Summary
В этой статье описывается изоляция и культивирование эмбриональных крыс симпатической нейронов от высшего ганглиев шейки матки. Он также предоставляет подробные протоколы для иммуноцитохимического окрашивания и для подготовки нейрональных экстрактов для масс-спектрометрического анализа.
Abstract
Симпатические нейроны из эмбриональной крысы выше цервикальных ганглиев (SCG) были использованы в качестве модели системы in vitro для периферических нейронов для изучения аксонального роста, аксонального оборота, синаптогенеза, дендритного роста, дендритной пластичности и нервно-целевого взаимодействия в системах совместной культуры. Этот протокол описывает изоляцию и диссоциацию нейронов от высших ганглиев шейки матки эмбрионов крысы E21, а затем подготовку и поддержание чистых нейронных культур в сыворотке свободной среде. Так как нейроны не придерживаются пластика без покрытия, нейроны будут культурированы либо на 12 мм стеклянных крышки или 6-хорошо пластин, покрытых поли-D-лизин. После лечения антимитотическим агентом (Ara-C, цитозин-D-арабинофуранозид), этот протокол генерирует здоровые нейронные культуры с менее чем 5% не-нейрональных клеток, которые могут поддерживаться в течение месяца в пробирке. Хотя эмбриональные нейроны SCG крысы являются многополярные с 5-8 дендритов в виво; в условиях, свободных от сыворотки, эти нейроны распространяются только на один аксон в культуре и продолжают быть однополярной в течение всего периода культуры. Тем не менее, эти нейроны могут быть вызваны продлить дендритов в присутствии экстракта мембраны подвала, кости морфогенетических белков (BMPs), или 10% плода икроножной сыворотки. Эти однородные нейронные культуры могут быть использованы для иммуноцитохимического окрашивания и для биохимических исследований. В этой статье также описывается оптимизированный протокол для иммуноцитохимического окрашивания микротрубочек, связанных с белком-2 (MAP-2) в этих нейронах и для подготовки нейрональных экстрактов для масс-спектрометрии.
Introduction
Симпатические нейроны, полученные из эмбриональных превосходных ганглиев шейки матки (SCG) широко используются в качестве основной системы нейронной культуры для изучения многих аспектов развития нейронов, включая зависимость фактора роста, нейронно-целевые взаимодействия, нейромедиатор сигнализации, аксональный рост, дендрит развития и пластичности, синаптогенез и сигнальныемеханизмы,лежащие в основе нервно-целевой / нейрон-глиивзаимодействий 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Несмотря на их небольшой размер (около 10000 нейронов / ганглиев), Есть три основные причины для развития и широкого использования этой системы культуры я) является первым ганглиев в симпатической цепи, они больше, и, следовательно, легче изолировать, чем остальные симпатическойганглиев 10; ii) в отличие от центральных нейронов, нейроны в SCG довольно однородны со всеми нейронами, получаемыми из нервного гребня, имеющие аналогичный размер, зависимость от фактора роста нерва и быть ни-adrenergic. Это делает их ценной моделью для морфологическихи геномных исследований 10,,11 и iii) эти нейроны могут поддерживаться в определенной среде, свободной от сыворотки, содержащей фактор роста нервовв течение месяца 10,12. Перинатальные нейроны SCG широко используются для изучения механизмов, лежащих в основе инициации и поддержания дендритов2. Это главным образом потому, что, хотя SCG нейроны имеют обширные дендритные беседки in vivo, они не расширяют дендритов в пробирке в отсутствиесыворотки,но могут быть вызваны расти дендриты в присутствии определенных факторов роста, таких как кости морфогенетических белков2,12,13.
В этой статье описывается протокол для изоляции и культивирования эмбриональных нейронов SCG крыс. За последние 50 лет, первичные нейронные культуры из SCG были в основном использованы для морфологических исследований с ограниченным числом исследований изучения крупномасштабных геномных или протеомных изменений. Это в основном связано с небольшим размером ткани, что приводит к изоляции низкого количества ДНК или белка, что затрудняет проведение геномного и протеомного анализа этих нейронов. Тем не менее, в последние годы повышенная чувствительность обнаружения позволила разработать методы для изучения генома, miRNome и протеома в нейронах SCG во время дендритного развития роста14,,15,,16,17. Эта статья также будет описывать метод морфологического анализа этих нейронов с использованием иммуноцитохимии и протокол для получения экстрактов нейронального белка для масс-спектрометрического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, проведенные в исследованиях с участием животных, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными (IACUC) в Колледже Святой Марии в Калифорнии. Руководящие принципы по уходу за животными и их использованию в колледже Святой Марии были разработаны на основе руководящих принципов, представленных Управлением лабораторного защиты животных в Национальном институте здравоохранения (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf и https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Подготовка культурных средств массовой информации (также именуемых средством контроля)
- Добавьте следующие ингредиенты, в порядке, перечисленном ниже, в стерильную колбу 500 мл: 190 мл 1x низко глюкозы DMEM, 10 мл 20 мг/мл жирных кислот, свободных от крупного рогатого скота альбумин (FAF-BSA) в DMEM, 2,8 мл 200 мМ L-глутамина, 4 мл 100-х инсулин-селениум-трансферрин смеси, 0,4 мл 125 мкг/мл фактора роста нерва (в 0,2% инертного стабилизатора белка в ДМЭМ) и 200 мл F-12 среды Хама.
