färsk fSW (figur 7B,C).
- Följande morgon, leta efter fullt mogna hanar med gula gonads och honor med ägg som visas som gyllene sfärer (figur 8A, B).
- Gör en lekbägare genom att försiktigt överföra 15 hanar och 30 honor till en ny bägare som innehåller 2,5 L färsk fSW med en 5 ml trubbig pipett.
OBS: Om det inte finns tillräckligt med hanar och honor, överför så många vuxna som möjligt till en bägare som innehåller 1 L fSW och låt dem leka naturligt. För att minimera fysisk stress för djur under manuell överföring, bör de långsamt siphoned och släppas under vattenytan. - Låt djuren leka naturligt för att initiera nästa generation. Tailed larver bör visas cirka 3 timmar efter befruktning.
OBS: Lek utförs av fullt mogna djur överge sina hus, simma mot ytvattnet, och släppa sina könsceller. Framgångsrik befruktning kan bekräftas genom att extrahera 5-10 ml havsvatten från botten av lekbägaren och identifiera ägg med klyvningar under ett mikroskop. - Den första morgonen efter lek (Dag 1), en ny generation av djur med uppblåsta hus bör visas i bägaren. Använd en handhållen 500 ml-bägare för att försiktigt överföra lekbägarens innehåll till en ny bägare som innehåller 7,5 L färsk fSW (vilket ger totalt 10 L). Häll i en vinkel för att undvika en stänkrörelse.
- Den andra morgonen (dag 2), manuellt överföra 150 djur till en ny bägare som innehåller 5 L färsk fSW.
- På den tredje morgonen (Dag 3), manuellt överföra 120 djur till en ny bägare med 5 L färsk fSW.
OBS: För att synkronisera utvecklingen av djur är det viktigt att välja individer med liknande storlekar under den manuella överföringen dag 2 och 3. Högst 10 djur kan siphoned i en enda överföring. - Den fjärde morgonen (dag 4) bör fullmogna djur förekomma. Upprepa steg 5.1.3 för att stänga livscykeln.
OBS: En automatiserad matningspump kan ställas in för att mata djuren klockan 17.00 på helgerna utan närvaro av odlingspersonal.
- Daglig beredning av algmat från arbetskulturen
- Mät arbetskulturens absorbans vid 660 nm.
- Baserat på daily feeding chart, ta reda på hur många algceller behöver utfodras för djur av särskild storlek (tabell 3).
- Med hjälp av algtillväxtkurvorna (figur 4) löser du ekvationerna nedan för att beräkna volymen av algmat (ml) som krävs en viss dag.
- För att beräkna volymen av en viss alger som behövs för en viss dag och matningstid, använd följande ekvation:
Om YA är algkoncentrationen en viss dag och A är den mängd alger som behövs per utfodring. Dessutom visas det linjära förhållandet mellan YA till x, värdena för skärningspunkt(c)och lutning (m) i figur 4. Se tabell 3 K för K-värden. - Till exempel, för att beräkna volymen av Isochrysis sp. behövs vid en 9 AM utfodring av dag 3 djur som upprätthålls i en 5 L kultur och med algabsorbenet på 0,234 (mätt vid 660 nm), beräknades följande:
OBS: Förvara dessa ekvationer i ett kalkylblad så att den dagliga matningsmängden beräknas automatiskt baserat på absorbansmätningar, djurens storlek och odlingsvolymen havsvatten(Tilläggsfil 1).
- För att beräkna volymen av en viss alger som behövs för en viss dag och matningstid, använd följande ekvation:
- Överför den beräknade volymen alger till 50 ml-rör, centrifug vid 5000 x g i 5 min vid 20 °C.
- Ta bort supernatanten. Fyll rören tillbaka upp till den ursprungliga volymen med färsk fSW, ersätta gamla alg media.
- Förvara beredd mat i kylskåp tills den är klar att användas för nästa foder. Kasta den gamla algmaten efter att ny mat tillagats nästa morgon.
