Summary
Den nuværende protokol demonstrerer en enkel metode til sporing af ventral tegmental område (VTA) glutamat fremskrivninger til hippocampus. Photostimulation af VTA glutamat neuroner blev kombineret med CA1 optagelse for at demonstrere, hvordan VTA glutamat terminaler modulere CA1 formodede pyramide fyring sats in vivo.
Abstract
Optogenetisk graduering af neuron subpopulationer i hjernen har gjort det muligt for forskere at dissekere neurale kredsløb in vivo og ex vivo. Dette giver en forudsætning for at bestemme neurontypernes rolle i et neuralt kredsløb og deres betydning i informationskodning i forhold til læring. Ligeledes kan metoden bruges til at teste den fysiologiske betydning af to eller flere forbundne hjerneregioner i vågne og bedøvede dyr. Den nuværende undersøgelse viser, hvordan VTA glutamat neuroner modulere fyring sats formodede pyramide neuroner i CA1 (hippocampus) af bedøvede mus. Denne protokol anvender adeno-associeret virus (AAV) afhængig mærkning af VTA glutamat neuroner til sporing af VTA presynaptic glutamat terminaler i lagene af hippocampus. Ekspression af lysstyret opsin (channelrhodopsin; hChR2) og fluorescensprotein (eYFP), der næres af AAV-vektoren, tilladte anterograde-sporing af VTA glutamatterminaler og fototimulation af VTA glutamat neuroncellelegemer (i VTA). Høj impedans akutte silicium elektroder blev placeret i CA1 til at opdage multi-enhed og enkelt-enhed reaktioner på VTA photostimulation in vivo. Resultaterne af denne undersøgelse viser den lagafhængige fordeling af præsynaptiske VTA glutamatterminaler i hippocampus (CA1, CA3 og GD). Også, den photostimulation af VTA glutamat neuroner øget fyring og brast sats formodede CA1 pyramideenheder in vivo.
Introduction
I det sidste årti blev en række genetiske værktøjer udviklet for at øge specificiteten af neuron-type graduering og kortlægning af komplekse neurale netværk1. Især neurotropiske vira med en iboende evne til at inficere og replikere i neuronale celler er blevet indsat for at udtrykke eller ablate specifikke proteiner i neuron sub-typer. Når der huser fluorescens proteiner eller genetisk kodet synaptiske aktivitetsindikatorer, transfected AAV vektorer etiket og afgrænse neurale netværk på tværs af hjernen regioner2,3. Valget af en promotor i AAV-konstruktionen dirigerer vektorens udtryk i neurontyper med en vis specificitet(promotorafhængigt udtryk). Men gennem Cre-lox rekombination, AAV konstruktioner er indsat med større specificitet for neuron mærkning4,5,6,7. Bemærk, fotoaktiverede mikrobielle opsiner og fluorescensproteiner pakket i AAV-vektorer kan udtrykkes i forskellige neuronundertyper8og er ideelle til billeddannelse, neuron-type kredsløbssporing og fotomodulation9,10.
AAV'er konstruerer stereotaktisk injiceres i en hjerne region (eller kerne) drev udtryk for reporter protein i soma, dendrit, og axoner terminaler. Neurale udtryk for AAV huser en reporter gen (eYFP) letter mærkning af neuron celle organer og anatomiske sporing af fremskrivninger til og fra andre hjerne regioner11,12,13,14. AAV-eYFP konstruerer transporterer lys-kontrolleret opsin (f.eks hChR2), kan anvendes som et redskab til billeddannelse6,15 og stimulation-baserede fysiologiske sporing af neurale fremskrivninger til at målrette hjernen områder in vivo16. Afhængigt af AAV-serotypen kan retningen af neuronmærkning være anterograde eller retrograd11,12. Tidligere undersøgelser har fastslået, at AAV5 rejser anterogradely i neuroner12. Således photostimulation af celle organer udtrykke hChR2 producerer præsynaptiske virkninger andre steder i hjernen (mål)17.
Her blev AAV (serotype 5) med en CaMKIIα promotor brugt til at udtrykke eYFP (reporter) og hChR2 (opsin) i VTA glutamat neuroner og axonale fremskrivninger. Resultaterne fra denne undersøgelse viser den lagafhængige fordeling af præsynaptiske VTA-glutamatterminaler i CA1-, CA3- og GD hippocampal-regionerne. Også, photostimulation af VTA glutamat neuroner øget CA1 multi-enhed og enkelt-enhed fyring satser in vivo sammenlignet med baseline værdier. Denne protokol bruger overkommelige værktøjer og kommercielt tilgængelig software, der kan øge kvaliteten af data opnået fra neurale kredsløbssporingseksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgs- og dyrehåndteringsprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Louisiana State University School of Veterinary Medicine.
