Summary
Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.
Abstract
Beyindeki nöron alt popülasyonlarının optogenetik modülasyonu, araştırmacıların in vivo ve ex vivo'daki sinir devrelerini parçalamalarına izin sağlamıştır. Bu, nöron tiplerinin bir sinir devresi içindeki rolünü ve öğrenmeye göre bilgi kodlamasındaki önemini belirlemek için bir öncül sağlar. Aynı şekilde, yöntem uyanık ve uyuşturulmış hayvanlarda iki veya daha fazla bağlı beyin bölgesinin fizyolojik önemini test etmek için kullanılabilir. Mevcut çalışma, VTA glutamat nöronlarının anestezi edilmiş farelerin CA1'deki (hipokampus) putatif piramital nöronların atış hızını nasıl modüle ettiklerini göstermektedir. Bu protokol, hipokampus katmanlarında VTA presynaptik glutamat terminallerinin izlenmesi için VTA glutamat nöronlarının adeno ilişkili virüs (AAV) bağımlı etiketlemesini kullanmaktadır. AAV vektörü tarafından barındırılan ışık kontrollü opsin (channelrhodopsin; hChR2) ve floresan proteininin (eYFP) ekspresyasyonu, VTA glutamat terminallerinin anterograd izlenmesine ve VTA glutamat nöron hücre cisimlerinin (VTA'da) fototimülasyonuna izin verdi. Yüksek empedanslı akut silikon elektrotlar, VTA fotostimülasyonuna in vivo olarak çok birimli ve tek birimli yanıtları tespit etmek için CA1'e yerleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları hipokampustaki (CA1, CA3 ve DG) presynaptik VTA glutamat terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, putatif CA1 piramidal ünitelerinin in vivo ateşlenme ve patlama hızını artırdı.
Introduction
Son on yılda, nöron tipi modülasyonun özgüllüğünü ve karmaşık sinir ağlarının haritalandırılmasını artırmak için bir dizi genetik araç geliştirilmiştir1. Özellikle, nöron alt tiplerinde belirli proteinleri ifade etmek veya alevlendirmek için nöronal hücrelerde enfekte olma ve çoğaltma yeteneğine sahip nörotropik virüsler konuşlandırılmıştır. Floresan proteinleri veya genetik olarak kodlanmış sinaptik aktivite göstergelerini barındırırken, transfected AAV vektörleri beyin bölgelerindeki sinir ağlarını etiketler ve tanımlama2,3. AAV yapısında bir promotörün seçimi, vektörün nöron tiplerinde bir miktar özgüllük(promotöre bağımlı ifade) ile ifadesini yönlendirir. Bununla birlikte, Cre-lox rekombinasyonu sayesinde, AAV yapılarınöron etiketlemesi 4,5,6,7için daha fazla özgüllükle dağıtılır. Not olarak, AAV vektörlerinde paketlenmiş fotoaktive mikrobiyal opsinler ve floresan proteinler çeşitli nöron alt tiplerinde ifade edilebilir8ve görüntüleme, nöron tipi devre izleme ve fotomodülasyon için idealdir9,10.
AAVs, soma, dendrit ve akson terminallerinde muhabir proteininin ekspresyonunun ifadesini yönlendiren bir beyin bölgesine (veya çekirdeğe) stereotaktik olarak enjekte edilen yapılar oluşturur. Bir muhabir geni (eYFP) barındıran AAV'nin sinirsel ifadesi, nöron hücre cisimlerinin etiketlenerek diğer beyin bölgelerine ve diğer beyin bölgelerine yapılan projeksiyonların anatomik olarak izlenmesini kolaylaştırır11,12,13,14. Işık kontrollü opsin taşıyan AAV-eYFP yapıları (örneğin, hChR2),6,15 görüntüleme ve16 vivo beyin bölgelerini hedeflemek için sinirsel projeksiyonların stimülasyontabanlı fizyolojik izleme için bir araç olarak dağıtılabilir. AAV serotipine bağlı olarak, nöron etiketlemenin yönü anterograd veya retrograd11,12olabilir. Önceki çalışmalar, AAV5'in nöronlarda anterograd olarak seyahat ettiğini ortaya12. Böylece, hChR2'yi ifade eden hücre cisimlerinin fotostimülasyonu beynin başka yerlerinde presynaptik etkiler üretir (hedef)17.
Burada VTA glutamat nöronlarında ve aksonal projeksiyonlarda eYFP (muhabir) ve hChR2 (opsin) ifade etmek için CaMKIIα promotörüne sahip AAV (serotip 5) kullanıldı. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, CA1, CA3 ve DG hipokampal bölgelerdeki VTA glutamat presynaptik terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, temel değerlerle karşılaştırıldığında CA1 çok birimli ve tek birimli ateşleme oranlarını vivo olarak artırdı. Bu protokol, sinir devresi izleme deneylerinden elde edilen verilerin kalitesini artırabilecek uygun fiyatlı araçlar ve ticari olarak kullanılabilen yazılımları kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel ve hayvan işleme prosedürleri Louisiana Eyalet Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Deneysel hayvan
- 5-6 haftalık fareler kullanın.