- Убедитесь в том, чтобы покрыть пипетку со средой, содержащей FAF-BSA до добавления белково-содержащих растворов, таких как инсулин-селениум-трансферрин и NGF, чтобы предотвратить прилипание белков к пипетке.
- Закружить колбу, чтобы смешать ингредиенты после каждого добавления. Тщательно смешайте с 25 мл пипетки после добавления F-12.
- Aliquot культуры средств массовой информации в 10 мл aliquots и хранить при -80 градусов по Цельсию. Алициты могут храниться в течение шести месяцев без потери активности.
2. Подготовка пластин для культивирования нейронов
- Разбавить 1 мг/мл поли-Д-лизина (сделано в буфере 0,5 М Трис, рН 8) до 100 мкг/мл стерильной дистиллированной водой.
- Для протеомного или геномного анализа, за один-два дня до вскрытия, пальто 6-хорошо пластин с примерно 2 мл стерильных 100 г/мл поли-D-лизина (PDL). Это необходимо для обеспечения присадения клеток к колодецу. Оберните пластины пленкой и храните тарелки на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Для морфологического анализа и микроскопии поместите 12 мм2 предварительно обработанные немецкие стеклянные крышки (которые можно очистить с помощью азотной кислоты,как описано ранее 18 или приобрели) в каждой из скважин 24-хорошо пластины.
- Пальто крышки с 0,3 мл стерильных 100 г/мл поли-D-лизина (PDL). Храните тарелки на ночь при 4 градусах Цельсия.
- В день вскрытия, перед началом вскрытия, удалите раствор поли-Д-лизина из колодцев и промойте колодцы пять раз стерильной дистиллированной водой, а затем один раз с низким содержанием глюкозы DMEM.
- Во время энзиматического пищеварения ганглиев (примерно за час до покрытия клеток), аспирировать DMEM из пластин и заменить его на 0,3 мл средств управления. Храните тарелки при 35,5 градусов по Цельсию под 5% CO2 в увлажненной камере.
3. Установка вскрытия
- Подготовка 200 МЛ средств массовой информации для вскрытия (именуемого сми вскрытия)
- Добавьте 8 мл 20 мг/мл жирных кислот, свободных от крупного рогатого скота альбумин (FAF-BSA) в низким содержанием глюкозы DMEM (с 1 мг/мл глюкозы) и 2 мл 100x пенициллин-стрептомицин 193 мл стерильной Лейбовиц l-15 среды (или любой воздушно-буферной среды)
- В капоте установлены следующие предметы для вскрытия: четыре 50 мл стерильных конических трубок с около 20 мл препарирования в каждой трубке, четыре стерильные 35-мм посуды с 1,5 мл препарирования, одна стерильная коническая трубка 50 мл с 20 мл препарирования для центрифугации, одна стерильная 15 мл конической трубки для центрирования банды , и одна стерильная 10 мл трубки для сбора диссоциированных клеток.
- Используйте сухой стерилизатор шарика для стерилизации пары тонких типсов (No.4 или No. 5 типсов) в течение по крайней мере одной минуты.
4. Изоляция высших ганглиев шейки матки от эмбриональных щенков крыс
- Удаление эмбрионов Е21 у беременной крысы
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление рога матки может быть выполнено за пределами капота, если окружающая территория тщательно стерилизована.- Усывляйте беременную крысу с помощьюингаляции CO 2. Смять мех из брюшной полости и протрите кожу в области с 70% алкоголя, чтобы стерилизовать его.
- Используя свежий набор стерильных ножниц и типсов, прорезать кожу, а затем мышечный слой, чтобы разоблачить рога матки, содержащие эмбрионы. Удалите рога матки с эмбрионами с помощью нового набора ножниц и типсов, заботясь, чтобы не повредить кишечник в этом процессе.
