Summary
O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.
Abstract
A modulação optogenética de subsu populações de neurônios no cérebro permitiu aos pesquisadores dissecar circuitos neurais in vivo e ex vivo. Isso fornece uma premissa para determinar o papel dos tipos de neurônios dentro de um circuito neural, e sua significância na codificação de informações em relação ao aprendizado. Da mesma forma, o método pode ser usado para testar a significância fisiológica de duas ou mais regiões cerebrais conectadas em animais acordados e anestesiados. O presente estudo demonstra como os neurônios de glutamato VTA modulam a taxa de disparo de neurônios piramidários putativos no CA1 (hipocampo) de camundongos anestesiados. Este protocolo emprega rotulagem dependente de adeno (AAV) de neurônios glutamato VTA para o rastreamento de terminais de glutamato pré-sináptico VTA nas camadas do hipocampo. Expressão de opsina controlada pela luz (channelrhodopsin; hChR2) e proteína de fluorescência (eYFP) abrigada pelo vetor AAV permitiu rastreamento anterograde de terminais de glutamato VTA, e fotostimulação de corpos celulares neurônios de glutamato VTA (no VTA). Eletrodos de silício agudos de alta impedância foram posicionados no CA1 para detectar respostas multi-unidades e uni unidades à fotostimulação VTA em vivo. Os resultados deste estudo demonstram a distribuição dependente de camadas dos terminais de glutamato VTA pré-sinápticos no hipocampo (CA1, CA3 e DG). Além disso, a fotostimulação dos neurônios glutamato VTA aumentou a taxa de disparo e estouro de unidades piramigráficas ca1 putativas in vivo.
Introduction
Na última década, uma série de ferramentas genéticas foi desenvolvida para aumentar a especificidade da modulação do tipo neurônio, e o mapeamento de redes neurais complexas1. Notavelmente, vírus neurotrópicos com uma capacidade inerente de infectar e replicar em células neuronais foram implantados para expressar ou ablate proteínas específicas em subtipos de neurônios. Ao abrigar proteínas de fluorescência ou indicadores de atividade sináptica geneticamente codificados, os vetores AAV transfectados rotulam e delineiam redes neurais nas regiões cerebrais2,3. A escolha de um promotor na construção AAV direciona a expressão do vetor em tipos de neurônios com algum nível de especificidade (expressãodependente do promotor). No entanto, através da recombinação de Cre-lox, os construtos AAV são implantados com maior especificidade para rotulagem de neurônios4,5,6,7. Note-se que as proteínas de opsinas microbianas fotoativadas e as proteínas de fluorescência embaladas em vetores AAV podem ser expressas em vários subtiposde neurônios 8, e são ideais para imagens, rastreamento de circuito do tipo neurônio e fotomodulação9,10.
Os AAVs constroem estereoticamente injetados em uma região cerebral (ou núcleo) impulsiona a expressão da proteína repórter nos terminais soma, dendrite e axônios. A expressão neural da AAV abrigando um gene repórter (eYFP) facilita a rotulagem de corpos celulares neurônios e o rastreamento anatômico de projeções de e para outras regiões cerebrais11,12,13,14. Os construtos AAV-eYFP que transportam opsina controlada por luz (por exemplo, hChR2), podem ser implantados como uma ferramenta para imagens6,15 e rastreamento fisiológico baseado em estimulação de projeções neurais para atingir áreas cerebrais in vivo16. Dependendo do sorotipo AAV, a direção da rotulagem de neurônios pode ser anterograda ou retrógrada11,12. Estudos anteriores estabeleceram que o AAV5 viaja anterogradavelmente em neurônios12. Assim, a fotostimulação de corpos celulares expressando hChR2 produz efeitos pré-sinápticos em outros lugares do cérebro (alvo)17.
Aqui, o AAV (sorotipo 5) com um promotor CaMKIIα foi usado para expressar eYFP (repórter) e hChR2 (opsin) em neurônios glutamato VTA e projeções axonais. Os resultados deste estudo demonstram a distribuição dependente de camadas dos terminais pré-sinápticos de VTA-glutamato nas regiões hipocampal CA1, CA3 e DG. Além disso, a fototimulação dos neurônios de glutamato VTA aumentou as taxas de disparo de ca1 multi-unidades e uni unidades in vivo quando comparada com os valores da linha de base. Este protocolo utiliza ferramentas acessíveis e softwares comercialmente disponíveis que podem aumentar a qualidade dos dados obtidos a partir de experimentos de rastreamento de circuito neural.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais e de manejo animal foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Louisiana.
