Summary
Het huidige protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het traceren van ventrale tegmentale gebied (VTA) glutamaatprojecties naar de hippocampus. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen werd gecombineerd met CA1-opname om aan te tonen hoe VTA-glutamaatterminals ca1-putatieve piramidale vuursnelheid in vivo moduleren.
Abstract
Optogenetische modulatie van neuronsubpopulaties in de hersenen heeft onderzoekers in staat gesteld neurale circuits in vivo en ex vivo te ontleden. Dit biedt een premisse voor het bepalen van de rol van neurontypen binnen een neuraal circuit en hun betekenis in informatiecodering ten opzichte van leren. Evenzo kan de methode worden gebruikt om de fysiologische betekenis van twee of meer verbonden hersengebieden bij wakkere en verdoofde dieren te testen. De huidige studie laat zien hoe VTA glutamaat neuronen moduleren de vuursnelheid van putatieve piramidale neuronen in de CA1 (hippocampus) van verdoofde muizen. Dit protocol maakt gebruik van adeno-geassocieerd virus (AAV)-afhankelijke etikettering van VTA-glutamaatneuronen voor het traceren van VTA presynaptische glutamaatterminals in de lagen van de hippocampus. Expressie van lichtgestuurde opsin (channelrhodopsine; hChR2) en fluorescentie-eiwit (eYFP) die door de AAV-vector werd opgeslagen, maakte anterograde tracing van VTA-glutamaatterminals en fotostimulatie van VTA-glutamaatneuroncellichamen (in de VTA) mogelijk. Acute siliciumelektroden met hoge impedantie werden in de CA1 geplaatst om multi-unit en single-unit reacties op VTA-fotostimulatie in vivo te detecteren. De resultaten van deze studie tonen de laagafhankelijke verdeling van presynaptische VTA-glutamaatterminals in de hippocampus (CA1, CA3 en DG) aan. Ook verhoogde de fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen de vuur- en burstsnelheid van putatieve CA1-piramidevormige eenheden in vivo.
Introduction
In het afgelopen decennium is een reeks genetische hulpmiddelen ontwikkeld om de specificiteit van neuron-type modulatie te verhogen, en het in kaart brengen van complexe neurale netwerken1. Met name neurotrope virussen met een inherent vermogen om te infecteren en te repliceren in neuronale cellen zijn ingezet om specifieke eiwitten in neuronsubtypen uit te drukken of af te zwakken. Bij het herbergen van fluorescentie-eiwitten of genetisch gecodeerde synaptische activiteitsindicatoren labelen en afbakenen AAV-vectoren neurale netwerken in hersengebieden2,3. De keuze van een promotor in de AAV-constructie stuurt de expressie van de vector in neurontypen met een bepaald specificiteitsniveau(promotorafhankelijke expressie). Echter, door Cre-lox recombinatie, AAV constructies worden ingezet met een grotere specificiteit voor neuron labeling4,5,6,7. Van belang, foto geactiveerde microbiële opsinen en fluorescentie-eiwitten verpakt in AAV vectoren kunnen worden uitgedrukt in verschillende neuron subtypes8, en zijn ideaal voor beeldvorming, neuron-type circuit tracing, en fotomodulatie9,10.
AAV's construeren stereotactically geïnjecteerd in een hersengebied (of kern) drijft de expressie van het reporter eiwit in de soma, dendriet, en axonen terminals. Neurale expressie van AAV met een reportergen (eYFP) vergemakkelijkt het labelen van neuroncellichamen en anatomische tracering van projecties van en naar andere hersengebieden11,12,13,14. AAV-eYFP constructies met lichtgestuurde opsin (bijv. hChR2), kunnen worden ingezet als een hulpmiddel voor beeldvorming6,15 en stimulatiegebaseerde fysiologische tracering van neurale projecties om hersengebieden in vivo te targeten16. Afhankelijk van het AAV-serotype kan de richting van neuronetikettering anterograde of retrograde11,12zijn . Eerdere studies hebben aangetoond dat AAV5 anterogradely reist in neuronen12. Zo produceert fotostimulatie van cellichamen die hChR2 uitdrukken presynaptische effecten elders in de hersenen (doel)17.
Hier werd AAV (serotype 5) met een CaMKIIα promotor gebruikt om eYFP (reporter) en hChR2 (opsin) uit te drukken in VTA glutamaat neuronen en axonale projecties. De resultaten van deze studie tonen de laagafhankelijke verdeling van VTA-glutamaat presynaptische terminals in de CA1-, CA3- en DG hippocampale regio's aan. Ook verhoogde fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen ca1 multi-unit en single-unit firing rates in vivo in vergelijking met baseline waarden. Dit protocol maakt gebruik van betaalbare tools en commercieel beschikbare software die de kwaliteit van gegevens die zijn verkregen uit neurale circuit tracing experimenten kan verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele en dierbehandelingsprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Louisiana State University School of Veterinary Medicine.