- 12 saat değişen ışık ve karanlık döngü standart koşulları altında kafes başına 3-5 hayvan barındırın. Yiyecek ve su reklam libitum sağlanmalıdır.
2. Kraniyotomi ve hayvan hazırlığı
NOT: Bu bölümde fare kraniyotomisi için ameliyat öncesi ve peri-operatif prosedürler açıklanmaktadır. Standart stereotaktik aparat ve uygun koordinatları kullanın (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML ve Dorsoventral: DV). İlgi çekici beyin bölgesinin koordinatlarını belirlemek için bir fare beyin atlasına bakın.
- Fareleri intraperitoneal ketamin (100 mg/kg)/ksilazin (10 mg/kg) kokteyl enjeksiyonu ile uyuşturun. Ameliyat başlamadan önce his olmamasını sağlamak için bir parmak sıkışma testi gerçekleştirin.
NOT: Alternatif olarak, bu adım için uygun burun odasına sahip izofluran anestezisi de kullanılabilir. - Hayvanın başını stereotaksik aparat üzerine hafifçe sabitlayın.
NOT: Bu işlem sırasında hayvanları dikkatli bir şekilde ele almak önemlidir. Ayrıca, ameliyata devam etmeden önce nefes alma oranını ve diğer hayati değerleri kontrol edin. Stresi azaltmak için hayvanın ~7 dakika dinlenmesine izin verin.- Stereotaksik çerçeveye, hayvanın vücudunun üzerinde yatarak yatarak bir ısıtma yastığı yerleştirin. Bu, vücut sıcaklığını korumaya ve hayvanı prosedür dışında olsa da sıcak tutmaya yardımcı olacaktır. Ameliyat sonrası bakım ve iyileşme için ısıtma yastığını saklayın.
- Saç derisinin üzerindeki saçları çıkarmak ve cildi iyot çözeltisi ile temizlemek için bir makas kullanın.
- Kafa derisindeki hissi engellemek için topikal lidokrin uygulayın.
- Önden oksipital bölgeye uzanan orta çizgili bir kafa derisi kesisi yapmak için neşter kullanın.
- Kesi alanını iyot çözeltisi ile temizleyin, ardından calvaria'yı açığa çıkarın.
NOT: Periosteumu kalvariden çıkarmak için az miktarda% 3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulanabilir. Bu, simge yapıların (bregma ve lambda) ve dikişlerin görünürlüğünü artıracaktır. - Fare beyni stereotaktik atlası kullanarak, bregmaya göre AP ve ML koordinatlarını belirleyin.
- VTA enjeksiyonu için, ultra ince künt noktalı iğne şırıngasını (örneğin, Nöros şırıngası) AP koordinatlarına yerleştirin: -3,08 mm/ML: bregmaya göre 0,5 mm.
- İşaretli AP/ML koordinatında kafatasında 1 mm'lik bir delik (kraniyotomi) delik açmak için bir delme aleti kullanın.
NOT: Bu adım önemli düzeyde dikkat gerektirir. Matkap ucunun beyin dokusunu ezmemesi için delme yaparken minimum basınç uygulanmalıdır. Mevcut çalışmada matkap ucu 0,8 mm idi ve matkap hızı 15.000 rpm olarak belirlendi.
DİkKAT: Kesi veya kalvarinin temizlenmesinde hidrojen peroksit kullanılmışsa, çözeltinin tamamen çıkarılmasını sağlayın veya delmeden önce tam kuruluk sağlayın.
3. AAV kokteyl enjeksiyonu
NOT: Bu bölümde yetişkin C57BL/6 farelerin VTA'sına (23-27 g) AAV enjeksiyonu işlemi açıklanmaktadır. Açıklanan yöntem, standart stereotaktik aparatlar ve uygun koordinatlar kullanılarak herhangi bir beyin bölgesine AAV enjeksiyonu için kullanılabilir. Bu protokolü göstermek için, eYFP ve hChR2, VTA glutamat nöronlarında CaMKIIα promotörü altında AAV5 aracılı transfeksiyon kullanılarak ifade edilmiştir (Şekil 1). Cre-lox rekombinasyonu bu adım için de kullanılabilir.
- Bir enjektöre ultra ince künt nokta iğnesi (32 G; 100 nL doğrulukta 5 μL kapasiteli) ile bir şırınga takın. Şırınga tutucuyu bir mikromanipülatöre sabitle.
NOT: Bu prosedür için 1,6 nL kalibrasyonlu manuel şırınna tutucu kullanılmıştır. Otomatik bir enjektör de kullanılabilir. - Sıvı akışını temizlemek ve test etmek için şırınnayı çift damıtılmış su ile doldurun.
- Buz üzerinde AAV (serotype 5) kokteyli aliquots çözün. AAV'ler iyi ifade için viral titreyi korumak için en iyi şekilde -80 °C'de saklanır.