1. Animal experimental
- Use ratos de 5 a 6 semanas.
- Casa 3-5 animais por gaiola sob condições padrão de 12 h alternando luz e ciclo escuro. Comida e água devem ser fornecidas ad libitum.
2. Craniotomia e preparação animal
NOTA: Esta seção descreve procedimentos pré e peri-operatórios para craniotomia do rato. Use aparelhos estereotáticos padrão e coordenadas apropriadas (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML e Dorsoventral: DV). Consulte um atlas cerebral de rato para determinar as coordenadas para a região cerebral de interesse.
- Anesthetize camundongos por cetamina intraperitoneal (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) injeção de coquetel. Realize um teste de beliscão do dedo do pé para garantir a ausência de sensação antes do início da cirurgia.
NOTA: Alternativamente, a anestesia isoflurane com uma câmara de nariz apropriada também pode ser usada para esta etapa. - Conserte suavemente a cabeça do animal no aparelho estereotaxico.
NOTA: É importante lidar com animais com cautela durante este processo. Além disso, verifique a taxa de respiração e outros sinais vitais antes de prosseguir com a cirurgia. Deixe o animal descansar por ~7 minutos para reduzir o estresse.- Coloque uma almofada de aquecimento na estrutura estereotaxa de tal forma que o corpo do animal esteja deitado sobre ele. Isso ajudará a manter a temperatura corporal e manter o animal aquecido, embora o procedimento. Mantenha a almofada de aquecimento para cuidados pós-operatórios e recuperação.
- Use um cortador para remover o cabelo sobre o couro cabeludo e limpe a pele com uma solução de iodo.
- Aplique lidocaína tópica para bloquear a sensação no couro cabeludo.
- Use um bisturi para fazer uma incisão de couro cabeludo médio que se estenda da frontal até a região occipital.
- Limpe a área de incisão com solução de iodo e exponha a calvaria.
NOTA: Uma pequena quantidade de 3% de solução de peróxido de hidrogênio pode ser aplicada para remover periosteum da calvária. Isso aumentará a visibilidade de marcos (bregma e lambda) e suturas. - Usando um atlas estereotático cerebral do camundongo, determine coordenadas AP e ML relativas ao bregma.
- Para injeção de VTA, posicione uma seringa de agulha de ponto contundente ultrafina (por exemplo, seringa neuros) nas coordenadas AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm em relação ao bregma.
- Use uma ferramenta de perfuração para furar um orifício de 1 mm (craniotomia) no crânio na coordenada AP/ML marcada.
NOTA: Esta etapa requer um nível significativo de cautela. A pressão mínima deve ser aplicada durante a perfuração para evitar que a broca esmague o tecido cerebral. No presente estudo, a broca foi de 0,8 mm e a velocidade da broca foi fixada em 15.000 rpm.
ATENÇÃO: Se o peróxido de hidrogênio foi usado na limpeza da incisão ou calvária, garanta a remoção total da solução ou permita a secura completa antes da perfuração.
3. Injeção de coquetel AAV
NOTA: Esta seção descreve o processo de injeção de AAV no VTA de camundongos C57BL/6 adultos (23-27 g). O método descrito pode ser usado para injeção de AAV em qualquer região cerebral usando aparelhos estereotáticos padrão e coordenadas apropriadas. Para demonstrar este protocolo, eYFP e hChR2 foram expressos em neurônios glutamato VTA usando transfecção mediada por AAV5 sob um promotor CaMKIIα(Figura 1). A recombinação de cre-lox também pode ser usada para esta etapa.
- Monte uma seringa com agulha de ponto contundente ultrafina (32 G; capacidade de 5 μL com precisão de 100 nL) em um injetor. Conserte o suporte de seringa em um micromanipulador.
NOTA: Para este procedimento, utilizou-se um porta-seringa manual, com calibração de 1,6 nL. Um injetor automatizado também pode ser usado. - Encha a seringa com água dupla destilada para limpar e testar o fluxo de fluido.
