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Neuroscience

形態学およびプロテオーム解析のための胚性子宮頸部神経節からのラット交感神経の培養

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61283

Summary

本論文では、上方の頸神経節からの胚性ラット交感神経の単離と培養について述べている。また、免疫細胞化学染色や質量分析のためのニューロン抽出物の準備のための詳細なプロトコルも提供します。

Abstract

胚性ラットの優れた子宮頸神経節(SCG)の交感神経ニューロンは、軸索成長、軸索密化、シナプトジェネシス、樹状増進、樹状可塑性および共培養系における神経標的相互作用を研究するための末梢ニューロンのインビトロモデルシステムとして使用されてきた。このプロトコルは、E21ラット胚の優れた子宮頸神経節からのニューロンの分離および解離、続いて無血清培地における純粋な神経細胞培養の調製および維持について説明する。ニューロンはコーティングされていないプラスチックに付着しないため、ニューロンは12mmのガラスカバーリップまたはポリD-リジンでコーティングされた6ウェルプレートのいずれかで培養されます。抗ミトキ薬(Ara-C、シトシンβ-D-アラビノフラノシド)による治療後、このプロトコルは、5%未満の非神経細胞を有する健康な神経培養を生成し、1ヶ月以上インビトロで維持することができる。胚性ラットSCGニューロンは生体内で5〜8デンドライトを有する多極であるが、;無血清条件下では、これらのニューロンは培養中の単一の軸索のみを拡張し、培養期間中はユニポーラであり続ける。しかし、これらのニューロンは、膜内抽出物、骨形態形成タンパク質(BMP)、または10%の胎児子牛血清の存在下でデンドライトを拡張するように誘導することができる。これらの均質な神経培養は、免疫細胞化学的染色および生化学的研究に使用することができる。また、これらのニューロンにおける微小管関連タンパク質-2(MAP-2)の免疫細胞化学的染色および質量分析用のニューロン抽出物の調製に対する最適化されたプロトコルについても説明する。

Introduction

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胚性優子宮頸神経膠小(SCG)由来,の交感神経細胞は、成長因子依存、神経標的相互作用、神経伝達物質シグナル伝達、軸索成長、樹状突起の発達および可塑性、神経標的/神経グリアと神経グリア相互作用の基礎となるシナプス形成およびシグナル伝達機構,2,3,4,5,6,7含む、神経発達の多くの側面を研究するための主要な神経細胞培養システムとして広く用いられている。,8その小さなサイズ(約10000ニューロン/神経節)にもかかわらず、この培養系の開発と広範な使用の3つの主な理由は、交感神経鎖の最初の神経節であり、交感神経節10の残りの部分よりも大きく、したがって分離しやすいです。ii)中央ニューロンとは異なり、SCGのニューロンはかなり均質で、すべてのニューロンは神経堤に由来し、同様の大きさを有し、神経成長因子に依存し、またアドレナリン症である。これにより、形態学的およびゲノム学的研究のための貴重なモデル,となる10、11,11およびiii)これらのニューロンは、10、12ヶ月以上の神経成長因子を含む定義された無血清培地で維持することができる。12周産期SCGニューロンは、樹状突起2の開始および維持の根底にあるメカニズムを研究するために広く使用されてきた。これは主に、SCGニューロンは生体内に広範な樹状樹状樹状の樹状樹状のアーバーを有するが、血清の不在時にインビトロで樹状突起を拡張しないが、骨形態形成タンパク質2、12、1312,のような2特定の成長因子の存在下で樹状突起を成長させることが誘導され得るからである。13

本論文では、胚性ラットSCGニューロンを単離・培養するためのプロトコルについて述べる。過去50年間、SCGの主要な神経細胞培養は、主に大規模なゲノムまたはプロテオミクスの変化を調べる研究の限られた数で形態学的研究に使用されてきました。これは主に組織サイズが小さく、少量のDNAまたはタンパク質の単離が原因であり、これらのニューロンにゲノムおよびプロテオミクス分析を行うことが困難です。しかしながら、近年、検出感度の上昇により、樹状成長発達14、15、16、17,15の間にSCGニューロンにおけるゲノム、miRNomeおよび16プロテオームを調べる方法の開発可能になっている。また、免疫細胞化学を用いたこれらのニューロンの形態学的解析方法と、質量分析のためのニューロンタンパク質抽出物を得るためのプロトコルについても述べる。

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Protocol

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動物を含む研究で行われたすべての手順は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。セントメアリーズカレッジの動物ケアと使用ガイドラインは、国立衛生研究所(https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdfおよびhttps://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf)の動物福祉研究所が提供するガイドラインに基づいて開発されました。

