Summary
Este artigo descreve o isolamento e a culminação de neurônios simpáticos de ratos embrionários da gânglio cervical superior. Também fornece protocolos detalhados para coloração imunocitoquímica e para preparação de extratos neuronais para análise espectrométrica em massa.
Abstract
Neurônios simpáticos da gânglio cervical superior de rato embrionário (SCG) têm sido usados como um sistema modelo in vitro para neurônios periféricos estudarem crescimento axonal, tráfico axonal, sinápgeno, crescimento dendrático, plasticidade dendrítica e interações de alvo nervoso em sistemas de cocultura. Este protocolo descreve o isolamento e dissociação de neurônios da gânglio cervical superior dos embriões de ratos E21, seguido pela preparação e manutenção de culturas neuronais puras em meio livre de soro. Como os neurônios não aderem ao plástico não revestido, os neurônios serão cultivados em tampas de vidro de 12 mm ou em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina. Após o tratamento com um agente antimitotico (Ara-C, citose β-D-arabinofuranoside), este protocolo gera culturas neuronais saudáveis com menos de 5% de células não neuronais, que podem ser mantidas por mais de um mês in vitro. Embora os neurônios SCG de ratos embrionários sejam multipolares com dendritos de 5-8 in vivo; sob condições livres de soro, esses neurônios estendem apenas um único axônio na cultura e continuam a ser unipolares durante a duração da cultura. No entanto, esses neurônios podem ser induzidos a estender dendritos na presença de extrato de membrana do porão, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), ou 10% de soro fetal da panturrilha. Essas culturas neuronais homogêneas podem ser utilizadas para coloração imunocitológica e para estudos bioquímicos. Este artigo também descreve o protocolo otimizado para coloração imunocitômica para microtúbulos associados à proteína-2 (MAP-2) nesses neurônios e para a preparação de extratos neuronais para espectrometria de massa.
Introduction
Neurônios simpáticos derivados de gânglios cervicais superiores embrionários (SCG) têm sido amplamente utilizados como um sistema de cultura neuronal primária para estudar muitos aspectos do desenvolvimento neuronal, incluindo a dependência do fator de crescimento, interações neurônio-alvo, sinalização neurotransmissor, crescimento axonal, desenvolvimento de dendrite e plasticidade, sinápsogênese e mecanismos de sinalização subjacentes às interações nervo-alvo/neurônio-glia1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. Apesar de seu pequeno tamanho (cerca de 10000 neurônios/gânglios), existem três razões principais para o desenvolvimento e uso extensivo desse sistema cultural serem i) sendo o primeiro gânglio na cadeia simpática, eles são maiores e, portanto, mais fáceis de isolar, do que o resto da gânglio simpático10; ii) ao contrário dos neurônios centrais, os neurônios no SCG são bastante homogêneos com todos os neurônios sendo derivados da crista neural, tendo um tamanho semelhante, dependência do fator de crescimento nervoso e sendo nor-adrenérgico. Isso os torna um modelo valioso para estudos morfológicos e genômicos10,,11 e iii) esses neurônios podem ser mantidos em um meio definido sem soro contendo fator de crescimento nervoso por mais de um mês10,12. Os neurônios SCG perinatal têm sido amplamente utilizados para estudar os mecanismos subjacentes à iniciação e manutenção dos dendritos2. Isso ocorre principalmente porque, embora os neurônios SCG tenham uma extensa arbor ndrítica in vivo, eles não estendem dendritos in vitro na ausência de soro, mas podem ser induzidos a cultivar dendritos na presença de certos fatores de crescimento, como proteínas morfogenéticas ósseas2,,12,,13.
Este artigo descreve o protocolo para isolar e culminar neurônios SCG de ratos embrionários. Nos últimos 50 anos, as culturas neuronais primárias do SCG têm sido utilizadas principalmente para estudos morfológicos com um número limitado de estudos examinando as mudanças genômicas ou proteômicas em larga escala. Isso se deve principalmente ao pequeno tamanho do tecido, resultando no isolamento de baixas quantidades de DNA ou proteína, o que dificulta a realização de análises genômicas e proteômicas nesses neurônios. No entanto, nos últimos anos, o aumento da sensibilidade à detecção permitiu o desenvolvimento de métodos para examinar o genoma, o miRNome e o proteome nos neurônios SCG durante o desenvolvimento do crescimento dendrítico14,,15,,16,17. Este artigo também descreverá o método de análise morfológica desses neurônios usando a imunocitoquímica e um protocolo para obter extratos de proteína neuronal para análise espectrométrica de massa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Saint Mary's College of California. As diretrizes de cuidado e uso de animais no Colégio Santa Maria foram desenvolvidas com base nas diretrizes fornecidas pelo Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial do Instituto Nacional de Saúde (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf e https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Preparação de meios culturais (também referido como meio de controle)
- Adicione os seguintes ingredientes, na ordem listada abaixo, a um frasco estéril de 500 mL: 190 mL de DMEM de baixa glicose 1x, 10 mL de 20 mg/mL de gárbio bovino livre de ácido bovino (FAF-BSA) em DMEM, 2,8 mL de 200 mM L-glutamina, 4 mL de 100x de mistura insulina-selênio-transferrina, 0,4 mL de 125 μg/mL fator de crescimento nervoso (em estabilizador de proteína inerte de 0,2% no DMEM), e 200 mL do meio F-12 de Ham.
