Summary
Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de las neuronas simpatizantes de ratas embrionarias de los ganglios cervicales superiores. También proporciona protocolos detallados para la tinción inmunocitoquímica y para la preparación de extractos neuronales para el análisis espectrométrico de masas.
Abstract
Las neuronas simpáticas de los ganglios cervicales superiores de rata embrionaria (SCG) se han utilizado como un sistema modelo in vitro para las neuronas periféricas para estudiar el crecimiento axonal, el tráfico de axonales, la sinaptogénesis, el crecimiento dendrítico, la plasticidad dendrítica y las interacciones nervio-objetivo en los sistemas de cultivo cooperativo. Este protocolo describe el aislamiento y la disociación de las neuronas de los ganglios cervicales superiores de los embriones de rata E21, seguido de la preparación y el mantenimiento de cultivos neuronales puros en medio libre de suero. Dado que las neuronas no se adhieren al plástico sin recubrimiento, las neuronas se cultivarán en cubiertas de vidrio de 12 mm o placas de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina. Después del tratamiento con un agente antimitotico (Ara-C, citosina-D-arabinofuranoside), este protocolo genera cultivos neuronales saludables con menos del 5% de células no neuronales, que se pueden mantener durante más de un mes in vitro. Aunque las neuronas de SCG de rata embrionaria son multipolares con 5-8 dendritas in vivo; en condiciones libres de suero, estas neuronas extienden sólo un axón en el cultivo y continúan siendo unipolares durante el cultivo. Sin embargo, estas neuronas se pueden inducir para extender las dendritas en presencia de extracto de membrana del sótano, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), o 10% suero de ternera fetal. Estos cultivos neuronales homogéneos se pueden utilizar para la tinción inmunocitoquímica y para estudios bioquímicos. Este artículo también describe el protocolo optimizado para la tinción inmunocitoquímica para la proteína asociada a microtúbulos-2 (MAP-2) en estas neuronas y para la preparación de extractos neuronales para espectrometría de masas.
Introduction
Las neuronas simpáticas derivadas de los ganglios cervicales superiores embrionarios (SCG) se han utilizado ampliamente como un sistema de cultivo neuronal primario para estudiar muchos aspectos del desarrollo neuronal, incluida la dependencia del factor de crecimiento, interacciones neuron-target, señalización de neurotransmisores, crecimiento axonal, desarrollo de dendrita y plasticidad, sinaptogénesis y mecanismos de señalización subyacentes a las interacciones nervio-objetivo/neurona-glia1,2,3,4,5,6,7,8,9. A pesar de su pequeño tamaño (alrededor de 10000 neuronas/ganglia), hay tres razones principales para el desarrollo y el uso extensivo de este sistema de cultivo son i) siendo los primeros ganglios en la cadena simpática, son más grandes, y por lo tanto más fáciles de aislar, que el resto de los ganglios simpáticos10; ii) a diferencia de las neuronas centrales, las neuronas en el SCG son bastante homogéneas con todas las neuronas que se derivan de la cresta neural, teniendo un tamaño similar, dependencia del factor de crecimiento nervioso y ser no-adrenergic. Esto los convierte en un modelo valioso para los estudios morfológicos y genómicos10,,11 y iii) estas neuronas se pueden mantener en un medio sin suero definido que contiene factor de crecimiento nervioso durante más de un mes10,,12. Las neuronas SCG perinatales se han utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos subyacentes a la iniciación y mantenimiento de dendritas2. Esto se debe principalmente a que, aunque las neuronas SCG tienen un árbol pródrico extenso in vivo, no extienden las dendritas in vitro en ausencia de suero, sino que pueden ser inducidas a crecer dendritas en presencia de ciertos factores de crecimiento como las proteínas morfogenéticas óseas2,,12,,13.
Este artículo describe el protocolo para aislar y cultivar las neuronas DE SCG de rata embrionaria. En los últimos 50 años, las culturas neuronales primarias del SCG se han utilizado principalmente para estudios morfológicos con un número limitado de estudios que examinan los cambios genómicos o proteómicos a gran escala. Esto se debe principalmente al pequeño tamaño del tejido que resulta en el aislamiento de bajas cantidades de ADN o proteína, lo que dificulta la realización de análisis genómicos y proteómicos en estas neuronas. Sin embargo, en los últimos años, el aumento de la sensibilidad de detección ha permitido el desarrollo de métodos para examinar el genoma, miRNome y proteoma en las neuronas SCG durante el desarrollo del crecimiento dendrítico14,,15,,16,,17. Este artículo también describirá el método para el análisis morfológico de estas neuronas utilizando inmunocitoquímica y un protocolo para obtener extractos de proteína neuronal para el análisis espectrométrico de masas.