1. 培養培地の作成(制御媒体ともいいます)

  1. 以下の成分を、以下に記載されている順序で、無菌500 mLフラスコに加える:1x低グルコースDMEMの190 mL、DMEMの20mg/mL脂肪酸フリーウシ血清アルブミン(FAF-BSA)の10 mL、 2.8 mL L-グルタミン、100xインスリンセレントランスフェリン混合物の4 mL、125 μg/mL神経成長因子の0.4 mL(DMEMでは0.2%不活性タンパク質安定剤)、および200 mLハムのF-12培地。
  2. ピペットへのタンパク質の付着を防ぐために、インスリン-セレントランスフェリンやNGFなどのタンパク質含有溶液を添加する前に、FAF-BSAを含む培地でピペットをコーティングしてください。
  3. フラスコを旋回し、添加するたびに材料を混ぜます。F-12を加えた後、25 mLピペットと十分に混ぜます。
  4. アリコートは10mLアリコートで培養培地を、-80°Cで保存する。 アリコートは活動を失うことなく6ヶ月間保存することができる。

2. ニューロンを培養するためのプレートの調製

  1. ポリD-リジン(0.5 Mトリスバッファー、pH 8で作られた)の1mg /mLストックを滅菌蒸留水で100μg/mLに希釈します。
  2. プロテオームまたはゲノム解析では、解剖の1〜2日前に、ポリD-リジン(PDL)の無菌100 g/mL(PDL)の約2 mLで6ウェルプレートをコーティングします。これは、ウェルへの細胞接着を確保するために必要です.プレートをしがみつくフィルムで包み、4°Cで一晩保管してください。
  3. 形態解析および顕微鏡検査のために、12 mm2 前処理されたドイツのガラスカバーリップ(これは、以前に説明した18 または購入した硝酸処理を使用して洗浄することができる)を24ウェルプレートの各ウェルに配置します。
    1. ポリD-リジン(PDL)の無菌100 g/mLの0.3 mLでカバーリップをコーティングします。プレートを4°Cで一晩保管してください。
  4. 解剖の日には、解剖が始まる前に、ポリD-リジン溶液を井戸から取り出し、滅菌蒸留水で井戸を5回リンスし、続いて低グルコースDMEMで1回ずつすすがします。
  5. 神経節の酵素消化中(細胞をめっきする約1時間前)、DMEMをプレートから吸引し、0.3mLの制御培地に交換します。プレートを加湿室に5%CO2 以下で35.5°Cで保管してください。

3. 解剖の設定

  1. 解剖用200mLのメディアの調製(解剖メディアと呼ばれる)
    1. 低グルコースDMEM(1mg/mLグルコースを含む)に20mg/mL脂肪酸フリーウシ血清アルブミン(FAF-BSA)の8 mLと100xペニシリンストレプトマイシンの2 mLを無菌ライボヴィッツのL-15培地(または任意のエアバッファリング培地)の193 mLに加える
  2. フードには、解剖のために次のアイテムを設定します:各チューブに約20 mLの解剖媒体を備えた4つの50 mL滅菌円錐管、解剖媒体の1.5 mLを備えた4つの無菌35mm皿、1つの無菌50 mL円錐管、20mLの解剖培地を用いた1つの、解約細胞を集めた1つの無菌10mLチューブを含む。
  3. 乾燥ビーズの滅菌器を使用して、1対の細かい鉗子(4または5鉗子)を少なくとも1分間殺菌してください。