- Certifique-se de revestir a pipeta com o meio contendo FAF-BSA antes da adição de soluções que contenham proteínas, como insulina-selênio-transferrina e NGF para evitar a aderência de proteínas à pipeta.
- Gire o frasco para misturar os ingredientes após cada adição. Misture bem com uma pipeta de 25 mL após a adição de F-12.
- Aliquot a mídia de cultura em alíquotas de 10 mL e armazene a -80 °C. As alíquotas podem ser armazenadas por seis meses sem perda de atividade.
2. Preparação de placas para cultivo de neurônios
- Diluir um estoque de 1 mg/mL de poli-D-lysine (feito em tampão tris de 0,5 M, pH 8) a 100 μg/mL com água destilada estéril.
- Para análise proteômica ou genômica, de um a dois dias antes da dissecção, cubra placas de 6 poços com aproximadamente 2 mL de estéril 100 g/mL de poli-D-lysine (PDL). Isso é necessário para garantir a adesão celular ao poço. Enrole as placas com filme agarrado e armazene as placas durante a noite a 4 °C.
- Para análise morfológica e microscopia, coloque 12 mm2 tampas de vidro alemães pré-tratadas (que podem ser limpas usando tratamento de ácido nítrico como descrito anteriormente18 ou comprado) em cada um dos poços de uma placa de 24 poços.
- Cubra as tampas com 0,3 mL de estéril 100 g/mL de poli-D-lisina (PDL). Armazene as placas durante a noite a 4 °C.
- No dia da dissecção, antes do início da dissecção, remova a solução de poli-D-lysine dos poços e enxágue os poços cinco vezes com água destilada estéril, seguida por uma vez com DMEM de baixa glicose.
- Durante a digestão enzimática do gânglio (aproximadamente uma hora antes de emplacamento das células), aspire o DMEM das placas e substitua-o por 0,3 mL de mídia de controle. Armazene as placas a 35,5 °C abaixo de 5% de CO2 em uma câmara umidificada.
3. Configuração de dissecação
- Preparação de 200 mL de mídia para dissecção (referida como mídia de dissecção)
- Adicione 8 mL de 20 mg/mL de gória bovina livre de ácidos graxos (FAF-BSA) em DMEM de baixa glicose (com 1 mg/mL de glicose) e 2 mL de penicilina-estreptomicina de 100x a 193 mL de meio L-15 estéril de Leibovitz (ou qualquer meio tampão de ar)
- No capô, configurar os seguintes itens para dissecção: quatro tubos cônicos estéreis de 50 mL com cerca de 20 mL de mídia de dissecção em cada tubo, quatro pratos estéreis de 35 mm com 1,5 mL de mídia de dissecção, um tubo conônico estéril de 50 mL com 20 mL de mídia de dissecção para centrifugação, estéril de 15 mL conical tubo para centrifugação da grália , e um tubo estéril de 10 mL para a coleta das células dissociadas.
- Use um esterilizador de contas seca para esterilizar um par de fórceps finos (no.4 ou nº 5 fórceps) por pelo menos um minuto.
4. Isolamento do gânglio cervical superior de filhotes de ratos embrionários
- Remoção de embriões E21 do rato gestante
NOTA: A remoção da buzina uterina pode ser realizada fora do capô se a área circundante estiver completamente esterilizada.- Eutanize o rato grávida usando inalação de CO2. Tesourar a pele da região abdominal e limpar a pele na área com 70% de álcool para esterilizá-la.
- Usando um conjunto fresco de tesouras estéreis e fórceps, corte a pele e, em seguida, a camada muscular para expor os chifres uterinos contendo os embriões. Remova os chifres uterinos com os embriões usando um novo conjunto de tesouras e fórceps, tomando cuidado para não danificar os intestinos no processo.
- Transfira os chifres uterinos com os embriões em uma placa de Petri estéril de 150 mm2 e transfira-os para o capô.
- Usando um novo conjunto de fórceps e tesouras, remova os embriões do chifre uterino e separe os embriões das membranas amnióticas e da placenta.