- Перенесите рога матки с эмбрионами в 150 мм2 стерильные чашки Петри и передать их в капюшон.
- Используя новый набор типсов и ножниц, удалить эмбрионы из рога матки и отделить эмбрионы от амниотических мембран и плаценты.
- Чтобы усытворить эмбрионы, перережьте спинной мозг эмбрионов вдоль средней линии под правой рукой. Это также уменьшит кровотечение из сонной артерии во время удаления SCG.
- Перенесите эти эмбрионы в подготовленные 50 мл конические трубки, содержащие средства вскрытия. Убедитесь, что эмбрионы погружены в средства массовой информации. Каждая трубка может в течение 3 эмбрионов.
- Изоляция высшего шейного ганглиона от эмбриона
- Перенесите одного щенка из средств вскрытия на стерильную 150 мм2 чашку Петри, наполовину наполненную твердым субстратом (парафиновым воском или силиконовым полимером), с его спинной поверхностью на субстрате. Используя три стерильные 23 G иглы, приколоть щенка к блюду с одной иглой под каждой рукой и третьей иглой через рот, чтобы тщательно hyperextend шеи.
- Вырезать через кожу в области шеи с помощью стерильных тонких типсов (No 4 или no. 5 типсов), чтобы разоблачить слюнных желез под ним. Удалите эти железы с помощью тонких типсов.
- Найдите стерноклеидомастоид и омохиоидные мышцы вблизи ключицы и трахеи, соответственно. Сначала вырезать поперечные стерноклеидомастоидные мышцы, а затем тщательно сократить тонкие омохиоидные мышцы с помощью тонких миппов. Как только эти мышцы будут удалены, бифуркация в сонной артерии на передней части будет видна по обе стороны трахеи, с SCG расположен под этой вилкой в сонной артерии.
- Используя закрытые типсы, аккуратно поднимите сонную артерию, чтобы визуализировать SCG. Используя один типс по обе стороны от SCG, вытащить сонной артерии и передать его в подготовленные стерильные 35 мм2 блюда. Эта ткань, скорее всего, содержат SCG с сонной артерии, блуждающий нерв с кинозной ганглиев, а также другие сегменты мышц или жира в этом районе.
- Повторите процесс вскрытия с другой стороны. Удалите SCGs из всех эмбрионов, прежде чем продолжить оставшиеся шаги вскрытия, изложенные ниже. Распределить изолированные ткани между двумя из 35 мм2 посуды для облегчения обработки образцов тканей.
- После обработки SCG
- Чтобы отделить SCG от расчлененной ткани, сначала используйте тонкие миппы для удаления любых посторонних тканей, таких как жир или мышцы, заботясь, чтобы избежать области вблизи сонной бифуркации.
- После того, как эти ткани были удалены, два ганглиев видны. Кинозный ганглия меньше и круглая, в то время как SCG имеет миндалевидную форму. Аккуратно потяните на блуждающий нерв, чтобы отделить блуждающий нерв и кинозные ганглии от сонной артерии, а затем отделить SCG от сонной артерии.
- Используйте тонкие типсы, чтобы удалить капсулу, которая окружает SCG. Перенесите SCG на новое 35-мм культурное блюдо. Повторите процесс со всеми вскрытых образцов тканей.
- Пальто стерилизованной, хлопок подключен стеклянный пипетка с вскрытием средств, чтобы предотвратить ткани от прилипления к стенки пипетки. Используйте пипетку, чтобы заменить средства вскрытия стерильными 2 мл коллагеназы типа II (1 мг/мл)/dispase типа II (5 мг/мл) в hbSS без кальция и магния, и инкубировать в течение 50 мин при 37 градусах Цельсия, чтобы помочь сломать ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубацио время, возможно, потребуется оптимизировать с различными партиями коллагеназы / dispase и, как правило, колеблется от 40 минут до часа. - Во время инкубации, аспирировать DMEM от пластин и заменить его на 0,3 мл средств управления. Храните тарелки при 35,5 градусов по Цельсию под 5% CO2 в увлажненной камере.
- После инкубации перенесите SCG в коллагеназу/диспазу в стерильную коническую трубку 15 мл. Используйте средства вскрытия для полоскания пластин и передачи раствора в трубку. Добавьте достаточное количество средств вскрытия, чтобы увеличить громкость примерно до 10 мл.