4. 胚性ラットの子犬からの上頸神経節の分離

  1. 妊娠ラットからのE21胚の除去
    注:周囲の領域が完全に殺菌されている場合、子宮ホーンの除去はフードの外側で行うことができます。
    1. CO2吸入を使用して妊娠中2のラットを安楽死させる。腹部の領域から毛皮を剪断し、それを殺菌するために70%アルコールで領域内の皮膚を拭きます。
    2. 無菌ハサミと鉗子の新鮮なセットを使用して、皮膚を切断し、次に筋肉層を切断し、胚を含む子宮の角を露出させる。新しいハサミと鉗子を使用して胚で子宮の角を取り除き、その過程で腸に損傷を与えないように注意してください。
    3. 胚を含む子宮ホーンを150mm2 の滅菌ペトリ皿に移し、フードに移します。
    4. 鉗子とはさみの新しいセットを使用して、子宮の角から胚を取り除き、羊膜と胎盤から胚を分離する。
    5. 胚を安楽死させるために、右腕の下の正中線に沿って胚の脊髄を切断する。これはまた、SCGの除去中に頸動脈からの出血を減少させる。
    6. これらの胚を解剖培地を含む調製された50 mL円錐管に移す。胚がメディアに沈んでいるか確認してください。各チューブは、最大3個の胚を保持できます。
  2. 胚からの上頸神経節の分離
    1. 解剖培地から1匹の子犬を無菌150mm2 ペトリ皿に半分充填した固体基板(パラフィンワックスまたはシリコーンポリマーのいずれか)に移し、その後ろ面を基板に移します。3本の無菌23G針を使用して、各腕の下に1本の針を持ち、口を通して3本目の針で子犬を皿に固定し、首を慎重に伸ばします。
    2. 下の唾液腺を露出させるために無菌の細かい鉗子(第4または第5鉗子)を使用して首の領域の皮膚を切り裂く。細かい鉗子を使用してこれらの腺を取り除きます。
    3. 鎖骨と気管の近くに胸骨筋とオモヨイドの筋肉をそれぞれ見つけます。まず、横断性胸骨結節筋を切断し、細いオモヨイド筋肉を細い鉗子を使用して慎重に切断する。これらの筋肉が取り除かれると、前側端部の頸動脈の分岐が気管の両側に見え、SCGは頸動脈のこのフォークの下に位置する。
    4. 閉じた鉗子を使用して、頸動脈を静かに持ち上げてSCGを視覚化する。SCGの両側に1つの鉗子を使用して、頸動脈を引き出し、準備された無菌35 mm2 皿に移す。この組織は、頸動脈を有するSCG、無用量神経節を有する迷走神経ならびに領域内の筋肉または脂肪の他のセグメントを含む可能性が最も高い。
    5. 反対側で解剖プロセスを繰り返します。以下に概説する残りの解剖ステップを続行する前に、すべての胚からSCGを取り除きます。35 mm2 の皿の 2 つの間の分離されたティッシュを分配してティッシュサンプルの処理を容易にする。
  3. SCGの後処理
    1. SCGを解剖組織から分離するには、まず細かい鉗子を使用して、脂肪や筋肉などの余分な組織を取り除き、頸動脈分岐の近くの領域を避けるように注意する。
    2. これらの組織が取り除かれると、2つの神経節が見える。無用量神経節は小さく円形で、SCGはアーモンド型です。迷走神経を優しく引っ張って迷走神経と無用量神経節を頸動脈から分離し、頸動脈からSCGを分離する。
    3. SCGを取り囲むカプセルを取り除くために細かい鉗子を使用してください。SCGを新しい35mm培養皿に移します。解剖された組織サンプルをすべて使用して、このプロセスを繰り返します。
    4. ティッシュがピペットの壁に付着するのを防ぐために、滅菌された綿のプラグガラスピペットに解剖媒体を塗ります。ピペットを使用して、脱剖培地をコラゲターゼII型II型(1mg/mL)/ジスパーゼII型II型(5mg/mL)のカルシウムおよびマグネシウムフリーHBSSの無菌2mLに置き換え、37°Cで50分間インキュベートして組織を分解します。
      注:インキュベーション時間はコラゲラーゼ/ディスパーゼの異なるバッチで最適化する必要があり、通常40分から1時間の範囲です。
    5. インキュベーション中に、DMEMをプレートから吸引し、0.3 mLの制御媒体に交換してください。プレートを加湿室に5%CO2 以下で35.5°Cで保管してください。
    6. インキュベーションの後、コラゲターゼ/ディスパーゼのSCGを無菌15 mL円錐形チューブに移します。解剖培地を使用してプレートをすすい、チューブに溶液を移します。ボリュームを約 10 mL まで上げるのに十分な解剖メディアを追加します。
    7. 200 x g (1000 ~ 1200 rpm) で 5 分間の遠心分離機を室温で試料をペレット化する。上清を吸引し、ペレットを外さないよう注意する。ペレットを10mLの解剖培地で再懸濁します。遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。
    8. 1-2 mLの培養培地に交換する。狭孔、ベント先端の無菌パスツールピペット(培養培地で前コーティング)を使用して、5〜6回穏やかに三度引きすることによって塊を機械的に解化する。大きな塊を約1分間落ち着かせてください。上清細胞懸濁液を新しい10 mLチューブに移します。
    9. SCGのほぼ完全な解離を確実にするために毎回トリアーレーションの力を増やすと、このプロセスをさらに3回繰り返します。
    10. ボリュームを 8 ~ 10 mL にする十分な培養メディアを追加します。細胞懸濁液を穏やかに混合し、ヘモサイトメーターで細胞密度を定量化します。
    11. 実験に適した細胞密度で細胞懸濁液をウェルに分配する。めっきプロセス中に細胞懸濁液を継続的に混合し、ウェルへの細胞の均等な分布を確保します。
      注:形態学的分析のために、24のウェルプレートに約8,000個の細胞/ウェルの細胞をプレートし、ゲノムおよびプロテオミクスプロトコルのために、30,000個の細胞/ウェルの高い細胞をプレートします。
    12. プレートを下部に滅菌水を入ったガラスデシケーターに移し、加湿チャンバーを作ります。十分なCO2( 約120mL)を注入して、密閉前にデシケータで5%のCO2 環境を得ます。プレートを35.5°Cに保ちます。 これは、プロトコルでは Day 0 と呼ばれます。
      注:これらのプレートは、通常の5%CO2インキュベーターで維持することもできます。上記の方法は、温度とpHの変化を最小限に抑え、また、クロス汚染を防ぐのに役立ちます。