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Protocol
Todos los procedimientos realizados en estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Saint Mary's College of California. Las pautas de cuidado y uso de animales en Saint Mary's College se desarrollaron sobre la base de las directrices proporcionadas por la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio en el Instituto Nacional de Salud (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf y https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Preparación de medios de cultivo (también denominados medios de control)
- Añadir los siguientes ingredientes, en el orden indicado a continuación, a un matraz estéril de 500 ml: 190 ml de 1x DMEM de baja glucosa, 10 ml de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos de 20 mg/ml (FAF-BSA) en DMEM, 2,8 ml de 200 mM de L-glutamina, 4 ml de 100x mezcla de insulina-selenio-transferrina, 0,4 ml de factor de crecimiento nervioso de 125 g/ml (en un 0,2% de estabilizador de proteína inerte en DMEM) y 200 ml del medio F-12 de Ham.
- Asegúrese de recubrir la pipeta con el medio que contiene FAF-BSA antes de la adición de soluciones que contengan proteínas como insulina-selenio-transferrina y NGF para evitar que se peguen proteínas a la pipeta.
- Gire el matraz para mezclar los ingredientes después de cada adición. Mezclar bien con una pipeta de 25 ml después de la adición de F-12.
- Aliquot los medios de cultivo en 10 mL alícuotas y almacenar a -80 oC. Las alícuotas se pueden almacenar durante seis meses sin pérdida de actividad.
2. Preparación de placas para el cultivo de neuronas
- Diluir un stock de 1 mg/ml de poli-D-lisina (hecho en tampón Tris de 0,5 M, pH 8) a 100 g/ml con agua destilada estéril.
- Para el análisis proteómico o genómico, uno o dos días antes de la disección, recubrir las placas de 6 pocillos con aproximadamente 2 ml de 100 g/ml estériles de poli-D-lisina (PDL). Esto es necesario para asegurar la adhesión celular al pozo. Envuelva los platos con película de adherencia y guarde los platos durante la noche a 4 oC.
- Para el análisis morfológico y la microscopía, coloque 12 mm2 cubreobjetos de vidrio alemanes pretratados (que se pueden limpiar mediante el tratamiento de ácido nítrico como se describió anteriormente18 o comprado) en cada uno de los pozos de una placa de 24 pozos.
- Recubrir los cubreobjetos con 0,3 ml de estéril 100 g/ml de poli-D-lisina (PDL). Almacene los platos durante la noche a 4oC.
- El día de la disección, antes del inicio de la disección, retire la solución de poli-D-lisina de los pozos y enjuague los pozos cinco veces con agua destilada estéril, seguida de una vez con DMEM de glucosa baja.
- Durante la digestión enzimática de los ganglios (aproximadamente una hora antes de enchapar las células), aspirar el DMEM de las placas y reemplazarlo por 0,3 ml de medios de control. Conservar las placas a 35,5 oC por debajo del 5% deCO2 en una cámara humidificada.
3. Configuración de la disección
- Preparación de 200 ml de medios para disección (denominados medios de disección)
- Añadir 8 ml de albúmina sérica bovina sin ácidos grasos de 20 mg/ml (FAF-BSA) en DMEM de glucosa baja (con 1 mg/ml de glucosa) y 2 ml de 100x de penicilina-estreptomicina a 193 ml del medio L-15 estéril de Leibovitz (o cualquier medio con amortiguación de aire)
- En la campana, configure los siguientes elementos para la disección: cuatro tubos cónicos estériles de 50 ml con unos 20 ml de medios de disección en cada tubo, cuatro platos estériles de 35 mm con 1,5 ml de medios de disección, un tubo cónico estéril de 50 ml con 20 ml de medios de disección para centrifugación, un tubo cónico estéril de 15 ml para centrifugar el gangiling , y un tubo estéril de 10 ml para recoger las células disociadas.
- Utilice un esterilizador de perlas secas para esterilizar un par de fórceps finos (no 4 o no 5 fórceps) durante al menos un minuto.
4. Aislamiento de los ganglios cervicales superiores de los cachorros de rata embrionaria
- Extirpación de embriones E21 de la rata embarazada
NOTA: La extracción de la bocina uterina se puede realizar fuera de la campana si el área circundante está completamente esterilizada.- Eutanasiar la rata embarazada usando inhalación deCO2. Corta el pelaje de la región abdominal y limpia la piel de la zona con 70% de alcohol para esterilizarlo.
- Usando un nuevo conjunto de tijeras estériles y fórceps, corta la piel y luego la capa muscular para exponer los cuernos uterinos que contienen los embriones. Retire los cuernos uterinos con los embriones utilizando un nuevo conjunto de tijeras y fórceps, teniendo cuidado de no dañar los intestinos en el proceso.
- Transfiera los cuernos uterinos con los embriones en un plato petri estéril de 150 mm2 y transfiéralos a la capucha.
- Usando un nuevo conjunto de fórceps y tijeras, retire los embriones del cuerno uterino y separe los embriones de las membranas amnióticas y la placenta.
- Para eutanasiar los embriones, corte la médula espinal de los embriones a lo largo de la línea media bajo el brazo derecho. Esto también reducirá el sangrado de la arteria carótida durante la extirpación del SCG.