- Descongelar alíquotas de AAV (sorotipo 5) coquetel no gelo. Os AAVs são melhor armazenados a -80 °C para manter o título viral para uma boa expressão.
- Encha a seringa montada com 1.000 nL de solução AAV (10 mM em soro fisco tamponado de fosfato (PBS), pH 7.4). Dispense 10 nL da solução AAV para confirmar o fluxo do líquido antes de baixar a agulha em um local de injeção.
- Use um micromanipulador para baixar a agulha estereoticamente na profundidade desejada (coordenada DV). Depois de baixar a agulha para a profundidade desejada, deixe a seringa permanecer no lugar por 10 minutos antes da injeção.
NOTA: Para este procedimento, a agulha foi abaixada no VTA a uma profundidade (DV) de 4,5 mm da superfície pial do cérebro. Para outras áreas cerebrais, use a coordenada dorsoventral apropriada (consulte o atlas cerebral do camundongo). - Injete 600-800 nL de AAV no VTA. O volume de injeção pode ser ajustado dependendo do tamanho do local alvo.
- Entregar a solução AAV à taxa de 60 nL/min (intervalo de 3 min).
- Para expressar eYFP e hChR2 em neurônios e projeções de glutamato VTA, injete AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
NOTA: O método de recombinação de Cre-lox também pode ser usado dependendo do objetivo do experimento. - Deixe a agulha permanecer no lugar por 15 minutos após a injeção de AAV. Isso reduzirá a difusão e o backflow.
- Retire a agulha da seringa e, em seguida, suturar a incisão para fechar a ferida.
- Administre antibióticos e analgésicos como parte dos cuidados pós-operatórios. Coloque o mouse em uma plataforma acolchoada quente e monitore o animal até acordar.
NOTA: Após 3 semanas de injeção, a expressão AAV pode ser observada pela detecção de fluorescência de proteína repórter (eYFP) em seções cerebrais de camundongos. Além disso, experimentos de fotostimulação podem ser realizados após 3 semanas(Figura 2).
4. Configuração para gravações neurais in vivo com optogenética
NOTA: Esta seção descreve os passos para gravação neural aguda com o rastreamento optogenético de um circuito cerebral (projeção de neurônio glutamato VTA para o CA1). Se necessário, verifique o sistema (amplificador e conexões) para problemas de ruído elétrico e aterramento antes de iniciar esta etapa. Realizar esta etapa em uma gaiola faraday pode ajudar a eliminar o ruído elétrico na gravação.
- Às 3 semanas após a injeção de AAV, anesthetize camundongos por injeção de uretano intraperitoneal (0,2 mg/kg).
ATENÇÃO: O uretano é cancerígeno e deve ser manuseado com cautela enquanto usa equipamento de proteção. Além disso, administrar anestesia de uretano nesta concentração não é sobrevivência. - Fixar a cabeça do animal em um quadro estereotático como descrito anteriormente (etapa 2.2, Figura 3A). Faça uma craniotomia para expor a dura (Figura 3A). Use uma ferramenta de perfuração (tamanho de bit: 0,8 mm, velocidade: 15.000 rpm) para remover parte do osso parietal.
- A craniotomia deve ter cerca de 3 mm x 4mm de largura. Aplique gotas de fluido cerebrospinal artificial (aCSF) sobre esta área para evitar o ressecamento.
- Sob um microscópio de dissecção (digital), use uma ponta de agulha dobrada (27 G) para extiridar a dura exposta. Tenha cuidado para não separar a delicada cobertura de pial e tecidos cortical nesta área.
- Furar o osso occipital (tamanho do bit: 0,8 mm, velocidade: 10.000 rpm) para segurar o parafuso moído (parafuso Phillips da cabeça da panela; M0,6 x 2,0 mm).
- Conecte um fio moído de aço inoxidável.
NOTA: Outros tipos de fios também podem ser usados(Figura 3b). - Para fotostimulação combinada (VTA) e gravação neural (CA1), use um aparelho estereotaxista multi-trilho equipado com micromanipuladores ultrafinas (10 μm ou 1 μm). Monte a fibra óptica e a sonda neural de gravação em micromanipulador de alcance de 10 μm e 1 μm de alcance, respectivamente.
- Se necessário, use um adaptador de teste de estágio da cabeça(Figura 3c).