1. Proefdier
- Gebruik muizen van 5-6 weken oud.
- Huis 3-5 dieren per kooi onder standaardomstandigheden van 12 uur afwisselend licht en donkere cyclus. Voedsel en water moeten ad libitum worden verstrekt.
2. Craniotomie en dierlijke voorbereiding
OPMERKING: Deze sectie beschrijft pre- en peri-operatieve procedures voor craniotomie van muizen. Gebruik standaard stereotactische apparatuur en geschikte coördinaten (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML en Dorsoventral: DV). Raadpleeg een muishersenatlas om de coördinaten voor het hersengebied van belang te bepalen.
- Verdoof muizen door intraperitoneale ketamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) cocktailinjectie. Voer een teenknijptest uit om de afwezigheid van gevoel voor het begin van de operatie te garanderen.
OPMERKING: Als alternatief kan isofluraan anesthesie met een geschikte neuskamer ook voor deze stap worden gebruikt. - Bevestig het hoofd van het dier voorzichtig op het stereotaxic-apparaat.
OPMERKING: Het is belangrijk om tijdens dit proces voorzichtig met dieren om te gaan. Controleer ook de ademhalingsfrequentie en andere vitale functies voordat u doorgaat met de operatie. Laat het dier ~7 min rusten om stress te verminderen.- Plaats een verwarmingskussen op het stereotaxic frame zodat het lichaam van het dier erop ligt. Dit zal helpen de lichaamstemperatuur te handhaven en het dier warm te houden tijdens de procedure. Houd het verwarmingskussen vast voor postoperatieve zorg en herstel.
- Gebruik een tondeuse om haar over de hoofdhuid te verwijderen en de huid schoon te maken met een jodiumoplossing.
- Breng topische lidocaïne aan om het gevoel op de hoofdhuid te blokkeren.
- Gebruik een scalpel om een midline hoofdhuidincisie te maken die zich uitstrekt van het frontale naar het occipitale gebied.
- Reinig het incisiegebied met jodiumoplossing en stel vervolgens de calvaria bloot.
OPMERKING: Een kleine hoeveelheid van 3% waterstofperoxideoplossing kan worden toegepast om periosteum uit de calvaria te verwijderen. Dit zal de zichtbaarheid van oriëntatiepunten (bregma en lambda) en hechtingen vergroten. - Bepaal met behulp van een stereotactische atlas van de muishersenen de AP- en ML-coördinaten ten opzichte van het bregma.
- Plaats voor VTA-injectie een ultrafijne stompe naaldspuit (bijv. Neuros-spuit) op de coördinaten AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm ten opzichte van het bregma.
- Gebruik een boorgereedschap om een gat van 1 mm (craniotomie) in de schedel te boren op de gemarkeerde AP/ML-coördinaat.
OPMERKING: Deze stap vereist een aanzienlijke mate van voorzichtigheid. Tijdens het boren moet minimale druk worden uitgeoefend om te voorkomen dat de boor het hersenweefsel verplettert. In de huidige studie was de boor 0,8 mm en de boorsnelheid was ingesteld op 15.000 tpm.
LET OP: Als waterstofperoxide is gebruikt bij het reinigen van de incisie of calvaria, zorg dan voor volledige verwijdering van de oplossing of laat volledige droogheid toe voordat u gaat boren.
3. AAV cocktail injectie
OPMERKING: Deze sectie beschrijft het proces voor AAV-injectie in de VTA van volwassen C57BL/6 muizen (23–27 g). De beschreven methode kan worden gebruikt voor AAV-injectie in elk hersengebied met behulp van standaard stereotactische apparaten en geschikte coördinaten. Om dit protocol aan te tonen, werden eYFP en hChR2 uitgedrukt in VTA-glutamaatneuronen met behulp van AAV5-gemedieerde transfectie onder een CaMKIIα-promotor (Figuur 1). Cre-lox recombinatie kan ook worden gebruikt voor deze stap.
- Monteer een spuit met ultrafijne stomppuntnaald (32 G; 5 μL capaciteit met 100 nL nauwkeurigheid) op een injector. Bevestig de spuithouder op een micromanipulator.
OPMERKING: Voor deze procedure werd een handmatige spuithouder met 1,6 nL kalibratie gebruikt. Er kan ook een geautomatiseerde injector worden gebruikt. - Vul de spuit met dubbel gedestilleerd water om de vloeistofstroom te reinigen en te testen.