- Para eutanásia dos embriões, corte a medula espinhal dos embriões ao longo da linha média sob o braço direito. Isso também reduzirá o sangramento da artéria carótida durante a remoção do SCG.
- Transfira esses embriões para os tubos cônicos preparados de 50 mL contendo mídia de dissecção. Certifique-se de que os embriões estão submersos na mídia. Cada tubo pode conter até 3 embriões.
- Isolamento do gânglio cervical superior do embrião
- Transfira um filhote da mídia de dissecção para uma placa de Petri estéril de 150 mm2 meio cheia de substrato sólido (cera de parafina ou polímero de silicone), com sua superfície dorsal no substrato. Usando três agulhas estéreis de 23 G, fixe o filhote no prato com uma agulha sob cada braço e uma terceira agulha através da boca para hiperesturar cuidadosamente o pescoço.
- Corte a pele na região do pescoço usando fórceps finos estéreis (nº 4 ou nº 5 fórceps) para expor as glândulas salivares por baixo. Remova essas glândulas usando fórceps finos.
- Localize os músculos esternocleidomastoide e omoidóides perto da clavícula e traqueia, respectivamente. Primeiro corte os músculos esterocleidomastoides transversais e, em seguida, corte cuidadosamente o músculo omomóide fino usando fórceps finos. Uma vez removidos esses músculos, a bifurcação na artéria carótida na extremidade anterior será visível em ambos os lados da traqueia, com o SCG localizado sob este garfo na artéria carótida.
- Usando fórceps fechados, levante suavemente a artéria carótida para visualizar o SCG. Usando um fórceps em ambos os lados do SCG, retire a carótida e transfira-a para os pratos estéreis preparados de 35 mm2. Este tecido provavelmente conterá o SCG com a artéria carótida, o nervo vago com o gânglios de nodose, bem como outros segmentos de músculo ou gordura na área.
- Repita o processo de dissecção do outro lado. Remova os SCGs de todos os embriões antes de continuar com as etapas de dissecção restantes descritas abaixo. Distribua os tecidos isolados entre dois dos 35 mm2 pratos para facilitar o processamento das amostras de tecido.
- Pós-processamento do SCG
- Para separar o SCG do tecido dissecado, primeiro utilize fórceps finos para remover qualquer tecido ínteo, como gordura ou músculo, tomando cuidado para evitar a área próxima à bifurcação carótida.
- Uma vez que esses tecidos foram removidos, dois gânglios são visíveis. O gânglio de nodose é menor e circular, enquanto o SCG é em forma de amêndoa. Puxe suavemente o nervo vago para separar o nervo vago e o gânglios de nodose da carótida e, em seguida, separar o SCG da artéria carótida.
- Use fórceps finos para remover a cápsula que circunda o SCG. Transfira o SCG para um novo prato de cultura de 35 mm. Repita o processo com todas as amostras de tecido dissecada.
- Cubra uma pipeta de vidro esterilizada e plugada de algodão com mídia de dissecção para evitar que o tecido aduque nas paredes da pipeta. Use a pipeta para substituir a mídia de dissecção por estéril 2 mL de Collagenase tipo II (1 mg/mL)/dispase tipo II (5 mg/mL) em HBSS sem cálcio e magnésio, e incubar por 50 minutos a 37 °C para ajudar a quebrar os tecidos.
NOTA: O tempo de incubação pode precisar ser otimizado com diferentes lotes de Colagenase/Dispase e geralmente varia de 40 minutos a uma hora. - Durante a incubação, aspire o DMEM das placas e substitua-o por 0,3 mL de mídia de controle. Armazene as placas a 35,5 °C abaixo de 5% de CO2 em uma câmara umidificada.
- Após a incubação, transfira os SCGs em colagenase/dispase para um tubo cônico estéril de 15 mL. Use a mídia de dissecção para enxaguar as placas e transferir a solução para o tubo. Adicione mídia de dissecção suficiente para aumentar o volume para aproximadamente 10 mL.
- Centrifugar a 200 x g (1000 - 1200 rpm) por 5 minutos em temperatura ambiente para pelotar a amostra. Aspire o supernatante, tomando o cuidado de não desalojar a pelota. Resuspense a pelota com 10 mL de mídia de dissecção. Repita a centrifugação e descarte o supernatante.
- Substitua por 1 a 2 mL de meio de cultura. Usando uma pipeta pasteur estéril de ponta estreita e dobrada (pré-revestida com meio de cultura), dissociar mecanicamente as moitas triturando suavemente 5-6 vezes. Deixe os aglomerados maiores se contentarem por cerca de um minuto. Transfira a suspensão da célula supernante para um novo tubo de 10 mL.
- Repita este processo mais 3 vezes, com força crescente de trituração a cada vez para garantir a dissociação quase completa dos SCGs. Transfira o supernasce após cada rodada de trituração para um tubo de 10 mL com o sobrenante da primeira trituração.