NOTA: No protocolo atual, um estágio de cabeça de 32 canais foi equipado com um adaptador para conter um eletrodo de gravação de 4 canais(Figura 3d). O fio moído de aço inoxidável foi soldado à porta de conexão terrestre do adaptador.
- Se necessário, use um adaptador de teste de estágio da cabeça(Figura 3c).
- Nas coordenadas AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, abaixe a fibra óptica de 400 μm de diâmetro no VTA.
- Antes de baixar a fibra óptica, conecte a ferrule a um cabo de fibra óptica (com aço inoxidável ou ferrule cerâmico) ligado a uma fonte LED acoplada a fibra.
NOTA: Certifique-se de que a intensidade da luz e o foco estão definidos conforme desejado. A escolha da fonte de luz LED deve corresponder às opsinas que estão sendo direcionadas. Aqui, um driver LED de 470 nm (luz azul) foi usado para fotoativação hChR2(Figura 4a). - Para sincronizar o pulso de luz com a gravação neural, conecte o driver LED e o controlador de gravação digital in porta a um pulsar de lógica transistor-transistor (Figura4b). Isso pode ser conseguido usando um divisor BNC.
NOTA: O uso de um pulsar TTL proporciona a flexibilidade de definir digitalmente a frequência e duração do trem de pulso desejados. No protocolo atual, pulsos de luz de 10 ms foram acionados a 50 Hz18. Para o controle TTL do driver LED, mude o motorista para "acionamento". Neste modo, a intensidade da luz pode ser regulada girando o "botão". A frequência de estimulação pode ser ajustada para acomodar variáveis experimentais e pode variar de 1 a 100 Hz. Para rastreamento de circuito neural, recomenda-se uma frequência de estimulação de >20 Hz. - Ajuste o botão para determinar a intensidade efetiva que pode gerar uma resposta sem produzir artefatos fotoelétricos. Se necessário, reposicione a fibra óptica para eliminar artefatos19.
NOTA: O driver LED usado para o protocolo atual produz potência leve de ~21,8 mW.
- Antes de baixar a fibra óptica, conecte a ferrule a um cabo de fibra óptica (com aço inoxidável ou ferrule cerâmico) ligado a uma fonte LED acoplada a fibra.
5. Gravação neural
- Use uma sonda neural aguda com uma haste de 15 a 50 μm de espessura, medindo pelo menos 5 mm de comprimento.
NOTA: A gravação de estruturas cerebrais profundas exigirá sondas neurais com uma haste mais longa. No presente estudo, foi utilizada uma sonda com comprimento de haste de 20 mm. - Conecte o estágio da cabeça do pré-amplificador ao controlador de gravação através de um cabo SPI (Serial Periférico Interface, interface periférica). Verifique a iluminação colorida dos LEDs nas portas do controlador de gravação. Os LEDs verdes e amarelos indicam tensão adequada na placa do amplificador conectado. Led vermelho indica um controle de estágio de cabeça de software de trabalho(Figura 5b).
- Utilizando um micromutor, posicione os locais de contato do eletrodo na camada celular piramida do CA1 (AP: -1,94mm, ML: +1,0mm, DV: +1,1 a 1,2mm).
NOTA: A fibra óptica e o eletrodo podem ser posicionados em outras regiões cerebrais desejadas para fotostimulação e gravação.
6. Configurações do amplificador e filtro
- Conecte o sistema do amplificador do controlador de gravação a um computador através de uma porta USB 3.0. Conecte o estágio da cabeça ao amplificador usando o cabo SPI. Inicie o software do controlador. Se não estiver conectado corretamente, o sistema exibirá uma mensagem "dispositivo não encontrado".
- Clique em Executar para ver a atividade nos canais. Cada forma de onda é plotada como a tensão (eixo y) versus o tempo (eixo x). Dependendo da região de interesse, ajuste a tensão e as escalas de tempo para ajustar o display de forma de onda.
- Se apenas alguns canais estiverem ativos, desabilite canais nãouso para reduzir o tamanho do arquivo no disco de armazenamento.
- Defina a taxa de amostragem e as frequências de corte editando parâmetros de largura de banda no software de aquisição. Para gravação uni unitária, defina as frequências de corte superior e inferior para 300 Hz e 5.000 Hz, respectivamente. Altere a taxa de amostragem do amplificador para 30 kS/s.
