Summary
目前的协议演示了一个简单的方法来跟踪腹腔四分位区域 （VTA） 谷氨酸投影到海马。VTA谷氨酸神经元的光刺激与CA1记录相结合，以演示VTA谷氨酸终端如何调节CA1假定金字塔发射率在体内。
Abstract
大脑中神经元亚群的光遗传调节使研究人员能够解剖体内和前体内的神经回路。这为确定神经元类型在神经回路中的作用及其在信息编码中相对于学习的意义提供了前提。同样，该方法也可用于测试清醒和麻醉动物中两个或两个以上相连的大脑区域的生理意义。目前的研究展示了VTA谷氨酸神经元如何调节麻醉小鼠CA1（海马）中假定金字塔神经元的发射速率。该协议采用腺相关病毒 （AAV） 依赖 VTA 谷氨酸神经元的标签，用于追踪海马层中的 VTA 早熟谷氨酸终端。AAV载体所蕴藏的光控制蛋白（通道罗多普辛;hChR2）和荧光蛋白（eYFP）的表达允许对VTA谷氨酸终端进行机前追踪，并可对VTA谷氨酸神经元细胞体（在VTA中）进行光刺激。高阻抗急性硅电极被放置在CA1中，以检测体内对VTA光刺激的多单元和单单元反应。这项研究的结果表明，在海马体（CA1，CA3和DG）中，早熟VTA谷氨酸终端的层依赖分布。此外，VTA谷氨酸神经元的光刺激增加了假定CA1金字塔单位在体内的发射和爆发率。
Introduction
在过去的十年中，开发了一系列遗传工具，以提高神经元类型调制的特异性，并绘制复杂的神经网络图谱1。值得注意的是，神经元细胞中具有内在感染和复制能力的神经毒性病毒已被部署用于表达或消融神经元亚类型的特定蛋白质。当含有荧光蛋白或基因编码突触活性指标时，转染AAV载体标签，并划出大脑区域2、3的神经网络。AAV 结构中的发起人选择指导具有一定特定性的神经元类型（促进者依赖表达）的载体表达。然而，通过Cre-lox重组，AAV结构被部署在神经元标记4，5，6，7的更大特异性。值得注意的是，在AAV载体中包装的光活化微生物蛋白和荧光蛋白可以用各种神经元亚型8来表达，非常适合成像、神经元型电路追踪和光调制9、10。
AAV 构建立体注射到大脑区域（或细胞核）中，驱动报告人蛋白质在索马、树突和轴突终端中的表达。AAV的神经表达含有记者基因（eYFP），有助于神经元细胞体的标签和分析跟踪投影到和从其他大脑区域11，12，13，14。AAV-eYFP结构携带光控制蛋白（例如hChR2），可以作为成像6，15和基于刺激的生理跟踪神经投影的工具，以目标大脑区域在体内16。根据 AAV 血清类型，神经元标记的方向可能是机前或逆行11，12。先前的研究已经证实，AAV5在神经元12中会异常旅行。因此，表达hChR2的细胞体的光刺激在大脑（目标）17的其他地方产生先天效应。
在这里，AAV（血清型5）与CaMKII®促进器被用来表达eYFP（记者）和hChR2（蛋白）在VTA谷氨酸神经元和轴向投影。这项研究的结果证明了VTA-谷氨酸早产终端在CA1、CA3和DG海马区域的层依赖分布。此外，与基线值相比，VTA 谷氨酸神经元的光刺激增加了 CA1 多单元和单单元活体中的发射速率。该协议使用经济实惠的工具和商用软件，可以提高从神经回路跟踪实验获得的数据质量。