- Transfiera estos embriones a los tubos cónicos de 50 ml preparados que contienen medios de disección. Asegúrese de que los embriones estén sumergidos en los medios. Cada tubo puede contener hasta 3 embriones.
- Aislamiento del ganglio cervical superior del embrión
- Transfiera un cachorro del medio de disección a un plato estéril de 150 mm2 Petri medio lleno de sustrato sólido (ya sea cera de parafina o polímero de silicona), con su superficie dorsal en el sustrato. Usando tres agujas estériles de 23 G, clavar el cachorro al plato con una aguja debajo de cada brazo y una tercera aguja a través de la boca para hiperextender cuidadosamente el cuello.
- Corte a través de la piel en la región del cuello usando fórceps finos estériles (no 4 o no. 5 fórceps) para exponer las glándulas salivales debajo. Retire estas glándulas usando fórceps finos.
- Localice los músculos esternocleidomastoideo y omohyoid cerca de la clavícula y la tráquea, respectivamente. Primero corte los músculos esternocleidomastoideos transversales y luego corte cuidadosamente el músculo omohioides delgado usando fórceps finos. Una vez que se retiran estos músculos, la bifurcación en la arteria carótida en el extremo anterior será visible a ambos lados de la tráquea, con el SCG situado debajo de esta horquilla en la arteria carótida.
- Con fórceps cerrados, levante suavemente la arteria carótida para visualizar el SCG. Usando un fórceps a cada lado del SCG, extraiga la carótida y transfiérala a los platos estériles preparados de 35 mm2. Lo más probable es que este tejido contenga el SCG con la arteria carótida, el nervio vago con los ganglios nodosos, así como otros segmentos de músculo o grasa en la zona.
- Repita el proceso de disección en el otro lado. Retire los SG de todos los embriones antes de continuar con los pasos de disección restantes que se describen a continuación. Distribuir los tejidos aislados entre dos de los 35 mm2 platos para facilitar el procesamiento de las muestras de tejido.
- Post-procesamiento de SCG
- Para separar el SCG del tejido diseccionado, primero use fórceps finos para extraer cualquier tejido extraño, como grasa o músculo, teniendo cuidado de evitar el área cerca de la bifurcación carótida.
- Una vez que estos tejidos han sido retirados, dos ganglios son visibles. El ganglio nodoso es más pequeño y circular, mientras que el SCG tiene forma de almendra. Tire suavemente del nervio vago para separar el nervio vago y los ganglios nodos de la carótida y luego separar el SCG de la arteria carótida.
- Utilice fórceps finos para extraer la cápsula que rodea el SCG. Transfiera el SCG a un nuevo plato de cultivo de 35 mm. Repita el proceso con todas las muestras de tejido diseccionado.
- Recubrir una pipeta de vidrio esterilizada, enchufada de algodón con medios de disección para evitar que el tejido se adhire a las paredes de la pipeta. Utilice la pipeta para sustituir el medio de disección por 2 ml estériles de colagenasa tipo II (1 mg/ml)/dispase tipo II (5 mg/ml) en HBSS libre de calcio y magnesio, e incubar durante 50 minutos a 37 oC para ayudar a descomponer los tejidos.
NOTA: El tiempo de incubación puede necesitar ser optimizado con diferentes lotes de Colagenasa/Dispase y por lo general oscila entre 40 min a una hora. - Durante la incubación, aspirar el DMEM de las placas y sustituirlo por 0,3 ml de medios de control. Conservar las placas a 35,5 oC por debajo del 5% deCO2 en una cámara humidificada.
- Después de la incubación, transfiera los SG en colagenasa/disase a un tubo cónico estéril de 15 ml. Utilice el soporte de disección para enjuagar las placas y transferir la solución al tubo. Agregue suficientes medios de disección para subir el volumen a aproximadamente 10 ml.
- Centrifugar a 200 x g (1000 - 1200 rpm) durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar la muestra. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no desalojar el pellet. Resuspender el pellet con 10 ml de medios de disección. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante.
- Reemplazar con 1 - 2 mL de medio de cultivo. Usando una pipeta pasteur estéril de punta estrecha y doblada (recubierta con medio de cultivo), disocia mecánicamente los grumos mediante la trituración suave de 5-6 veces. Deje que los grupos más grandes se conformen durante aproximadamente un minuto. Transfiera la suspensión de la célula sobrenadante a un nuevo tubo de 10 ml.
- Repita este proceso 3 veces más, con una creciente fuerza de trituración cada vez para asegurar la disociación casi completa de los SCG. Transfiera el sobrenadante después de cada ronda de trituración a un tubo de 10 ml con el sobrenadante desde la primera trituración.
- Agregue suficientes medios de referencia cultural para subir el volumen a 8 - 10 ml. Mezclar suavemente la suspensión celular y cuantificar la densidad celular con un hemocitoómetro.