- Aktivt kol (tillval)
OBS: 10 g aktivt kol tillsätts varje kulturbägare för att bibehålla vattenkvaliteten. Träkol kan återanvändas upp till fyra gånger. Öppna kolpåsen långsamt för att undvika att koldamm kommer in i kulturbägarna.- Överför ~700 g aktivt kol i en behållare. Blötlägg i sötvatten (FW) i 48 timmar och låt dem bosätta sig på botten.
- Skölj med FW för att avlägsna kvarvarande koldamm.
- Koka kol i FW i 15-20 min. Ta bort från värmen och låt svalna.
- Skölj tills de flesta koldamm avlägsnas, och vattnet blir klart.
- Förvara rent kol i 2 L-bägare som innehåller fSW. Täck bägaren för att förhindra att damm kommer in.
- Tillsätt kol till varje ny bägare innan du överför djuren.
Representative Results
Oikopleura kan samlas in från en båt eller från en hamn genom långsam, mild bogsering av en 100 μm mesh plankton netto med en icke-filtrering cod-end (figur 5). På grund av djurens ömtåliga natur är det viktigt att undvika varje rörelse som kan orsaka fysisk stress, såsom grov hantering av nätet eller stänk på grund av en instängd luftficka i provburken.
Det är viktigt att förstå säsongsmönstret för lokala Oikopleura populationer samt de åtföljande fluktuationerna i de fysiska egenskaperna hos vattnet vid en provtagningsplats. Provtagningen mellan 2015 och 2019 visade på en konsekvent säsongsvariation i förekomsten av O. dioica i Ishikawa och Kin-hamnarna i Okinawa (figur 6). Ytvattentemperaturen verkar vara en viktig faktor. O. dioica var den dominerande arten när ytvatten nådde ≥28 °C och O. longicauda samexisterade med O. dioica vid temperaturer mellan 24 °C och 27 °C. O. longicauda dominerade dock under 23 °C (figur 6A). Gradvis förändring av salthalten efter flera dagar i följd av kraftigt regn korrelerade inte med överflödet av O. dioica (figur 6B).
Med hjälp av de provtagningsförfaranden som beskrivs ovan var de flesta O. dioica vi återhämtade oss mellan dag 2 och 3 av deras 4-dagars livscykel (figur 7C). Mogna hanar kändes igen av den gula färgningen av gonads medan kvinnliga gonads skimrade guld från ägg som var 70-80 μm i diameter (figur 8A,B). Omogna O. dioica bekräftades av två subchordal celler på deras svansar (Figur 8D). En annan dominerande art i de lokala vattnen, O. longicauda, var liknande i storlek och morfologi. Vi använde följande kriterier för att skilja O. longicauda från O. dioica38,,39,40:en brist på subchordal celler i svansen, förekomsten av velum i stammen, och förekomsten av en hermafrodit gonad ( figur8E, F). De olika svans morfologier är också användbara för att skilja O. longicauda från O. dioica. När en intakt naken djur utan huset var orienterad i sidled, svansen av O. longicauda var mer rak med mindre krökning, vilket ger det en "styvare" utseende jämfört med O. dioica.
De tre viktigaste faktorerna för att upprätta ett stabilt oikopleuraodlingssystem är i) upprätthållandet av hög vattenkvalitet, ii) identifiera den optimala utfodringsregimen och iii) inrätta en lekbägare med tillräckligt många hanar och honor. Införandet av ett filtersystem i flera steg (figur 1) förbättrade kulturens vattenkvalitet och stabilitet. Ett filtreringssystem är inte nödvändigt för artificiellt havsvatten; Men kostnaden, tillgängligheten och bekvämligheten med naturligt havsvatten gör det till ett bättre alternativ för laboratorier som ligger nära kusten. För att fastställa utfodringssystemet rekommenderar vi att man mäter algtillväxtkurvor som gäller för enskilda laboratorieinställningar, eftersom temperatur- och ljusförhållandena varierar kraftigt. Vi kombinerade tillväxtkurvorna med tidigare publicerade utfodringsscheman för att optimera algmatningskoncentrationer och kompositioner27 (figur 4). Vi följer också en strikt alg inokulering schema för att upprätthålla en ny tillgång på alg mat (tabell 2). Det automatiserade matningssystemet gör det möjligt för oss att upprätthålla ett konsekvent dagligt utfodringsschema utan närvaro av odlingspersonal (figur 2B).