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Protocol
所有实验和动物处理程序都得到了路易斯安那州立大学兽医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 实验动物
- 使用5至6周大的小鼠。
- 在12小时交替光和暗循环的标准条件下，每笼有3至5只动物。食物和水应该提供。
2. 颅骨切除术和动物制备
注：本节描述了小鼠颅骨切除术的术前和术前手术程序。使用标准立体定向仪器和适当的坐标（前哨：AP、医疗：ML 和多索文特：DV）。参考小鼠大脑地图集，以确定感兴趣的大脑区域的坐标。
- 通过腹内氯胺酮（100毫克/千克）/西拉津（10毫克/千克）鸡尾酒注射麻醉小鼠。进行脚趾捏测试，以确保手术开始前没有感觉。
注：另外，伊索夫卢拉内麻醉与适当的鼻腔也可以用于这一步骤。 - 轻轻地将动物的头部固定在立体定向仪器上。
注意：在此过程中，谨慎处理动物非常重要。此外，在手术前检查呼吸速率和其他生命体征。让动物休息7分钟，以减轻压力。- 在立体声框架上放置一个加热垫，使动物的身体躺在它身上。这将有助于保持体温和保持动物温暖，虽然出程序。保留加热垫，用于术后护理和恢复。
- 使用剪子去除头皮上的头发，并用碘溶液清洁皮肤。
- 应用局部利多卡因来阻止头皮上的感觉。
- 使用手术刀使中线头皮切口从正面延伸到腹膜区域。
- 用碘溶液清洁切口区域，然后暴露钙化物。
注：少量的3%过氧化氢溶液可用于从钙化物中去除腹膜。这将提高地标（布雷格玛和兰姆达）和缝合线的能见度。 - 使用鼠标大脑立体战术地图集，确定AP和ML坐标相对于布雷格玛。
- 对于 VTA 注射，将超细钝点针注射器（例如神经注射器）放置在坐标 AP： -3.08 mm/ML： 相对于布雷格玛 0.5 mm。
- 使用钻孔工具在标有 AP/ML 坐标的头骨上钻一个 1 mm 孔（颅骨切除术）。
注：此步骤需要高度谨慎。在钻探时应施加最小的压力，以防止钻头压碎脑组织。在目前的研究中，钻头为 0.8 mm，钻头速度设定为 15，000 rpm。
警告：如果在清洁切口或钙化物时使用过氧化氢，请确保完全去除溶液或允许在钻探前完全干燥。
3. AAV 鸡尾酒注射
注：本节描述了AAV注射到成年C57BL/6小鼠VTA（23×27克）的过程。上述方法可用于使用标准立体战术装置和适当的坐标将 AAV 注射到任何大脑区域。为了证明这个协议，eYFP和hChR2在VTA谷氨酸神经元中使用AV5介质的转染在CaMKII®促进器下表达（图1）。Cre-lox重组也可用于此步骤。
- 将带超细钝点针的注射器（32 G;5 μL 容量，100 nL 精度）安装在喷油器上。将注射器支架固定在微操纵器上。
注：对于此过程，使用了具有 1.6 nL 校准的手动注射器支架。还可使用自动喷油器。 - 将注射器装满双蒸馏水，以清洁和测试液体的流动。
- 在冰上解冻 AAV （血清型 5） 鸡尾酒的酒。AAV 最好存储在 -80 °C 下，以保持病毒滴答声以获得良好的表达。