5. 培養されたSCGニューロンおよび治療の維持

  1. 1日目(めっき後24時間)に、培養培地の半分を慎重に取り出し、2μM Ara-C(シトシンβ-D-アラビノフラノシド、抗ミトティック剤)に交換します。48時間細胞に治療を残します。通常、この治療期間は、培養中の非神経細胞を排除するのに十分である。
  2. 3日目に、培地の半分を軽く吸い込み、制御媒体に交換します。
  3. 4日目、細胞は実験的治療の準備ができています。適切な培地で1日おきに培養を供給し、ウェル内の培地の半分を新鮮な培地にそっと置き換える。
  4. 無血清培地中の培養SCGニューロンは軸索のみを伸ばす。実験が樹状突起の存在を必要とする場合は、10%の胎児の子牛血清、75-100 μg/mLの基体膜マトリックス抽出物または骨形態形成タンパク質-7の50 ng/mLを用いて細胞を治療する。樹状の成長は、治療の1週間以内に観察された精巧な樹状樹状樹状の樹状樹状の樹状の樹状の樹状の樹状の樹状の樹状の治療の48時間以内に観察される。

6. 免疫染色培養SCGニューロン

  1. 徐々に0.1 Mリン酸緩衝液で4%パラホルムアルデヒド、ヒュームフードでpH 7.2でウェル中の細胞培養培地を交換します。
    1. ウェル内の培養培地の半分を取り除き、4%パラホルムアルデヒドにそっと交換します。次に、この処理を少なくとも2回以上繰り返し、毎回ウェル内の培地の3分の2を取り除き、4%パラホルムアルデヒドに置き換えます。このプロセスの最後に、井戸のメディアの色はピンクから無色に変わったはずです。
    2. すべての培地を4%パラホルムアルデヒドに置き換えたら、室温で15〜20分間ウェルをインキュベートします。
  2. 上記と同様の方法で、4%パラホルムアルデヒド溶液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2に徐々に置き換える。5分間放置します。井戸をさらに2回、PBSで5分間リンスします。
    1. 4%パラホルムアルデヒドを取り除いたら、プレートをベンチトップに移動してさらに処理します。このステップは、プレートを一晩4°Cで保存できる良好な停止点です。
  3. すべての PBS を削除します。細胞を覆うのに十分な量の0.1%トリトンX-100をPBSに加える。5分間培養液に残して、ニューロンを透過させます。このステップのタイミングは、細胞の完全性を維持しながら良好な染色を確保するために重要です。
  4. トリトンX-100溶液を慎重に取り出し、PBSで毎回5分間ウェルを3回リンスします。PBS 溶液を削除します。
  5. 細胞を覆うのに十分な5%のBSAをPBSに加え、室温で20分間インキュベートして非特異的抗体結合を低減します。
  6. ブロッキング溶液を取り出し、PBSで5%BSAで希釈したMAP-2タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体と交換してください。一次抗体を4°Cで一晩細胞に残します。
  7. 再使用のために一次抗体を除去して保存します。一次抗体は、検出強度を失うことなく少なくとも2回再使用することができる。
  8. 細胞を覆うのに十分なPBSで3回リンスします。PBSを細胞に10分間放置します。
  9. PBS溶液を取り出し、PBS中の5%BSAで1:1000希釈時に、蛍光タグ共役ヤギ抗マウスIgG二次抗体と交換してください。室温で暗闇の中で2時間インキュベートする。
  10. 二次抗体を取り出し、PBSに交換します。1回10分間PBSで3回ウェルをすすいすります。水で井戸を一度すすいで塩を取り除きます。
  11. 蛍光標識サンプルに適した水性マウントタントの滴を含むガラススライドにカバースリップを取り付けます。スライドをイメージの準備ができるまで、スライドフォルダ内の4°Cに保存します。