1. Forsøgsdyr
- Brug 5-6 uger gamle mus.
- Hus 3-5 dyr pr bur under standardbetingelser på 12 timer skiftevis lys og mørk cyklus. Mad og vand skal leveres ad libitum.
2. Kraniotomi og tilberedning af dyr
BEMÆRK: I dette afsnit beskrives præ- og peri-operative procedurer for museteatomi. Brug standard stereotaktiske apparater og passende koordinater (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML og Dorsoventral: DV). Henvis til en mus hjerne atlas til at bestemme koordinater for hjernen region af interesse.
- Bedøve mus ved intraperitoneal ketamin (100 mg/kg)/xylazin (10 mg/kg) cocktail injektion. Udfør en tå knivspids test for at sikre fraværet af fornemmelse før påbegyndelsen af operationen.
BEMÆRK: Alternativt kan Isoflurane anæstesi med et passende næsekammer også bruges til dette trin. - Fastgør forsigtigt dyrets hoved på det stereotaxiske apparat.
BEMÆRK: Det er vigtigt at håndtere dyr med forsigtighed under denne proces. Kontroller også vejrtrækningshastigheden og andre vitale, før du fortsætter med operationen. Lad dyret hvile i ~ 7 minutter for at reducere stress.- Placer en varmepude på den stereotaxiske ramme, så dyrets krop ligger på den. Dette vil bidrage til at opretholde kropstemperaturen og holde dyret varmt selv ud proceduren. Bevar varmepuden til postoperativ pleje og restitution.
- Brug en klipper til at fjerne hår over hovedbunden og rense huden med en jodopløsning.
- Påfør aktuel lidocain til at blokere fornemmelse på hovedbunden.
- Brug en skalpel til at gøre en midterlinjen hovedbund snit strækker sig fra frontal til occipital regionen.
- Rengør snitområdet med jodopløsning, og udsæt derefter calvariaen.
BEMÆRK: En lille mængde på 3% hydrogenperoxidopløsning kan påføres for at fjerne periosteum fra calvariaen. Dette vil øge synligheden af vartegn (bregma og lambda) og suturer. - Ved hjælp af en mus hjerne stereotaktisk atlas, bestemme AP og ML koordinater i forhold til bregma.
- Ved VTA-injektion anbringes en ultrafin stump spidsnålssprøjte (f.eks. neurosprøjte) ved koordinaterne AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm i forhold til bregmaen.
- Brug et boreværktøj til at bore et 1 mm hul (kraniotomi) i kraniet ved den markerede AP/ML-koordinat.
BEMÆRK: Dette trin kræver en betydelig grad af forsigtighed. Der skal lægges minimalt tryk under boringen for at forhindre boret i at knuse hjernevævet. I den aktuelle undersøgelse var boret 0,8 mm, og borehastigheden blev indstillet til 15.000 omdrejninger i minuttet.
ADVARSEL: Hvis der blev anvendt brintoverilte til rengøring af snittet eller calvariaen, skal du sørge for fuldstændig fjernelse af opløsningen eller tillade fuldstændig tørhed før boring.
3. AAV cocktail injektion
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver processen for AAV-injektion i VTA for voksne C57BL/6-mus (23-27 g). Den beskrevne metode kan bruges til AAV-injektion i ethvert hjerneområde ved hjælp af standard stereotaktisk apparatur og passende koordinater. For at demonstrere denne protokol blev eYFP og hChR2 udtrykt i VTA glutamatneuroner ved hjælp af AAV5-medieret transinfektion under en CaMKIIα-promotor (figur 1). Cre-lox rekombination kan også bruges til dette trin.
- En sprøjte monteres med ultrafin stump spidsnål (32 G; 5 μL kapacitet med 100 nL nøjagtighed) på en injektor. Fastgør sprøjteholderen på en mikromanipulator.
BEMÆRK: Til denne procedure blev der anvendt en manuel sprøjteholder med 1,6 nL kalibrering. En automatiseret injektor kan også bruges. - Fyld sprøjten med dobbelt destilleret vand for at rengøre og teste væskestrømmen.
