Summary
현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.
Abstract
두뇌에 있는 신경 하위 인구의 Optogenetic 변조는 연구원이 생체 내및 ex vivo에 있는 신경 회로를 해부하는 것을 허용했습니다. 이것은 신경 회로 내의 신경 모형의 역할 및 학습에 상대적인 정보 인코딩에 있는 그들의 중요성을 결정하기 위한 전제를 제공합니다. 마찬가지로, 이 방법은 깨어 있는 동물및 마취동물에서 두 개 이상의 연결된 뇌 영역의 생리적 중요성을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 현재 연구는 VTA 글루타민트 뉴런이 마취 된 마우스의 CA1 (해마)에서 푸티피라미드 뉴런의 발사 속도를 조절하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 해마층의 VTA 전시냅스 글루타메이트 단자 추적을 위해 VTA 글루타민트 뉴런의 아데노 관련 바이러스(AAV)의존 라벨을 사용합니다. VTA 글루타민트 말미제 말단의 전방 추적을 허용한 AAV 벡터에 의해 수용된 광 제어 옵신(channelrhodopsin; hChR2) 및 형광 단백질(eYFP)의 발현( VTA 글루타메이트 뉴런 세포 체체)의 사진 자극(VTA에서). 고임피던스 급성 실리콘 전극은 생체 내에서 VTA 사진 자극에 대한 다중 장치 및 단일 단위 응답을 검출하기 위해 CA1에 배치되었다. 이 연구의 결과는 해마 (CA1, CA3 및 DG)에 있는 전시냅스 VTA 글루타민단 단자의 층 의존분포를 보여줍니다. 또한, VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 생체 내에서 PUTative CA1 피라미드 단위의 발사 및 버스트 속도를 증가시켰습니다.
Introduction
지난 10년 동안, 뉴런형 변조의 특이성을 높이기 위해 다양한 유전도구가 개발되었으며, 복잡한 신경망1의매핑. 특히, 신경 세포에서 감염 하 고 복제 하는 고유 한 능력을 가진 신경 tropic 바이러스 는 표현 하거나 뉴런 하위 유형에 특정 단백질을 ablate 배포 되었습니다. 형광 단백질 또는 유전적으로 인코딩된 시냅스 활동 지표를 수용할 때, 전감염된 AAV 벡터 라벨및 뇌 영역2,3을통해 신경망을 묘사한다. AAV 구조에서 프로모터의 선택은 어느 정도의특이성(프로모터 의존식)을 가진 뉴런 유형에서 벡터의 발현을 지시한다. 그러나, Cre-lox 재조합을 통해, AAV 구문은 뉴런 라벨링4,5,6,7에대한 더 큰 특이성을 가지고 배포된다. 참고로, AAV 벡터에 포장된 광활성화 미생물 opsinsins 및 형광 단백질은 다양한 뉴런 아형8으로발현될 수 있으며, 이미징, 뉴런 형 회로 추적 및 광변조9,10에이상적입니다.
AAV는 뇌 영역(또는 핵)에 스테레오전술적으로 주입되어 소마, 원점 및 축축단 단자에서 리포터 단백질의 발현을 구동한다. AAV의 신경발현은 기자 유전자(eYFP)를 수용하는 것으로 다른 뇌 영역을 온팎으로 신경세포체및 해부학적 추적의 라벨링을 용이하게 한다11,12,13,14. AAV-eYFP는 빛 제어 옵신(예를 들어 hChR2)을 운반하는 구조물을 영상6,15 및 자극 기반의 생리학적 추적을 위한 도구로 전개하여 생체 내 뇌 영역을 표적으로 삼을 수 있다. AAV 혈청형에 따라, 뉴런 라벨링의 방향은11,12의역행 또는 역행일 수 있다. 이전 연구는 AAV5 뉴런에서 선행 여행 것을설립했다 12. 따라서, hChR2를 발현하는 세포 체의 사진 자극은 뇌의 다른 곳에서 미리 생성효과를 생성(표적)17.
여기서, CaMKIIα 프로모터를 사용한 AAV(혈청형 5)는 VTA 글루타민트 뉴런 및 축삭 프로젝션에서 eYFP(리포터) 및 hChR2(opsin)를 발현하는 데 사용되었다. 이 연구의 결과는 CA1, CA3 및 DG 해마 지역에서 VTA 글루타민제 전시냅스 말단의 층 의존 분포를 보여줍니다. 또한 VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 기준값과 비교할 때 생체 내에서 CA1 다중 유닛 및 단일 단위 발사 속도를 증가시켰습니다. 이 프로토콜은 신경 회로 추적 실험에서 얻은 데이터의 품질을 높일 수있는 저렴한 도구와 시판되는 소프트웨어를 사용합니다.