- Monte edilen şırınnayı 1.000 nL AAV çözeltisi (fosfat tamponlu salin (PBS) 10 mM), pH 7.4 ile doldurun. İğneyi bir enjeksiyon bölgesine indirmeden önce sıvının akışını onaylamak için AAV çözeltisinin 10 nL'sini dağıtın.
- İğneyi stereotaktik olarak istenen derinliğe (DV koordinatı) indirmek için bir mikromanipülatör kullanın. İğneyi istenen derinliğe indirdikten sonra, şırınganın enjeksiyondan önce 10 dakika yerinde kalmasını kesin.
NOT: Bu işlem için iğne, beynin pial yüzeyinden 4,5 mm derinlikte (DV) VTA'ya indirildi. Diğer beyin bölgeleri için uygun dorsoventral koordinatı kullanın (fare beyin atlasına bakın). - VTA'ya 600-800 nL AAV enjekte edin. Enjeksiyon hacmi hedef sitenin boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir.
- AAV çözümünü 60 nL/dk (3 dakika aralık) hızında sunun.
- VTA glutamat nöronlarında ve projeksiyonlarında eYFP ve hChR2'yi ifade etmek için AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP enjekte edin.
NOT: Cre-lox rekombinasyon yöntemi, deneyin amacına bağlı olarak da kullanılabilir. - AAV enjeksiyonundan sonra iğnenin 15 dakika yerinde kalmasını izin verin. Bu, difüzyonu ve geri akışı azaltacaktır.
- Şırınga iğnesini çekin ve yarayı kapatmak için kesiği dikin.
- Ameliyat sonrası bakımın bir parçası olarak antibiyotik ve analjezi uygular. Fareyi sıcak yastıklı bir platforma yerleştirin ve uyanana kadar hayvanı izleyin.
NOT: 3 haftalık enjeksiyondan sonra fare beyin bölümlerinde muhabir proteininin (eYFP) floresan tespiti ile AAV ekspresyolü gözlemlenebilir. Ayrıca, fotostimülasyon deneyleri 3 hafta sonra yapılabilir (Şekil 2).
4. Optogenetik ile in vivo nöral kayıtlar için kurulum
NOT: Bu bölümde, bir beyin devresinin optogenetik izlemesi (CA1'e VTA glutamat nöron projeksiyonu) ile akut nöral kayıt için adımlar açıklanmaktadır. Gerekirse, bu adıma başlamadan önce sistemi (amplifikatör ve bağlantılar) elektrik gürültüsü ve topraklama sorunları için kontrol edin. Bu adımı bir Faraday kafesinde gerçekleştirmek, kayıttaki elektrik gürültüsünü ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir.
- AAV enjeksiyonundan 3 hafta sonra, fareleri intraperitoneal üretan enjeksiyonu (0.2 mg/kg) ile uyuşturun.
DİkKAT: Üretan kanserojendir ve koruyucu giysi giyerken dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Ayrıca, bu konsantrasyonda üretan anestezi uygulamak sağkalım değildir. - Hayvanın başını daha önce açıklandığı gibi stereotaktik bir çerçeveye yapıştırın (adım 2.2, Şekil 3A). Durayı ortaya çıkarmak için kraniyotomi gerçekleştirin (Şekil 3A). Parietal kemiğin bir kısmını çıkarmak için bir delme aleti (bit boyutu: 0,8 mm, hız: 15.000 rpm) kullanın.
- Kraniyotomi yaklaşık 3 mm x 4 mm genişliğinde olmalıdır. Kuruluğu önlemek için bu bölgeye yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) damlaları uygulayın.
- Diseksiyon (dijital) mikroskop altında, maruz kalan durayı çıkarmak için bükülmüş bir iğne ucu (27 G) kullanın. Bu bölgedeki hassas pial kaplamayı ve kortikal dokuları ayırmamaya dikkat edin.
- Zemin vidasını (tava başı Phillips vidası) tutmak için oksipital kemikte bir delik açın (bit boyutu: 0.8 mm, hız: 10.000 rpm); M0,6 x 2,0 mm).
- Paslanmaz çelik zemin tellerini bağlayın.
NOT: Diğer tel türleri de kullanılabilir (Şekil 3b). - Kombine fototimülasyon (VTA) ve nöral kayıt (CA1) için ultra ince (10 μm veya 1 μm) mikromanipülatörlerle donatılmış çok raylı stereotaksik bir aparat kullanın. Optik fiberi ve kayıt sinir probını sırasıyla 10 μm aralık ve 1 μm menzilli mikromanipülatöre monte edin.
- Gerekirse, bir kafa aşaması prob adaptörü kullanın (Şekil 3c).
NOT: Mevcut protokolde, 4 kanallı bir kayıt elektrodu(Şekil 3d)tutmak için 32 kanallı bir kafa aşamasına bir adaptör takılmıştır. Paslanmaz çelik öğütülmüş tel, adaptörün zemin bağlantı noktasına lehimlenmişti.