- Tø aliquots af AAV (serotype 5) cocktail på is. AAV'er opbevares bedst ved -80 °C for at opretholde viral titer for godt udtryk.
- Fyld den monterede sprøjte med 1.000 nL AAV-opløsning (10 mM i fosfatbufferet saltvand (PBS), pH 7.4). Dispenser 10 nL af AAV-opløsningen for at bekræfte væskestrømmen, før du sænker nålen ned på et injektionssted.
- Brug en mikromanipulator til at sænke nålen stereotactically i den ønskede dybde (DV koordinat). Når du har sænket nålen til den ønskede dybde, skal du lade sprøjten forblive på plads i 10 minutter før injektionen.
BEMÆRK: Til denne procedure blev nålen sænket ned i VTA'en i en dybde (DV) på 4,5 mm fra hjernens pialoverflade. For andre hjerneområder skal du bruge den relevante dorsoventralkoordinat (se musehjerneatlaset). - Injicere 600-800 nL AAV i VTA. Injektionsvolumen kan justeres afhængigt af målstedets størrelse.
- Levere AAV-opløsningen med en hastighed på 60 nL/min (3 min. interval).
- For at udtrykke eYFP og hChR2 i VTA glutamat neuroner og fremskrivninger, injicere AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
BEMÆRK: Cre-lox rekombination metode kan også bruges afhængigt af målet med eksperimentet. - Lad kanylen forblive på plads i 15 minutter efter AAV-injektionen. Dette vil reducere diffusion og tilbagestrømning.
- Træk sprøjtenålen tilbage, og syr derefter snittet for at lukke såret.
- Administrere antibiotika og smertestillende midler som en del af postoperativ pleje. Placer musen på en varm polstret platforme og overvåge dyret, indtil vågen.
BEMÆRK: Efter 3 ugers injektion kan AAV-ekspression observeres ved fluorescensdetektion af reporterprotein (eYFP) i musehjernesektioner. Også fotostimulationseksperimulationseksperimenter kan udføres efter 3 uger (Figur 2).
4. Opsætning til in vivo neurale optagelser med optogenetics
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver trinene for akut neural optagelse med optogenetisk sporing af et hjernekredsløb (VTA glutamat neuronprojektion til CA1). Hvis det er nødvendigt, skal du kontrollere systemet (forstærker og tilslutninger) for elektrisk støj og jordforbindelse spørgsmål, før du begynder dette trin. Udførelse af dette trin i et Faraday-bur kan hjælpe med at eliminere elektrisk støj i optagelsen.
- Efter 3 uger efter AAV-injektion bedøves mus ved intraperitoneal urethaninjektion (0,2 mg/kg).
ADVARSEL: Urethan er kræftfremkaldende og skal håndteres forsigtigt, mens der bæres beskyttelsesudstyr. Også, administrere urethan anæstesi ved denne koncentration er ikke-overlevelse. - Anbringe dyrets hoved på en stereotaktisk ramme som beskrevet tidligere (trin 2.2, Figur 3A). Udfør en kraniotomi for at eksponere duraen (Figur 3A). Brug et boreværktøj (bitstørrelse: 0,8 mm, hastighed: 15.000 omdrejninger i minuttet) til at fjerne en del af parietalbenet.
- Kraniotomien skal være ca. 3 mm x 4 mm bred. Påfør dråber kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) over dette område for at forhindre tørhed.
- Under et dissektionsmikroskop (digitalt) skal du bruge en bøjet nålespids (27 G) til at fjerne den eksponerede dura. Pas på ikke at trække de sarte pialbeklædning og kortikale væv i dette område fra hinanden.
- Bar et hul i nakkebenet (bitstørrelse: 0,8 mm, hastighed: 10.000 omdrejninger i minuttet) for at holde jordskruen (pandehoved Phillips skrue; M0,6 x 2,0 mm).
- Tilslut en jordledning i rustfrit stål.
BEMÆRK: Andre typer ledninger kan også anvendes (Figur 3b). - Til kombineret lystagning (VTA) og neural optagelse (CA1) skal du bruge et flerjernet stereotaxisk apparat udstyret med ultrafine (10 μm eller 1 μm) mikromanipulatorer. Monter den optiske fiber og indspilning af neural sonde på henholdsvis 10 μm-området og 1 μm-området mikromanipulator.