- Ontdooi aliquots van AAV (serotype 5) cocktail op ijs. AAV's kunnen het beste bij -80 °C worden opgeslagen om virale titer te behouden voor een goede expressie.
- Vul de gemonteerde spuit met 1.000 nL AAV-oplossing (10 ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4). Doseer 10 nL van de AAV-oplossing om de vloeistofstroom te bevestigen voordat u de naald op een injectieplaats laat zakken.
- Gebruik een micromanipulator om de naald stereotactisch in de gewenste diepte te laten zakken (DV-coördinaat). Laat de spuit na het verlagen van de naald tot de gewenste diepte 10 minuten op zijn plaats blijven voordat u de injectie ondergaat.
OPMERKING: Voor deze procedure werd de naald in de VTA neergelaten op een diepte (DV) van 4,5 mm van het piale oppervlak van de hersenen. Gebruik voor andere hersengebieden de juiste dorsoventrale coördinaat (zie de muishersenatlas). - Injecteer 600–800 nL AAV in de VTA. Het injectievolume kan worden aangepast afhankelijk van de grootte van de doellocatie.
- Lever de AAV-oplossing met een snelheid van 60 nL/min (interval van 3 minuten).
- Om eYFP en hChR2 uit te drukken in VTA glutamaat neuronen en projecties, injecteer AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
OPMERKING: Cre-lox recombinatiemethode kan ook worden gebruikt, afhankelijk van het doel van het experiment. - Laat de naald na AAV-injectie 15 minuten op zijn plaats blijven. Dit vermindert diffusie en terugstroming.
- Trek de spuitnaald terug en hecht vervolgens de incisie om de wond te sluiten.
- Antibiotica en analgesie toedienen als onderdeel van postoperatieve zorg. Plaats de muis op een warm opgevuld platform en houd het dier in de gaten tot het wakker is.
OPMERKING: Na 3 weken injectie kan AAV-expressie worden waargenomen door fluorescentiedetectie van reportereiwit (eYFP) in muishersensecties. Ook kunnen fotostimulatie-experimenten na 3 weken worden uitgevoerd (figuur 2).
4. Set-up voor in vivo neurale opnames met optogenetica
OPMERKING: Deze sectie beschrijft de stappen voor acute neurale opname met de optogenetische tracering van een hersencircuit (VTA glutamaat neuron projectie naar de CA1). Controleer indien nodig het systeem (versterker en aansluitingen) op elektrische ruis en aardingsproblemen voordat u met deze stap begint. Het uitvoeren van deze stap in een Kooi van Faraday kan helpen bij het elimineren van elektrische ruis in de opname.
- Verdoof muizen na 3 weken na AAV-injectie met intraperitoneale urethaaninjectie (0,2 mg/kg).
LET OP: Urethaan is kankerverwekkend en moet voorzichtig worden behandeld tijdens het dragen van beschermende kleding. Ook is het toedienen van urethaan anesthesie in deze concentratie niet-overleving. - Breng het hoofd van het dier aan op een stereotiep frame zoals eerder beschreven (stap 2.2, figuur 3A). Voer een craniotomie uit om de dura bloot te leggen (figuur 3A). Gebruik een boorgereedschap (bitgrootte: 0,8 mm, snelheid: 15.000 tpm) om een deel van het pariëtale bot te verwijderen.
- De craniotomie moet ongeveer 3 mm x 4 mm breed zijn. Breng druppels kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) aan op dit gebied om uitdroging te voorkomen.
- Gebruik onder een dissectie (digitale) microscoop een gebogen naaldpunt (27 G) om de blootgestelde dura te verwijderen. Pas op dat u de delicate pialbedekking en corticale weefsels in dit gebied niet uit elkaar trekt.
- Boor een gat in het achterhoofdsbeen (bitgrootte: 0,8 mm, snelheid: 10.000 tpm) om de grondschroef (pankop Phillips-schroef; M0,6 x 2,0 mm).
- Sluit een roestvrijstalen aardingsdraad aan.
OPMERKING: Er kunnen ook andere soorten draden worden gebruikt (figuur 3b). - Gebruik voor gecombineerde fotostimulatie (VTA) en neurale opname (CA1) een multi-rail stereotaxic apparaat uitgerust met ultrafijne (10 μm of 1 μm) micromanipulatoren. Monteer de optische vezel en de opnameneurale sonde op respectievelijk 10 μm-bereik en 1 μm-bereik micromanipulator.
- Gebruik indien nodig een adapter voor de hoofdtrapsonde (afbeelding 3c).