7. 液体クロマトグラフィーと質量分析法を用いたプロテオームの分析用サンプル調製

  1. 培養ニューロンのリシス
    1. 井戸の中の培養培地をすべてそっと取り除きます。冷たい、無菌カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4と交換してください。すぐに取り出し、PBSに置き換え、5分間座らせます。このステップは、培養培地中に存在するタンパク質を除去するために行われる。
    2. 特定の治療のためにすべての井戸から慎重にすべてのPBSを取り除きます。このプロセスをもう一度繰り返します。細胞をライシングする際に氷の上にプレートを維持し、神経の損傷やタンパク質分解を最小限に抑えます。
    3. 100 ~ 150 μLの 50 mM重炭酸アンモニウム、pH 7.5 (NH4HCO3)を、滅菌セルスクレーパーを使用してウェルとスクレープセルの 1 つに加えます。マイクロピペットを使用して、液体を移し、特定の処理のためにすべてのウェルで掻き取りプロセスを繰り返します。掻き取った後、顕微鏡下の井戸を調べて、ほとんどの細胞が除去されていることを確認します。
      1. ニューロンの数が少ない場合は、限られた体積を使用して細胞を分解し、プロテオミクス分析に十分な濃度を確保します。
    4. 細胞溶解を助けるために一晩-80 °Cで溶液を凍結します。ライセートは、さらなる処理の準備ができるまで、この段階で保存することができます。
    5. 解凍したら、26 G または 28 G の針でサンプルを噴出し、細胞を機械的に融解します。
    6. 10分間2回超音波水浴でサンプルを超音波処理します。水浴に氷を加えて、タンパク質の過熱や変性を防ぎます。遠心分離機は12,000 x gで4°Cで5分間。
    7. タンパク質濃度を測定します。典型的なタンパク質濃度は0.4~1μg/μLの範囲
  2. プロテオーム分析用サンプル調製とトリプシン消化
    1. 最大60 μLのライセートまたは50 μgのタンパク質をDNase、RNase-およびプロテアーゼフリーの1.5 mLチューブに移します。ライセートの体積が60μL未満の場合は、ボリュームを構成するのに十分な50 mM重炭酸アンモニウムを加えます。
    2. 0.2%の酸不安定界面活性剤と渦の25 μLを加えます。80°Cのブロックヒーターでチューブを15分間インキュベートします。30 sの12,000 x g でチューブを遠心分離します。
    3. 100 mM のジチオトレイトールと渦を 2.5 μL 加えます。これにより、タンパク質はアルキル化と消化のためによりアクセスしやすくなります。ブロックヒーターで60°Cで30分間インキュベートします。室温と遠心分離機に冷却します。
    4. サンプルと渦に300 mMのヨウドアセトアセトアミドを2.5 μL加えます。このステップは、システインをアルキル化するのに役立ち、二硫化物結合の改革を防ぎます。暗闇の中で室温で30分間チューブをインキュベートします。
    5. 質量分析グレードのトリプシン(0.5 μg/μL)をトリプシンでチューブに加えます:タンパク質比1:10。一晩37°Cでサンプルを消化します。
    6. 5%トリフルオロ酢酸(TFA)と渦を10μL加えます。37°Cで90分間インキュベートします。この工程は、質量分析中の干渉を防止するために、酸不安定界面活性剤を加水分解する必要がある。
    7. サンプルを4°Cで30分間遠心分離し、g上澄みをクロマトグラフィー認定クリアガラスバイアルに移し、プリスリットテフロン/シリコーン中隔キャップを使用します。サンプルは、質量分析分析の前に-20 °Cで保存することができます。
    8. サンプルバイアルを液体クロマトグラフィーに供し、高精細質量分析法と結合する。

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Representative Results

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胚性SCGニューロンの神経培養の分離と維持
ラット胚SCGからの解離細胞は、ポリD-リジン被覆板またはカバースリップでめっきし、b神経成長因子を含む血清遊離培養培地中に維持した。ニューロンとグリア細胞の混合物を含む解解化細胞は、めっき時に円形に見える(図1A)。めっきの24時間以内に、ニューロンは位相コントラスト顕微鏡の下で位相暗くグリア細胞を平坦化して現れる小軸索プロセスを拡張する(図1B)。Ara-Cによる治療の後、99%のグリア細胞が排除され、培養物には楕円形の細胞体、広範な軸索成長および樹状突起のない主に神経細胞が含まれている(図1C)。