- Brug om nødvendigt en hovedstadiesondeadapter (Figur 3c).
BEMÆRK: I den nuværende protokol var en 32-kanals hovedfase udstyret med en adapter til at holde en 4-kanals optagelseselektrode (Figur 3d). Jordledningen i rustfrit stål blev loddet til adapterens jordtilslutningsport.
- Brug om nødvendigt en hovedstadiesondeadapter (Figur 3c).
- Ved koordinater AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, sænk 400 μm diameter optisk fiber i VTA.
- Før du sænker den optiske fiber, skal du forbinde ferrule til et fiberoptisk kabel (med rustfrit stål eller keramisk ferrule) knyttet til en fiberkoblet LED-kilde.
BEMÆRK: Sørg for, at lysintensiteten og fokus er indstillet efter behov. Valget af LED-lyskilden bør svare til de opsiner, der målrettes mod. Her blev en 470 nm (blåt lys) LED-driver brugt til hChR2 fotoaktivering (Figur 4a). - Hvis du vil synkronisere lyspulsen med den neurale optagelse, skal du forbinde LED-driveren og optage controlleren digital IN-port til en transistortransistorlogik (TTL) pulser (Figur 4b). Dette kan opnås ved hjælp af en BNC splitter.
BEMÆRK: Brugen af en TTL-pulsør giver fleksibiliteten ved digitalt at indstille den ønskede pulstogfrekvens og varighed. I den nuværende protokol blev 10 ms lysimpulser udløst ved 50 Hz18. For TTL-styring af LED-driveren skal du skifte driveren til "trigger". I denne tilstand kan lysintensiteten reguleres ved at dreje på "knappen". Stimuleringsfrekvensen kan justeres, så den passer til eksperimentelle variabler, og kan variere fra 1 til 100 Hz. Til neural kredsløbssporing anbefales en stimuleringsfrekvens på >20 Hz. - Juster knappen for at bestemme den effektive intensitet, der kan generere et svar uden at producere fotoelektriske artefakter. Hvis det er nødvendigt, skal du flytte den optiske fiber for at fjerne artefakter19.
BEMÆRK: Den LED-driver, der bruges til den aktuelle protokol, producerer en lyseffekt på ~21,8 mW.
- Før du sænker den optiske fiber, skal du forbinde ferrule til et fiberoptisk kabel (med rustfrit stål eller keramisk ferrule) knyttet til en fiberkoblet LED-kilde.
5. Neural optagelse
- Brug en akut neural sonde med en 15-50 μm tyk skaft, der måler mindst 5 mm i længden.
BEMÆRK: Optagelse fra dybe hjernestrukturer vil kræve neurale sonder med en længere skaft. I den aktuelle undersøgelse blev der anvendt en sonde med en 20 mm skaftlængde. - Tilslut fasen med forforstærkerhovedet til optagecontrolleren via et SPI-kabel (Serial Peripheral Interface). Kontroller LED'ernes farvebelysning på optagerens controllerporte. Grønne og gule LED'er indikerer korrekt spænding på det tilsluttede forstærkerbræt. Rød LED angiver en fungerende software-head scenekontrol (Figur 5b).
- Ved hjælp af en mikro-manipulator skal du placere elektrodekontaktstederne i det pyramideformede cellelag på CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 til 1,2 mm).
BEMÆRK: Den optiske fiber og elektrode kan placeres i andre ønskede hjerneområder til fototimulation og optagelse.
6. Indstillinger for forstærker og filter
- Slut forstærkersystemet til optagelsescontrolleren til en computer via en USB 3.0-port. Tilslut hovedstadiet til forstærkeren ved hjælp af SPI-kablet. Start controllersoftwaren. Hvis den ikke er korrekt tilsluttet, vises meddelelsen "enheden blev ikke fundet".
- Klik på Kør for at få vist aktivitet på kanalerne. Hver bølgeform afbildes som spændingen (y-aksen) versus tiden (x-aksen). Afhængigt af interesseområdet skal du justere spændings- og tidsskalaerne for at justere bølgeformdisplayet.
- Hvis kun nogle få kanaler er aktive, skal du deaktivere ubrugte kanaler for at reducere filstørrelsen på lagerdisken.