OPMERKING: In het huidige protocol was een 32-kanaals hoofdtrap uitgerust met een adapter voor het vasthouden van een 4-kanaals opnameelektrode (afbeelding 3d). De roestvrijstalen aarddraad werd aan de aardingspoort van de adapter gesoldeerd.
- Gebruik indien nodig een adapter voor de hoofdtrapsonde (afbeelding 3c).
- Bij coördinaten AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, laat de 400 μm diameter optische vezel in de VTA zakken.
- Voordat u de optische vezel verlaagt, sluit u de ferrule aan op een glasvezelkabel (met roestvrijstalen of keramische ferrule) die is gekoppeld aan een vezelgekoppelde LED-bron.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de lichtintensiteit en scherpstelling naar wens zijn ingesteld. De keuze van de LED-lichtbron moet overeenkomen met de opsins die het doelwit zijn. Hier werd een 470 nm (blauw licht) LED-driver gebruikt voor hChR2-fotoactivering (figuur 4a). - Om de lichtpuls te synchroniseren met de neurale opname, sluit u de LED-driver en de digitale IN-poort van de opnamecontroller aan op een transistor-transistorlogica (TTL) pulser(afbeelding 4b). Dit kan worden bereikt met behulp van een BNC-splitter.
OPMERKING: Het gebruik van een TTL-pulser biedt de flexibiliteit om de gewenste frequentie en duur van de pulstrein digitaal in te stellen. In het huidige protocol werden 10 ms lichtpulsen geactiveerd bij 50 Hz18. Voor TTL-bediening van het LED-stuurprogramma schakelt u de driver in op "trigger". In deze modus kan de lichtintensiteit worden geregeld door aan de "knop" te draaien. De stimulatiefrequentie kan worden aangepast aan experimentele variabelen en kan variëren van 1 tot 100 Hz. Voor neurale circuit tracing wordt een stimulatiefrequentie van >20 Hz aanbevolen. - Pas de knop aan om de effectieve intensiteit te bepalen die een reactie kan genereren zonder foto-elektrische artefacten te produceren. Indien nodig, herpositioneer de optische vezel om artefacten te elimineren19.
OPMERKING: De LED-driver die voor het huidige protocol wordt gebruikt, produceert een lichtvermogen van ~ 21,8 mW.
- Voordat u de optische vezel verlaagt, sluit u de ferrule aan op een glasvezelkabel (met roestvrijstalen of keramische ferrule) die is gekoppeld aan een vezelgekoppelde LED-bron.
5. Neurale opname
- Gebruik een acute neurale sonde met een 15-50 μm dikke schacht, met een lengte van ten minste 5 mm.
OPMERKING: Voor opname van diepe hersenstructuren zijn neurale sondes met een langere schacht nodig. In de huidige studie werd een sonde met een schachtlengte van 20 mm gebruikt. - Sluit de voorversterkerkoptrap aan op de opnamecontroller via een spi-kabel (serial peripheral interface). Controleer de kleurverlichting van de LED's op de poorten van de opnamecontroller. Groene en gele LED's geven de juiste spanning aan op de aangesloten versterkerplaat. Rode LED geeft een werkende software-head stage control aan (Figuur 5b).
- Plaats met behulp van een micromanipulator de contactplaatsen van de elektrode in de piramidale cellaag van de CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 tot 1,2 mm).
OPMERKING: De optische vezel en elektrode kunnen in andere gewenste hersengebieden worden geplaatst voor fotostimulatie en opname.
6. Versterker- en filterinstellingen
- Sluit het versterkersysteem van de opnamecontroller aan op een computer via een USB 3.0-poort. Sluit de hoofdtrap aan op de versterker met behulp van de SPI-kabel. Start de controllersoftware. Als het systeem niet correct is aangesloten, wordt een bericht 'apparaat niet gevonden' weergegeven.
- Klik op Uitvoeren om de activiteit op de kanalen weer te geven. Elke golfvorm wordt uitgezet als de spanning (y-as) versus tijd (x-as). Afhankelijk van de regio van belang, pas de spanning en tijdschalen aan om de golfvormweergave aan te passen.
- Als slechts een paar kanalen actief zijn, schakelt u ongebruikte kanalen uit om de bestandsgrootte op de opslagschijf te verkleinen.
- Stel de samplingfrequentie en cut-off frequenties in door bandbreedteparameters op de acquisitiesoftware te bewerken. Stel voor opname met één eenheid de bovenste en onderste afsluitfrequenties in op respectievelijk 300 Hz en 5.000 Hz. Verander de bemonsteringsfrequentie van de versterker in 30 kS/s.