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Protocol
모든 실험 및 동물 취급 절차는 루이지애나 주립 대학 수의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 실험동물
- 5-6 주 된 쥐를 사용.
- 12h번의 빛과 어두운 주기의 표준 조건하에서 케이지당 3-5마리의 동물을 보관합니다. 음식과 물은 광고 리비툼을 제공해야합니다.
2. 두개골 절제술 및 동물 준비
참고: 이 섹션에서는 마우스 두개골 절제술에 대한 사전 및 peri 수술 절차를 설명합니다. 표준 입체 장치와 적절한 좌표(Anteroposterior: AP, 평범석: ML 및 도르소벤트랄: DV)을 사용합니다. 관심있는 뇌 영역에 대한 좌표를 결정하기 위해 마우스 뇌 아틀라스를 참조하십시오.
- 인트라테오네아 케타민(100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg) 칵테일 주사로 쥐를 마취시킵니다. 수술 이 시작되기 전에 감각의 부재를 보장하기 위해 발가락 핀치 테스트를 수행.
참고: 또는 적절한 코 챔버가 있는 이소플루란 마취도 이 단계에 사용될 수 있다. - 스테레오탁스 장치에 동물의 머리를 부드럽게 고정합니다.
참고: 이 과정에서 동물을 조심스럽게 처리하는 것이 중요합니다. 또한 수술을 진행하기 전에 호흡 속도 및 기타 활력을 확인하십시오. 동물이 스트레스를 줄이기 위해 ~ 7 분 동안 휴식을 취하도록 허용하십시오.- 동물의 몸이 그것에 누워 있도록 스테레오 테틱 프레임에 가열 패드를 배치합니다. 이것은 체온을 유지하고 절차를 벗어나더라도 동물을 따뜻하게 유지하는 데 도움이됩니다. 수술 후 관리 및 회복을위한 가열 패드를 유지합니다.
- 클리퍼를 사용하여 두피에 머리카락을 제거하고 요오드 용액으로 피부를 청소하십시오.
- 국소 리도카인을 적용하여 두피에 센세이션을 차단합니다.
- 메스를 사용하여 전두엽에서 후수 부위까지 이어지는 중간 두피 절개를 만듭니다.
- 요오드 용액으로 절개 부위를 청소한 다음 calvaria를 노출시하십시오.
참고: 소량의 과산화수소 용액을 적용하여 칼바리아에서 골막수를 제거할 수 있습니다. 이렇게 하면 랜드마크(브레그마와 람다)와 봉합사의 가시성이 향상됩니다. - 마우스 뇌 스테레오테전술 아틀라스를 사용하여, BREgma에 비해 AP 및 ML 좌표를 결정합니다.
- VTA 주사의 경우, 좌표 AP에 초미세 무딘 점 바늘 주사기(예: 신경 주사기)를 좌표 AP에 배치: -3.08 mm/ML: 0.5 mm 의 브레그마에 상대한다.
- 표시된 AP/ML 좌표에서 두개골에 1mm 구멍(두개골 절제술)을 뚫기 위해 드릴링 도구를 사용합니다.
참고: 이 단계에서는 상당한 수준의 주의가 필요합니다. 드릴 비트가 뇌 조직을 분쇄하는 것을 방지하기 위해 드릴링하는 동안 최소한의 압력을 가해야 합니다. 현재 연구에서드릴 비트는 0.8mm였고 드릴 속도는 15,000rpm으로 설정되었습니다.
주의: 과산화수소가 절개 또는 칼바리아 를 세척하는 데 사용되었다면, 용액을 완전히 제거하거나 드릴링 전에 완전한 건조를 허용하십시오.
3. AAV 칵테일 주입
참고: 이 섹션에서는 성인 C57BL/6 마우스(23-27 g)의 VTA내A내A에 AAV 주입 과정을 설명합니다. 상기 기술된 방법은 표준 입체 장치 및 적절한 좌표를 사용하여 임의의 뇌 영역으로 AAV 주입을 위해 사용될 수 있다. 이러한 프로토콜을 입증하기 위해 eYFP 및 hChR2는 CaMKIIα 프로모터(도1)에서AAV5 매개 트랜스페션을 사용하여 VTA 글루타민트 뉴런으로 발현되었다. Cre-lox 재조합도 이 단계에 사용할 수 있습니다.
- 인젝터에 초미세 무딘 점 바늘 (32 G, 100 nL 정확도로 5 μL 용량)을 장착한 주사기를 장착합니다. 마이크로 조작기에서 주사기 홀더를 수정합니다.
참고: 이 절차의 경우 1.6nL 교정이 있는 수동 주사기 홀더가 사용되었습니다. 자동 인젝터를 사용할 수도 있습니다. - 주사기를 이중 증류수로 채우고 유체의 흐름을 청소하고 테스트합니다.