När optimala havsvatten- och utfodringsförhållanden har uppnåtts är det viktigt att initiera nya generationer genom att skapa en lekbägare med 15 hanar och 30 honor i 2,5 L fSW. Detta säkerställer en god koncentration av dag 1 djur följande morgon, vilket är tillräckligt för att isolera 150 djur på dag 2, 120 på dag 3 och 45 mogna vuxna på dag 4 för lek. Om det inte finns tillräckligt många män och honor på dag 4, samla in och överföra så många mogna individer som möjligt till 1 L fSW och låt dem leka naturligt i hopp om att det kommer att finnas tillräckligt med larver för att bära på nästa generation. Enligt det angivna protokollet är O. dioicas livscykel 4 dagar vid 23 °C (figur 7C). Vi har på ett tillförlitligt sätt etablerat sex oberoende vilda populationer av O. dioica, som alla varade mer än 20 generationer.
Figur 1: Schematiskt för havsvattenfiltersystemet.
(Aoch B) Havsvatten filtreras initialt genom en 25 μm filterenhet innan du går in i reservoartanken(C)En magnetisk drivpump används för att dra havsvatten från reservoartanken. Havsvattnet trycks sedan genom två polypropylenfilter och en UV-autoklav innan den återvänder till reservoartanken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kultursystem för O. dioica.
(A)Översikt över kultursystemet (B) Närbild av synkron motor- och algsreservoar för den automatiserade doseringspumpen. Innerdiametrar av silikonrör A och B är 2 mm respektive 4 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lagerkulturer för O. dioica.
Från vänster- C. kalcitrans, Isochrysis sp., Synechococcus sp., och R. reticulata efter att ha odlats vid 17 °C under kontinuerligt ljus i ~ 10 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Algtillväxtkurva för två av de viktigaste livsmedelsarterna, C. calcitrans och Isochrysis sp..
Spridningsområden med optisk densitet (OD) vid 660 nm och totala cellkoncentrationer för(A) C. kalcitrans och (B) Isochrysis sp.. Varje punkt representerar medelvärdet av tre mätningar. En cellräknare användes för att bestämma andelen livsdugliga celler och totala cellkoncentrationer (celler/ml). Mätningarna registrerades i 20 dagar (n = 47). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Ändrat planktonnät för provtagning av Oikopleura.
Den som är en handhållen planktonnät (100 μm maska) skall ersättas med en tvättflaska på 500 ml. En vikt på 70 g fästs vid lyftet. Ca 5 m rep fästs på nyckelringen. Ett säkerhetskoppel fästs för att ytterligare säkra lyftet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Säsongsvariationer av O. dioica i Okinawa.
Närvaro och frånvaro av O. dioica och O. longicauda i förhållande till säsongsmässiga förändringar i(A)temperatur och (B) salthalt vid hamnar i Ishikawa (26° 25'39.3"N 127°49'56.6"E) och Kin (26°26'40.2"N 127°55'00.3"E) mellan 2015-2019. Varje art registrerades som närvarande om mer än 50 djur räknades manuellt. Temperatur- och salthaltsmätningar av ytvatten registrerades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Flödesschema för initiering av monokultur av o. dioica.
a) Tre, 500 ml planktonprover samlas in från en provtagningsplats(B)Varje provburk späds ut och O. dioica isoleras från resten av plankton(C)En monokultur av O. dioica initieras genom att 120 Dag 3-djur överförs manuellt till en ny beaker som innehåller 5 L söt filtrerat havsvatten (fSW). Sätt upp en lekbägare som innehåller 30 honor, 15 hanar och 2,5 L färsk fSW. Den första morgonen efter lek (Dag1), noggrant tömma lekbägaren med den nya generationen djur i en bägare som innehåller 7,5 L färsk fSW. Den andra dagen efter leken (dag 2) överför 150 djur till en bägare som innehåller 5 L färsk fSW. På den tredje dagen efter leken (dag 3) överför du 120 djur till en bägare som innehåller 5 L färsk fSW. På den sista dagen (Dag 4), inrätta en ny lekbägare som innehåller 30 honor, 15 hanar och 2,5 L färska fSW som förberedelse för nästa generation. Djuren har en 4-dagars livscykel vid 23 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Identifiering av Oikopleura spp. (A-D: O. dioica,E och F: O. longicauda).