培養胚ラット優子宮頸神経細胞の免疫細胞化学的染色
これまでの研究では、無血清培地で増殖した培養交感神経は軸索のみを拡張し、基基膜抽出物の存在下で精巧な樹状樹状樹状樹状の樹状樹状の樹状樹状を伸ばすだけであることが示されている、 10%血清または250 ng/mL骨形態形成タンパク質-7(BMP-7)2,12。,12これらの観察に同意して、位相コントラスト顕微鏡は、BMP-7(50 ng/mL)の存在下で5日間成長したニューロンが、無血清制御培地で増殖したニューロンと比較して、複数の厚い先細りプロセスを有する扁平な細胞体を有することを示している(図2)。デンドライトとしてのこれらのプロセスの同一性は、MAP-2の存在によって確認され、細胞体および樹状突起19,20,20に主に見られる細胞骨格タンパク質である。制御条件下では、MAP-2の蛍光染色は、細胞質および近位軸索内で観察され、核から除外される(核染色と共標識して核を可視化する(図3A-3D)。5日間50ng/mLでBMP-7で治療した後、MAP-2の免疫反応性は細胞質だけでなく樹状突起においても観察される(図3E-3H)。

制御培地で増殖した培養SCGニューロンのサンプルプロテオミクス解析
E21ラット交感神経は、6日間の制御培地で培養し、LC-MS分析を行った。サンプルを質量分析計上で3回の複製で実行し、各サンプルについて観察された断片化ペプチドの数に基づいてタンパク質を同定した。タンパク質の存在量(0~300000単位以上)と各タンパク質に対して観察された断片化ペプチドの数(5~500の範囲)に基づくタンパク質IDの信頼度スコアを算出した。無血清制御培地で培養されたSCGニューロンから30μgタンパク質のタンパク質の質量分析から得られたサンプルデータセットを 図4に示す。

1287タンパク質に対応するサンプルで検出された13,134個のペプチドがありました。このうち1100件は、500を超える正規化された豊富な値を持つ3つの技術的複製すべてに存在していた。これらの1100個のタンパク質のうち、90個のタンパク質が単一のペプチドヒットの存在によって同定され、これはタンパク質のごく一部のみをカバーした。したがって、同定が正しく、これらのタンパク質が低いタンパク質信頼度スコア(スコア<10)であるかどうかを判断することは困難でした。これらのタンパク質を分析から排除し、残りの1010タンパク質をさらに解析して、異なる局在および機能を有するタンパク質の検出にプロトコルが成功したかどうかを判断した。

このデータセットの遺伝子オントロジー分析は、パンサー分類データベース(http://www.pantherdb.org/)を用いて、このデータセットに細胞局在または分子および生物学的機能の異なるタンパク質が含まれているかどうかを判断し、同定されたタンパク質と既知の経路21との間に結合があるかどうかを調べるために行った。分析の結果、700以上のタンパク質が細胞質であったが、そのデータセットには、核、膜、複数の細胞小器官、および細胞接合を含む細胞の他の領域に局在するタンパク質が含まれていることが示された(図4A)。また、解析の結果、400以上のタンパク質が触媒活性を有し、約300個のタンパク質がシグナル伝達経路に関与していたことも明らかになった(図4B および 図4C)。さらに、データセットには様々なシグナル経路に関与するタンパク質が含まれていました。 表1 は、データセット内で同定されたGタンパク質シグナル伝達、細胞接着、成長因子シグナル伝達経路、シナプス小胞の入稿経路における5つのタンパク質を示す。

Figure 1
図1:培養E21ラット胚性SCGニューロンの経時変化。表相対比顕微鏡画像は、めっき後20分後にE21ラットSCGから解離した細胞の10倍倍倍(A)、めっき後(B)とAra-C処理の48時間後(めっき後5日後)(C)の1日目に。(B)におけるグリア細胞(矢印)および軸索拡張(矢印頭)の存在と、(C)における広範な軸索成長を示すグリア細胞およびニューロンの欠如に注意する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:BMP-7による治療後のE21ラットSCGニューロンの神経形態の変化。非神経細胞の排除に続いて、培養されたSCGニューロンを5日間50ng/mL(B)でコントロールメディア(A)またはBMP-7で処理した。代表的な位相コントラスト顕微鏡(10倍倍率)は、BMP-7で処理した場合の制御ニューロン(A)および複数の短い樹状突起様プロセスを有するニューロン(矢印 、B)における軸索を有する円形ニューロン細胞体を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:培養胚性ラット交感ニューロンにおけるMAP-2タンパク質に対する免疫染色。非神経細胞の排除後、培養されたSCGニューロンを50ng/mL(E-H)で5日間コントロールメディア(A-D)またはBMP-7E-Hで処理し、MAP-2に対してマウスモノクローナル抗体を用いて免疫染色し、核マーカーで共標識した。微小管関連タンパク質-2(MAP-2)、染色(D,H)と位相差顕微鏡写真(B,F)と3つのチャネルの結合を有するニューロンの免疫細胞化学的染色を示す代表的な顕微鏡写真(A,E)。微小管関連タンパク質−2に対する免疫細胞化学的染色は、コントロールニューロンの細胞体および近位軸索(C)およびBMP-7処理ニューロンにおける細胞体および樹状突起におけるMAP−2タンパク質の染色に存在する(G)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:培養E21ラットSCGニューロンのプロテオーム解析で同定されたタンパク質の分類と分布。1100個のタンパク質に対するタンパク質IDは、パンサー分類システム上の遺伝子オントロジー分析を行い、細胞局在化(A)、細胞機能およびそれらが関与した生物学的プロセスに関するデータセット内のBタンパク質の分布を調べ、タンパク質構造に基づく分子機能クラス(C)を行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