- 얼음에 AAV (세로형 5) 칵테일의 알리쿼트를 해동. AAV는 좋은 표현을 위해 바이러스 성 티터를 유지하기 위해 -80 °C에 저장되는 것이 가장 좋습니다.
- 장착된 주사기를 1,000nL의 AAV 용액(인산염 완충식식염수(PBS), pH 7.4로 채우는 다. 주사 부위로 바늘을 낮추기 전에 액체의 흐름을 확인하기 위해 AAV 용액의 10 nL을 분배합니다.
- 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 원하는 깊이(DV 좌표)로 고정적으로 낮춥니다. 바늘을 원하는 깊이로 하강한 후 주사 전에 주사기를 10분 동안 제자리에 두도록 하십시오.
참고: 이 절차의 경우, 바늘은 뇌의 피알 표면으로부터 4.5mm의 깊이(DV)에서 VTA로 하부되었다. 다른 뇌 영역의 경우 적절한 등소 벤트랄 좌표를 사용하십시오 (마우스 뇌 아틀라스참조). - VTA에 AAV의 600-800 nL을 주입합니다. 사출 부피는 대상 사이트의 크기에 따라 조절될 수 있다.
- 60nL/분(3분 간격)의 속도로 AAV 솔루션을 제공합니다.
- VTA 글루타민트 뉴런 및 프로젝션에서 eYFP 및 hChR2를 발현하려면 AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP를 주입하십시오.
참고: Cre-lox 재조합 방법은 실험의 목표에 따라 사용할 수도 있습니다. - AAV 주입 후 15 분 동안 바늘을 제자리에 유지하십시오. 이렇게 하면 확산 및 역류가 줄어듭니다.
- 주사기 바늘을 철회한 다음 절개를 봉합하여 상처를 닫습니다.
- 수술 후 치료의 일환으로 항생제와 진통을 관리하십시오. 따뜻한 패딩 플랫폼에 마우스를 놓고 깨어날 때까지 동물을 모니터링합니다.
참고: 3주 간의 주사 후 마우스 뇌 섹션에서 기자 단백질(eYFP)의 형광 검출에 의해 AAV 발현을 관찰할 수 있다. 또한, 사진 자극 실험은 3주 후에 수행될 수있다(도 2).
4. 광유전학을 가진 생체 내 신경 기록에 대한 설정
참고: 이 섹션은 뇌 회로의 광유전학 추적 (CA1에 VTA 글루타메이트 뉴런 프로젝션)을 가진 급성 신경 기록의 단계를 설명합니다. 필요한 경우 이 단계를 시작하기 전에 시스템(증폭기 및 연결)에서 전기 소음 및 접지 문제를 확인합니다. 패러데이 케이지에서 이 단계를 수행하면 녹음에서 전기 노이즈를 제거할 수 있습니다.
- AAV 주입 후 3주 후, 인트라테오탄 주사(0.2 mg/kg)로 마우스를 마취한다.
주의: 우레탄은 발암성이며 보호 장비를 착용하는 동안 조심스럽게 처리해야합니다. 또한, 이 농도에서 우레탄 마취를 투여하는 것은 생존이 아니다. - 이전에 설명한 바와 같이 동물의 머리를 입체 프레임에 부착합니다(2.2단계, 그림 3A). 두라(그림3A)를노출시키기 위해 두개골 절제술을 수행한다. 드릴링 도구(비트 크기: 0.8mm, 속도: 15,000rpm)를 사용하여 정수리 뼈의 일부를 제거합니다.
- 두개골 절제술은 폭이 약 3mm x 4mm여야 합니다. 건조를 방지하기 위해이 지역에 인공 뇌척수액 (aCSF)의 방울을 적용합니다.
- 해부 (디지털) 현미경하에서, 노출된 두라를 소비하기 위해 구부러진 바늘 팁(27 G)을 사용한다. 이 지역의 섬세한 피알 덮개와 피질 조직을 분리하지 않도록주의하십시오.
- 나사를 잡기 위해 목막 뼈에 구멍을 뚫고 (비트 크기 : 0.8 mm, 속도 : 10,000 rpm) 지상 나사 (팬 헤드 필립스 나사; M0.6 x 2.0 mm).
- 스테인리스 스틸 접지 와이어를 연결합니다.
참고 : 다른 유형의 전선도 사용할 수 있습니다(그림 3b). - 결합된 사진 자극(VTA) 및 신경 기록(CA1)의 경우, 초미세(10 μm 또는 1 μm) 미세 조작기가 장착된 다중 레일 스테레오택시 장치를 사용하십시오. 광섬유와 기록 신경 프로브를 각각 10 μm 범위 및 1 μm 범위 마이크로 조작기에 장착합니다.
- 필요한 경우 헤드 스테이지 프로브 어댑터(그림3c)를사용합니다.