- Adicione mídia cultural suficiente para aumentar o volume para 8 - 10 mL. Misture suavemente a suspensão celular e quantifique a densidade celular com um hemótmetro.
- Distribua a suspensão celular nos poços na densidade celular apropriada para os experimentos. Misture continuamente a suspensão da célula durante o processo de revestimento para garantir a distribuição uniforme das células nos poços.
NOTA: Para análise morfológica, as células emplaquem cerca de 8.000 células/poço em 24 placas de poço e para protocolos genômicos e proteômicos, emplaquem as células até 30.000 células/bem. - Transfira as placas para um desiccador de vidro com água estéril na parte inferior para criar uma câmara umidificada. Injete CO2 suficiente (cerca de 120 mL) para obter um ambiente de CO2 de 5% no desiccator, antes da vedação. Mantenha as placas a 35,5 °C. Isso é chamado de Dia 0 no protocolo.
NOTA: Essas placas também podem ser mantidas em uma incubadora regular de CO2 de 5%. O método descrito acima minimiza as mudanças de temperatura e pH e também ajuda a evitar a contaminação cruzada.
5. Manutenção dos neurônios e tratamentos SCG cultivados
- No dia 1 (24 horas após o revestimento), remova cuidadosamente metade da mídia cultural e substitua por 2 μM Ara-C (citosina β-D-arabinofuranoside, um agente anti-mitotístico). Deixe o tratamento nas células por 48 h. Normalmente, esse comprimento de tratamento é suficiente para eliminar células não neuronais na cultura.
- No dia 3, aspire suavemente metade do meio e substitua com meio de controle.
- No dia 4, as células estão prontas para tratamentos experimentais. Alimentar culturas a cada dois dias com o meio apropriado, substituindo suavemente metade do meio no poço por meio fresco.
- Neurônios SCG cultivados em meio livre de soro estendem apenas axônios. Se os experimentos requerem a presença de dendritos, trate as células com soro de bezerro fetal de 10%, 75-100 μg/mL de extrato de matriz de membrana do porão ou 50 ng/mL de proteína morfogenética óssea-7. O crescimento dendrático é observado dentro de 48 horas após o tratamento com arbor dendrítica elaborada observada dentro de uma semana de tratamento.
6. Imunostaining cultivar neurônios SCG
- Substitua gradualmente o meio de cultura celular no poço por 4% de paraformaldeído em tampão fosfato de 0,1 M, pH 7.2 em uma capa de fumaça.
- Remova metade da mídia cultural no poço e substitua-a suavemente por 4% de paraformaldeído. Em seguida, repita o processo pelo menos mais duas vezes, removendo dois terços da mídia no poço cada vez e substituindo por 4% de paraformaldeído. No final desse processo, a cor da mídia no poço deveria ter mudado de rosa para incolor.
- Uma vez que todo o meio tenha sido substituído por 4% de paraformaldeído, incubar os poços por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente.
- Com um processo semelhante ao descrito acima, substitua gradualmente a solução de paraformaldeído de 4% por soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS), pH 7.2. Deixe por 5 minutos. Enxágüe os poços mais duas vezes por 5 minutos cada com PBS.
- Uma vez removido o paraformaldeído de 4%, mova as placas para a bancada para posterior processamento. Este passo é um bom ponto de parada onde as placas podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite.
- Remova toda a PBS. Adicione volume suficiente de 0,1% Triton X-100 em PBS para cobrir as células. Deixe nas culturas por 5 minutos para permeabiliizar os neurônios. O momento desta etapa é fundamental para garantir uma boa coloração, mantendo a integridade das células.
- Remova cuidadosamente a solução Triton X-100 e enxágue os poços três vezes por 5 minutos cada vez com PBS. Remova a solução PBS.
- Adicione 5% de BSA suficiente no PBS para cobrir as células e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos para reduzir a ligação de anticorpos não específicos.
- Remova a solução de bloqueio e substitua-a por um anticorpo monoclonal do rato contra a proteína MAP-2 diluída em 5% de BSA no PBS. Deixe o anticorpo primário nas células durante a noite a 4 °C.
- Remova e salve o anticorpo primário para reutilização. O anticorpo primário pode ser reutilizado pelo menos duas vezes sem perda de intensidade de detecção.
- Enxágüe três vezes com PBS suficiente para cobrir as células. Deixe pbs nas células por 10 minutos por enxágue.
- Remova a solução PBS e substitua-a por anticorpo secundário anti-rato IgG de cabra conjugado fluorescente a 1:1000 diluição em 5% de BSA no PBS. Incubar por 2 horas no escuro à temperatura ambiente.