(A)Kvinna O. dioica med ägg (B) Hane O. dioica med spermier (C) Lateral vy av omogna O. dioica (D)Ventral syn på omogen O. dioica med två subchordal celler anges med vita pilar (E) Ventral syn på mogna O. longicauda bärande ägg (pil 1) och spermier (pil 2)f) Lateral vy av O. longicauda visar velum (pil 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagenser | Kemiska produkter | Belopp | Slutlig vol. (mL) | Sterilisering | Lager / Öppnat |
| Lösning A | Na2EDTA | 45 g | 1000 | Autoklav | -20 °C / 4 °C |
| NaNO3 | 100 g | ||||
| H3BO3 | 33,6 g | ||||
| NaH2PO4 | 20 g | ||||
| MnCl2·4H2O | 0,36 g | ||||
| FeCl3·6H2O | 1,3 g | ||||
| Lösning B | 1,0 ml | ||||
| Lösning B | ZnCl2 (På) | 2,1 g | 1000 | Autoklav | 4 °C / 4 °C |
| CoCl2·6H2O | 2,0 g | ||||
| (NH4)6Mo7O24·4H2O | 0,9 g | ||||
| CuSO4·5H2O | 2,0 g | ||||
| *HCl (HCl) | -- mL | ||||
| Vitamin | Tiamin (B1) · Hcl | 200 mg | 1000 | Autoklav | -20 °C / 4 °C |
| Biotin | 1 mg | ||||
| Kobalamin (B12) | 1 mg | ||||
| Natriumsilikat | Na2SiO3 | 5% | 1000 | 0,22 μm filter | 4 °C / 4 °C |
| Streptomycin | C21H39N7O12 | 25 mg/ml | 50 | 0,22 μm filter | -20 °C / -20 °C |
Tabell 1: Recept på reagenser som är nödvändiga för att upprätthålla algmat. Efter upplösning av all kemikalie som anges för lösning B tillsätts HCl tills lösningen blir klar utan grumlighet. Alla reagenser steriliseras antingen genom autoklavering (120 °C, 25 min) eller med hjälp av ett 0,22 m filter. Alla reagenser utom vitaminlagren steriliseras efter tillsats av specificerad kemikalie. För vitamin lager, autoklav vattnet först, och sedan lösa upp den listade kemikalien. Lagringstemperaturer för lager och öppnade reagenser listas.
| Typ av kultur | Alg spp. | ASW (ml) | Vitamin | Lösning A | Natriumsilikat | Streptomycin | Alger (mL) / Kulturtyp | Inkubera / Lagra | Frekvens |
| Lagerkultur | Chaeto (på en) | 60 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Endast Chaeto) |
1/1000 (Alla utom Syn) |
0,03 / lager | 17°C / 4°C | Varannan vecka |
| Iso | 60 | 0,03 / lager | |||||||
| Rhino | 80 | 0,06 / lager | |||||||
| Syn | 60 | 0,03 / lager | |||||||
| Underkultur | Chaeto (på en) | 500 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Endast Chaeto) |
1/1000 (Alla utom Syn) |
10 / lager | 17°C / 17°C | Vecka |
| Iso | 500 | 10 / lager | |||||||
| Rhino | 500 | 20 / lager | |||||||
| Syn | 500 | 10 / lager | |||||||
| Arbetskultur | Chaeto (på en) | 400 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Endast Chaeto) |
1/1000 (Alla utom Syn) |
100 / sub | RM / RM | Var fjärde dag |
| Iso | 400 | 100 / sub | |||||||
| Rhino | 400 | 150 / sub | |||||||
| Syn | 400 | 100 / sub |
Tabell 2: Instruktion för underhåll av tre algodlingstyper. Tillsätt den angivna mängden kosttillskott till kolvar som innehåller autoklaverat havsvatten. Inokulera varje kolv med specificerad mängd algodling. Inkubera och lagra algkulturer vid angivna temperaturer. Inokulera ny lagerkultur och subkultur från den tidigare lagerkulturen, och ny arbetskultur från den tidigare delkulturen. Inokulera ny lagerkultur, subkultur och arbetskultur varannan vecka, en vecka respektive fyra dagar. Detta schema ger tillräckligt med mat för cirka 10 bägare av O. dioica kultur. Underhåll 2 - 3 uppsättningar av varje algkultur typ som back-ups. RM – rumstemperatur.