OPMERKING: Als u een hoge bemonsteringsfrequentie kiest, wordt een grotere bestandsgrootte gemaakt. - Controleer voor het opnemen de integriteit van de elektrodekanalen door de impedantie bij 1.000 Hz te meten. Dit kan door de functie in de gebruikersinterface (controllersoftware) te starten. Een werkkanaal moet een impedantiewaarde hebben die varieert van 0,1 tot 5 MΩ.
- Als een audio-uitgang (luidspreker) is aangesloten op de ANALOG OUT-poort, past u de versterking en geluiddemper aan voor een optimaal spikegeluid.
- Als u de TTL-pulstreinmarkering in de spike-opname wilt weergeven, schakelt u het display voor de DIGITAL IN-markering in. Als u de tijdstempel van de pulstrein wilt opnemen, schakelt u de digitale in-kanaalweergave in vóór het hoofdexperiment.
OPMERKING: Er is meestal meer dan één "DIGITAL IN" kanaal (1 of 2). Zorg ervoor dat de BNC-kabel van de TTL-pulser is aangesloten op de "DIGITAL IN"-poort die is geselecteerd voor weergave in de opnamecontrollersoftware. - Voor realtime weergave van de piekgolfvorm opent u het venster spikebereik en stelt u de drempel in met de muisklik.
- Inspecteer het geluidsniveau door het Wortelgemiddelde Vierkant (RMS in μV) te controleren. Voor schone spike-opname heeft het de voorkeur dat de neurale piekdrempel ten minste 5x RMS is.
- Zodra de installatie is voltooid, selecteert u de indeling voor bestandsuitvoer.
OPMERKING: Hier is de CA1 neural spike opgenomen in .rhd formaat. Andere bestandsindelingen (.rhs en .dat) kunnen ook worden geselecteerd om overeen te komen met de bestandsindelingen die door de analysesoftware zijn toegestaan.
7. In vivo optogenetische opname en instellingen
- Open de pulsregelingssoftware (TTL) die verschillende instelbare pulsparameters weergeeft. Selecteer de juiste COM-poort op de software. Stel de pulsparameters in door de trein- en groepsinstellingen aan te passen.
OPMERKING: De pulsconditie moet worden bepaald door experimentele variabelen en ontwerp te overwegen. - Klik op de versterkercontrollersoftware op Uitvoeren om neurale spikes in de hippocampus of het gewenste hersengebied te detecteren. Pas indien nodig de elektrodediepte aan om levensvatbare en actieve neuronen te detecteren.
- Zodra extracellulaire spanningsactiviteit is gedetecteerd, observeer je de pieken bij aanvang gedurende 15 minuten en controleer je de vitale functies van het dier. Test ook de lichtpuls om responsieve neuronen binnen het CA1- of gewenste anatomische doelgebied te detecteren.
OPMERKING: Controleer op foto-elektrische artefacten en elimineer door de lichtintensiteit of de positie van de glasvezel aan te passen. - Registreer de basisactiviteit gedurende ~ 10 minuten voordat u de lichtpuls op de gewenste frequentie activeert (figuur 5a, b). Dit maakt het mogelijk om vuur- of burstsnelheden met en zonder verlichting te vergelijken.
OPMERKING: In het huidige onderzoek werd de uitgangsactiviteit gedurende 10 minuten zonder verlichting geregistreerd, gevolgd door verlichting bij 50 Hz (Film 1).
8. Analyse
- Converteer het .rhd-bestand naar Nex 5-uitvoerindeling.
- Bestandsnaam verwerken. Nex5-bestand in een offline sorteersoftware om rastertreinen en golfvormen van één eenheid te detecteren (figuur 5a–b).
- Selecteer het gewenste kanaal in het vervolgkeuzevenster.
OPMERKING: De continu opgenomen piekgegevens kunnen in een apart venster van het OFSS worden bekeken. De tijdschaal kan ook worden aangepast. Als een tetrode wordt gebruikt, kan de OFSS worden ingesteld om de 4 kanalen als een tetrode te sorteren. - Stel het spanningsniveau in voor drempelovergangsgolfvormextractie.
LET OP: Gebruik minimaal 5x RMS voor een goede spikedetectie. - Detecteer golfvormen en voer vervolgens pieksortering uit met behulp van valley-seeking (automatisch) of K-means (semi-automatisch) methode. Voeg waar nodig eenheden samen die vergelijkbare regio's van de PCA-ruimte (3D-Principal Component Analysis) bezetten.
- Export gesorteerd . Nex5 bestanden voor verdere analyse (figuur 5c–d).
OPMERKING: Analyseresultaten voor het interspike-interval, de vuursnelheid en de burst-snelheid kunnen worden geëxporteerd naar andere analyseplatforms.