- 将安装的注射器填充 1，000 nL 的 AAV 溶液（磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 10 mM，pH 7.4）。在将针头放入注射部位之前，分配 AAV 溶液的 10 nL 以确认液体的流动。
- 使用微操纵器将针头立体定向降低到所需的深度（DV 坐标）。将针头降低到所需的深度后，让注射器在注射前保持原位 10 分钟。
注：对于此程序，针头从大脑的皮层表面以 4.5 mm 的深度 （DV） 降低到 VTA 中。对于其他大脑区域，使用适当的多索文特坐标（指小鼠大脑地图集）。 - 向 VTA 注入 600 至 800 nL 的 AAV。注射量可根据目标站点的大小进行调整。
- 以 60 nL/min（3 分钟间隔）的速度交付 AAV 解决方案。
- 要在 VTA 谷氨酸神经元和投影中表达 eYFP 和 hChR2，注射 AAV-卡姆基®-ChR2-eYFP。
注 ：Cre-lox 重组方法也可以根据实验目标使用。 - 在 AAV 注射后，让针头保持原位 15 分钟。这将减少扩散和回流。
- 取下注射器针头，然后缝合切口以关闭伤口。
- 作为术后护理的一部分，使用抗生素和镇痛剂。将鼠标放在一个温暖的填充平台上，并监视动物直到醒来。
注：注射3周后，通过在小鼠大脑部分检测记者蛋白（eYFP）的荧光，可以观察到AAV表达。此外，光刺激实验可以在3周后进行（图2）。
4. 设置为带光遗传学的体内神经记录
注：本节描述了急性神经记录的步骤与大脑回路的光遗传学跟踪（VTA谷氨酸神经元投影到CA1）。如有必要，请在开始此步骤之前检查系统（放大器和连接）是否有电气噪声和接地问题。在法拉第笼子中执行此步骤有助于消除录音中的电气噪音。
- 在 AAV 注射后 3 周，通过腹膜尿素注射（0.2 毫克/千克）麻醉小鼠。
警告：尿素是致癌的，必须谨慎处理，而穿着防护装备。此外，在这个浓度下进行尿素麻醉是非生存的。 - 将动物的头部贴在如前所述的立体刻画框架上（第 2.2 步， 图 3A）。进行颅骨切除术，以暴露杜拉（图3A）。使用钻孔工具（位大小：0.8 mm，速度：15，000 rpm）去除部分骨骼。
- 颅骨切除术应约3毫米×4毫米宽。将人工脑脊液 （aCSF） 滴到此区域，以防止干燥。
- 在解剖（数字）显微镜下，使用弯曲的针尖（27 G）切除暴露的杜拉。小心不要拉开这个区域细腻的皮叶覆盖物和皮质组织。
- 在腹骨上钻一个洞（位大小：0.8毫米，速度：10，000转/分）抱住地面螺丝（平头菲利普斯螺丝：M0.6 x 2.0 毫米）。
- 连接不锈钢接线。
注：其他类型的电线也可以使用（图3b）。 - 对于合并光刺激 （VTA） 和神经记录 （CA1），请使用配备超细（10 μm 或 1 μm） 微操纵器的多轨立体定型处理设备。分别在 10 μm 范围和 1 μm 范围微操纵器上安装光纤并记录神经探头。
- 如有必要，请使用头部舞台探针适配器（图3c）。
注：在当前协议中，32 通道头台装有适配器，可容纳 4 通道录制电极（图3d）。不锈钢接地线焊接到适配器的地面连接端口。
- 如有必要，请使用头部舞台探针适配器（图3c）。
- 在协调 AP： -3.08 mm ML： 0.5 毫米， 降低 400 μm 直径光纤到 VTA.