| Dag | Alg spp. | 09:00 och 17:00 | 12:00 |
| 1 | Chaeto (på en) | — | — |
| Iso | 1000 | 2000 | |
| Syn | 20,000 | 40,000 | |
| 2 | Chaeto (på en) | 1000 | 2000 |
| Iso | 2000 | 2000 | |
| Rhino | 1000 | 1000 | |
| 3 | Chaeto (på en) | 3000 | 4000 |
| Iso | 3000 | 4000 | |
| Rhino | 1500 | 1500 | |
| 4 | Chaeto (på en) | 1000 | 2000 |
| Iso | 1000 | 2000 | |
| Rhino | 1000 | 1000 |
Tabell 3: Algkoncentration per utfodring, modifierad från bukett et al.27. Algkoncentrationer (celler mL-1) och algarter som används för daglig utfodring under Okinawa O. dioicas 4-dagars livscykel.
Kompletterande fil 1: Daglig utfodring diagram. Dagliga matningsmängder för varje odlingsbägare beräknas automatiskt efter att dagliga algabsorbensmätningar (OD), djurens storlek (Dag) och volymen av havsvatten (SW vol.) i varje kulturbämma. Tillväxtkurvorna för R. reticulata och Synechococcus sp. anpassades från Bouquet et al.27. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Hur man ansluter synkron motor till akryl paddel. Skruva fast paddeln ordentligt på motorn med hjälp av en sexkantsnyckel. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
För att underlätta flexibiliteten i inrättandet av O. dioica-kulturen är det viktigt att förstå djurens naturliga livsmiljö. Säsongsdata ger information om de fysiska parametrarnas intervall, som kan användas för att styra laboratorieodlingsförhållandena. Det hjälper också att förstå säsongsvariationer i överflödet av djur. I Okinawa, O. dioica är mest tillförlitligt hittas från juni till oktober. Men i Tokyo bay, populationer topp i februari och oktober41. Även om odling av O. dioica rapporteras ofta vid 20 °C eller lägre27,28,29, Okinawan O. dioica visar bättre överlevnad vid temperaturer över 20 °C; Detta kan förklaras av det faktum att den lägsta yttemperaturen havsvatten i Okinawa är ~ 20 ° C(Figur 6). Överflödet av O. dioica kan också påverkas av fytoplankton blommar42 och rovdjur överflöd43,44. Oavsett var O. dioica samlas in, förståelse säsongsvariationer lokalbefolkningen maximerar chansen att provtagning och odling framgång.
Med tanke på lämplig säsong och plats är nettoprovtagning ett effektivt sätt att samla in ett stort antal Oikopleura med minimal ansträngning. Planktonnät med mindre maskstorlek (60-70 μm) får också användas för att samla alla stadier av djuren. Fullt mogna djur finns sällan i nätet, kanske på grund av deras bräcklighet i slutet av livscykeln. Därför uppnås artidentifiering följt av provtagning genom mikroskopisk observation av subchordalceller. Mogna individer uppträder vanligtvis en eller två dagar efter provtagningen när djuren fortsätter att växa i laboratoriet. Även om nettoprovtagningen är effektiv kan alternativa provtagningsmetoder vara nödvändiga under olika omständigheter. Till exempel kan nettoprovtagning nära stadsområden samla in ett stort antal fytoplankton, vilket gör det svårt att isolera Oikopleura. I sådana fall rekommenderas enkel provtagning av skopan för att samla upp provtagning på grundvatten eller båt från områden utanför hamnen. Resultaten visade att den gradvisa förändringen i salthalt på grund av på varandra följande dagar av regn inte påverkade överflödet av O. dioica; Landprovtagning omedelbart efter extrema väderförhållanden, såsom tropiska cykloner, bör dock undvikas. Dessa händelser orsakar plötsliga och drastiska biogeokemiska förändringar i en skyddad vattenförekomst45,46. Dagvatten avrinning kan bära föroreningar, sediment, och överskott näringsämnen, vilket ökar grumlighet och lägre vattenkvalitet47. Filter-utfodring plankton, såsom Oikopleura, kan vara särskilt mottagliga för dessa förändringar på grund av deras sätt att mata och begränsad rörlighet. I sådana fall rekommenderar vi att du skjuter upp provtagningen i några dagar tills de lokala förhållandena återgår till det normala.