- Gerekirse, bir kafa aşaması prob adaptörü kullanın (Şekil 3c).
- Ap: -3.08 mm ML: 0.5 mm koordinatlarında, 400 μm çapındaki optik fiberi VTA'ya 200 μm düşür.
- Optik elyafı düşürmeden önce, yükseği fiber bağlantılı bir LED kaynağına bağlı bir fiber optik kabloya (paslanmaz çelik veya seramik yüksük ile) bağlayın.
NOT: Işık yoğunluğunun ve odağın istenildiği gibi ayarlandığından emin olun. LED ışık kaynağının seçimi hedeflenen opsinlere karşılık gelmelidir. Burada, hChR2 fotoaktivasyonu için 470 nm (mavi ışık) LED sürücüsü kullanıldı (Şekil 4a). - Işık darbesini nöral kayıtla senkronize etmek için, LED sürücüsünü ve kayıt denetleyicisi dijital IN bağlantı noktasını transistör-transistör mantığı (TTL) darbesine(Şekil 4b)bağlayın. Bu, bir BNC ayırıcı kullanılarak elde edilebilir.
NOT: TTL darbeli solunum hizmeti kullanımı, istenen darbeli tren frekansını ve süresini dijital olarak ayarlama esnekliği sağlar. Mevcut protokolde, 50 Hz18'de 10ms ışık darbeleri tetiklendi. LED sürücünün TTL kontrolü için sürücüyü "tetikleyici" olarak değiştirin. Bu modda, ışık yoğunluğu "düğme" döndürülerek düzenlenebilir. Stimülasyon frekansı deneysel değişkenlere uyum sağlayacak şekilde ayarlanabilir ve 1 ila 100 Hz arasında değişebilir. Nöral devre izleme için >20 Hz'lik bir stimülasyon frekansı önerilir. - Fotoelektrik eserler üretmeden yanıt oluşturabilecek etkili yoğunluğu belirlemek için düğmeyi ayarlayın. Gerekirse, objeleri ortadan kaldırmak için optik elyafı yeniden konumlandırın19.
NOT: Mevcut protokol için kullanılan LED sürücü ~21,8 mW ışık gücü üretir.
- Optik elyafı düşürmeden önce, yükseği fiber bağlantılı bir LED kaynağına bağlı bir fiber optik kabloya (paslanmaz çelik veya seramik yüksük ile) bağlayın.
5. Sinirsel kayıt
- En az 5 mm uzunluğunda, 15-50 μm kalınlığında bir saplı akut bir sinir probu kullanın.
NOT: Derin beyin yapılarından kayıt, daha uzun saplı sinirsel problar gerektirecektir. Mevcut çalışmada 20 mm sap uzunluğunda bir prob kullanılmıştır. - Ön amplifikatör kafa sahnesini seri çevre birimi arabirimi (SPI) kablosuyla kayıt denetleyicisine bağlayın. Kayıt denetleyicisi bağlantı noktalarında LED'lerin renk aydınlatmasını kontrol edin. Yeşil ve sarı LED'ler bağlı amplifikatör kartında uygun voltajı gösterir. Kırmızı LED, çalışan bir yazılım kafası sahne kontrolünü gösterir (Şekil 5b).
- Bir mikro manipülatör kullanarak, elektrot temas alanlarını CA1'in piramit hücre katmanına yerleştirin (AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 ila 1.2mm).
NOT: Optik fiber ve elektrot, fotostimülasyon ve kayıt için istenen diğer beyin bölgelerine konumlandırılabilir.
6. Amplifikatör ve filtre ayarları
- Kayıt denetleyicisi amplifikatör sistemini USB 3.0 bağlantı noktasından bir bilgisayara bağlayın. SPI kablosunu kullanarak baş sahneyi amplifikatöre bağlayın. Denetleyici yazılımını başlatın. Düzgün bağlanmamışsa, sistem bir "aygıt bulunamadı" iletisi görüntüler.
- Kanallardaki etkinliği görüntülemek için Çalıştır'ı tıklatın. Her dalga formu gerilim (y ekseni) ve zamana (x ekseni) olarak çizilir. İlgi alanına bağlı olarak, dalga biçimi ekranını ayarlamak için voltaj ve zaman ölçeklerini ayarlayın.
- Yalnızca birkaç kanal etkinse, depolama diskinde dosya boyutunu azaltmak için kullanılmayan kanalları devre dışı bırakın.
- Satın alma yazılımındaki bant genişliği parametrelerini düzenleyerek örnekleme hızını ve kesme frekanslarını ayarlayın. Tek birimli kayıt için üst ve alt kesme frekanslarını sırasıyla 300 Hz ve 5.000 Hz olarak ayarlayın. Amplifikatör örnekleme hızını 30 kS/s olarak değiştirin.