- Selecteer het gewenste kanaal in het vervolgkeuzevenster.
9. Fluorescentiedetectie van AAV-expressie
- Euthanaseer het dier na de opname in een isofluraankamer.
- Voer transcardiale perfusie uit met 10 mM PBS (~10 ml), gevolgd door 4% fosfaatgebufferd paraformaldehyde (PB-PFA, ~10 ml).
- Verwijder de hele hersenen intact en bevestig het in 4% PB-PFA gedurende 48 uur.
- Breng de vaste hersenen over in 4% PB-PFA met 30% sacharose voor cryopreservatie bij 4 °C. Na 72 uur doorsnijd je de hersenen in een cryostaat en monteer je plakjes op een met gelatine bedekte glijbaan.
OPMERKING: In het huidige protocol zijn secties met het gesloten deel van de hippocampus (rostral) geselecteerd om terminals met AAV-label in dg, CA3 en CA1 aan te tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anterograde-tracering
AAV-expressie werd geverifieerd door immunofluorescentiebeeldvorming van reportereiwit (eYFP) in de VTA van C57BL/6 muizen 21 dagen na injectie (Figuur 2). Succesvolle anterograde-etikettering van presynaptische VTA-glutamaatprojecties in de hippocampus werd ook geverifieerd door eYFP-detectie in de lagen van DG, CA3 en CA1 (figuur 6a–d; Film 2 en 3).
VTA glutamaat projecties op de hippocampus moduleren CA1 activiteit
Fotostimulatie van VTA glutamaat neuronen verhoogde de activiteit van putatieve piramidale CA1 neuronen. Dit is duidelijk te zien als een toename van piekgebeurtenissen tijdens de licht AAN-fase (Film 1) in vergelijking met de licht-UIT-fase (Figuur 5a–b). Om dit resultaat te ondersteunen, bleek uit statistische vergelijking van de afvuursnelheden van het CA1-netwerk vóór (licht UIT; baseline) en na (licht AAN) fotostimulatie een significante toename voor de poststimulatieperiode (figuur 7a; p = 0,0002). Latere analyse van de rastertrein om bursts te detecteren (2-4 pieken in <16 ms) toont ook een verhoogde burst rate aan voor de CA1 putatieve piramidale neuronen na VTA glutamaat fotostimulatie (Figuur 7b; p = 0,0025). Statistische (Student's t-test) analyse werd uitgevoerd met standaard software. Hier werd de basislijn (licht UIT) vuur- of burstsnelheid vergeleken met licht AAN (fotostimulatie) waarden.
Figuur 1: Schematische illustratie van AAV-CaMKII-ChR2-eYFP injectie in de VTA van C57BL/6 muis.
Anterograde labeling van VTA neuronen en axonale projecties naar de hippocampus. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Fluorescentiebeelden met AAV-CaMKII-ChR2-eYFP-expressie in de VTA en glasvezelspoor.
Dk: kern van Darkschewitsch, scp: superieure cerebellaire steel, VTA: ventrale tegmentale gebied, en RM: retromamillaire kern. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Demonstratie van de craniotomie, elektrodeplaatsing en plaatsing van glasvezel.
(A) Middellijnincisie die de schedel blootstelt (b: bregma, oc: achterhoofdsbeen). (B) Plaatsing van de grondschroef (gs) in het achterhoofdsbeen en de aangesloten roestvrijstalen gronddraad (gw). (C) Stereotactische positionering van optische glasvezel canule (foc: fiberoptic kabel). (D) Stereotactische positionering van optische vezel canule en neurale sonde schacht (foc: fiberoptische kabel, adp: adapter, ms: paring mouw, prs: sonde schacht, hs: hoofd stadium). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: BNC split aansluiting voor gecombineerde lichtpulsing en versterker (trigger) tijdstempels.
(A) Demonstratie van LED-lichtemissie vanaf de punt van een optische glasvezel canule. (B) TTL-puls door een BNC split adapter om LED en tijdstempelversterker (ampl) opname te regelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Continu geregistreerde spike train (ruwe data) met single unit detectie.
(A) Screengrab van ruwe opname van de hippocampus van een verdoofde muis. (B) TTL-aangedreven fotoverlichting van de VTA in de onbewerkte opname. Lichtblauwe lijnen tonen de tijdstempels voor Licht AAN (λ = 470nm) perioden en de frequentie van stimulatie. (C–D) Continu geregistreerde spike trein en neuron eenheden afgeleid door spike sortering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Representatieve fluorescentiebeelden die de expressie van AAV-CaMKII-ChR2-eYFP in de hippocampus aantonen.