Införandet av ett flerstegsfiltersystem är nödvändigt för att upprätthålla små filtermatningsorganismer som O. dioica. Med hjälp av dåligt filtrerat havsvatten (till exempel ett 25 μm maska i det tidigare kultursystemet) var kulturen ofta instabil, särskilt under sommaren, vilket kan bero på det högre överflödet av fytoplankton. Även om vissa fytoplankton är till nytta för O. dioica tillväxt, andra producerar biotoxiner som kan orsaka onormal utveckling av O. dioica embryon48. Dessutom är en hög koncentration av kiselalger som Chaetoceros spp. potentiellt skadliga för O. dioica tillväxt eftersom de kan ha lång setae som kan täppa till huset och förhindra effektiv utfodring49. Vi observerade ofta hus av små djur som är igensatta av C. calcitrans setae; Därför matar vi nu C. calcitrans endast till djur dag 2 och äldre (tabell 3).
Även om det inte var ett problem här, småskaliga långsiktiga odling av O. dioica kan uppleva plötsliga droppar i befolkningsstorlek på grund av en genetisk flaskhals; I sådana fall rekommenderar Martí-Solans et al.29 att lägga till nya vilda individer i kulturen var 20:e generation.
Oikopleura kultursystem är flexibelt. En stabil kultur kan etableras inom en vecka. Långsiktig odling av O. dioica är möjlig på en blygsam budget med icke-specialiserad utrustning. Den dagliga ansträngning som krävs för underhåll av 5-10 bägare av Oikopleura är i allmänhet mindre än 2 timmar med 2 personer. O. dioica kan också bibehållas i konstgjort havsvatten, vilket är fördelaktigt för dem som inte har tillgång till naturligt havsvatten28. Långtidsförvaring av algmat är möjlig med hjälp av fast kultur och kryobevarande29. Dessutom kan O. dioica spermier cryopreserved, och förbli livskraftig i mer än ett år50. Alla dessa faktorer innebär att kulturer lätt kan återupprättas. Slutligen tidigare erfarenheter med oavsiktlig odling av Pleurobrachia sp. kan föreslå att det odlingssystem som utvecklats för Oikopleura potentiellt skulle kunna utvidgas till en bredare gemenskap av ömtåliga pelagiska organismer.
O. dioica fortsätter att ge kraftfulla insikter i olika biologiska fält. En förståelse för lokala säsongsvariationer, ett minutiöst kultursystem och några engagerade individer gör det möjligt att etablera en effektiv kultur med liten ansträngning. Oikopleura kultursystem ger baslinjen resurser för att undersöka ett brett spektrum av biologiska områden som rör ekologi, utveckling, genomik och utvecklingen av denna unika marina chordate.