- Distribuya la suspensión celular en los pozos con la densidad celular adecuada para los experimentos. Mezclar la suspensión celular continuamente durante el proceso de chapado para asegurar una distribución uniforme de las células en los pozos.
NOTA: Para el análisis morfológico, placar las células alrededor de 8.000 células / pozo en una placa de 24 pozos y para protocolos genómicos y proteómicos, placar las células tan alto como 30.000 células / pozo. - Transfiera las placas a un desecador de vidrio con agua estéril en la parte inferior para crear una cámara humidificada. Inyectar suficiente CO2 (alrededor de 120 ml) para obtener un entorno de 5% deCO2 en el desecador, antes del sellado. Mantener las placas a 35,5 oC. Esto se conoce como Día 0 en el protocolo.
NOTA: Estas placas también se pueden mantener en una incubadora regular de 5% de CO2. El método descrito anteriormente minimiza los cambios de temperatura y pH y también ayuda a prevenir la contaminación cruzada.
5. Mantenimiento de las neuronas y tratamientos SCG cultivados
- El día 1 (24 horas después del enchapado), retire cuidadosamente la mitad de los medios de cultivo y sustitúyalos por 2 M de Ara-C (citosina-D-arabinofuranoside, un agente antimitético). Deje el tratamiento en las células durante 48 h. Por lo general, esta duración del tratamiento es suficiente para eliminar las células no neuronales en el cultivo.
- El día 3, aspira suavemente la mitad del medio y reúmbilo con medio de control.
- El día 4, las células están listas para tratamientos experimentales. Alimente los cultivos cada dos días con el medio adecuado, reemplazando suavemente la mitad del medio en el pozo por un medio fresco.
- Las neuronas SCG cultivadas en medio libre de suero extienden sólo axones. Si los experimentos requieren la presencia de dendritas, tratar las células con un 10% de suero de ternera fetal, 75-100 g/ml de extracto de matriz de membrana del sótano o 50 ng/ml de proteína morfogenética ósea-7. El crecimiento dendrítico se observa dentro de las 48 horas posteriores al tratamiento con un árbol dendrítico elaborado observado dentro de una semana de tratamiento.
6. Inmunostaining cultivados neuronas SCG
- Reemplazar gradualmente el medio de cultivo celular en el pozo con 4% de paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M, pH 7,2 en una campana de humo.
- Retire la mitad de los medios de cultivo en el pozo y reemplácelo suavemente con un 4% de paraformaldehído. Luego, repita el proceso al menos dos veces más, eliminando dos tercios de los medios en el pozo cada vez y reemplazando con 4% de paraformaldehído. Al final de este proceso, el color de los medios en el pozo debería haber cambiado de rosa a incoloro.
- Una vez que todo el medio ha sido sustituido por un 4% de paraformaldehído, incubar los pozos durante 15 - 20 minutos a temperatura ambiente.
- Con un proceso similar como se describió anteriormente, reemplace gradualmente la solución de paraformaldehído del 4% con solución salina tamponada por fosfato (PBS), pH 7.2. Dejar actuar durante 5 minutos. Enjuague los pozos dos veces más durante 5 minutos cada uno con PBS.
- Una vez que se retire el paraformaldehído del 4%, mueva las placas a la mesa para su posterior procesamiento. Este paso es un buen punto de parada donde las placas se pueden almacenar a 4 oC durante la noche.
- Quite todo el PBS. Agregue suficiente volumen de 0.1% Triton X-100 en PBS para cubrir las células. Déjalo en las culturas durante 5 minutos para permeabilizar las neuronas. El momento de este paso es fundamental para garantizar una buena tinción mientras se mantiene la integridad de las células.
- Retire cuidadosamente la solución Triton X-100 y enjuague los pozos tres veces durante 5 minutos cada vez con PBS. Retire la solución PBS.
- Agregue suficiente 5% de BSA en PBS para cubrir las células e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para reducir la unión de anticuerpos no específicos.
- Retire la solución de bloqueo y reemplácela con un anticuerpo monoclonal de ratón contra la proteína MAP-2 diluida en 5% de BSA en PBS. Deje el anticuerpo primario en las células durante la noche a 4 oC.
- Retire y guarde el anticuerpo primario para reutilizarlo. El anticuerpo primario se puede reutilizar al menos dos veces sin pérdida de intensidad de detección.
- Enjuague tres veces con suficiente PBS para cubrir las células. Deje PBS en las células durante 10 minutos por enjuague.
- Retire la solución PBS y sustitúyela por un anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con etiqueta fluorescente a 1:1000 en 5% de BSA en PBS. Incubar durante 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Retire el anticuerpo secundario y reemplácelo por PBS. Enjuague los pozos tres veces con PBS durante 10 minutos por enjuague. Enjuague los pozos una vez con agua para eliminar las sales.