- Центрифуга при температуре 200 х г (1000 - 1200 об/мин) в течение 5 минут при комнатной температуре гранулировать образец. Аспирировать супернатанта, заботясь, чтобы не выбить гранулы. Переусердуйте гранулы с 10 мл средств вскрытия. Повторите центрифугу и отбросьте супернатант.
- Заменить 1 - 2 мл культуры среды. Используя узкоствольную, согнутую стерильную пастерную пипетку (предварительно покрытую культурной средой), механически разобщает сгустки, мягко тритурируя 5-6 раз. Пусть большие сгустки оседают около одной минуты. Перенесите супернатантную клеточную подвеску в новую трубку 10 мл.
- Повторите этот процесс еще 3 раза, с увеличением силы тритурации каждый раз, чтобы обеспечить почти полную диссоциацию SCGs. Передача супернатанта после каждого раунда тритурации в 10 мл трубки с супернатантом от первой тритурации.
- Добавьте достаточное количество культурных медиа, чтобы увеличить громкость до 8 - 10 мл. Аккуратно смешайте подвеску клетки и количественно плотность клеток с гемоцитометром.
- Распределив подвеску клетки в скважины при соответствующей плотности клеток для экспериментов. Смешайте подвеску клетки постоянно во время процесса покрытия, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток в скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для морфологического анализа, пластины клеток около 8000 клеток / хорошо в 24 пластины и для геномных и протеомных протоколов, пластины клеток выше, чем 30000 клеток / хорошо. - Перенесите пластины в стеклянный децикатор со стерильной водой внизу, чтобы создать увлажняемую камеру. Ввисьдостаточное количество CO 2 (около 120 мл), чтобы получить 5% CO2 окружающей среды в децикаторе, до уплотнения. Поддерживайте пластины при 35,5 градусов по Цельсию. В протоколе это называется Днем 0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пластины также могут поддерживаться в обычном инкубаторе CO2 5%. Описанный выше метод сводит к минимуму изменения температуры и рН, а также помогает предотвратить перекрестное загрязнение.
5. Поддержание культурных нейронов SCG и методов лечения
- На 1-й день (через 24 часа после покрытия), тщательно удалить половину культуры средств массовой информации, и заменить 2 ЗМ Ара-С (цитозин З-D-арабинофуранозид, антимитотический агент). Оставьте лечение на клетках на 48 ч. Как правило, эта продолжительность лечения достаточна для устранения не нейрональных клеток в культуре.
- На 3-й день аккуратно аспирировать половину среды и заменить средством управления.
- На 4-й день клетки готовы к экспериментальному лечению. Кормите культуры через день соответствующей средой, мягко заменяя половину среды в колодец свежей средой.
- Культурные нейроны SCG в среде, свободной от сыворотки, распространяются только на аксоны. Если эксперименты требуют наличия дендритов, лечить клетки либо 10% фетальной сыворотки теленка, 75-100 мкг/мл экстракта мембранной матрицы подвала или 50 нг/мл костного морфогенетического белка-7. Дендритный рост наблюдается в течение 48 часов после лечения с помощью сложной дендритической беседки, наблюдаемой в течение недели после лечения.
6. Иммуностинирование культурных нейронов SCG
- Постепенно заменить клеточной культуры среды в хорошо с 4% параформальдегида в 0,1 М фосфат буфера, рН 7,2 в капоте дыма.
- Удалите половину культурных средств массовой информации в колодец и заменить его мягко с 4% paraformaldehyde. Затем повторите процесс по крайней мере еще два раза, удалив две трети средств массовой информации в хорошо каждый раз и заменив 4% paraformaldehyde. В конце этого процесса, цвет средств массовой информации в хорошо должны были измениться с розового на бесцветный.
- После того, как вся среда была заменена на 4% параформальдегида, инкубировать скважины в течение 15 - 20 минут при комнатной температуре.
- При аналогичном процессе, как описано выше, постепенно заменяем 4% параформальдегидный раствор фосфатно-буферным солевым раствором (PBS), рН 7.2. Оставьте на 5 минут. Промыть скважины еще два раза в течение 5 минут каждый с PBS.
- После того, как 4% параформальдегид удаляется, переместить пластины на скамейку для дальнейшей обработки. Этот шаг является хорошей точкой остановки, где пластины могут храниться при 4 градусов по Цельсию на ночь.
- Удалите все PBS. Добавьте достаточное количество 0,1% Triton X-100 в PBS, чтобы покрыть клетки. Оставьте его на культурах в течение 5 минут, чтобы пронизать нейроны. Сроки этого шага имеет решающее значение для обеспечения хорошего окрашивания при сохранении целостности клеток.