- Indstil samplingfrekvensen og cut-off-frekvenserne ved at redigere båndbreddeparametre på anskaffelsessoftwaren. Til optagelse med en enkelt enhed skal du indstille de øvre og nedre skæringsfrekvenser til henholdsvis 300 Hz og 5.000 Hz. Skift prøvetagningshastigheden for forstærkeren til 30 kS/s.
BEMÆRK: Hvis du vælger en høj samplingfrekvens, får du en større filstørrelse. - Før du optager, skal du kontrollere elektrodekanalernes integritet ved at måle impedans ved 1.000 Hz. Dette kan gøres ved at starte funktionen i brugergrænsefladen (controllersoftware). En arbejdskanal skal have en impedansværdi, der varierer fra 0,1 til 5 MΩ.
- Hvis en lydudgang (højttaler) er tilsluttet ANALOG OUT-porten, skal du justere forstærkning og lyddæmper for at opnå optimal spike-lyd.
- Hvis du vil have vist TTL-pulstogmarkøren i spike-optagelsen, skal du aktivere displayet for DIGITAL IN-markøren. Hvis du vil registrere tidsstemplet for pulstoget, skal du aktivere digital in-kanalvisning før hovedeksperimentet.
BEMÆRK: Der er normalt mere end én "DIGITAL IN" kanal (1 eller 2). Sørg for, at BNC-kablet fra TTL-pulsen er tilsluttet den "DIGITAL IN"-port, der er valgt til visning i optagelsescontrollersoftwaren. - Hvis du vil se spikebølgeformen i realtid, skal du åbne vinduet med spidsomfang og angive en tærskel ved hjælp af museklik.
- Undersøg støjniveauet ved at overvåge rodgennemsøgningspladsen (RMS i μV). For ren spike optagelse, foretrækkes det, at den neurale spike tærsklen er mindst 5x RMS.
- Når installationen er fuldført, skal du vælge filoutputformatet.
BEMÆRK: Her blev CA1 neural spike registreret i .rhd-format. Andre filformater (.rhs og .dat) kan også vælges, så de svarer til de filformater, der er tilladt af analysesoftwaren.
7. In vivo optogenetic optagelse og indstillinger
- Åbn pulsstyringssoftwaren (TTL), som viser forskellige justerbare pulsparametre. Vælg den relevante COM-port på softwaren. Angiv pulsparametre ved at justere indstillingerne for Tog og Gruppe.
BEMÆRK: Pulstilstanden skal bestemmes ved at overveje eksperimentelle variabler og design. - På forstærkercontrollersoftwaren skal du klikke på Kør for at registrere neurale pigge i hippocampus eller det ønskede hjerneområde. Juster om nødvendigt elektrodedybden for at detektere levedygtige og aktive neuroner.
- Når ekstracellulær spændingsaktivitet er opdaget, skal du observere baseline spikes i 15 minutter og overvåge dyrets vitale. Test også lyspulsen for at registrere lydhøre neuroner inden for CA1 eller den ønskede anatomiske målregion.
BEMÆRK: Kontroller, om der er fotoelektriske artefakter, og fjern ved at justere lysintensiteten eller optisk fiberposition. - Registrer den oprindelige aktivitet i ~10 min., før lyspulsen udløses med den ønskede frekvens(Figur 5a,b). Dette vil gøre det muligt at sammenligne fyring eller burst satser med og uden belysning.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev baselineaktiviteten registreret i 10 minutter uden belysning efterfulgt af belysning ved 50 Hz (Movie 1).
8. Analyse
- Konverter .rhd-filen til Nex 5-outputformat.
- Behandl filnavn. Nex5-fil i en offlinesorteringssoftware til registrering af rastertog og bølgeformer til en enkelt enhed (Figur 5a-b).
- Vælg den ønskede kanal i rullevinduet.
BEMÆRK: De kontinuerligt registrerede spike data kan ses i et separat vindue i OFSS. Tidsskalaen kan også justeres. Hvis der bruges en tetrode, kan OFSS indstilles til at sortere de 4 kanaler som en tetrode. - Indstil spændingsniveauet for bølgeformudtrækning ved tærskelkrydsning.
ADVARSEL: Brug mindst 5x RMS for korrekt spike detektion. - Registrer bølgeformer, og udfør derefter spike-sortering ved hjælp af valley-søger (automatisk) eller K-midler (semi-automatisk) metode. Om nødvendigt fusionere enheder, der besætter lignende regioner i 3D-principal component analysis (PCA) rummet.