- Monte los cubreobjetos en diapositivas de vidrio que contengan una gota de montura acuosa que sea adecuada para muestras con etiquetas fluorescentes. Almacene las diapositivas a 4 oC, en una carpeta de diapositivas hasta que estén listas para la creación de imágenes.
7. Preparación de muestras para el análisis del proteome utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas
- Lisis de neuronas cultivadas
- Retire suavemente todos los medios de cultivo en los pozos. Reemplácelo por calcio frío y estéril y solución salina tamponada de fosfato libre de magnesio (PBS), pH 7.4. Retire rápidamente y reemplácelo con PBS y déjelo reposar durante 5 minutos. Este paso se realiza para eliminar cualquier proteína presente en los medios de cultivo.
- Retire cuidadosamente todo el PBS de todos los pozos para un tratamiento particular. Repita el proceso una vez más. Mantenga las placas sobre hielo al alce las células para minimizar el daño neuronal y la proteólisis.
- Añadir 100 - 150 l de bicarbonato de amonio de 50 mM, pH 7.5 (NH4HCO3) a uno de los pozos y células raspadoras utilizando un rascador de células estériles. Con una micropipeta, transfiera el líquido y repita el proceso de raspado con todos los pozos para un tratamiento particular. Examine los pozos bajo el microscopio después del raspado para asegurarse de que la mayoría de las células han sido removidas.
- Con el bajo número de neuronas, utilice un volumen limitado para anlicer las células para asegurar una concentración lo suficientemente alta para el análisis proteómico.
- Congele la solución a -80 oC durante la noche para ayudar con la lisis celular. Los lysates se pueden almacenar en esta etapa hasta que estén listos para su posterior procesamiento.
- Una vez descongeladas, chorro las muestras a través de una jeringa con una aguja de 26 G o 28 G para licecer mecánicamente las células.
- Sonicar las muestras en un baño de agua sonicante dos veces durante 10 minutos. Agregue hielo al baño de agua para evitar el sobrecalentamiento y la desnaturalización de las proteínas. Centrifugar durante 5 minutos a 4oC a 12.000 x g.
- Mida la concentración de proteínas. Las concentraciones típicas de proteínas oscilan entre 0,4 - 1 g/l
- Preparación de muestras y digestión de tripsina para análisis de proteome
- Transfiera un máximo de 60 ml del izado o 50 g de proteína a un tubo de 1,5 ml libre de DNase, RNase y proteasa. Si el volumen del izado es inferior a 60 ml, añada suficiente bicarbonato de amonio de 50 mM para componer el volumen.
- Añadir 25 l de 0,2% de tensioactivo lábil ácido y vórtice. Incubar el tubo en un calentador de bloque a 80oC durante 15 minutos. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 30 s.
- Añadir 2,5 l de ditiothreitol de 100 mM y vórtice. Esto hace que la proteína sea más accesible para la alquilación y la digestión. Incubar el tubo a 60oC en un calentador de bloque durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y centrifugar.
- Añadir 2,5 l de iodoacetamida de 300 mM a la muestra y vórtice. Este paso ayuda a alquilate a los cisteínas y les impide reformar los enlaces disulfuros. Incubar los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
- Añadir la tripina de grado de espectrometría de masas (0,5 g/L) al tubo a una relación de proteína de trippsina: de 1:10. Digerir las muestras a 37oC durante la noche.
- Añadir 10 l de ácido trifluoroacético al 5% (TFA) y vórtice. Incubar las muestras a 37oC durante 90 minutos. Este paso es necesario para hidrolizar el tensioactivo lábil ácido para evitar interferencias durante la espectrometría de masas.
- Centrifugar las muestras a 12.000 x g a 4 oC durante 30 minutos y transferir el sobrenadante a un vial de vidrio transparente certificado por cromatografía con tapas de tabique de teflón/silicona precubiertas. Las muestras se pueden almacenar a -20 oC antes del análisis de espectrometría de masas.
- Somete los viales de muestra a cromatografía líquida junto con espectrometría de masas de alta definición.
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Representative Results
Aislamiento y mantenimiento de cultivos neuronales de neuronas de SCG embrionarias
Las células disociadas del SCG embrionario de rata fueron chapadas en una placa o cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina y mantenidas en medios de cultivo libres de suero que contienen factor de crecimiento del nervio b. Las células disociadas que contienen una mezcla de neuronas y células gliales se ven circulares sobre el chapado (Figura 1A). Dentro de las 24 horas posteriores al encojo, las neuronas extienden pequeños procesos axonales con aplanamiento de células gliales y que aparecen en fase-oscura bajo microscopía de contraste de fase (Figura 1B). Tras el tratamiento con Ara-C, se eliminan el 99% de las células gliales y los cultivos contienen predominantemente células neuronales con un cuerpo celular ovalado, un crecimiento axonal extenso y sin dendritas (Figura 1C).