NOT: Yüksek örnekleme hızı seçmek daha büyük bir dosya boyutu üretecektir. - Kayıt etmeden önce, empedansı 1.000 Hz olarak ölçerek elektrot kanallarının bütünlüğünü kontrol edin. Bu, işlevi kullanıcı arayüzünde (denetleyici yazılımı) başlatarak yapılabilir. Bir çalışma kanalının empedans değeri 0,1 ila 5 MΩ arasında olmalıdır.
- Analog OUT bağlantı noktasına bir ses çıkışı (hoparlör) bağlıysa, optimum ani ses için kazancı ve susturucusu ayarlayın.
- TTL darbeli tren işaretçisini ani kayıtta görüntülemek için Digital IN işaretçisinin görüntüsünü etkinleştirin. Darbe treni zaman damgasını kaydetmek için, ana denemeden önce Digital IN kanal ekranını etkinleştirin.
NOT: Genellikle birden fazla "Digital IN" kanalı (1 veya 2) vardır. TTL darbeciden gelen BNC kablosunun kayıt denetleyicisi yazılımında görüntülenmek üzere seçilen "DIGITAL IN" bağlantı noktasına bağlı olduğundan emin olun. - Ani dalga biçiminin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, başak kapsamı penceresini açın ve fare tıklatarak eşiği ayarlayın.
- Kök Ortalama Karesini (μV'de RMS) izleyerek gürültü seviyesini inceleyin. Temiz ani kayıt için, sinirsel ani artış eşiğinin en az 5x RMS olması tercih edilir.
- Kurulum tamamlandıktan sonra dosya çıkış biçimini seçin.
NOT: Burada, CA1 sinirsel ani artış .rhd biçiminde kaydedildi. Diğer dosya biçimleri (.rhs ve .dat) analiz yazılımı tarafından izin verilen dosya biçimleriyle eşleşecek şekilde de seçilebilir.
7. In vivo optogenetik kayıt ve ayarlar
- Çeşitli ayarlanabilir darbe parametrelerini görüntüleyen darbe kontrol yazılımını (TTL) açın. Yazılımda uygun COM bağlantı noktasını seçin. Tren ve Grup ayarlarını yaparak darbe parametrelerini ayarlayın.
NOT: Nabız durumu deneysel değişkenler ve tasarım göz önünde bulundurularak belirlenmelidir. - Amplifikatör denetleyicisi yazılımında, hipokampustaki veya istenen beyin bölgesindeki sinirsel ani artışları algılamak için Çalıştır'ı tıklatın. Gerekirse, uygulanabilir ve aktif nöronları tespit etmek için elektrot derinliğini ayarlayın.
- Hücre dışı voltaj aktivitesi tespit edildikten sonra, 15 dakika boyunca taban çizgisi sivri uçlarını gözlemleyin ve hayvanın hayatilerini izleyin. Ayrıca, CA1 veya istenen anatomik hedef bölgedeki duyarlı nöronları tespit etmek için ışık darbesini test edin.
NOT: Fotoelektrik objeleri kontrol edin ve ışık yoğunluğunu veya optik fiber konumunu ayarlayarak ortadan kaldırın. - Işık darbesini istenen frekansta tetiklemeden önce temel aktiviteyi ~10 dakika boyunca kaydedin(Şekil 5a,b). Bu, aydınlatmalı ve aydınlatmasız ateşleme veya patlama oranlarının karşılaştırılmasına izin verecektir.
NOT: Mevcut çalışmada, temel aktivite aydınlatma olmadan 10 dakika boyunca kaydedilmiş, ardından 50 Hz 'de aydınlatma(Film 1).
8. Analiz
- .rhd dosyasını Nex5 çıktı biçimine dönüştürün.
- İşlem dosyası adı. Tek birim raster trenleri ve dalga formlarını algılamak için çevrimdışı bir sıralayıcı yazılımında Nex5 dosyası (Şekil 5a–b).
- Açılan pencereden istediğiniz kanalı seçin.
NOT: Sürekli kaydedilen ani veriler OFSS'nin ayrı bir penceresinde görüntülenebilir. Zaman ölçeği de ayarlanabilir. Bir tetrode kullanılırsa, OFSS 4 kanalı tetrode olarak sıralamak için ayarlanabilir. - Eşik geçişi dalga biçimi ekstraksiyonu için voltaj seviyesini ayarlayın.
DİkKAT: Uygun ani algılama için en az 5x RMS kullanın. - Dalga formlarını algılayın, ardından vadi arama (otomatik) veya K-means (yarı otomatik) yöntemini kullanarak ani sıralama gerçekleştirin. Gerektiğinde, 3D-Principal Bileşen Analizi (PCA) alanının benzer bölgelerini kaplayan birimleri birleştirin.
- Sıralanmış dışarı aktarma . Daha fazla analiz için Nex5 dosyaları (Şekil 5c–d).
NOT: Ara aralık, atış hızı ve patlama hızı için analiz sonuçları diğer analiz platformlarına aktarılabilir.
- Açılan pencereden istediğiniz kanalı seçin.