- Eksportér sorteret . Nex5-sagerne til yderligere analyse (figur 5c-d).
BEMÆRK: Analyseresultater for interspike-intervallet, fyringshastighed og burst-hastighed kan eksporteres til andre analyseplatforme.
- Vælg den ønskede kanal i rullevinduet.
9. Fluorescensdetektion af AAV-udtryk
- Efter optagelsen aflives dyret i et isoflurankammer.
- Udfør transcardial perfusion med 10 mM PBS (~10 mL), efterfulgt af 4% fosfat-buffered paraformaldehyd (PB-PFA, ~10 mL).
- Fjern hele hjernen intakt og ordne det i 4% PB-PFA i 48 timer.
- Den faste hjerne overføres til 4 % PB-PFA, der indeholder 30 % saccharose til kryopræservering ved 4 °C. Efter 72 timer, sektion hjernen i en kryostat og montere skiver på en gelatine-belagt dias.
BEMÆRK: I den nuværende protokol blev afsnit, der indeholder den lukkede del af hippocampus (rostral), udvalgt til at demonstrere AAV-mærkede terminaler i GD, CA3 og CA1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anterograde-sporing
AAV-ekspressionen blev verificeret ved immunfluorescensbilleddannelse af reporterprotein (eYFP) i VTA for C57BL/6-mus 21 dage efter injektionen (figur 2). Vellykket anterograde mærkning af præsynaptiske VTA glutamat fremskrivninger i hippocampus blev også verificeret ved eYFP afsløring i lagene af GD, CA3, og CA1 (Figur 6a-d; Film 2 og 3).
VTA glutamat fremskrivninger til hippocampus modulere CA1 aktivitet
Photostimulation af VTA glutamat neuroner øget aktiviteten af formodede pyramideformede CA1 neuroner. Dette ses tydeligt som en stigning i spiking begivenheder i lyset ON fase (Movie 1) sammenlignet med lyset OFF fase (Figur 5a-b). For at understøtte dette resultat viste statistisk sammenligning af CA1-nettets fyringsrater før (light OFF; baseline) og efter (light ON) fototimulation en betydelig stigning for perioden efter stimulering(figur 7a; p = 0,0002). Efterfølgende analyse af rastertoget til påvisning af sprængninger (2-4 pigge i <16 ms) viser også en øget bristehastighed for CA1-formodede pyramide neuroner efter VTA glutamatfototimulation (Figur 7b; p = 0,0025). Statistisk (Student's t-test)analyse blev udført med standard software. Her blev baseline (light OFF) fyring eller burst rate sammenlignet med lys ON (photostimulation) værdier.
Figur 1: Skematisk illustration af AAV-CaMKII-ChR2-eYFP-injektion i VTA'en for C57BL/6-mus.
Anterograde mærkning af VTA neuroner og axonal fremskrivninger til hippocampus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fluorescensbilleder, der viser AAV-CaMKII-ChR2-eYFP-udtryk i VTA og optisk fiberspor.
Dk: kerne af Darkschewitsch, scp: superior cerebellar peduncle, VTA: ventral tegmental area og RM: retromamillary kerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Demonstration af kraniotomi, elektrodeplacering og optisk fiberplacering.
(A) Midterlinjeindsnit, der udsætter kraniet (b: bregma, oc: occipital bone). (B) Placering af jordskruen (gs) i nakkebenet og tilsluttet jordledning i rustfrit stål (gw). (C) Stereotaktisk placering af optisk fiber kanyle (foc: fiberoptisk kabel). (D) Stereotaktisk positionering af optisk fiber kanyle og neurale sonde skaft (foc: fiberoptisk kabel, adp: adapter, ms: parring ærme, prs: sonde skaft, hs: hoved fase). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: BNC-splitforbindelse til kombinerede lyspulser og forstærkertidsstempler (trigger).
(A) Påvisning af LED-lysemission fra spidsen af en optisk fiberbeholder. (B) TTL puls gennem en BNC split adapter til at styre LED og tidsstempel forstærker (ampl) optagelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kontinuerligt registreret spiketog (rå data) med registrering af en enkelt enhed.
(A) Screengrab af rå optagelse fra hippocampus af en bedøvet mus. (B) TTL-drevet fotobelysning af VTA i den rå optagelse. Lyseblå linjer demonstrerer tidsstemplerne for Light ON (λ = 470nm) perioder og frekvens af stimulering. (CD) Kontinuerligt registreret spike tog og neuron enheder afledt af spike sortering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative fluorescensbilleder, der viser udtrykket af AAV-CaMKII-ChR2-eYFP i hippocampus.