참고: 현재 프로토콜에서 32채널 헤드 스테이지에는 4채널 레코딩 전극(도3d)을보유하는 어댑터가 장착되었습니다. 스테인레스 스틸 접지 와이어는 어댑터의 접지 연결 포트로 납땜되었습니다.
- 필요한 경우 헤드 스테이지 프로브 어댑터(그림3c)를사용합니다.
- 좌표 AP: -3.08 mm ML: 0.5 mm, VTA에 400 μm 직경 광섬유를 낮춥다.
- 광섬유를 낮추기 전에 광섬유 케이블(스테인리스 스틸 또는 세라믹 페룰)에 페룰을 연결하여 광섬유 결합 LED 소스에 연결합니다.
참고: 빛의 강도와 초점이 원하는 대로 설정되어 있는지 확인합니다. LED 광원의 선택은 대상이 되는 작전과 일치해야 합니다. 여기서, 470nm(블루라이트) LED 드라이버가 hChR2 포토활성화(도4a)에사용되었다. - 광 펄스를 신경 기록과 동기화하려면 LED 드라이버 및 레코딩 컨트롤러 디지털 IN 포트를 트랜지스터 트랜지스터 로직(TTL) 펄스(도4b)에연결합니다. 이는 BNC 스플리터를 사용하여 달성할 수 있습니다.
참고: TTL 펄스러를 사용하면 원하는 펄스 트레인 주파수와 지속 시간을 디지털 방식으로 설정할 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 10ms 광 펄스는 50Hz18에서트리거되었습니다. LED 드라이버의 TTL 컨트롤의 경우 드라이버를 "트리거"로 전환합니다. 이 모드에서는 "노브"를 돌려 광 강도를 조절할 수 있습니다. 자극 주파수는 실험 변수를 수용하기 위해 조정할 수 있으며 1~100Hz 범위일 수 있습니다. 신경 회로 추적의 경우 >20Hz의 자극 주파수를 권장합니다. - 노브를 조정하여 광전 아티팩트를 생성하지 않고 응답을 생성할 수 있는 효과적인 강도를 결정합니다. 필요한 경우, 광학 섬유를 재배치하여아티팩트(19)를제거한다.
참고: 현재 프로토콜에 사용되는 LED 드라이버는 ~21.8mW의 광전력을 생성합니다.
- 광섬유를 낮추기 전에 광섬유 케이블(스테인리스 스틸 또는 세라믹 페룰)에 페룰을 연결하여 광섬유 결합 LED 소스에 연결합니다.
5. 신경 녹음
- 15-50 μm 두께의 생크가 있는 급성 신경 프로브를 사용하여 길이가 최소 5mm이상측정됩니다.
참고: 깊은 뇌 구조에서 기록 하면 더 긴 생크와 신경 프로브 필요 합니다. 현재 연구에서는 20mm 생크 길이를 가진 프로브가 사용되었습니다. - 시리얼 주변 인터페이스(SPI) 케이블을 통해 사전 증폭기 헤드 스테이지를 레코딩 컨트롤러에 연결합니다. 레코딩 컨트롤러 포트에서 LED 색상 조명을 확인합니다. 녹색 및 노란색 LED는 연결된 앰프 보드에 적절한 전압을 나타냅니다. 빨간색 LED는 작동하는 소프트웨어 헤드 스테이지제어(그림 5b)를나타냅니다.
- 마이크로 조작기를 사용하여 CA1의 피라미드 세포 층에 전극 접촉 부위를 배치합니다(AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 ~ 1.2mm).
참고: 광섬유와 전극은 사진 화와 녹음을 위해 다른 원하는 뇌 영역에 배치할 수 있습니다.
6. 증폭기 및 필터 설정
- USB 3.0 포트를 통해 레코딩 컨트롤러 증폭기 시스템을 컴퓨터에 연결합니다. SPI 케이블을 사용하여 헤드 스테이지를 앰프에 연결합니다. 컨트롤러 소프트웨어를 실행합니다. 제대로 연결되지 않으면 시스템에 "장치가 찾을 수 없는" 메시지가 표시됩니다.
- 실행 실행을 클릭하여 채널에서 활동을 봅니다. 각 파형은 전압(y축) 대 시간(x축)으로 플로팅됩니다. 관심 영역에 따라 전압 및 시간 축척을 조정하여 파형 디스플레이를 조정합니다.
- 몇 채널만 활성 상태인 경우 사용되지 않는 채널을 사용하지 않도록 설정하여 저장소 디스크의 파일 크기를 줄입니다.
- 획득 소프트웨어에서 대역폭 매개 변수를 편집하여 샘플링 속도와 절충 주파수를 설정합니다. 단일 단위 레코딩의 경우 상하 컷오프 주파수를 각각 300Hz 및 5,000Hz로 설정합니다. 증폭기 샘플링 속도를 30kS/s로 변경합니다.