9. AAV ifadesinin floresan tespiti
- Kayıttan sonra, hayvanı bir izofluran odasında ötenazi.
- 10 mM PBS (~10 mL) ile transkardiyal perfüzyon ve ardından %4 fosfat tamponlu paraformaldehit (PB-PFA, ~10 mL) gerçekleştirin.
- Tüm beyni sağlam bir şekilde çıkarın ve 48 saat boyunca% 4 PB-PFA'da sabitle.
- Sabit beyni 4 °C'de kriyoprezervasyon için %30 sakkaroz içeren %4 PB-PFA'ya aktarın. 72 saat sonra, beyni kriyostatta bölümleyin ve jelatin kaplı bir kaydıraktan dilimler monte edin.
NOT: Mevcut protokolde, DG, CA3 ve CA1'deki AAV etiketli terminalleri göstermek için hipokampüsün (rostral) kapalı kısmını içeren bölümler seçilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anterograd izleme
AAV ekspresyolojisi, enjeksiyondan 21 gün sonra C57BL/6 fare vtasında muhabir proteininin (eYFP) immünofluoresans görüntülemesi ile doğrulanmıştır (Şekil 2). Hipokampustaki presynaptik VTA glutamat projeksiyonlarının başarılı anterograd etiketlemesi de DG, CA3 ve CA1 katmanlarında eYFP tespiti ile doğrulandı(Şekil 6a–d; Film 2 ve 3).
Hipokampusa VTA glutamat projeksiyonları CA1 aktivitesini modüle eder
VTA glutamat nöronlarının fotostimülasyonu putatif piramitAL CA1 nöronlarının aktivitesini artırdı. Bu, ışık KAPAMA aşaması (Film 1) sırasında ışık KAPSA ETABı(Şekil 5a–b)ile karşılaştırıldığında, spiking olaylarında bir artış olarak açıktır. Bu sonucu desteklemek için, CA1 ağ ateşleme oranlarının (light OFF; baseline) ve sonrası (light ON) fototimülasyonun istatistiksel karşılaştırması, stimülasyon sonrası dönem için önemli bir artış olduğunu ortaya koydu(Şekil 7a; p = 0.0002). Patlamaları tespit etmek için raster trenin daha sonraki analizi (<16 ms'de 2-4 ani artış) ayrıca VTA glutamat fotostimülasyonundan sonra CA1 putatif piramidal nöronlar için artan bir patlama oranını göstermektedir(Şekil 7b; p = 0.0025). standart yazılım ile istatistiksel (Öğrenci t-test) analizi yapıldı. Burada, taban çizgisi (ışık KAPAĞI) ateşleme veya patlama hızı ışık AÇIK (fotostimülasyon) değerleriyle karşılaştırıldı.
Şekil 1: C57BL/6 farenin VTA'sına AAV-CaMKII-ChR2-eYFP enjeksiyonunun şematik illüstrasyonu.
VTA nöronlarının anterograd etiketlemesi ve hipokampusa aksonal projeksiyonlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: VTA'da AAV-CaMKII-ChR2-eYFP ifadesini ve optik fiber parçayı gösteren floresan görüntüler.
Dk: Darkschewitsch çekirdeği, scp: üstün serebellar peduncle, VTA: ventral tegmental alan ve RM: retromamillary çekirdeği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kraniyotomi, elektrot yerleşimi ve optik lif yerleşiminin gösterimi.
(A) Kafatasını açığa çıkaran orta çizgi kesi (b: bregma, oc: oksipital kemik). (B) Zemin vidasının (gs) oksipital kemiğe ve bağlı paslanmaz çelik zemin teline (gw) yerleştirilmesi. (C) Optik fiber kanolün stereotaktik konumlandırması (foc: fiberoptik kablo). (D) Optik fiber canül ve nöral prob sapının stereotaktik konumlandırılması (foc: fiberoptik kablo, adp: adaptör, ms: çiftleşme manşonu, prs: prob sapı, hs: baş sahne). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Birleşik ışık titreşimi ve amplifikatör (tetikleyici) zaman damgaları için BNC bölünmüş bağlantı.
(A) Optik fiber bir canül ucundan LED ışık emisyonunun gösterimi. (B) LED ve zaman damgası amplifikatörü (ampl) kaydını kontrol etmek için BNC bölünmüş adaptör aracılığıyla TTL darbesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tek birim algılamalı sürekli kaydedilen başak treni (ham veri).
(A) Uyuşturulmuş bir farenin hipokampusundan ham kayıt ekran görüntüsü. (B) Ham kayıtta VTA'nın TTL odaklı fotoğraf aydınlatması. Açık mavi çizgiler, Açık ON (φ = 470nm) dönemleri için zaman damgalarını ve stimülasyon sıklığını gösterir. (C–D) Spike sıralama ile türetilen sürekli kaydedilen başak treni ve nöron üniteleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hipokampusta AAV-CaMKII-ChR2-eYFP ifadesini gösteren temsili floresan görüntüler.