NOTA: Escolher uma alta taxa de amostragem produzirá um tamanho maior de arquivo. - Antes de gravar, verifique a integridade dos canais de eletrodos medindo a impedância a 1.000 Hz. Isso pode ser feito lançando a função na interface do usuário (software do controlador). Um canal de trabalho deve ter um valor de impedância que varia de 0,1 a 5 MΩ.
- Se uma saída de áudio (alto-falante) estiver conectada à porta ANALOG OUT, ajuste o ganho e o silenciador para um som de pico ideal.
- Para exibir o marcador do trem de pulso TTL na gravação de pico, habilite o display para o marcador DIGITAL IN. Para gravar o carimbo de tempo do trem de pulso, habilite a exibição do canal DIGITAL IN antes do experimento principal.
NOTA: Geralmente há mais de um canal "DIGITAL IN" (1 ou 2). Certifique-se de que o cabo BNC do pulsador TTL esteja conectado à porta "DIGITAL IN" selecionada para exibição no software do controlador de gravação. - Para visualização em tempo real da forma de onda de pico, abra a janela do escopo de pico e defina o limiar usando o clique do mouse.
- Inspecione o nível de ruído monitorando o Root Mean Square (RMS in μV). Para gravação de pico limpo, é preferível que o limiar de pico neural seja de pelo menos 5x RMS.
- Uma vez concluída a configuração, selecione o formato de saída do arquivo.
NOTA: Aqui, o pico neural ca1 foi registrado em formato .rhd. Outros formatos de arquivo (.rhs e .dat) também podem ser selecionados para corresponder aos formatos de arquivo permitidos pelo software de análise.
7. Gravação e configurações optogenéticas in vivo
- Abra o software de controle de pulso (TTL), que exibe vários parâmetros de pulso ajustáveis. Selecione a porta COM apropriada no software. Ajuste os parâmetros de pulso ajustando as configurações trem e grupo.
NOTA: A condição de pulso deve ser determinada considerando variáveis experimentais e design. - No software do controlador do amplificador, clique em Executar para detectar picos neurais no hipocampo ou área cerebral desejada. Se necessário, ajuste a profundidade do eletrodo para detectar neurônios viáveis e ativos.
- Uma vez detectada atividade de tensão extracelular, observe os picos de linha de base por 15 minutos e monitore os sinais vitais do animal. Além disso, teste o pulso de luz para detectar neurônios responsivos dentro do CA1 ou região alvo anatômica desejada.
NOTA: Verifique se há artefatos fotoelétricos e elimine ajustando a intensidade da luz ou a posição da fibra óptica. - Regisso da linha de base por ~10 min antes de acionar o pulso de luz na frequência desejada(Figura 5a,b). Isso permitirá a comparação das taxas de disparo ou estouro com e sem iluminação.
NOTA: No presente estudo, a atividade de linha de base foi registrada por 10 minutos sem iluminação, seguida de iluminação a 50 Hz(Filme 1).
8. Análise
- Converta o arquivo .rhd em formato de saída Nex5.
- Nome do arquivo do processo. Arquivo Nex5 em um software de classificador offline para detectar trens rasteres e formas de onda de uma única unidade(Figura 5a-b).
- Selecione o canal desejado na janela de entrega.
NOTA: Os dados de pico registrados continuamente podem ser visualizados em uma janela separada do OFSS. A escala de tempo também pode ser ajustada. Se um tetrode for usado, o OFSS pode ser definido para classificar os 4 canais como um tetrode. - Defina o nível de tensão para extração de forma de onda de cruzamento de limiar.
ATENÇÃO: Utilize um mínimo de 5x RMS para detecção adequada de picos. - Detecte formas de onda e realize a classificação de picos usando o método de busca de vale (automático) ou K -means (semiautomático). Quando necessário, mescla unidades que ocupam regiões semelhantes do espaço de Análise de Componentes 3D-Principal (PCA).
- Exportação classificada . Nex5 arquivos para análise posterior(Figura 5c-d).
NOTA: Os resultados da análise do intervalo interspique, da taxa de disparo e da taxa de estouro podem ser exportados para outras plataformas de análise.
- Selecione o canal desejado na janela de entrega.