A) 生体接着に関与するタンパク質
ユニプロト加盟 ID 遺伝子名 遺伝子シンボル
Q9Z1Y3 カドヘリン-2 Cdh2
O35112 CD166抗原 アルカム
P49134 インテグリン β-1 イットグブ1
D3ZES7 プレクシンA4 プルクスナ4
F1LP44 インテグリンサブユニット α L イットガル
B) 成長因子シグナル伝達に関与するタンパク質
P35213 14-3-3 タンパク質ベータ/アルファ ユハブ
Q5BJ92 セリン/スレオンニンタンパク質ホスファターゼ4触媒サブユニット Ppp4c
P47196 Rac – アルファセリン/スレオニンプロテインキナーゼ Akt1
P62994 成長因子受容体結合タンパク質 2 Grb2
P21708 マイトゲン活性化プロテインキナーゼ 3 マプク3
C) Gタンパク質結合シグナル経路に関与するタンパク質
P08753 グアニンヌクレオチド結合タンパク質 G(k) サブユニット α グナイ3
D4ABV5 カルモドゥリン-2 落ち着く2
P18266 グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3ベータ Gsk3b
P09456 cAMP依存性プロテインキナーゼタイプI-α調節サブユニット プルカル1a
P53534 グリコーゲンホスホリラーゼ ピグ(脳の形)
D) シナプス小胞の密売に関与するタンパク質
P47861 シナプトタジン-5 Syt5
P63045 ベシクル関連膜タンパク質2 ヴァンプ2
P61265 シンシン-1B Stx1b
Q63537 シナプシン-2 シン2
P60881 シナプトソーム関連タンパク質 25 スナップ25

表1:培養ラット胚性SCGニューロンからプロテオームデータで同定された代表的なタンパク質は、それらの生物学的機能によって分類される。 1100タンパク質を有するプロテオームデータを、パンサー分類システムを用いた遺伝子オントロジー解析を行った。以下に挙げるのは、4つの生物学的経路について同定された上位5つのタンパク質です。

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Discussion

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本論文では、胚性ラットの上位脳神経節から交感神経を培養するためのプロトコルについて述べている。このモデルシステムを用いる利点は、成長因子に対して同様の応答を提供するニューロンの均質集団を得ることができることであり、またこれらのニューロンに対する成長因子要件が十分に特徴付けられているため、これらのニューロンを定義された培地において、無血清条件下で成長させることができる。プロトコルは、SCGをE21ラットの子犬から隔離するプロセスを記述しているが、このプロトコルは、E17からE21へのラットの子犬からのSCGの解剖および胚マウスSCG10、22、2322,23の解剖のために使用10することができる。この解剖プロトコルは、初期ステップにわずかな変更を加えた出生後ラットからSCGを単離するためにも使用することができる。これらの改変は、Cセクションの必要性の排除、二酸化炭素を用いた出生後動物の安楽死、および70%アルコール中の子犬の浸漬による安楽死後の出生後の子犬の殺菌、解剖培地10に移す前に含まれる。この神経細胞培養プロトコルは、カンペノチャンバーおよびマイクロ流体室24,25,25を用いた軸索誘導、軸索輸送およびシナプス形成の研究に適応することもできる。これらのニューロンはまた、後根神経節または脊髄運動ニューロンからのニューロンまたは神経細胞との共培養を行って、ニューロンの相互作用およびニューロンを研究する - 末梢神経系26、27、28、29,28,2926,標的相互作用を研究することができる。

免疫細胞化学研究のための培養SCGニューロンの使用は十分に文書化されています。この論文に記載されているプロトコルは、ほとんどの抗体を扱うための出発点として良いところを提供します。しかし、固定プロトコルやパーメアビライゼーションプロトコルへの修飾を必要とする核タンパク質を検出するような抗体があります。ホスホ−SMAD抗体の場合、−20°Cで100%メタノールによる治療がニューロン30,31,31を固定および透過するために使用されている。