참고: 높은 샘플링 속도를 선택하면 파일 크기가 커집니다. - 녹화하기 전에 1,000Hz에서 임피던드를 측정하여 전극 채널의 무결성을 확인하십시오. 이 작업은 사용자 인터페이스(컨트롤러 소프트웨어)에서 함수를 시작하여 수행할 수 있습니다. 작업 채널에는 0.1에서 5MΩ범위의 임피던스 값이 있어야 합니다.
- 오디오 출력(스피커)이 ANALOG OUT 포트에 연결되어 있는 경우 최적의 스파이크 사운드를 위해 게인 및 소음기를 조정합니다.
- 스파이크 레코딩에 TTL 펄스 트레인 마커를 표시하려면 디지털 IN 마커에 대한 디스플레이를 활성화합니다. 펄스 트레인 타임스탬프를 기록하려면 메인 실험 전에 디지털 IN 채널 디스플레이를 사용하도록 설정합니다.
참고: 일반적으로 하나 이상의 "디지털 IN" 채널(1 또는 2)이 있습니다. TTL 펄스의 BNC 케이블이 레코딩 컨트롤러 소프트웨어에 표시되도록 선택한 "DIGITAL IN" 포트에 연결되어 있는지 확인합니다. - 스파이크 파형의 실시간 보기를 위해 스파이크 범위 창을 열고 마우스 클릭을 사용하여 임계값을 설정합니다.
- 루트 평균 사각형(μV의 RMS)을 모니터링하여 노이즈 레벨을 검사합니다. 클린 스파이크 레코딩의 경우 신경 스파이크 임계값이 최소 5배 RMS인 것이 바람직하다.
- 설정이 완료되면 파일 출력 형식을 선택합니다.
참고: 여기, CA1 신경 스파이크는 .rhd 형식으로 기록되었습니다. 다른 파일 형식(.rhs 및 .dat)도 분석 소프트웨어에서 허용하는 파일 형식과 일치하도록 선택할 수 있습니다.
7. 생체 내 광유전학 적고 및 설정
- 다양한 조정 가능한 펄스 매개 변수를 표시하는 TTL(펄스 제어 소프트웨어)을 엽니다. 소프트웨어에서 적절한 COM 포트를 선택합니다. 기차 및 그룹 설정을 조정하여 펄스 매개 변수를 설정합니다.
참고: 펄스 상태는 실험 변수 및 설계를 고려하여 결정되어야 합니다. - 증폭기 컨트롤러 소프트웨어에서 실행을 클릭하여 해마 또는 원하는 뇌 영역에서 신경 스파이크를 감지합니다. 필요한 경우 전극 깊이를 조정하여 실행 가능한 활성 뉴런을 감지합니다.
- 세포외 전압 활동이 감지되면 기준선 스파이크를 15분 동안 관찰하고 동물의 활력을 모니터링합니다. 또한, 광 펄스를 테스트하여 CA1 또는 원하는 해부학 표적 영역 내에서 반응성 뉴런을 검출한다.
참고: 광전 유물을 확인하고 광강도 또는 광섬유 위치를 조정하여 제거합니다. - 원하는 주파수에서 광 펄스를 트리거하기 전에 ~10 분 동안 기준 활성을 기록합니다(그림 5a,b). 이렇게 하면 조명이 있거나 없는 발사 또는 버스트 속도를 비교할 수 있습니다.
참고: 현재 연구에서기준 활성은 조명 없이 10분 동안 기록되었고, 그 다음으로 50Hz(Movie1)에서조명이 뒤따랐다.
8. 분석
- .rhd 파일을 넥스5 출력 형식으로 변환합니다.
- 파일 이름을 처리합니다. Nex5 파일은 단일 단위 래스터 열차 및 파형을 감지하는 오프라인 선별기 소프트웨어의 파일(그림 5a-b).
- 드롭다운 창에서 원하는 채널을 선택합니다.
참고: 지속적으로 기록된 스파이크 데이터는 OFSS의 별도의 창에서 볼 수 있습니다. 시간 척도도 조정할 수 있습니다. 테트로드를 사용하는 경우 OFSS는 4개의 채널을 테트로드로 정렬하도록 설정할 수 있습니다. - 임계값 교차 파형 추출에 대한 전압 레벨을 설정합니다.
주의: 적절한 스파이크 감지를 위해 최소 5배의 RMS를 사용합니다. - 파형을 감지한 다음, 계곡 을 구사(자동) 또는 K-means(반자동) 방법을 사용하여 스파이크 정렬을 수행합니다. 필요한 경우 PCA(3D 주체 구성 요소 분석) 공간의 유사한 영역을 차지하는 병합 단위입니다.
- 정렬된 내보내기입니다. 추가 분석을 위한 넥스5 파일(그림5c-d).