- Remova o anticorpo secundário e substitua-o por PBS. Enxágüe os poços três vezes com PBS por 10 minutos por enxágue. Enxágüe os poços uma vez com água para remover os sais.
- Monte as tampas em lâminas de vidro contendo uma gota de montário aquoso que é apropriado para amostras fluorescentes rotuladas. Armazene os slides a 4 °C, em uma pasta de slides até estar pronto para a imagem.
7. Preparação amostral para análise do proteome utilizando cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa
- Lise de neurônios cultivados
- Remova suavemente todos os meios de comunicação culturais dos poços. Substitua-o por soro fisiológico frio, estéril e sem fosfato livre de fosfato (PBS), pH 7.4. Retire rapidamente e substitua com PBS e deixe descansar por 5 minutos. Este passo é feito para remover quaisquer proteínas presentes na mídia cultural.
- Remova cuidadosamente todo o PBS de todos os poços para um tratamento específico. Repita o processo mais uma vez. Mantenha placas sobre gelo ao lise as células para minimizar danos neuronais e proteólise.
- Adicione 100 - 150 μL de 50 mM de bicarbonato de amônio, pH 7.5 (NH4HCO3) a um dos poços e raspar células usando um raspador de células estéril. Usando uma micropipette, transfira o líquido e repita o processo de raspagem com todos os poços para um tratamento específico. Examine os poços sob o microscópio depois de raspar para ter certeza de que a maioria das células foram removidas.
- Com o baixo número de neurônios, use um volume limitado para lise as células para garantir alta concentração suficiente para análise proteômica.
- Congele a solução a -80 °C durante a noite para ajudar com a lise celular. Os lises podem ser armazenados nesta fase até estarem prontos para posterior processamento.
- Uma vez descongelado, esguiche as amostras através de uma seringa com uma agulha de 26 G ou 28 G para lise mecanicamente as células.
- Sonicar as amostras em um banho de água sônica duas vezes por 10 minutos. Adicione gelo ao banho de água para evitar superaquecimento e desnaturação de proteínas. Centrífuga por 5 minutos a 4 °C a 12.000 x g.
- Meça a concentração de proteínas. As concentrações típicas de proteína variam de 0,4 a 1 μg/μL
- Preparação da amostra e digestão de trippsina para análise de proteome
- Transfira um máximo de 60 μL do lysate ou 50 μg de proteína em um tubo DNase-, RNase e sem protease de 1,5 mL. Se o volume do lysato for inferior a 60 μL, adicione bicarbonato de amônio suficiente de 50 mM para compensar o volume.
- Adicione 25 μL de 0,2% de surfactante labile ácido e vórtice. Incubar o tubo em um aquecedor de bloco a 80 °C por 15 minutos. Centrifugar o tubo a 12.000 x g para 30 s.
- Adicione 2,5 μL de dithiothiothreitol e vórtice de 100 mM. Isso torna a proteína mais acessível para alquilação e digestão. Incubar o tubo a 60 °C em um aquecedor de bloco por 30 minutos. Esfrie a temperatura ambiente e centrífuga.
- Adicione 2,5 μL de iodoacetamida de 300 mM à amostra e vórtice. Este passo ajuda a aquilar os cisteínas e os impede de reformar os laços de dissulfeto. Incubar os tubos à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.
- Adicione trippsina de grau de espectrometria de massa (0,5 μg/μL) ao tubo em uma trippsina: razão proteica de 1:10. Digerir as amostras a 37 °C durante a noite.
- Adicione 10 μL de ácido trifluoroacético de 5% (TFA) e vórtice. Incubar as amostras a 37 °C por 90 minutos. Esta etapa é necessária para hidrolisar o surfactante labile ácido para evitar interferência durante a espectrometria de massa.
- Centrifugar as amostras a 12.000 x g a 4 °C por 30 minutos e transferir supernasal para um frasco de vidro transparente certificado pela cromatografia com tampas de teflon/silicone pré-fenda. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C antes da análise da espectrometria de massa.
- Submeter os frascos de amostra à cromatografia líquida, juntamente com espectrometria de massa de alta definição.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolar e manter culturas neuronais de neurônios SCG embrionários
As células dissociadas do SCG embrionário de rato foram banhadas em uma placa revestida de poli-D-lisina ou deslizamento de cobertura e mantidas em meios de cultura livre de soro contendo fator de crescimento b-nervo. As células dissociadas contendo uma mistura de neurônios e células gliais parecem circulares sobre o revestimento(Figura 1A). Dentro de 24 horas após o revestimento, os neurônios estendem pequenos processos axonais com células gliais achatando e aparecendo fase-escura sob microscopia de contraste de fase(Figura 1B). Após o tratamento com Ara-C, 99% das células gliais são eliminadas e as culturas contêm células predominantemente neuronais com corpo de células ovais, crescimento axonal extenso e sem dendritos(Figura 1C).