このモデルシステムでの作業の主な制限は、胚性ラットの子犬のSCGの小さなサイズに起因し、その結果、少数のニューロンが生じる。これは、子犬の1つのごみの解剖から得ることができる核酸またはタンパク質の限られた量をもたらす。これは、特に1回の解剖で複数の治療を比較する場合、ゲノム解析とプロテオーム解析に問題が生じ得ます。また、単一の胚からSCG神経培養を得ることはできない。したがって、すべての実験は、ごみ中のすべてのラット胚のSCGから得られたプールされたサンプルに対して行われる。システムのもう一つの制限は、SCGニューロンが、中枢ニューロン32と比較して、より低いDNAトランスフェクション効率(10〜20%、未発表の観察)およびトランスフェクション後の毒性が高い点である。このトランスフェクション効率は、個々のニューロンを用いた形態学的研究では問題ありませんが、遺伝子発現の変化を検出/確認するための分子研究や生化学的研究を行うことは困難です。

しかし、近年、培養SCGニューロンは樹状成長の基礎となるメカニズムを調べる研究や、転写とmiRNome分析14、15、3315,3314使用されている。先に示したように、低タンパク量のために、胚性SCGからの培養ニューロンは、プロテオミクス分析のために以前に使用されていなかった。このプロトコルと代表的な結果は、低濃度のサンプルであっても、現在の高精細質量分析機器がこれらのニューロンのプロテオミクス研究に使用できる証拠を提供する。ここで説明するサンプル調製プロトコルはSCGニューロン用であるが、このプロトコルはLC-MS分析のための低タンパク質濃度の任意のサンプルの調製に使用することができる。制限の1つは、タンパク質濃度の変動やトリプシン消化の効率が小さいと、不完全な断片化が発生し、LC-MSによって検出されるタンパク質の数が劇的に減少する可能性があることです。したがって、タンパク質濃度を50μg近く、タンパク質の比が10:1であるトリプシンを確実にすることが重要です。また、質量分析グレードのトリプシンをアリクォートして、複数の凍結融解サイクルを防止することをお勧めします。

プロトコルのもう一つの制限は、プロテオームで検出された膜貫通タンパク質の数が限られていたことである。酸不安定界面活性剤は質量分析に有効な界面活性剤であることが示されているが、培養細胞に関する以前の研究では、これらの界面活性剤が細胞質タンパク質の数をわずかに増やし、プロテオミックプロファイル34の膜タンパク質を減少させることができることがわかった。また、Lys-Cのような細菌性内ペプチダーゼを用いた前消化は、トリプシン消化前に膜結合タンパク質のトリプシン消化の効率を向上させ、膜タンパク質断片がLCカラム35に保持されるのを防ぐことが示唆されている。

要約すると、この論文は、培養ラット胚交感神経を成長させ、これらのニューロンに関する形態学的およびプロテオーム研究を行うための詳細なプロトコルを提供する。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの教員開発基金とサマーリサーチプログラム助成金によって支援されました。著者らはまた、カリフォルニア大学デービス校のパメラ・レイン博士とUCバークレー質量分析施設のアンソニー・イアバロン博士に、これらのプロトコルの開発中に助言を求めて感謝したいと考えています。著者らはまた、ビデオ制作と編集に関する彼女の助けのためにカリフォルニア州セントメアリーズカレッジのカレッジコミュニケーションズオフィスのヘイリー・ネルソンに感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D nanoACQUITY Waters Corporation
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
BMP-7 R&D Systems 354-BP
Bovine Serum Alumin Sigma-Aldrich 5470
Cell scraper Corning CLS-3010
Collagenase Worthington Biochemical 4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates Fisher Scientific 07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) ATCC 30-2200
Dispase II Roche 4942078001
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11885
Fatty Acid Free BSA Calbiochem 126609 20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 Ted Pella Inc 5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection Ted Pella Inc 1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mm Neuvitro Corporation GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated Thermo Fisher Scientific A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) Thermo Fisher Scientific 14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) Thermo Fisher Scientific 41400-045
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Leibovitz L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
Mounting media for glass coverslips Thermo Fisher Scientific P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) BioLegend SMI 52
Nerve growth factor Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) BT5017 Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye Spectrum Chemicals P1010
Penicillin-Streptomycin (100X) Thermo Fisher Scientific 15140
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P0899
Prionex Millipore 529600 10% solution, 100 mL
RapiGest SF Waters Corporation 186001861 5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry Waters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing grade Thermo Fisher Scientific 28904 10 X 1 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin Promega or NEB V511A, P8101S 100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials Waters Corporation 186000385c

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References

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形態学およびプロテオーム解析のための胚性子宮頸部神経節からのラット交感神経の培養
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Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).More

Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).

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