Tinción inmunocitoquímica de las neuronas ganglia cervicales superiores de rata embrionaria cultivada
Estudios anteriores han demostrado que las neuronas simpáticas cultivadas cultivadas cultivadas cultivadas en medio libre de suero extienden sólo los axones y sólo extienden un árbol dendrítico elaborado en presencia de extracto de membrana sótano, 10% de suero o 50 ng/ml de proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7)2,12. De acuerdo con estas observaciones, la microscopía de contraste de fase muestra que las neuronas cultivadas en presencia de BMP-7 (50 ng/ml) durante 5 días tienen un cuerpo celular aplanado con múltiples procesos cónicos gruesos en comparación con las neuronas cultivadas en medios de control sin suero (Figura 2). La identidad de estos procesos como dendritas se confirma por la presencia de MAP-2, una proteína citoesquelética que se encuentra predominantemente en el cuerpo celular y dendritas19,,20. En condiciones de control, la tinción fluorescente para MAP-2 se observa dentro del citoplasma y los axones proximales y se excluye del núcleo (como lo demuestra el coetiqueta con una mancha nuclear para visualizar el núcleo (Figura 3A-3D). Tras el tratamiento con BMP-7 a 50 ng/ml durante 5 días, la inmunorreactividad para MAP-2 se observa no sólo en el citoplasma, sino también en dendritas(Figura 3E-3H).
Análisis proteómico de muestras de neuronas SCG cultivadas cultivadas cultivadas en medios de control
Las neuronas simpáticas de rata E21 se cultivaron en medios de control durante 6 días in vitro, se lejeron y se sometieron a análisis de LC-MS. La muestra se realizó en tres réplicas en el espectrómetro de masas y las proteínas se identificaron en función del número de péptidos fragmentados observados para cada muestra. Se calculó la abundancia de proteínas (que oscilan entre 0 y más de 300000 unidades arbitrarias) y la puntuación de confianza para la identificación de proteínas basada en el número de péptidos fragmentados observados para cada proteína (que oscila entre 5 y 500). En la Figura 4se muestra un conjunto de datos de muestra del análisis espectrométrico de masas del proteoma de 30 g de proteína de las neuronas SCG cultivadas en medios de control sin suero.
Se detectaron 13 134 péptidos en la muestra que correspondieron a 1287 proteínas. De ellos, 1100 de los cuales estaban presentes en las tres réplicas técnicas con valores de abundancia normalizados superiores a 500. De estas 1100 proteínas, 90 proteínas se identificaron por la presencia de un solo impacto de péptido, que sólo cubría una pequeña porción de la proteína. Por lo tanto, era difícil determinar si la identificación era correcta y estas proteínas tenían una puntuación baja de confianza en proteínas (puntuación <10). Estas proteínas se eliminaron del análisis y las 1010 proteínas restantes se analizaron más a fondo utilizando la ontología Gene para determinar si el protocolo tuvo éxito en la detección de proteínas con diferente localización y función.
El análisis ondlógico genético de este conjunto de datos se realizó utilizando la base de datos de clasificación Panther (http://www.pantherdb.org/) para determinar si este conjunto de datos incluía proteínas con diferentes localizaciones celulares o funciones moleculares y biológicas y para examinar si existían las conexiones entre las proteínas identificadas y las vías conocidas21. El análisis mostró que aunque más de 700 de las proteínas eran citoplasmáticas, ese conjunto de datos contenía proteínas que se localizaron en otras regiones de la célula, incluyendo el núcleo, la membrana, varios orgánulos celulares y uniones celulares (Figura 4A). El análisis también reveló que más de 400 proteínas tenían actividad catalítica, y alrededor de 300 proteínas estaban involucradas en vías de señalización(Figura 4B y Figura 4C). Además, el conjunto de datos contenía proteínas implicadas en varias vías de señalización. La Tabla 1 muestra cinco de las proteínas en la señalización de proteínas G, la adhesión celular, la vía de señalización del factor de crecimiento y las vías de tráfico de vesículas sinápticas, respectivamente, que se identificaron en el conjunto de datos.