Coloração imunocitoquímica de neurônios gânglios cervicais superiores de ratos embrionários
Estudos anteriores mostraram que neurônios simpáticos cultivados em meio livre de soro estendem apenas axônios e só estendem uma árvore dendrítica elaborada na presença de extrato de membrana de porão, 10% de soro ou 50 ng/mL proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7)2,12. De acordo com essas observações, a microscopia de contraste de fase mostra que os neurônios cultivados na presença de BMP-7 (50 ng/mL) durante 5 dias têm um corpo celular achatado com múltiplos processos afilados espessos quando comparados aos neurônios cultivados em mídia de controle livre de soro(Figura 2). A identidade desses processos como dendritos é confirmada pela presença do MAP-2, uma proteína citoesquelletal predominantemente encontrada no corpo celular e dendritos19,20. Em condições de controle, a coloração fluorescente para MAP-2 é observada dentro do citoplasma e dos axônios proximais e excluída do núcleo (como evidenciado pela co-rotulagem com uma mancha nuclear para visualizar o núcleo (Figura 3A-3D). Após o tratamento com BMP-7 a 50 ng/mL por 5 dias, a imunoreatividade para MAP-2 é observada não só no citoplasma, mas também em dendritos (Figura 3E-3H).
Amostra de análise proteômica de neurônios SCG cultivados cultivados em mídia de controle
Os neurônios simpáticos aos ratos E21 foram cultivados na mídia de controle por 6 dias in vitro, líseticos e submetidos à análise de LC-MS. A amostra foi realizada em três réplicas do espectrômetro de massa e as proteínas foram identificadas com base no número de peptídeos fragmentados observados para cada amostra. A abundância das proteínas (variando de 0 a mais de 300000 unidades arbitrárias) e o escore de confiança para iD proteico com base no número de peptídeos fragmentados observados para cada proteína (variando de 5 a 500) foi calculado. Um conjunto de dados amostrais da análise espectrométrica de massa do proteome de 30 μg de proteína de neurônios SCG cultivados em mídia de controle livre de soro é mostrado na Figura 4.
Foram detectados 13.134 peptídeos na amostra que corresponderam a 1287 proteínas. Destes, 1100 estavam presentes nas três réplicas técnicas com valores de abundância normalizados superiores a 500. Dessas 1100 proteínas, 90 proteínas foram identificadas pela presença de um único golpe de peptídeo, que cobria apenas uma pequena porção da proteína. Portanto, foi difícil determinar se a identificação estava correta e essas proteínas apresentaram baixo escore de confiança proteica (escore <10). Essas proteínas foram eliminadas da análise e as 1010 proteínas restantes foram ainda mais analisadas usando ontologia genética para determinar se o protocolo foi bem sucedido na detecção de proteínas com diferentes localização e função.
A análise de ontologia genética deste conjunto de dados foi realizada utilizando-se o banco de dados de classificação pantera (http://www.pantherdb.org/) para determinar se esse conjunto de dados incluía proteínas com diferentes localizações celulares ou funções moleculares e biológicas e para examinar se havia conexões entre as proteínas identificadas e as vias conhecidas21. A análise mostrou que, embora mais de 700 proteínas fossem citoplasmáticas, esse conjunto de dados continha proteínas localizadas em outras regiões da célula, incluindo o núcleo, a membrana, várias organelas celulares e junções celulares(Figura 4A). A análise também revelou que mais de 400 proteínas tinham atividade catalítica, e cerca de 300 proteínas estavam envolvidas em vias de sinalização (Figura 4B e Figura 4C). Além disso, o conjunto de dados continha proteínas envolvidas em várias vias de sinalização. A Tabela 1 mostra cinco das proteínas em sinalização de proteína G, adesão celular, caminho de sinalização de fator de crescimento e vias de tráfico de vesículas sinápticas, respectivamente, que foram identificadas no conjunto de dados.