참고: 인터스파이크 간격, 발사 속도 및 버스트 속도에 대한 분석 결과를 다른 분석 플랫폼으로 내보낼 수 있습니다.
- 드롭다운 창에서 원하는 채널을 선택합니다.
9. AAV 발현의 형광 검출
- 녹음 후, 이소플루란 챔버에서 동물을 안락사.
- 10mM PBS(~10mL)로 경외 관류를 수행하고, 4% 인산염 완충 파라포름데히드(PB-PFA, ~10mL)를 수행한다.
- 전체 뇌를 그대로 제거하고 48 시간 동안 4 % PB-PFA로 수정하십시오.
- 고정 된 뇌를 4 ° C에서 냉동 보존을위한 30 % 자당을 포함하는 4 % PB-PFA로 전송합니다. 72시간 후, 뇌를 극저온으로 절개하고 젤라틴 코팅 슬라이드에 슬라이스를 장착합니다.
참고: 현재 프로토콜에서, 해마의 폐쇄된 부분(rostral)을 포함하는 단면이 DG, CA3 및 CA1에서 AAV 표지단을 시연하도록 선택되었다.
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Representative Results
앤티로그라드 추적
AAV 발현은 C57BL/6 마우스의 VTA에서 기자 단백질(eYFP)의 면역형광 이미징에 의해 확인되었다 21일 후사(그림2). 해마에서 사전 시냅스 VTA 글루타민트 프로젝션의 성공적인 anterograde 라벨링은 또한 DG, CA3 및 CA1의 층에서 eYFP 검출에 의해확인되었다(도 6a-d; 영화 2와 3).
해마변CA1 활성에 대한 VTA 글루타민트 프로젝션
VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 퍼티피라미드 CA1 뉴런의 활동을 증가시켰습니다. 이는 라이트 온(1) 경상(영상1)과비교하여 라이트 OFF 단계(그림5a-b)와비교하여 스파이크 이벤트의 증가로 분명하게 드러난다. 이러한 결과를 지원하기 위해, CA1 네트워크 발사속도(light OFF; baseline) 및 이후(light ON) 사진 자극의 통계적 비교는 자극 후 기간에 대한 유의한 증가를보였다(도 7a;p = 0.0002). 버스트를 감지하기 위한 래스터 트레인(<16ms의 2-4 스파이크)의 후속 분석은 VTA 글루타민트 사진 자극 후 CA1 퍼티얼 피라미드 뉴런에 대한 버스트 비율이 증가하는 것을보여준다(그림 7b;p = 0.0025). 통계(학생의 t-test)분석은 표준 소프트웨어로 수행되었습니다. 여기서, 기준선(light OFF) 발사 또는 버스트 속도는 라이트 ON(사진 자극) 값과 비교하였다.
그림 1: C57BL/6 마우스의 VTA에 AAV-CaMKII-ChR2-eYFP 주입의 회로도 그림.
해마에 VTA 뉴런과 축 축 투영의 Anterograde 라벨링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: VTA에서 AAV-CaMKII-ChR2-eYFP 발현을 보여주는 형광 영상 및 광섬유 트랙.
Dk: 다크슈치치의 핵, scp: 우수한 소뇌 받침대, VTA: 복부 테게멘탈 영역, RM: 레트로마밀리얼 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 두개골 절제술, 전극 배치 및 광섬유 배치의 데모.
(A)두개골을 노출하는 중간 절개 (b : 브레그마, 옥 : 목수 뼈). (B)후두 뼈및 연결된 스테인레스 스틸 접지 와이어 (gw)에 접지 나사 (gs)의 배치. (C)광섬유 캐뉼라의 스테레오포티드 포지셔닝(foc: 광섬유 케이블). (D)광섬유 캐뉼라 및 신경 프로브 생크의 스테레오포티드 포지셔닝 (foc: 광섬유 케이블, adP: 어댑터, Ms: 짝짓기 슬리브, prs: 프로브 생크, hs: 헤드 스테이지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: BNC 분할 연결결합 광 맥동 및 증폭기(트리거) 타임스탬프.
(A)광섬유 캐뉼라 의 끝에서 LED 발광의 시연. (B)TTL은 BNC 분할 어댑터를 통해 펄스하여 LED 및 타임스탬프 증폭기(ampl) 레코딩을 제어합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 단일 단위 감지를 사용하여 연속으로 기록된 스파이크 트레인(원시 데이터)입니다.
(A)마취 마우스의 해마에서 원시 기록의 스크린 그랩. (B)원시 레코딩에서 VTA의 TTL 구동 사진 조명. 밝은 파란색 선은 Light ON(λ = 470nm) 기간 및 자극 주파수의 타임 스탬프를 보여줍니다. (C-D) 스파이크 정렬에 의해 파생된 스파이크 트레인 및 뉴런 유닛을 지속적으로 기록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 해마에서 AAV-CaMKII-ChR2-eYFP의 발현을 보여주는 대표적인 형광 영상.