9. Detecção de fluorescência da expressão AAV
- Após a gravação, eutanize o animal em uma câmara isoflurane.
- Realizar perfusão transcárvia com PBS de 10 mM (~10 mL), seguido de paraformaldeído tamponado de fosfato de 4% (PB-PFA, ~10 mL).
- Remova todo o cérebro intacto e fixe-o em 4% PB-PFA por 48 h.
- Transfira o cérebro fixo para 4% pb-PFA contendo 30% de sacarose para criopreservação a 4 °C. Depois de 72 h, se sectionia o cérebro em um criostat e monte fatias em um slide revestido de gelatina.
NOTA: No protocolo atual, foram selecionadas seções contendo a parte fechada do hipocampo (rostral) para demonstrar terminais rotulados por AAV no DG, CA3 e CA1.
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Representative Results
Rastreamento de anterogrado
A expressão AAV foi verificada por imagens de imunofluorescência de proteína repórter (eYFP) no VTA de C57BL/6 camundongos 21 dias após a injeção(Figura 2). A rotulagem anterograda bem sucedida de projeções de glutamato VTA pré-sináptico no hipocampo também foi verificada pela detecção de eYFP nas camadas do DG, CA3 e CA1 (Figura 6a-d; Filme 2 e 3).
Projeções de glutamato VTA para o hipocampo modulam a atividade ca1
A fotostimulação dos neurônios glutamato VTA aumentou a atividade de neurônios CA1 piramidalas putativos. Isso é evidente como um aumento dos eventos de espetamento durante a fase ON light(Filme 1)quando comparado com a fase light OFF(Figura 5a-b). Para suportar esse desfecho, a comparação estatística das taxas de disparo de rede CA1 antes (luz OFF; linha de base) e após a fototimulação (light ON) revelou um aumento significativo para o período pós-estimulação (Figura 7a; p = 0,0002). A análise subsequente do trem raster para detectar rajadas (2-4 picos em <16 ms) também demonstra uma taxa de estouro aumentada para os neurônios piramidfábulos putativos cata após fototimulação de glutamato VTA(Figura 7b; p = 0,0025). A análise estatística (teste t-testedo aluno) foi realizada com software padrão. Aqui, a taxa de disparo ou estouro da linha de base (light OFF) foi comparada com os valores light ON (fotostimulação).
Figura 1: Ilustração esquemática da injeção AAV-CaMKII-ChR2-eYFP no VTA do mouse C57BL/6.
Rotulagem anterograda de neurônios VTA e projeções axonais para o hipocampo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de fluorescência que mostram a expressão AAV-CaMKII-ChR2-eYFP no VTA e a faixa de fibra óptica.
Dk: núcleo de Darkschewitsch, scp: peduncle cerebelar superior, VTA: área tegmental ventral, e RM: núcleo retromárquico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Demonstração da craniotomia, colocação de eletrodos e colocação de fibra óptica.
(A) Incisão midline expondo o crânio (b: bregma, oc: osso occipital). (B) Colocação do parafuso de aterramento (gs) no osso occipital e fio de aço inoxidável conectado (gw). (C) Posicionamento estereotático da cânula de fibra óptica (foc: cabo de fibra óptica). (D) Posicionamento estereotático da cânula de fibra óptica e pernil da sonda neural (foc: cabo de fibra óptica, adp: adaptador, ms: manga de acasalamento, prs: pernil sonda, hs: estágio da cabeça). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Conexão dividida BNC para carimbos de tempo combinados de pulsação de luz e amplificador (gatilho).
(A) Demonstração da emissão de luz LED a partir da ponta de uma cânula de fibra óptica. (B) Pulso TTL através de um adaptador split BNC para controlar a gravação do LED e do amplificador de carimbo de tempo (ampl). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Trem de pico registrado continuamente (dados brutos) com detecção de unidade única.
(A) Captura de tela de gravação bruta do hipocampo de um rato anestesiado. (B) Iluminação fotográfica orientada por TTL do VTA na gravação bruta. Linhas azuis claras demonstram os carimbos de tempo para períodos Light ON (λ = 470nm) e frequência de estimulação. (C-D) Unidades de trem de pico e neurônios continuamente registradas derivadas pela triagem de picos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens representativas da fluorescência demonstrando a expressão de AAV-CaMKII-ChR2-eYFP no hipocampo.