Figura 1: Mudanças na morfologia dos neurônios SCG embrionários de ratos E21 cultivados ao longo do tempo. As imagens de microscopia de contraste de fase representativa em 10x de ampliação de células dissociadas do rato E21 SCG 20 min após o revestimento(A),um dia após o revestimento(B) e após 48 horas de tratamento Ara-C (5 dias após o revestimento)(C). Note a presença de células gliais (setas) e extensão axonal (pontas de seta) em (B), e ausência de células gliais e neurônios mostrando crescimento axonal extenso em (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alterações na morfologia neuronal dos neurônios SCG de ratos E21 após o tratamento com BMP-7. Após a eliminação de células não neuronais, os neurônios SCG cultivados foram tratados com mídia de controle (A) ou BMP-7 a 50 ng/mL (B) por 5 dias. Micrografos de contraste de fase representativo (ampliação de 10x) mostram o corpo celular neuronal circular com axônios em neurônios de controle(A) e neurônios com múltiplos processos curtos semelhantes ao dendrito quando tratados com BMP-7 (setas, B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imunostaining para proteína MAP-2 em neurônios embrionários cultivados de ratos embrionários. Após a eliminação de células não neuronais, os neurônios SCG cultivados foram tratados com mídia de controle (A-D) ou BMP-7 a 50 ng/mL(E-H) por 5 dias e imunossuados usando um anticorpo monoclonal de rato contra MAP-2 e co-rotulado com um marcador nuclear. Micrografos representativos que mostram a coloração imunocitômica dos neurônios com proteína associada a microtúbulos-2 (MAP-2)(C,G),uma mancha nuclear(D,H) com micrografias de contraste de fase(B,F)e uma fusão dos três canais(A,E). A coloração imunocitômica para microtúbulos associados à proteína-2 está presente no corpo celular e nos axônios proximais dos neurônios de controle (C)e coloração para proteína MAP-2 no corpo celular e dendritos em neurônios tratados BMP-7(G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Classificação e distribuição de proteínas identificadas na análise proteome dos neurônios SCG de ratos E21 cultivados. As IDs proteicas das 1100 proteínas foram submetidas à análise de ontologia genética no sistema de classificação pantera para examinar a distribuição de proteínas nos dados definidos em relação à localização celular(A),função celular e processos biológicos em que estavam envolvidos (B) e classe de função molecular baseada na estrutura proteica(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| A) Proteínas envolvidas na adesão biológica | ||
| ID de adesão uniprot | Nome genético | Símbolo genético |
| Q9Z1Y3 | Cadherin-2 | Cdh2 |
| O35112 | Antígeno CD166 | Alcam |
| P49134 | Integrin beta-1 | Itgb1 |
| D3ZES7 | Plexin A4 | Plxna4 |
| F1LP44 | Subunidade integrin alfa L | Itgal |
| B) Proteínas envolvidas na sinalização de fatores de crescimento | ||
| P35213 | 14-3-3 proteína beta/alfa | Ywhab |
| Q5BJ92 | Fosfattase 4 subunidade catalítica de serina/threonina 4 catalítico | Ppp4c |
| P47196 | Rac – proteína alfa serina/threonina quinase | Akt1 |
| P62994 | Proteína ligada ao receptor de fator de crescimento 2 | Grb2 |
| P21708 | Quinase de proteína ativada por mitogênio 3 | Mapk3 |
| C) Proteínas envolvidas na via de sinalização acoplado à proteína G | ||
| P08753 | Proteína de ligação de nucleotídeos de guanina G(k) subunidade alfa | Gnai3 |
| D4ABV5 | Calmodulin-2 | Calma2 |
| P18266 | Glycogen synthase kinase-3 beta | Gsk3b |
| P09456 | cAMP-dependente proteína quinase tipo I-alfa subunidade regulatória | Prkar1a |
| P53534 | Fosforilase glicógeno | Pygb (forma cerebral) |
| D) Proteínas envolvidas no tráfico de vesículas sináptica | ||
| P47861 | Sinaptotagmin-5 | Syt5 |
| P63045 | Proteína de membrana associada à vesícula 2 | Vamp2 |
| P61265 | Sintaxin-1B | Stx1b |
| Q63537 | Sinapsin-2 | Syn2 |
| P60881 | Proteína associada à sinapstosômica 25 | Snap25 |
Tabela 1: Proteínas representativas identificadas nos dados proteome de neurônios SCG embrionários de ratos cultivados, classificados por suas funções biológicas. Os dados proteome com as 1100 proteínas foram submetidos à análise de ontologia genética utilizando o sistema de classificação Pantera. Listas abaixo estão as cinco principais proteínas identificadas para quatro vias biológicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este artigo descreve os protocolos para cultivar neurônios simpáticos de gânglios cervicais superiores de filhotes de ratos embrionários. As vantagens de utilizar esse sistema modelo são que é possível obter uma população homogênea de neurônios fornecendo uma resposta semelhante aos fatores de crescimento, e como os requisitos do fator de crescimento para esses neurônios têm sido bem caracterizados, é possível cultivar esses neurônios in vitro em meios definidos, sob condições livres de soro10. Embora o protocolo descreva o processo de isolamento do SCG de filhotes de ratos E21, este protocolo pode ser usado para dissecção de SCG de filhotes de ratos de E17 a E21 e para dissecção do rato embrionário SCG10,,22,23. Este protocolo de dissecção também pode ser usado para isolar SCG de ratos pós-natais com pequenas modificações nas etapas iniciais. Essas modificações incluem a eliminação da necessidade de cesariana, eutanásia dos animais pós-natal usando dióxido de carbono e esterilização dos filhotes pós-natais após a eutanásia por imersão dos filhotes em 70% de álcool, antes de transferi-los para a mídia de dissecção10. Este protocolo de cultivo neuronal também pode ser adaptado para o estudo de orientação axonal, transporte axonal e formação de sinapse usando câmaras Campenot e câmaras microfluídicas24,25. Esses neurônios também podem ser co-cultivados com neurônios da gânglio raiz dorsal ou neurônios motores espinhais ou com cardiomiócitos para estudar as interações neuronais e neurônios – interações de alvo no sistema nervoso periférico26,,27,,28,29.