(A)DG (GCL: 세분화된 세포층, 힐루스). (B)DG에 가까운 CA3의 일부 (SL: 지층 라쿠노섬, 피르: 피라미드 세포 층). (C)CA3 적절. (D)CA1 (그래서 : 지층 오리엔스, 피르 : 피라미드 세포 층, 라드 : 층 라디큘라타). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 사진 화후 발사 율에 대한 통계적 비교.
(A)사진 조명 후 CA1(***p = 0.0002)에서 피라미드 형 뉴런 유닛에 대한 평균 발사 속도(Hz)가 증가된 것을 보여주는 바 그래프. (B)사진 조명 후 PUTative CA1 뉴런에 대한 증가 버스트 속도를 보여주는 바 그래프 (**p = 0.0025). 오류 표시줄: 평균의 표준 오류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 앰프 컨트롤러 및 펄스 소프트웨어의 스크린 그랩 레코딩. 이 동영상은 기준선 기록(light OFF)을 보여 주며, 파란색 타임스탬프로 표시된 사진 자극(라이트 ON, λ = 470 nm)을 보여 줍니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2 및 영화 3 : 마우스의 DG에서 VTA 조미료 단자의 3D 그림. DAPI-블루: 세분화된 세포 층(GCL)의 핵 라벨; eYFP-Green: DG 힐루스의 AAV 라벨-VTA 단자. 이 동영상을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지난 10년 동안 AAV 구조의 설계가 크게 발전했습니다. 이와 같이, 더 많은 뉴런 특이성 프로모터는 향상된 형질 전환특이성(14)을위한 AAV 혈청형배열에 편입되었다. 형광 단백질, 수송기, 수용체 및 이온 채널을 위한 유전자를 결합함으로써, AAV의 도서관은 지금 화상 진찰, 신경 변조 및 시냅스 활동 검출을 위해 존재합니다. 시판되는 AAV-constructs에서, 유전적으로 인코딩된 형광소 및 이온 채널(opsin)의 조합은 신경 회로의 결합된 신경 해부학 및 전기생리학적 추적을 허용한다14,18,19. 마찬가지로, 프로모터(또는 cre-lox 재조합 방법)의 선택은 회로 내의 뉴런 유형 별 투영의 추적을 허용할 수 있다. 현재 연구에서는, 이 프로토콜은 해마(CA1 지역)에 대한 VTA 글루타민트 신경 투영의 해부학적 및 전기생리학적 평가를 위해 배포되었다.
VTA-해마 신경 회로
VTA는 중뇌 중구 중구 의 일부입니다. 보상 및 혐오 학습에 관여하는 뇌 영역에 대한 VTA 예측은광범위하게 입증되었다 20,21,22,23,24,25. VTA는 도파민을 포함 하는 동안, 글루타민, 그리고 GABA 뉴런, 도파민 신경 인구는 해부학적으로 지배적이다. 혐오와 보상 학습에서 VTA의 주요 기능은 핵 accumbens 및 등쪽 라페 핵22,24,25,26,27,28에대한 강력한 VTA 도파민 투영에 기인한다. VTA 도파민과 글루타민 뉴런이 해마에 투영되지만, 해부학적으로 지배적인 VTA 글루타민단의 기능은해마29,30의VTA 도파민 단자에 비해 덜 연구된다.
현재 프로토콜은 해마에서 CaMKIIα 발현 VTA(글루타메이트) 단자 매핑을 위해 불소호레(eYFP) 및 빛 제어 옵신(hChR2)을 수용하는 AAV5 구조물의 사용을 설명합니다. 이전 연구는 VTA 글루타민 단자가 VTA 도파민 단자29와비교했을 때 해마에서 해부학적으로 지배적이라는 것을 확립했습니다. 해마에서 VTA 글루타민제 전시냅스 단자를 시연하기 위해 AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP가 VTA 뉴런 세포 체체로 전염되었다. 이것은 세포 바디 VTA 글루타민제 뉴런 (VTA 내)을 표지하고 해마의 층 내의 VTA 글루타민단 단자 설명했습니다.