- 在降低光纤之前，将铁杉连接到与光纤耦合 LED 源相连的光纤电缆（不锈钢或陶瓷铁杉）。
注意：确保光线强度和焦点随需设置。LED 光源的选择应与目标操作相对应。在这里，一个470纳米（蓝光）LED驱动器用于hChR2光激活（图4a）。 - 要将光脉冲与神经记录同步，将 LED 驱动程序和录制控制器数字 IN 端口连接到晶体管晶体管逻辑 （TTL） 脉冲器 （图 4b）。这可以通过 BNC 拆分器实现。
注：使用TTL脉冲器可灵活地以数字方式设置所需的脉冲列车频率和持续时间。在当前协议中，10 ms 光脉冲在 50 Hz18触发。对于 LED 驱动程序的 TTL 控制，将驱动程序切换为"触发器"。在此模式下，光强度可以通过转动"旋钮"来调节。刺激频率可以调整以适应实验变量，范围从 1 到 100 Hz。对于神经回路追踪，建议刺激频率为 >20 Hz。 - 调整旋钮，以确定有效强度，可以在不产生光电伪影的情况下产生响应。如有必要，重新定位光纤以消除人工制品19。
注：当前协议中使用的 LED 驱动程序产生的光功率为 ±21.8 mW。
- 在降低光纤之前，将铁杉连接到与光纤耦合 LED 源相连的光纤电缆（不锈钢或陶瓷铁杉）。
5. 神经记录
- 使用 15°50 μm 厚柄的急性神经探针，长度至少为 5 毫米。
注：从深层大脑结构进行记录需要用更长的刀柄进行神经探针。在目前的研究中，使用了一个20毫米柄长的探针。 - 通过串行外设接口 （SPI） 电缆将预放大器头阶段连接到录制控制器。检查录制控制器端口上的 LED 颜色照明。绿色和黄色 LED 表示连接放大器板上的适当电压。红色 LED 表示工作软件头级控制（图 5b）。
- 使用微操纵器，将电极接触点放置在 CA1 的金字塔细胞层中（AP： -1.94mm，ML：+1.0mm，DV：+1.1 至 1.2mm）。
注：光纤和电极可以放置在其他所需的大脑区域进行光刺激和记录。
6. 放大器和滤光片设置
- 通过 USB 3.0 端口将录制控制器放大器系统连接到计算机。使用 SPI 电缆将头部阶段连接到放大器。启动控制器软件。如果连接不当，系统将显示"找不到设备"消息。
- 单击 "运行" 查看频道上的活动。每个波形被绘制为电压（y轴）与时间（x轴）。根据感兴趣区域，调整电压和时间尺度以调整波形显示。
- 如果只有少数通道处于活动状态，则禁用未使用的通道以减少存储盘上的文件大小。
- 通过编辑采集软件上的带宽参数来设置采样速率和截止频率。对于单单元录制，将上下截止频率分别设置为 300 Hz 和 5，000 Hz。将放大器采样速率更改为 30 kS/s。
注：选择高抽样率将产生更大的文件大小。 - 在录制之前，请通过测量 1，000 Hz 的阻抗性来检查电极通道的完整性。这可以通过在用户界面（控制器软件）中启动功能来完成。工作通道的阻抗值范围应为 0.1 至 5 MΩ。
- 如果音频输出（扬声器）连接到 模拟输出 端口，请调整 增益 和 消音器 以获得最佳峰值声音。
- 要在峰值记录中显示 TTL 脉冲列车标记，可启用 数字 IN 标记的显示。要记录脉冲列车时间戳，请在主实验前启用 数字 IN 通道显示。
注：通常有多个"数字"通道（1 或 2）。确保来自 TTL 脉冲器的 BNC 电缆连接到选定用于录制控制器软件中显示的"数字 IN"端口。 - 要实时查看峰值波形，请打开峰值示波窗口，并使用鼠标单击设置阈值。
- 通过监控根平均方块（μV 中的 RMS）来检查噪声水平。对于干净的峰值记录，首选神经峰值阈值至少为 5 倍 RMS。
- 设置完成后，选择文件输出格式。
注：在这里，CA1神经尖峰被记录在.rhd格式。还可以选择其他文件格式（.rhs 和 .dat）来匹配分析软件允许的文件格式。
7. 在体内光遗传学记录和设置
- 打开脉冲控制软件 （TTL），显示各种可调脉冲参数。在软件上选择适当的 COM 端口。通过调整 列车 和 组 设置设置脉冲参数。