(A) DG (GCL: granül hücre tabakası, hil: hilus). (B) CA3'ün DG'ye yakın bir kısmı (SL: stratum lacunosum, pyr: piramidal hücre tabakası). (C) CA3 uygun. (D) CA1 (yani: stratum oriens, pyr: piramidal hücre tabakası, rad: stratum radiculata). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Fototimülasyon öncesi ve sonrası ateşleme oranının istatistiksel karşılaştırması.
(A) Fotoğraf aydınlatmasından sonra CA1'deki (*p = 0.0002) putatif piramidal nöron üniteleri için ortalama atış hızının (Hz) arttığını gösteren çubuk grafik. (B) Fotoğraf aydınlatması sonrası putatif CA1 nöronları için artan patlama hızını gösteren çubuk grafik (**p = 0.0025). Hata çubuğu: standart ortalama hatası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Amplifikatör denetleyicisi ve darbe yazılımının screengrab kaydı. Film, temel kaydı (light OFF) ve ardından mavi zaman damgalarıyla gösterilen fotostimülasyonu (light ON, φ = 470 nm) gösterir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 2 ve Film 3: Bir farenin DG'sinde VTA glutamat terminallerinin 3D illüstrasyonu. DAPI-mavi: granül hücre tabakasında (GCL) nükleer etiket; eYFP-Green: DG hilus'taki AAV etiketli-VTA terminalleri. Bu videoları indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son on yılda, AAV yapılarının tasarımı önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu nedenle, daha fazla nörona özgü promotörler, gelişmiş transfeksiyon özgüllüğü için bir dizi AAV serotipine dahil edilmiştir14. Floresan proteinler, taşıyıcılar, reseptörler ve iyon kanalları için genleri birleştirerek, AAV kütüphaneleri artık görüntüleme, nöromodülasyon ve sinaptik aktivite tespiti için mevcuttur. Ticari olarak mevcut AAV yapılarında, genetik olarak kodlanmış bir florofor ve iyon kanallarının (opsin) bir kombinasyonu, nöral devrelerin14 , 18,19'unbirleştirilmiş nöroanatomik ve elektrofizyolojik izlenmesini sağlar. Aynı şekilde, bir promotörün (veya cre-lox rekombinasyon yönteminin) seçilmesi, bir devre içinde nöron tipine özgü projeksiyonların izlenmesine izin verebilir. Mevcut çalışmada, bu protokol hipokampusa (CA1 bölgesi) VTA glutamat nöral projeksiyonlarının anatomik ve elektrofizyolojik değerlendirmesi için konuşlandırılmıştır.
VTA-Hipokampus sinir devresi
VTA, orta beyin mezocortikolimbic yolunun bir parçasıdır. Ödül ve nefret öğreniminde yer alan beyin alanlarına VTA projeksiyonları kapsamlı bir şekilde gösterilmiştir20,21,22,23,24,25. VTA dopamin, glutamat ve GABA nöronları içerirken, dopamin nöron popülasyonu anatomik olarak baskındır. VTA'nın nefret ve ödül öğreniminde önemli bir işlevi, çekirdek akumbens ve dorsal raphe çekirdeği 22 ,24 , 25 , 26,27,28'esağlam bir VTA dopamin projeksiyonuna atfedilir. VTA dopamin ve glutamat nöronları hipokampusa projelendirse de, anatomik olarak baskın VTA glutamat terminallerinin işlevi hipokampus29,30'dakiVTA dopamin terminallerine kıyasla daha az incelenmiştir.
Mevcut protokol, hipokampustaki CaMKIIα ifade eden VTA (glutamat) terminallerinin haritalandırılması için florofor (eYFP) ve ışık kontrollü opsin (hChR2) barındıran bir AAV5 yapısı kullanımını açıklar. Önceki çalışmalar, VTA glutamat terminallerinin VTA dopamin terminalleri ile karşılaştırıldığında hipokampusta anatomik olarak baskın olduğunu ortaya çıkarmıştır29. Hipokampustaki VTA glutamat presynaptik terminallerini göstermek için AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP VTA nöronal hücre cisimlerine transkrome edildi. Bu, hücre gövdeleri VTA glutamat nöronlarını (VTA içinde) etiketledi ve hipokampus katmanları içindeki VTA glutamat terminallerini özetledi.