(A) DG (GCL: korrelige cellaag, hil: hilus). (B) Een deel van de CA3 in de buurt van het DG (SL: stratum lacunosum, pyr: piramidale cellaag). (C) CA3 correct. (D) CA1 (dus: stratum oriens, pyr: piramidale cellaag, rad: stratum radiculata). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Statistische vergelijking van de vuursnelheid voor en na fotostimulatie.
(A) Staafgrafiek die een verhoogde gemiddelde vuursnelheid (Hz) aantoont voor putatieve piramidale neuroneenheden in de CA1 (***p = 0,0002) na fotoverlichting. (B) Staafgrafiek die een verhoogde burst rate aantoont voor putatieve CA1 neuronen na fotoverlichting (**p = 0,0025). Foutbalk: standaardfout van gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film 1: Screengrab opname van de versterker controller en pulser software. De film demonstreert baseline opname (licht UIT) gevolgd door fotostimulatie (licht AAN, λ = 470 nm) die wordt aangegeven met blauwe tijdstempels. Klik hier om deze video te downloaden.
Film 2 en Film 3: 3D illustratie van VTA glutamaat terminals in de DG van een muis. DAPI-blauw: nucleair label in de korrelige cellaag (GCL); eYFP-Green: AAV-gelabelde VTA-terminals in dg hilus. Klik hier om deze video's te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het afgelopen decennium is het ontwerp van AAV-constructies aanzienlijk vooruitgegaan. Als zodanig zijn meer neuronspecifieke promotors opgenomen in een reeks AAV-serotypen voor verbeterde transfectiespecifiekheid14. Door genen voor fluorescentie-eiwitten, transporters, receptoren en ionenkanalen te combineren, bestaan er nu bibliotheken van AAV voor beeldvorming, neuromodulatie en synaptische activiteitsdetectie. In in de handel verkrijgde AAV-constructies maakt een combinatie van een genetisch gecodeerde fluorofoor en ionenkanalen (opsin) een gecombineerde neuroanatomische en elektrofysiologische tracering van neurale circuits14,18,19mogelijk . Evenzo kan de selectie van een promotor (of cre-lox recombinatiemethode) het traceren van een neurontypespecifieke projecties binnen een circuit mogelijk maken. In de huidige studie werd dit protocol ingezet voor anatomische en elektrofysiologische beoordeling van VTA glutamaat neurale projecties naar de hippocampus (CA1 regio).
VTA-Hippocampus neuraal circuit
De VTA maakt deel uit van het midbrain mesocorticolimbische traject. VTA-projecties naar hersengebieden die betrokken zijn bij belonings - en aversieleren zijn uitgebreid aangetoond20,21,22,23,24,25. Terwijl de VTA bevat dopamine, glutamaat, en GABA neuronen, de dopamine neuron populatie is anatomisch dominant. Een belangrijke functie van de VTA in aversie - en beloningsleren wordt toegeschreven aan een robuuste VTA-dopamineprojectie aan de nucleus accumbens en dorsale raphe nucleus22,24,25,26,27,28. Hoewel VTA dopamine en glutamaat neuronen projecteren op de hippocampus, wordt de functie van de anatomisch dominante VTA glutamaat terminals minder bestudeerd in vergelijking met VTA dopamine terminals in de hippocampus29,30.
Het huidige protocol beschrijft het gebruik van een AAV5-constructie met een fluorofoor (eYFP) en lichtgestuurde opsin (hChR2) voor het in kaart brengen van CaMKIIα-expresserende VTA -terminals (glutamaat) in de hippocampus. Eerdere studies hebben aangetoond dat VTA glutamaat terminals anatomisch dominant zijn in de hippocampus in vergelijking met VTA dopamine terminals29. Om de VTA glutamaat presynaptische terminals in de hippocampus aan te tonen, werd AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP getransfecteerd in VTA neuronale cellichamen. Dit labelde de cellichamen VTA glutamaat neuronen (binnen de VTA) en schetste VTA glutamaat terminals binnen de lagen van de hippocampus.