注：脉搏条件应通过考虑实验变量和设计来确定。 - 在放大器控制器软件上，单击 "运行" 以检测海马区或所需大脑区域的神经尖峰。如有必要，调整电极深度以检测可行和活跃的神经元。
- 一旦检测到细胞外电压活动，观察基线尖峰15分钟，并监测动物的生命体征。此外，测试光脉冲以检测CA1或所需的解剖目标区域内反应灵敏的神经元。
注意：检查光电器件，并通过调整光强度或光纤位置消除。 - 在以所需的频率触发光脉冲之前，将基线活动记录为 ±10 分钟（图 5a，b）。这将允许比较有照明和没有照明的射击或爆裂率。
注：在目前的研究中，基线活动被记录为10分钟没有照明，其次是照明在50赫兹（电影1）。
8. 分析
- 将 .rhd 文件转换为 Nex5 输出格式。
- 处理文件名。Nex5 文件在离线分拣软件中检测单个单元拉斯特列车和波形 （图 5a×b）。
- 从下拉窗口中选择所需的通道。
注：可在 OFSS 的单独窗口上查看连续录制的峰值数据。时间尺度也可以调整。如果使用四重奏，可以设置 OFS 将 4 个通道排序为四重奏。 - 设置阈值交叉波形提取的电压级别。
警告：使用至少 5 倍 RMS 进行适当的峰值检测。 - 检测波形，然后使用寻谷（自动）或 K 形（半自动）方法执行峰值排序。必要时，合并占据 3D 主组件分析 （PCA） 空间类似区域的单位。
- 出口分类。Nex5 文件供进一步分析 （图 5c×d）。
注：对间尖间隔、发射速率和爆裂率的分析结果可导出到其他分析平台。
- 从下拉窗口中选择所需的通道。
9. AAV 表达物的荧光检测
- 录音后，在异黄素室对动物实施安乐死。
- 用 10 mM PBS （+10 mL） 进行跨心灌注，然后用 4% 磷酸盐缓冲的副甲醛 （PB-PFA， +10 mL） 进行。
- 将整个大脑完整地取出，并将其固定在 4% PB-PFA 中，保持 48 小时。
- 将固定的大脑转移到 4% PB-PFA 中，其中含有 30% 蔗糖，在 4 °C 下进行低温保存。 72小时后，将大脑切成低温，并将切片安装在明胶涂层的幻灯片上。
注：在当前协议中，选择包含海马封闭部分（星体）的部分，以演示 DG、CA3 和 CA1 中的 AAV 标记终端。
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Representative Results
羚生追踪
AAV表达通过C57BL/6小鼠注射后21天（图2）的记者蛋白（eYFP）免疫荧光成像进行验证。在海马区成功标记了早产VTA谷氨酸投影，也通过在DG、CA3和CA1层的eYFP检测（图6a+d：电影2和3）。
VTA 谷氨酸预测海马调节 CA1 活动
VTA谷氨酸神经元的光刺激增加了假定金字塔CA1神经元的活性。与光关闭阶段（图5a a b）相比，光开阶段（电影1）期间的尖刺事件增加，这是显而易见的。为了支持这一结果，对CA1网络发射率之前（光关闭;基线）和（光开）后的光刺激率的统计比较显示，刺激后期（图7a;p= 0.0002）显著增加。随后对检测爆裂的拉斯特列车（2+4 峰值在 <16 ms） 的分析也表明，在 VTA 谷氨酸光刺激（图 7b;p = 0.0025）之后，CA1 假定金字塔神经元的爆发率有所上升。统计（学生测试）分析是用标准软件执行的。在这里，基线（光关闭）发射或爆裂率与光开（光刺激）值进行比较。
图1：AAV-卡姆基-ChR2-eYFP注射到C57BL/6鼠标VTA的示意图图。
VTA 神经元的逆行标记和海马的轴向投影。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：荧光图像显示AV-卡姆基-ChR2-eYFP在VTA和光纤轨道中的表达。
Dk： 达克舍维茨的核， scp： 优越的小脑皮， Vta： 腹腔四肢区域， 和 Rm： 复古原子核。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：颅骨切除术、电极放置和光纤放置演示。