(A) DG (GCL: camada de célula granular, hil: hilus). (B) Parte do CA3 próximo ao DG (SL: estrato lacunosum, pira: camada celular pirana). (C) CA3 propriamente dito. (D) CA1 (assim: stratum oriens, pyr: pyramidal cell layer, rad: stratum radiculata). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Comparação estatística da taxa de disparo antes e depois da fototimulação.
(A) Gráfico de barras demonstrando uma taxa média aumentada de disparo (Hz) para unidades de neurônios piramidários putativos no CA1 (***p = 0,0002) após a iluminação fotográfica. (B) Gráfico de barras demonstrando uma taxa de estouro aumentada para neurônios ca1 putativos após iluminação fotográfica (**p = 0,0025). Barra de erro: erro padrão de média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Gravação de captura de tela do controlador do amplificador e do software pulser. O filme demonstra gravação de linha de base (light OFF) seguida de fotostimulação (luz ON, λ = 470 nm) que é indicada com carimbos de tempo azuis. Clique aqui para baixar este vídeo.
Filme 2 e Filme 3: Ilustração 3D dos terminais de glutamato VTA no DG de um mouse. DAPI-azul: rótulo nuclear na camada de célula granular (GCL); eYFP-Green: Terminais AAV rotulados-VTA no DG hilus. Clique aqui para baixar esses vídeos.
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Discussion
Na última década, o projeto de construções AAV avançou significativamente. Como tal, promotores mais específicos de neurônios foram incorporados em uma matriz de sorotipos AAV para uma especificação de transfecção melhorada14. Combinando genes para proteínas de fluorescência, transportadores, receptores e canais de íons, bibliotecas de AAV agora existem para imagem, neuromodulação e detecção de atividade sináptica. Em construções AAV disponíveis comercialmente, uma combinação de canais de fluoroforo e íons geneticamente codificados (opsin) permite um rastreamento neuroantomático e eletrofisiológico combinado dos circuitos neurais14,18,19. Da mesma forma, a seleção de um promotor (ou método de recombinação de cre-lox) pode permitir o rastreamento de projeções específicas do tipo neurônio dentro de um circuito. No presente estudo, este protocolo foi implantado para avaliação anatômica e eletrofisiológica das projeções neurais de glutamato VTA para o hipocampo (ca1).
Circuito neural VTA-Hippocampus
O VTA faz parte do caminho mesocorticolimbico midbrain. As projeções de VTA para as áreas cerebrais envolvidas no aprendizado de recompensa e aversão foram demonstradas extensivamente20,21,22,23,24,25. Enquanto o VTA contém neurônios de dopamina, glutamato e GABA, a população de neurônios de dopamina é anatomicamente dominante. Uma função importante do VTA na aprendizagem de aversão e recompensa é atribuída a uma projeção robusta de dopamina VTA ao núcleo accumbens e núcleo raphe dorsal22,24,25,26,27,28. Embora os neurônios de dopamina e glutamato VTA projetem para o hipocampo, a função dos terminais de glutamato VTA anatomicamente dominantes é menos estudada em comparação com os terminais de dopamina VTA no hipocampo29,30.
O protocolo atual descreve o uso de uma construção AAV5 que abriga um fluorforeiro (eYFP) e opsina controlada por luz (hChR2) para o mapeamento de terminais VTA (glutamato) expressos em CaMKIIα no hipocampo. Estudos anteriores estabeleceram que os terminais de glutamato VTA são anatomicamente dominantes no hipocampo quando comparados com os terminais de dopamina VTA29. Para demonstrar os terminais pré-sinápticos de glutamato VTA no hipocampo, o AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP foi transfectado em corpos de células neuronais VTA. Isso rotulou os corpos celulares de neurônios de glutamato VTA (dentro do VTA) e esboçou terminais de glutamato VTA dentro das camadas do hipocampo.