Hoewel VTA-glutamaat presynaptische terminals innervate DG, CA3 en CA1 vertonen, laten de resultaten laagafhankelijke variaties zien voor deze drie regio's (figuur 6a–d). In de DG zijn VTA-glutamaatterminals met het AAV-label anatomisch dominant in de hilus in vergelijking met de korrelige cellaag. In de CA3 zijn de VTA glutamaat terminals relatief overvloedig aanwezig in het stratum lacunosum in vergelijking met de piramidale cellaag en stratum oriens. Terwijl in de CA1 VTA-glutamaatterminals de dendritische lagen (stratum oriens en radiatum) aanzienlijk innervaten in vergelijking met de piramidale cellaag. De uitkomst van deze studie toont ook aan dat fotostimulatie van de VTA glutamaat neuronale cellichamen de activiteit van het CA1 neurale netwerk in vivo moduleren. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen leidde tot een significante toename van de CA1-vuursnelheid en burst-snelheid tijdens het fotostimulatietijdperk (figuur 7a–b). Dit komt overeen met de anatomische verdeling van VTA-glutamaatterminals in de dendritische lagen van de CA1 (figuur 6d) waar het effecten kan hebben op hippocampale informatiecodering. Ter ondersteuning van deze observatie hebben andere studies aangetoond dat de VTA een primaire determinant is van hippocampale werkgeheugencodering en de selectie van informatie die in het langetermijngeheugen moet worden opgeslagen via de VTA-hippocampuslus22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Technische overwegingen
Om dit protocol met succes te implementeren, moet de keuze van AAV-constructies worden bepaald op basis van het neurontype dat moet worden getarget. De onderzoeker moet een geschikte promotor (een genproduct) identificeren die uniek is voor het te targeten neurontype. In de huidige studie werd een CaMKIIα promotor gebruikt om de expressie van eYFP en hChR2 in CaMKIIα uitdrukkende neuronen te stimuleren. Er kan echter ook een cre-lox recombinatiemethode worden gebruikt. In dit geval kan een dubbel gevlokte AAV5 worden uitgedrukt in de VTA van CaMKIIα-Cre muizen. De promotor en cre-lox gebaseerde expressiemethoden zijn ook van toepassing op andere neurontypen35,36,37.
Het systeem moet worden gecontroleerd op elektrische ruis. Dit kan worden gedaan door de RMS in spike scope te evalueren tijdens een proef opname sessie. Indien nodig moeten het systeem en het stereotactische apparaat in een Kooi van Faraday worden ondergebracht, terwijl de versterkergrond op de kooi is aangesloten. Elektrodecontactplaatsen kunnen lineair of een tetrode worden gerangschikt. De keuze van het ontwerp van de sonde moet worden bepaald op basis van het doel van het experiment. Een lineaire array detecteert neuronen over meerdere lagen. Sondes met verschillende spatiëringsspecificaties (in microns) zijn ook in de handel verkrijgbaar. Tijdens de registratieprocedure en voor de analyse moet rekening worden gehouden met de schachtlengte en de afstand tussen de contactplaatsen van de sonde. Wanneer de installatie is voltooid, moet de lichtpuls worden gecontroleerd tijdens een proefopname om foto-elektrische artefacten te elimineren. Dit kan ook worden geoptimaliseerd door de positie van de elektrode aan te passen ten opzichte van de diepte en locatie van de glasvezel.
Beperkingen
Hoewel CaMKIIα voornamelijk wordt uitgedrukt in glutamaat-releasing neuronen, het eiwit is ook aanwezig in sommige populaties van dopamine neuronen die co-release glutamaat. Dus, met behulp van AAV5-CaMKIIα zal meestal label glutamaat neuronen en sommige dopamine neuronen die CaMKIIα uitdrukken. LED-aangedreven fotostimulatieprotocollen zijn betaalbaar en kunnen eenvoudig worden gemonteerd. Het is echter belangrijk op te merken dat een lasergestuurd fotostimulatieprotocol effectiever is38,39,40. AAV-oplossing geïnjecteerd in hetzelfde hersengebied voor verschillende dieren levert verschillende expressiedrempels op. Echter, wachten tot 3 weken of meer na de injectie kan een dergelijke variatie verminderen door optimale transfectie mogelijk te maken. AAV-oplossing geïnjecteerd in een hersengebied kan ook diffuus zijn naar omliggende hersengebieden. Het observeren van de wachttijd nadat de naald is neergelaten en tussen bolusinjecties kan de diffusie van de AAV-oplossing vanaf de injectieplaats worden verminderen.
Kortom, deze methode kan worden gebruikt om neurale circuits in de hersenen van knaagdieren te traceren. Hoewel het huidige protocol in vivo neurale circuit tracing beschrijft bij verdoofde muizen, kan de procedure ook worden ingezet voor chronische opname bij wakkere muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door CBS Bridging Grant toegekend aan OOM. OOM, PAA en AS ontwierpen het onderzoek en voerden de experimenten uit. AS en PAA analyseerden de resultaten. OOM en PAA maakten het manuscript klaar. We danken Dr. Karl Disseroth (Stanford University) voor het beschikbaar stellen van de AAV voor ons gebruik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