Disclosures
Författaren har inget att deklarera.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Garth Ilsley för hans stöd för att etablera kultursystemet. Vi erkänner Ritsuko Suyamas och Sylvain Guillots bidrag till tidig provtagning och artidentifiering. Ett särskilt tack till Hiroki Nishida, Takeshi Onuma och Tatsuya Omotezako för deras generösa stöd och vägledning i hela, inklusive det lokala odlingssystemet och delning av djur och mikroalgalkultur. Vi tackar också Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro och Alfonso Ferrández-Roldán för att de delar med sig av sin expertis inom provtagning och odling. Jai Denton, Charles Plessy och Jeffrey Jolly gav ovärderlig feedback på manuskriptet. Charlotte West formulerade en generaliserad ekvation för algberäkning. Slutligen tackar vi OIST för finansiering, Mary Collins och OIST Fieldwork Safety Committee för råd om säkra provtagningsförfaranden, personalen på OIST maskinverkstad för byggandet av odlings- och provtagningsutrustning, och Koichi Toda för leverans av havsvatten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
| Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
| Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
| Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
| Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
| Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
| Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
| Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
| Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
| TCW-5N-PPS | |||
| TCW-1N-PPS | |||
| Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
| Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
| Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
| Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
| Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
| UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
| Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |
References
- Travis, J. Is It What We Know or Who We Know? Choice of Organism and Robustness of Inference in Ecology and Evolutionary Biology (American Society of Naturalists Presidential Address). The American Naturalist. 167 (3), 303-314 (2006).
- Jenner, R. A., Wills, M. A. The choice of model organisms in evo-devo. Nature Reviews Genetics. 8 (4), 311-314 (2007).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wilson, S., Ruhl, H., Smith, J. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Steinberg, D. K., Lomas, M. W., Cope, J. S. Long-term increase in mesozooplankton biomass in the Sargasso Sea: Linkage to climate and implications for food web dynamics and biogeochemical cycling. Global Biogeochemical Cycles. 26 (1), 1004 (2012).
- Lombard, F., Kiørboe, T. Marine snow originating from appendicularian houses: Age-dependent settling characteristics. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. 57 (10), 1304-1313 (2010).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 251-264 (1998).
- Hopcroft, R. R. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 45-57 (2005).
- Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e59832 (2019).
- Deibel, D. Feeding mechanism and house of the appendicularian Oikopleura vanhoeffeni. Marine Biology. 93 (3), 429-436 (1986).
- Spada, F., et al. Molecular patterning of the oikoplastic epithelium of the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 20624-20632 (2001).
- Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , Contemporaty Publishing International. 59-85 (2005).
- Tokioka, T. Studies on the distribution of appendicularians and some thaliaceans of the North Pacific, with some morphological notes. Publication of the Seto Marine Biological Laboratory. (8), 351-443 (1960).
- Alldredge, A. L. Discarded appendicularian houses as sources of food, surface habitats, and particulate organic matter in planktonic environments. Limnology and Oceanography. 21 (1), 14-24 (1976).
- Clarke, C., Roff, J. C. Abundance and biomass of herbivorous zooplankton off Kingston, Jamaica, with estimates of their annual production. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 31 (4), 423-437 (1990).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Zooplankton growth rates: extraordinary production by the larvacean Oikopleura dioica in tropical waters. Journal of Plankton Research. 17 (2), 205-220 (1995).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Production of tropical larvaceans in Kingston Harbour, Jamaica: are we ignoring an important secondary producer. Journal of Plankton Research. 20 (3), 557-569 (1998).
- Mochioka, N., Iwamizu, M. Diet of anguilloid larvae: leptocephali feed selectively on larvacean houses and fecal pellets. Marine Biology. 125 (3), 447-452 (1996).
- Sakaguchi, S. O., et al. Morphological identity of a taxonomically unassigned cytochrome c oxidase subunit i sequence from stomach contents of juvenile chum salmon determined using polymerase chain reaction. Fisheries Science. 83 (5), 757-765 (2017).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 25-34 (1998).
- Sato, R., Tanaka, Y., Ishimaru, T. House production by Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) under laboratory conditions. Journal of Plankton Research. 23 (4), 415-423 (2001).
- Flood, R., Deibel, D. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 105-124 (1998).
- Alldredge, A. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 309-326 (2005).
- Katija, K., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. New technology reveals the role of giant larvaceans in oceanic carbon cycling. Science Advances. 3 (5), 1602374 (2017).
- Katija, K., Choy, C. A., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. From the surface to the seafloor: How giant larvaceans transport microplastics into the deep sea. Science Advances. 3 (8), 1700715 (2017).