Embora os terminais pré-sinápticos de glutamato VTA inerçam DG, CA3 e CA1, os resultados mostram variações dependentes de camadas para essas três regiões(Figura 6a-d). No DG, os terminais de glutamato VTA rotulados AAV são anatomicamente dominantes no hilus quando comparados com a camada de célula granular. No CA3, os terminais de glutamato VTA são relativamente abundantes no estrato lacunosum quando comparados com a camada celular piramial e oriens estrato. Considerando que no CA1, os terminais de glutamato VTA inervam significativamente as camadas dendríticas (estrato oriens e radiatum) quando comparados com a camada celular piramipcional. O resultado deste estudo também demonstra que a fotostimulação dos corpos de células neuronais de glutamato VTA modulam a atividade da rede neural CA1 in vivo. A fotostimulação dos neurônios glutamato VTA levou a um aumento significativo na taxa de disparo do CA1 e na taxa de estouro durante a época de fotostimulação(Figura 7a-b). Isso concorda com a distribuição anatômica dos terminais de glutamato VTA nas camadas dendríticas do CA1 (Figura 6d), onde pode exercer efeitos sobre a codificação de informações hipocampais. Em apoio a esta observação, outros estudos mostraram que o VTA é um determinante primário da codificação da memória de trabalho hipocampal, e regula a seleção de informações a serem armazenadas em memória de longo prazo através do loop VTA-hipocampo22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Considerações técnicas
Para implementar com sucesso este protocolo, a escolha dos construtos AAV deve ser determinada com base no tipo de neurônio a ser direcionado. O pesquisador deve identificar um promotor adequado (um produto genético) que seja exclusivo do tipo neurônio a ser alvo. No presente estudo, um promotor de CaMKIIα foi usado para conduzir a expressão de eYFP e hChR2 em Neurônios expressantes caMKIIα. No entanto, um método de recombinação de cre-lox também pode ser usado. Neste caso, um AAV5 floxed duplo pode ser expresso no VTA de ratos CaMKIIα-Cre. Os métodos de expressão baseados em promotor e cre-lox também são aplicáveis a outros tipos de neurônios35,36,37.
O sistema deve ser verificado quanto a ruídos elétricos. Isso pode ser feito avaliando o RMS no escopo de pico durante uma sessão de gravação de teste. Se necessário, o sistema e o aparelho estereotático devem ser alojados em uma gaiola faraday, enquanto o solo do amplificador está conectado à gaiola. Os locais de contato com o eletrodo podem ser organizados linearmente ou um tetrode. A escolha do projeto da sonda deve ser determinada com base no objetivo do experimento. Uma matriz linear detecta neurônios em várias camadas. Sondas com várias especificações de espaçamento (em mícrons) também estão disponíveis comercialmente. O comprimento da haste e a distância entre os locais de contato da sonda devem ser considerados durante o procedimento de gravação e para a análise. Quando a configuração estiver concluída, o pulso de luz precisa ser verificado durante uma gravação de teste para eliminar artefatos fotoelétricos. Isso também pode ser otimizado ajustando a posição do eletrodo em relação à profundidade e localização da fibra óptica.
Limitações
Embora o CaMKIIα seja expresso principalmente em neurônios liberadores de glutamato, a proteína também está presente em algumas populações de neurônios de dopamina que co-liberam glutamato. Assim, o uso de AAV5-CaMKIIα irá rotular principalmente neurônios glutamato e alguns neurônios de dopamina que expressam CaMKIIα. Os protocolos de fotostimulação com LED são acessíveis e podem ser facilmente montados. No entanto, é importante notar que um protocolo de fotostimulação acionado a laser é mais eficaz38,39,40. A solução AAV injetada na mesma região cerebral para diferentes animais produz diferentes limiares de expressão. No entanto, esperar por 3 semanas ou mais após a injeção pode reduzir essa variação permitindo a transfecção ideal. A solução AAV injetada em uma região cerebral também pode se difundir para áreas cerebrais circundantes. Observar o período de espera após a redução da agulha, e entre as injeções de bolus podem reduzir a difusão da solução AAV do local da injeção.
Em resumo, este método pode ser usado para rastrear circuitos neurais no cérebro de roedores. Embora o protocolo atual descreva o rastreamento do circuito neural in vivo em camundongos anestesiados, o procedimento também pode ser implantado para gravação crônica em camundongos de comportamento acordado.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado pela CBS Bridging Grant concedido à OOM. OOM, PAA e AS projetaram o estudo e realizaram os experimentos. As e PAA analisaram os resultados. OOM e PAA prepararam o manuscrito. Agradecemos ao Dr. Karl Disseroth (Universidade de Stanford) por disponibilizar o AAV para nosso uso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
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