Figura 1: Cambios en la morfología de las neuronas E21 embrionarias de SCG cultivadas con el tiempo. Imágenes representativas de microscopía de contraste de fase a 10x aumento de células disociadas de E21 rata SCG 20 min después del chapado (A), un día después del chapado (B) y después de 48 horas de tratamiento Ara-C (5 días después del chapado) (C). Tenga en cuenta la presencia de células gliales (flechas) y extensión axonal (cabezas de flecha) en (B), y ausencia de células gliales y neuronas que muestran un crecimiento axonal extenso en (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cambios en la morfología neuronal de las neuronas DE SCG de rata E21 después del tratamiento con BMP-7. Tras la eliminación de las células no neuronales, las neuronas SCG cultivadas fueron tratadas con medios de control (A) o BMP-7 a 50 ng/ml (B) durante 5 días. Las micrografías de contraste de fase representativa (aumento de 10x) muestran el cuerpo celular neuronal circular con axones en las neuronas de control (A) y las neuronas con múltiples procesos cortos similares a dendrita cuando se trata con BMP-7 (flechas, B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inmunosusteza de la proteína MAP-2 en neuronas simpáticas de rata embrionaria cultivadas. Tras la eliminación de las células no neuronales, las neuronas SCG cultivadas fueron tratadas con medios de control (A-D) o BMP-7 a 50 ng/mL (E-H) durante 5 días y inmunotenidas con un anticuerpo monoclonal de ratón contra MAP-2 y etiquetadas conjuntamente con un marcador nuclear. Micrografías representativas que muestran la tinción inmunocitoquímica de las neuronas con microtúbulo asociado a la proteína-2 (MAP-2) (C,G), una mancha nuclear (D,H) con micrografías de contraste de fase (B,F) y una fusión de los tres canales (A,E). La tinción inmunocitoquímica para la proteína asociada a microtúbulos-2 está presente en el cuerpo celular y axones proximales de las neuronas de control (C) y la tinción de la proteína MAP-2 en el cuerpo celular y las dendritas en las neuronas tratadas con BMP-7 (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Clasificación y distribución de proteínas identificadas en el análisis proteoma de las neuronas de SCG de ratas E21 cultivadas. Las IDs de proteínas para las 1100 proteínas fueron sometidas a análisis ontología genética en el sistema de clasificación Panther para examinar la distribución de proteínas en el conjunto de datos con respecto a la localización celular (A), la función celular y los procesos biológicos en los que participaron (B) y la clase de función molecular basada en la estructura proteica (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| A) Proteínas implicadas en la adhesión biológica | ||
| ID de adhesión de UniProt | Nombre geneo | Símbolo genético |
| Q9Z1Y3 | Cadherin-2 | Cdh2 |
| O35112 | Antígeno CD166 | Alcam |
| P49134 | Integrin beta-1 | Itgb1 |
| D3ZES7 | Plexin A4 | Plxna4 |
| F1LP44 | Subunidad Integrin alfa L | Itgal |
| B) Proteínas implicadas en la señalización del factor de crecimiento | ||
| P35213 | 14-3-3 proteína beta/alfa | Ywhab |
| Q5BJ92 | Fosfatasa de proteína serina/trionina 4 subunidad catalítica | Ppp4c |
| P47196 | Rac – proteína quinasa de proteína alfarina/threonina | Akt1 |
| P62994 | Proteína unida al receptor del factor de crecimiento 2 | Grb2 |
| P21708 | Proteína quinasa activada por mitógenos 3 | Mapk3 |
| C) Proteínas implicadas en la vía de señalización acoplada a la proteína G | ||
| P08753 | Proteína de unión a nucleótidos de guanina G(k) subunidad alfa | Gnai3 |
| D4ABV5 | Calmodulin-2 | Calma2 |
| P18266 | Glycogen sintasa quinasa-3 beta | Gsk3b |
| P09456 | Subunidad reguladora de proteína quinasa dependiente del campo I-alfa | Prkar1a |
| P53534 | Fosforilasa de glucógeno | Pygb (forma cerebral) |
| D) Proteínas implicadas en el tráfico de vesículas sinápticas | ||
| P47861 | Synaptotagmin-5 | Syt5 |
| P63045 | Proteína de membrana asociada a vesículas 2 | Vamp2 |
| P61265 | Sintaxis-1B | Stx1b |
| Q63537 | Synapsin-2 | Syn2 |
| P60881 | Proteína asociada a Synaptosomal 25 | Snap25 |
Tabla 1: Proteínas representativas identificadas en los datos del proteoma de las neuronas de SCG embrionarias de ratas cultivadas, clasificadas por sus funciones biológicas. Los datos del proteoma con las 1100 proteínas fueron sometidos a análisis ontología genética utilizando el sistema de clasificación Panther. A continuación se enumeran las cinco proteínas principales identificadas para cuatro vías biológicas.
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Discussion
Este artículo describe los protocolos para el cultivo de neuronas simpáticas de ganglios cervicales superiores de cachorros de rata embrionaria. Las ventajas de utilizar este sistema modelo son que es posible obtener una población homogénea de neuronas proporcionando una respuesta similar a los factores de crecimiento, y dado que los requisitos del factor de crecimiento para estas neuronas ha sido bien caracterizado, es posible crecer estas neuronas in vitro en medios definidos, en condiciones libres de suero10. Aunque el protocolo describe el proceso para aislar SCG de cachorros de rata E21, este protocolo se puede utilizar para la disección de SCG de cachorros de rata de E17 a E21 y para la disección del ratón embrionario SCG10,22,,23. Este protocolo de disección también se puede utilizar para aislar SCG de ratas postnatales con una modificación menor en los pasos iniciales. Estas modificaciones incluyen la eliminación de la necesidad de cesárea, eutanasia de los animales postnatales utilizando dióxido de carbono, y la esterilización de los cachorros postnatales después de la eutanasia por inmersión de los cachorros en 70% de alcohol, antes de transferirlos a medios de disección10. Este protocolo de cultivo neuronal también se puede adaptar para el estudio de la orientación axonal, el transporte axonal y la formación de la sinapsis utilizando cámaras Campenot y cámaras microfluídicas24,,25. Estas neuronas también pueden ser co-cultivadas con neuronas de las neuronas de la raíz dorsal o las neuronas motoras espinales o con cardiomiocitos para estudiar las interacciones neuronales y la neurona – interacciones objetivo en el sistema nervioso periférico26,27,28,29.