- Hidaka, K. Species composition and horizontal distribution of the appendicularian community in waters adjacent to the Kuroshio in winter-early spring. Plankton and Benthos Research. 3 (3), 152-164 (2008).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359-370 (2009).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: culture, genome, and cell lineages. Development, Growth & Differentiation. 50, 239-256 (2008).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica culturing made easy: A Low-Cost facility for an emerging animal model in Evo Devo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), 146-152 (2016).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Seo, H. C., et al. Miniature genome in the marine chordate Oikopleura dioica. Science. 294 (5551), 2506 (2001).
- Fredriksson, G., Olsson, R. The subchordal cells of Oikopleura dioica and O. albicans (Appendicularia, Chordata). Acta Zoologica. 72 (4), 251-256 (1991).
- Paffenhöfer, G. A. The cultivation of an appendicularian through numerous generations. Marine Biology. 22 (2), 183-185 (1973).
- Fenaux, R., Gorsky, G. Nouvelle technique d'élevage des appendiculaires. Rapports et Procés-Verbaux des Réunions-Commission Internationale pour l'Exploration Scientifique de la Mer Méditerranée. 29, 291-292 (1985).
- Fujii, S., Nishio, T., Nishida, H. Cleavage pattern, gastrulation, and neurulation in the appendicularian, Oikopleura dioica. Development Genes and Evolution. 218 (2), 69-79 (2008).
- Patry, W. L., Bubel, M., Hansen, C., Knowles, T. Diffusion tubes: a method for the mass culture of ctenophores and other pelagic marine invertebrates. PeerJ. 8, 8938 (2020).
- Fenaux, R. The classification of Appendicularia (Tunicata): history and current state. Memoires de I'Institut oceanographique. , (1993).
- Shiga, N. Illustrated Guide to Marine Plankton in Japan. Chihara, M., Murano, M. , Tokai University Press. 1393-1414 (1997).
- Gorsky, G., Castellani, C. Marine Plankton: A practical guide to ecology, methodology, and taxonomy. Castellani, C., Edwards, M. , Oxford University Press. 599-606 (2017).
- Sato, R., Ishibashi, Y., Tanaka, Y., Ishimaru, T., Dagg, M. J. Productivity and grazing impact of Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) in Tokyo Bay. Journal of Plankton Research. 30 (3), 299-309 (2008).
- Nakamura, Y., Suzuki, K., Suzuki, S. Y., Hiromi, J. Production of Oikopleura dioica (Appendicularia) following a picoplankton 'bloom'in a eutrophic coastal area. Journal of Plankton Research. 19 (1), 113-124 (1997).
- Nakamura, Y. Blooms of tunicates Oikopleura spp. and Dolioletta gegenbauri in the Seto Inland Sea, Japan, during summer. Hydrobiologia. 385 (1-3), 183-192 (1998).
- Uye, S. I., Ichino, S. Seasonal variations in abundance, size composition, biomass and production rate of Oikopleura dioica (Fol)(Tunicata: Appendicularia) in a temperate eutrophic inlet. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 189 (1-2), 1-11 (1995).
- Tsuchiya, K., et al. Phytoplankton community response and succession in relation to typhoon passages in the coastal waters of Japan. Journal of Plankton Research. 36 (2), 424-438 (2014).
- Lopez-Lopez, L., et al. Effects of typhoons on gelatinous carnivore zooplankton off Northern Taiwan. Cahiers de Biologie Marine. 53, 349-355 (2012).
- Ares, Á, et al. Extreme storm-induced run-off causes rapid, context-dependent shifts in nearshore subtropical bacterial communities. bioRxiv. , (2019).
- Torres-Águila, N. P., et al. Diatom bloom-derived biotoxins cause aberrant development and gene expression in the appendicularian chordate Oikopleura dioica. Communications Biology. 1 (1), 1-11 (2018).
- Troedsson, C., Frischer, M. E., Nejstgaard, J. C., Thompson, E. M. Molecular quantification of differential ingestion and particle trapping rates by the appendicularian Oikopleura dioica as a function of prey size and shape. Limnology and Oceanography. 52 (1), 416-427 (2007).
- Ouchi, K., Nishino, A., Nishida, H. Simple procedure for sperm cryopreservation in the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Zoological Science. 28 (1), 8-11 (2011).