（A） 中线切口暴露颅骨（b： 布雷格玛，oc：腹骨）。（B） 将地面螺丝（gs）放置在腹骨和连接不锈钢接地线（gw）中。（C） 光纤管的立体定向定位（foc：光纤电缆）。（D） 光纤管和神经探针柄的立体定向定位（foc：光纤电缆，adp：适配器，ms：交配套，prs：探针柄，hs：头部阶段）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：BNC拆分连接，用于组合光脉动和放大器（触发）时间戳。
（A） 从光纤灯管尖端发射LED光的演示。（B） TTL 脉冲通过 BNC 拆分适配器控制 LED 和时间戳放大器 （放大器） 录制。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：连续记录的峰值列车（原始数据），单单元检测。
（A） 麻醉老鼠海马的原始记录的屏幕抓图。（B） 原始录音中 VTA 的 TTL 驱动照片照明。浅蓝色线条显示光开（+470nm）周期和刺激频率的时间戳。（C/D）连续记录尖峰列车和神经元单位由尖峰排序派生。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：代表荧光图像，显示海马区AAV-卡姆基-ChR2-eYFP的表达。
（A） DG （GCL： 粒状细胞层， 希尔： 希卢斯）.（B） CA3 的一部分接近 DG （SL： 层层拉库诺姆， 皮尔： 金字塔细胞层） 。（C） CA3 适当。（D） CA1 （所以： 地层奥里安， 皮尔： 金字塔细胞层， rad： 地层辐射） 。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：照片刺激前后发射速率的统计比较。
（A） 在照片照明后，证明 CA1 （***p = 0.0002） 中假定金字塔神经元单位的平均发射速率 （Hz） 增加的条形图。（B） 条形图显示照片照明后假定 CA1 神经元的爆发率增加 （**p = 0.0025）。错误栏：平均标准误差。请单击此处查看此图的较大版本。
电影1：放大器控制器和脉冲器软件的屏幕抓图记录。 影片演示了基准记录（光关闭），然后是用蓝色时间戳表示的光刺激（亮开，=470 nm）。 请点击这里下载此视频。
电影 2 和电影 3： 鼠标 DG 中的 VTA 谷氨酸终端的 3D 插图。 DAPI 蓝色：颗粒细胞层 （GCL） 中的核标签：eyfp - 绿色： Dg hilus 中标记 Vta 终端的 Aav 。请点击这里下载这些视频。
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Discussion
在过去的十年中，AAV结构的设计有了显著的进步。因此，更多的神经元特异性促进剂已被纳入AAV血清型阵列，以改善转染特异性14。通过结合荧光蛋白、运输器、受体和离子通道的基因，AAV 的库现在用于成像、神经调节和突触活动检测。在商业上可用的AAV结构中，基因编码的荧光和离子通道（opsin）的组合允许神经解剖学和电生理学的神经回路14，18，19的组合。同样，选择促进器（或cre-lox重组方法）可以允许在电路内跟踪神经元类型特定的投影。在目前的研究中，该协议被部署用于对海马（CA1区域）的VTA谷氨酸神经投影进行解剖和电生理评估。
VTA-希波坎普斯神经回路
VTA 是中脑中皮质通路的一部分。VTA对参与奖励和厌恶学习的大脑区域的预测已经广泛证明20，21，22，23，24，25。虽然VTA含有多巴胺、谷氨酸和GABA神经元，但多巴胺神经元群体在解剖学上占主导地位。VTA在厌恶和奖励学习的主要功能归因于一个强大的VTA多巴胺投影到细胞核和背拉菲核22，24，25，26，27，28。虽然VTA多巴胺和谷氨酸神经元项目海马，解剖占主导地位的VTA谷氨酸终端的功能是较少研究相比，VTA多巴胺终端在海马区29，30。