(A)GD (GCL: granulært cellelag, hil: hilus). (B) En del af CA3 tæt på GD (SL: stratum lacunosum, pyr: pyramidecellelag). (C)CA3 korrekt. (D) CA1 (soo: stratum oriens, pyr: pyramidecellelag, rad: stratum radiculata). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Statistisk sammenligning af fyringshastigheden før og efter fototimulation.
(A) Søjlediagram, der viser en øget gennemsnitlig affyringshastighed (Hz) for formodede pyramide neuronenheder i CA1 (***p = 0,0002) efter fotobelysning. (B) Søjlediagram, der viser en øget bristehastighed for formodede CA1-neuroner efter fotobelysning (**p = 0,0025). Fejllinje: standardfejl i middelværdi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1: Screengrab optagelse af forstærker controller og pulser software. Filmen demonstrerer baseline optagelse (lys OFF) efterfulgt af photostimulation (lys ON, λ = 470 nm), der er angivet med blå tidsstempler. Klik her for at downloade denne video.
Film 2 og Film 3: 3D illustration af VTA glutamat terminaler i GD for en mus. DAPI-blå: nuklear etiket i det granulære cellelag (GCL); eYFP-Green: AAV-mærkede VTA-terminaler i GD Hilus. Klik her for at downloade disse videoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det seneste årti er designet af AAV-konstruktioner avanceret betydeligt. Som sådan er mere neuron-specifikke initiativtagere blevet indarbejdet i en række AAV-serotyper for forbedret transfektspecifikitet14. Ved at kombinere gener for fluorescensproteiner, transportører, receptorer og ionkanaler findes der nu biblioteker af AAV til billeddannelse, neuromodulation og synaptisk aktivitetsdetektion. I kommercielt tilgængelige AAV-konstruktioner giver en kombination af en genetisk kodet fluorophore og ionkanaler (opsin) mulighed for en kombineret neuroanatomisk og elektrofysiologisk sporing af neurale kredsløb14,18,19. På samme måde kan valget af en promotor (eller cre-lox rekombinationsmetode) tillade sporing af neurontypespecifikke fremskrivninger i et kredsløb. I den aktuelle undersøgelse blev denne protokol indsat til anatomisk og elektrofysiologisk vurdering af VTA glutamat neurale fremskrivninger til hippocampus (CA1-regionen).
VTA-Hippocampus neurale kredsløb
VTA er en del af midbrain mesocorticolimlimbic vej. VTA fremskrivninger til hjernen områder, der er involveret i belønning og aversion læring er blevet påvist i vid udstrækning20,21,22,23,24,25. Mens VTA indeholder dopamin, glutamat, og GABA neuroner, dopamin neuron befolkning er anatomisk dominerende. En vigtig funktion af VTA i aversion og belønning læring tilskrives en robust VTA dopamin projektion til kernen accumbens og dorsale raphe kerne22,24,25,26,27,28. Selvom VTA dopamin og glutamat neuroner projekt til hippocampus, funktionen af anatomisk dominerende VTA glutamat terminaler er mindre undersøgt sammenlignet med VTA dopamin terminaler i hippocampus29,30.
Den nuværende protokol beskriver brugen af en AAV5-konstruktion, der huser en fluorophore (eYFP) og lysstyret opsin (hChR2) til kortlægning af CaMKIIα-udtrykkende VTA -terminaler (glutamat) i hippocampus. Tidligere undersøgelser har vist, at VTA glutamatterminaler er anatomisk dominerende i hippocampus sammenlignet med VTA dopaminterminaler29. For at demonstrere VTA glutamat præsynaptiske terminaler i hippocampus blev AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP transfected i VTA neuronale cellelegemer. Dette mærkede cellelegemerne VTA glutamat neuroner (inden for VTA) og skitserede VTA glutamatterminaler inden for hippocampus lag.