VTA 글루타메이트 전시냅스 단자가 내부점 DG, CA3 및 CA1이지만, 결과는 이들 세 영역에 대한 계층 의존적 변화를보여준다(그림 6a-d). DG에서, AAV 표지된 VTA 글루타민단단은 세분화된 세포 층과 비교할 때 힐루스에서 해부학적으로 지배적이다. CA3에서, VTA 글루타민단단은 피라미드 세포 층 및 지층 오리엔스와 비교했을 때 지층 라쿠노섬에 상대적으로 풍부하다. CA1에서, VTA 글루타민단단은 피라미드 세포 층과 비교할 때 수지상 층(지층 오리엔스 및 라디툼)을 현저히 내면화한다. 이 연구의 결과는 또한 VTA 글루타민산 신경 세포 체의 사진 자극이 생체 내CA1 신경망의 활동을 조절한다는 것을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 사진 자극 기간 동안 CA1 발사 속도 및 버스트 비율의 현저한 증가를 주도하였다(그림7a-b). 이는 해마 정보 인코딩에 영향을 미칠 수 있는 CA1(도6d)의수지상 층에서 VTA 글루타민단단의 해부학적 분포에 동의한다. 이러한 관찰을 지원하기 위해, 다른 연구는 VTA가 해마 작업 메모리 인코딩의 주요결정요인임을 보여주었으며, VTA 해마 루프22,23,24,25,26,27,28,29,31,32,VTA-해마 루프를 통해 장기 메모리에 저장되는 정보의 선택을조절하고 33,34.
기술적 고려 사항
이 프로토콜을 성공적으로 구현하려면 대상이 될 신경 유형에 따라 AAV 구문 선택을 결정해야 합니다. 연구원은 표적으로 하기 위하여 신경 모형에 유일하게 적당한 프로모터 (유전자 제품)를 확인해야 합니다. 현재 연구에서는, CaMKIIα 프로모터가 뉴런을 발현하는 CaMKIIα에서 eYFP 및 hChR2의 발현을 구동하기 위해 사용되었다. 그러나, cre-lox 재조합 방법도 사용될 수 있다. 이 경우, 이중 플록스 AAV5는 CaMKIIα-Cre 마우스의 VTA에서 발현될 수 있다. 프로모터 및 크레록 기반 발현 방법은 다른 뉴런유형(35,36,37)에도적용가능하다.
시스템은 전기 소음을 확인해야합니다. 이 작업은 평가판 기록 세션 동안 스파이크 범위에서 RMS를 평가하여 수행할 수 있습니다. 필요한 경우, 시스템 및 스테레오전술 장치는 패러데이 케이지에 보관되어야 하며 앰프 접지는 케이지에 연결되어 있어야 합니다. 전극 접소 부위는 선형 또는 테트로드를 정렬할 수 있습니다. 프로브 설계의 선택은 실험의 목적에 따라 결정되어야 합니다. 선형 배열은 여러 계층에서 뉴런을 감지합니다. 다양한 간격(미크론) 사양을 갖춘 프로브도 시판됩니다. 프로브 접촉 사이트 사이의 생크 길이와 거리는 기록 절차 및 분석 중에 고려해야 합니다. 설정이 완료되면 광전 아티팩트를 제거하기 위해 평가판 녹화 중에 라이트 펄스를 확인해야 합니다. 이는 또한 광섬유 깊이 및 위치에 비해 전극의 위치를 조정하여 최적화할 수 있습니다.
제한
CaMKIIα는 글루타민염 방출 뉴런에서 주로 표현되지만, 단백질은 글루타민을 공동 방출하는 도파민 뉴런의 일부 인구에도 존재합니다. 따라서, AAV5-CaMKIIα를 사용하면 주로 글루타민트 뉴런과 CaMKIIα를 발현하는 일부 도파민 뉴런에 라벨을 붙일 것이다. LED 구동 사진 자극 프로토콜은 저렴하며 쉽게 조립할 수 있습니다. 그러나 레이저 구동 사진 자극 프로토콜이38,39,40보다더 효과적이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 다른 동물을 위해 동일한 뇌 부위에 주입된 AAV 용액은 다양한 발현 임계값을 산출합니다. 그러나, 주분 후 3 주 이상 기다리는 것은 최적의 전환을 허용하여 이러한 변화를 줄일 수 있습니다. 뇌 부위에 주입된 AAV 용액은 주변 뇌 영역으로 확산될 수도 있습니다. 바늘이 낮아진 후 대기 기간을 관찰하고, 볼루스 주사 사이에 는 주사 부위로부터 AAV 용액의 확산을 줄일 수 있다.
요약하자면, 이 방법은 설치류의 두뇌에 있는 신경 회로를 추적하는 데 사용될 수 있습니다. 현재 프로토콜은 마취 된 마우스에서 생체 신경 회로 추적을 설명하지만, 절차는 또한 깨어 있는 면도 마우스에서 만성 기록을 위해 배포될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 OOM에 수여 CBS 브리징 그랜트에 의해 지원됩니다. OOM, PAA 및 AS는 연구를 설계하고 실험을 수행했습니다. AS와 PAA는 결과를 분석했습니다. OOM과 PAA는 원고를 준비했습니다. 우리는 우리의 사용에 대 한 AAV를 사용할 수 있도록 칼 디세로스 박사 (스탠포드 대학) 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
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