当前协议描述了使用 AAV5 结构，其中含有氟磷 （eYFP） 和光控制蛋白 （hChR2），用于绘制海马区卡姆基®表达 VTA （谷氨酸） 终端的映射。先前的研究已经确定，VTA谷氨酸终端在海马体中在解剖学上占主导地位，而VTA多巴胺终端为29。为了证明在海马区VTA谷氨酸前终端，AAV（5）-卡姆基®-hChR2-eYFP被转移到VTA神经元细胞体中。这标记了细胞体VTA谷氨酸神经元（在VTA内），并概述了海马层内的VTA谷氨酸终端。
虽然VTA谷氨酸早产终端内附DG，CA3和CA1，结果显示这三个区域的层依赖变化（图6a/d）。在 DG 中，与颗粒细胞层相比，标有 VTA 谷氨酸终端的 AAV 在溶胶中在解剖学上占主导地位。在CA3中，VTA谷氨酸终端相对丰富的地层拉库诺森相比，金字塔细胞层和层骨质。而在CA1中，VTA谷氨酸终端与金字塔细胞层相比，显著内化树突状层（层状或拉迪亚图姆）。这项研究的结果还表明，VTA谷氨酸神经元细胞体的光刺激调节了CA1神经网络在体内的活动。VTA谷氨酸神经元的光刺激导致CA1发射率和爆发率在光刺激时代显著增加（图7a a/b）。这符合VTA谷氨酸终端在CA1树突层（图6d）的解剖分布，它可能会对海马信息编码产生影响。为了支持这一观察，其他研究表明，VTA是海马工作记忆编码的主要决定因素，并规范通过VTA-海马环路22、23、24、25、26、27、28、29、31、32在长期记忆中存储的信息的选择。 33，34.
技术考虑
要成功实施此协议，AAV 结构的选择应根据要针对的神经元类型确定。研究人员必须确定一个合适的促进者（基因产物），这是独特的神经元类型要瞄准。在目前的研究中，一个CaMKI®促进器被用来驱动卡姆基®表达神经元的eYFP和hChR2的表达。但是，也可以使用cre-lox重组方法。在这种情况下，在卡姆基®-克雷小鼠的VTA中可以表达双牙线AAV5。促进器和基于cre-lox的表达方法也适用于其他神经元类型35，36，37。
应检查系统是否发出电气噪音。这可以通过在试用录制会话期间在峰值范围内评估 RMS 来完成。如果需要，系统和立体定向设备应安置在法拉第笼子中，而放大器地面与笼子相连。电极接触点可以线性排列或四重奏。探针设计的选择应根据实验目标确定。线性阵列检测多个层的神经元。具有各种间距（微米）规格的探针也可在市售。在记录过程中和分析过程中，应考虑探针接触点之间的刀柄长度和距离。设置完成后，需要在试用录制期间检查光脉冲以消除光电伪影。这也可以通过调整电极相对于光纤深度和位置的位置来优化。
局限性
虽然CaMKII®主要表现在谷氨酸释放神经元中，但这种蛋白质也存在于一些共同释放谷氨酸的多巴胺神经元中。因此，使用 AAV5-CaMKII® 将主要标记谷氨酸神经元和一些表达 CaMKII® 的多巴胺神经元。LED 驱动的光刺激协议价格实惠，可以轻松组装。然而，重要的是要注意，激光驱动的光刺激协议是更有效的38，39，40。注射到同一大脑区域的AAV溶液为不同的动物产生不同的表达阈值。但是，在注射后等待 3 周或更长的时间可以通过允许最佳的转染来减少这种变异。注入大脑区域的 AAV 溶液也可能扩散到周围的大脑区域。观察针头降低后的等待期，并在注射之间进行玻利瓦尔注射，可减少 AAV 溶液从注射部位的扩散。
总之，这种方法可用于追踪啮齿动物大脑中的神经回路。虽然目前的协议描述了麻醉小鼠的体内神经回路追踪，但该程序也可以用于在清醒的有行为的小鼠进行慢性记录。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作是由哥伦比亚广播公司桥接赠款授予OOM资助。OOM、PAA 和 AS 设计了这项研究并进行了实验。AS 和 PAA 分析了结果。欧姆和PAA准备了手稿。我们感谢卡尔·迪塞罗斯博士（斯坦福大学）提供AAV供我们使用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
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