O uso de neurônios SCG cultivados para estudos imunocitológicos está bem documentado. O protocolo descrito no artigo fornece um bom ponto de partida para trabalhar com a maioria dos anticorpos. No entanto, existem anticorpos, como aqueles que detectam proteínas nucleares que podem exigir uma modificação no protocolo de fixação e protocolo de permeabilização. No caso do anticorpo fosfo-SMAD, o tratamento com 100% de metanol a -20 °C tem sido utilizado para fixação e permeabilização dos neurônios30,31.
As principais limitações de trabalhar neste sistema modelo decorrem do pequeno tamanho de SCGs em filhotes de ratos embrionários, o que resulta em um pequeno número de neurônios. Isso resulta em uma quantidade limitada de ácidos nucleicos ou proteínas que podem ser obtidos a partir da dissecção de uma ninhada de filhotes. Isso pode ser problemático para análise genômica e proteômica, especialmente quando se compara entre múltiplos tratamentos em uma dissecção. Além disso, não é possível obter culturas neuronais SCG a partir de um único embrião. Todos os experimentos são, portanto, realizados em amostras agrupadas que são obtidas do SCG de todos os embriões de ratos em uma ninhada. Outra limitação do sistema é que os neurônios SCG têm menor eficiência de transfecção de DNA (10 - 20%, observações inéditas) e maior toxicidade após a transfecção em comparação com os neurônios centrais32. Embora essa eficiência de transfecção seja boa para estudos morfológicos com neurônios individuais, é difícil realizar estudos moleculares ou bioquímicos para detectar/confirmar alterações na expressão genética.
No entanto, nos últimos anos, os neurônios SCG cultivados têm sido utilizados para estudos que examinam os mecanismos subjacentes ao crescimento dendrítico e para as análises transcriptome e miRNome14,,15,,33. Como indicado anteriormente, devido à baixa quantidade de proteínas, neurônios cultivados do SCG embrionário não foram utilizados anteriormente para análise proteômica. Este protocolo e resultados representativos fornecem evidências de que, mesmo com baixa concentração de amostras, os instrumentos atuais de espectrometria de massa de alta definição poderiam ser usados para estudos proteômicos sobre esses neurônios. Embora o protocolo de preparação da amostra descrito aqui seja para neurônios SCG, este protocolo pode ser usado para a preparação de qualquer amostra com baixa concentração proteica para análise de LC-MS. Uma das limitações é que pequenas variações na concentração proteica ou eficiência da digestão da trippsina podem resultar em fragmentação incompleta e uma diminuição dramática no número de proteínas detectadas pela LC-MS. Portanto, é fundamental garantir que as concentrações de proteínas iniciais sejam tão próximas de 50 μg com uma proporção de proteína de 10:1: trippsina. Além disso, é uma boa prática aliquotar a trippsina de grau espectrometria de massa para evitar múltiplos ciclos de congelamento.
Outra limitação do protocolo é que havia apenas um número limitado de proteínas transmembranas detectadas no proteome. Embora o surfactante labile ácido tenha se mostrado um surfactante eficaz para espectrometria de massa, um estudo prévio sobre células cultivadas descobriu que esses surfactantes podem aumentar ligeiramente o número de proteínas citoplasmáticas e diminuir as proteínas da membrana no perfil proteômico34. Além disso, foi sugerido que a pré-digestão usando uma endopeptidase bacteriana como Lys-C, antes da digestão de trippsina pode melhorar a eficiência da digestão de trippsina de proteínas ligadas à membrana e impedir que os fragmentos de proteína de membrana sejam retidos nas colunas LC35.
Em resumo, este artigo fornece protocolos detalhados para o cultivo de neurônios embrionários embrionários de ratos cultivados e para a realização de estudos morfológicos e proteômicos sobre esses neurônios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Desenvolvimento da Faculdade e pelo Programa de Pesquisa de Verão do Saint Mary's College of California. Os autores também gostariam de agradecer à Dra. Os autores também gostariam de agradecer Haley Nelson no Escritório de Comunicações Universitárias do Saint Mary's College of California por sua ajuda na produção e edição de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