El uso de neuronas SCG cultivadas para estudios inmunocitoquímicos está bien documentado. El protocolo descrito en el documento proporciona un buen punto de partida para trabajar con la mayoría de los anticuerpos. Sin embargo, existen anticuerpos, como los que detectan proteínas nucleares que pueden requerir una modificación del protocolo de fijación y del protocolo de permeabilización. En el caso de los anticuerpos fosfo-SMAD, se ha utilizado el tratamiento con metanol 100% a -20 oC para fijar y permeabilizar las neuronas30,,31.
Las principales limitaciones de trabajar en este sistema modelo se derivan del pequeño tamaño de los SCG en los cachorros de rata embrionaria, lo que resulta en un pequeño número de neuronas. Esto resulta en una cantidad limitada de ácidos nucleicos o proteínas que se pueden obtener de la disección de una camada de cachorros. Esto puede ser problemático para el análisis genómico y proteómico, especialmente cuando se compara entre múltiples tratamientos en una disección. Además, no es posible obtener cultivos neuronales SCG a partir de un solo embrión. Por lo tanto, todos los experimentos se realizan en muestras agrupadas que se obtienen de SCG de todos los embriones de rata en una camada. Otra limitación del sistema es que las neuronas SCG tienen menor eficiencia de transfección de ADN (10 - 20%, observaciones inéditas) y mayor toxicidad después de la transfección en comparación con las neuronas centrales32. Aunque esta eficiencia de transfección está bien para estudios morfológicos con neuronas individuales, es difícil realizar estudios moleculares o bioquímicos para detectar/confirmar cambios en la expresión génica.
Sin embargo, en los últimos años, las neuronas SCG cultivadas se han utilizado para estudios que examinan los mecanismos subyacentes al crecimiento dendrítico y para los análisis de transcriptoma y miRNome14,,15,,33. Como se indicó anteriormente, debido a las bajas cantidades de proteínas, las neuronas cultivadas de SCG embrionario no se han utilizado previamente para el análisis proteómico. Este protocolo y los resultados representativos proporcionan evidencia de que incluso con la baja concentración de muestras, los instrumentos actuales de espectrometría de masas de alta definición podrían utilizarse para estudios proteómicos sobre estas neuronas. Aunque el protocolo de preparación de muestras descrito aquí es para las neuronas SCG, este protocolo se puede utilizar para la preparación de cualquier muestra con baja concentración de proteínas para el análisis de LC-MS. Una de las limitaciones es que las pequeñas variaciones en la concentración de proteínas o la eficiencia de la digestión de la trippsina pueden dar lugar a una fragmentación incompleta y a una disminución dramática en el número de proteínas detectadas por LC-MS. Por lo tanto, es fundamental asegurarse de que las concentraciones iniciales de proteínas sean tan cercanas a los 50 g con una proporción de 10:1 de proteína: tripina. Además, es una buena práctica alicucular la espectrometría de masas-grado de trippsina para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación.
Otra limitación del protocolo es que sólo hubo un número limitado de proteínas transmembranas detectadas en el proteoma. Mientras que el tensioactivo lábil ácido ha demostrado ser un surfactante eficaz para la espectrometría de masas, un estudio previo sobre células cultivadas encontró que estos tensioactivos pueden aumentar ligeramente el número de proteínas citoplasmáticas y disminuir las proteínas de membrana en el perfil proteómico34. También, se ha sugerido que la pre-digestión utilizando una endopeptidasa bacteriana como Lys-C, antes de la digestión de la trippsina puede mejorar la eficiencia de la digestión de la trippsina de proteínas unidas a la membrana y evitar que los fragmentos de proteína de membrana se conserven en las columnas LC35.
En resumen, este documento proporciona protocolos detallados para el crecimiento de las neuronas simpáticas embrionarias de ratas cultivadas y para realizar estudios morfológicos y proteómicos en estas neuronas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la beca del Fondo de Desarrollo Docente y del Programa de Investigación de Verano en el Saint Mary's College of California. Los autores también quieren agradecer a la Dra. Pamela Lein de la Universidad de California en Davis y al Dr. Anthony Iavarone en la instalación de espectrometría de masas de UC Berkeley por sus consejos durante el desarrollo de estos protocolos. Los autores también quieren agradecer a Haley Nelson en la Oficina de Comunicaciones Universitarias del Saint Mary's College of California por su ayuda con la producción y edición de videos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
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