Selv om VTA glutamat præsynaptiske terminaler innerverer GD, CA3 og CA1, viser resultaterne lagafhængige variationer for disse tre regioner(figur 6a-d). I GD er AAV-mærkede VTA glutamatterminaler anatomisk dominerende i hilus sammenlignet med det granulære cellelag. I CA3 er VTA glutamatterminalerne relativt rigelige i stratum lacunosum sammenlignet med pyramidecellelaget og stratumorienerne. Mens VTA glutamatterminalerne i CA1 i betydelig grad innerverer de dendritiske lag (stratum oriens og radiatum) sammenlignet med pyramidecellelaget. Resultatet af denne undersøgelse viser også, at photostimulation af VTA glutamat neuronale cellelegemer modulere aktiviteten af CA1 neurale netværk in vivo. Photostimulation af VTA glutamat neuroner førte til en betydelig stigning i CA1 fyring sats og burst sats under photostimulation epoke (Figur 7a-b). Dette er i enige i den anatomiske fordeling af VTA glutamatterminaler i ca1's dendritiske lag (figur 6d), hvor det kan have virkninger på hippocampal informationskodning. Til støtte for denne observation har andre undersøgelser vist, at VTA er en primær determinant for hippocampal arbejdshukommelseskodning og regulerer udvælgelsen af oplysninger, der skal lagres i langtidshukommelsen gennem VTA-hippocampus loop22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Tekniske overvejelser
For at gennemføre denne protokol med succes bør valget af AAV-konstruktioner bestemmes ud fra den neurontype, der skal målrettes mod. Forskeren skal identificere en egnet promotor (et genprodukt), der er unikt for den neuron type, der skal målrettes. I den aktuelle undersøgelse blev en CaMKIIα-promotor brugt til at drive udtrykket eYFP og hChR2 i CaMKIIα, der udtrykker neuroner. Men en cre-lox rekombination metode kan også bruges. I dette tilfælde kan en dobbelt floxed AAV5 udtrykkes i VTA for CaMKIIα-Cre mus. De promotor - og cre-loxbaserede ekspressionsmetoder gælder også for andre neurontyper35,36,37.
Systemet skal kontrolleres for elektrisk støj. Dette kan gøres ved at evaluere RMS i spike omfang under en retssag optagelse session. Om nødvendigt skal systemet og stereotaktisk apparat være anbragt i et Faraday-bur, mens forstærkerjorden er forbundet til buret. Elektrode kontakt sites kan arrangeres lineært eller en tetrode. Valget af sondedesign bør bestemmes på grundlag af forsøgets formål. Et lineært array registrerer neuroner på tværs af flere lag. Sonder med forskellige afstande (i mikron) specifikationer er også kommercielt tilgængelige. Skaftets længde og afstand mellem sondekontaktstederne bør tages i betragtning under registreringsproceduren og til analysen. Når opsætningen er færdig, skal lyspulsen kontrolleres under en prøveoptagelse for at eliminere fotoelektriske artefakter. Dette kan også optimeres ved at justere elektrodens position i forhold til optisk fiberdybde og placering.
Begrænsninger
Selvom CaMKIIα primært udtrykkes i glutamatfriende neuroner, er proteinet også til stede i nogle populationer af dopaminneuroner, der samtidig frigiver glutamat. Således vil brugen af AAV5-CaMKIIα for det meste mærke glutamatneuroner og nogle dopaminneuroner, der udtrykker CaMKIIα. LED-drevne photostimulation protokoller er overkommelige og kan nemt samles. Det er dog vigtigt at bemærke, at en laserdrevet fototimulationsprotokol er mere effektiv38,39,40. AAV-opløsning, der injiceres i den samme hjerneregion for forskellige dyr, giver forskellige udtrykstærskler. Men venter i 3 uger eller mere efter injektionen kan reducere en sådan variation ved at tillade optimal transfekt. AAV-opløsning injiceret i en hjerneregion kan også diffuse til omkringliggende hjerneområder. Observation af ventetiden efter, at nålen er blevet sænket, og mellem bolusinjektioner kan det reducere diffusionen af AAV-opløsningen fra injektionsstedet.
Sammenfattende kan denne metode bruges til at spore neurale kredsløb i gnavere hjerner. Selvom den nuværende protokol beskriver in vivo neural kredsløbssporing i bedøvede mus, kan proceduren også implementeres til kronisk optagelse i vågent opførsel mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af CBS Bridging Grant tildelt OOM. OOM, PAA og AS designede undersøgelsen og udførte eksperimenterne. AS og PAA analyserede resultaterne. OOM og PAA forberedte manuskriptet. Vi takker Dr. Karl Disseroth (Stanford University) for at gøre AAV til rådighed for vores brug.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