VTA glutamat presynaptik terminalleri DG, CA3 ve CA1'i içselleştirse de, sonuçlar bu üç bölge için katmana bağlı varyasyonlar gösterir(Şekil 6a-d). DG'de, AAV etiketli VTA glutamat terminalleri, granül hücre tabakası ile karşılaştırıldığında anatomik olarak hilusta baskındır. CA3'te, VTA glutamat terminalleri, piramidal hücre tabakası ve stratum oriens ile karşılaştırıldığında stratum lacunosum'da nispeten boldur. CA1'de VTA glutamat terminalleri, piramit hücre tabakası ile karşılaştırıldığında dendritik katmanları (stratum oriens ve radiatum) önemli ölçüde içselleştirir. Bu çalışmanın sonucu ayrıca VTA glutamat nöronal hücre gövdelerinin fototimülasyonunun CA1 sinir ağının in vivo aktivitesini modüle ettiğini göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, fotostimülasyon döneminde CA1 ateşleme hızında ve patlama hızında önemli bir artışa yol açmıştır(Şekil 7a–b). Bu, VTA glutamat terminallerinin hipokampal bilgi kodlaması üzerinde etki yaratabileceği CA1'in dendritik katmanlarındaki anatomik dağılımını kabul eder (Şekil 6d). Bu gözlemi desteklemek için, diğer çalışmalar VTA'nın hipokampal çalışma belleği kodlamasının birincil belirleyicisi olduğunu ve VTA-hipokampus döngüsü 22 , 23,24 , 25 , 26,27,28,29,31,32aracılığıyla uzun süreli bellekte saklanacak bilgilerin seçimini düzenlediğinigöstermiştir. 33,34.
Teknik hususlar
Bu protokolü başarıyla uygulamak için AAV yapılarının seçimi hedeflenecek nöron tipine göre belirlenmelidir. Araştırmacı, hedeflenecek nöron tipine özgü uygun bir promotör (gen ürünü) tanımlamalıdır. Mevcut çalışmada, CaMKIIα'da nöronları ifade eden eYFP ve hChR2 ekspresyonlarını yönlendirmek için bir CaMKIIα promotörü kullanılmıştır. Bununla birlikte, bir cre-lox rekombinasyon yöntemi de kullanılabilir. Bu durumda, camkiiα-Cre farelerinin VTA'sında çift floxed AAV5 ifade edilebilir. Promotör ve cre-lox tabanlı ekspresyon yöntemleri diğer nörontipleri 35 , 36,37için de geçerlidir.
Sistem elektrik gürültüsü açısından kontrol edilmelidir. Bu, bir deneme kaydı oturumu sırasında RMS'yi başak kapsamında değerlendirerek yapılabilir. Gerekirse, amplifikatör zemini kafese bağlıyken, sistem ve stereotaktik aparat bir Faraday kafesine yerleştirilecektir. Elektrot temas bölgeleri doğrusal olarak veya bir tetrode düzenlenebilir. Prob tasarımının seçimi, deneyin amacına göre belirlenmelidir. Doğrusal bir dizi, birden çok katmanda nöronları algılar. Çeşitli aralıklara (mikronlarda) özelliklerine sahip problar da ticari olarak mevcuttur. Prob temas bölgeleri arasındaki sap uzunluğu ve mesafesi kayıt prosedürü sırasında ve analiz için göz önünde bulundurulmalıdır. Kurulum tamamlandığında, fotoelektrik yapıtları ortadan kaldırmak için bir deneme kaydı sırasında ışık darbesinin kontrol edilmesi gerekir. Bu, elektrodun konumunu optik fiber derinliğine ve konumuna göre ayarlayarak da optimize edilebilir.
Sınırlama
CaMKIIα öncelikle glutamat salgılayan nöronlarla ifade edilse de, protein glutamat salgılayan bazı dopamin nöron popülasyonlarında da bulunur. Bu nedenle, AAV5-CaMKIIα kullanmak çoğunlukla glutamat nöronlarını ve CaMKIIα'yı ifade eden bazı dopamin nöronlarını etiketleyecektir. LED tahrikli fotostimülasyon protokolleri uygun fiyatlıdır ve kolayca monte edilebilir. Bununla birlikte, lazer tahrikli bir fotostimülasyon protokolün daha etkili olduğunu not etmek önemlidir38,39,40. Farklı hayvanlar için aynı beyin bölgesine enjekte edilen AAV çözeltisi değişen ifade eşikleri verir. Bununla birlikte, enjeksiyondan sonra 3 hafta veya daha fazla beklemek, optimum transfeksiyona izin vererek bu varyasyonu azaltabilir. Bir beyin bölgesine enjekte edilen AAV çözeltisi de çevredeki beyin bölgelerine yayılabilir. İğne indirildikten sonra bekleme süresinin gözlemlenmesi ve bolus enjeksiyonları arasında AAV çözeltisinin enjeksiyon bölgesinden difüzyonunu azaltabilir.
Özetle, bu yöntem kemirgenlerin beyinlerindeki sinir devrelerini izlemek için kullanılabilir. Mevcut protokol uyuşturulmuş farelerde in vivo nöral devre izlemeyi açıklasa da, prosedür uyanık davranan farelerde kronik kayıt için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, OOM'ye verilen CBS Bridging Grant tarafından finanse edilir. OOM, PAA ve AS çalışmayı tasarladı ve deneyleri gerçekleştirdi. AS ve PAA sonuçları analiz etti. Makaleyi OOM ve PAA hazırladı. Dr. Karl Disseroth'a (Stanford Üniversitesi) AAV'ı kullanımımıza sunduklarından dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