- Тщательно удалите раствор Triton X-100 и промойте скважины три раза в течение 5 минут каждый раз с помощью PBS. Удалите решение PBS.
- Добавьте достаточно 5% BSA в PBS, чтобы покрыть клетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы уменьшить неспецифические связывания антител.
- Удалите блокирующий раствор и замените его моноклональным антителом мыши против белка MAP-2, разбавленного 5% BSA в PBS. Оставьте первичное антитело на клетках на ночь при 4 градусов по Цельсию.
- Удалите и сохраните первичное антитело для повторного использования. Первичные антитела могут быть повторно использованы по крайней мере дважды без потери интенсивности обнаружения.
- Промыть три раза с достаточным PBS, чтобы покрыть клетки. Оставьте PBS на клетках на 10 минут на полоскание.
- Удалите решение PBS и замените его флуоресцентным тегом спряженных Коза анти-мышь IgG вторичного антитела на 1:1000 разбавления в 5% BSA в PBS. Инкубировать в течение 2 часов в темноте при комнатной температуре.
- Удалите вторичное антитело и замените его PBS. Промыть скважины три раза с PBS в течение 10 минут на полоскание. Промыть колодцы один раз с водой, чтобы удалить любые соли.
- Намонтайте крышки на стеклянные горки, содержащие каплю аквозного монтатора, который подходит для флуоресцентно помеченных образцов. Храните слайды при 4 градусов по Цельсию в папке слайдов до готовности к визуализации.
7. Пример подготовки к анализу протеома с использованием жидкой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией
- Лиз культурных нейронов
- Аккуратно удалите все культурные средства массовой информации в колодцах. Замените его холодным, стерильным кальцием и без магния фосфатным солевым раствором (PBS), рН 7.4. Удалить быстро и заменить PBS и дайте ему сидеть в течение 5 минут. Этот шаг сделан для удаления любых белков, присутствующих в культурных средствах массовой информации.
- Тщательно удалите все PBS из всех скважин для конкретного лечения. Повторите процесс еще раз. Поддерживайте пластины над льдом при облизывания клеток, чтобы свести к минимуму повреждения нейронов и протеолиза.
- Добавьте 100 - 150 МКЛ из 50 мм бикарбоната аммония, рН 7,5 (NH4HCO3) водну из скважин и соскребли клетки с помощью стерильного клеточного скребка. Используя микропипюту, перенесите жидкость и повторите процесс выскабливания со всеми скважинами для конкретной обработки. Изучите скважины под микроскопом после соскабливания, чтобы убедиться, что большинство клеток были удалены.
- При низком количестве нейронов, использовать ограниченный объем, чтобы подлизить клетки, чтобы обеспечить достаточно высокую концентрацию для протеомного анализа.
- Заморозить раствор при -80 градусов по Цельсию на ночь, чтобы помочь с лизом клеток. Лисаты могут храниться на данном этапе до готовности к дальнейшей обработке.
- После размораживания, шприц образцов через шприц с 26 G или 28 G иглы механически лизать клетки.
- Sonicate образцы в sonicating водяной бане два раза в течение 10 минут. Добавьте лед в водяную баню, чтобы предотвратить перегрев и денатурацию белков. Центрифуга в течение 5 минут при 4 градусов по Цельсию при 12000 х г.
- Измерьте концентрацию белка. Типичные концентрации белка варьируются от 0,4 до 1 мкг/л
- Пример подготовки и переваривания трипсина для протеомного анализа
- Перенесите максимум 60 мкл лизата или 50 мкг белка в DNase-, RNase- и протеазную трубку объемом 1,5 мл. Если объем лизоля составляет менее 60 мкл, добавьте достаточно 50 мм бикарбоната аммония, чтобы составить объем.
- Добавьте 25 МКЛ из 0,2% кислотного лабильного сурфакта и вихря. Инкубировать трубку в блок нагреватель при 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Центрифуга трубки на 12000 х г на 30 с.
- Добавьте 2,5 мл дитиотреитола 100 мМ и вихря. Это делает белок более доступным для алкиляции и пищеварения. Инкубировать трубку при 60 градусов по Цельсию в блок нагреватель в течение 30 минут. Охладить до комнатной температуры и центрифуги.
- Добавьте 2,5 МЛ 300 мМ иодоацетамида в образец и вихрь. Этот шаг помогает алкилат цистеинам и предотвращает их реформирование дисульфидных связей. Инкубировать трубки при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
- Добавьте трипсин масс-спектрометрии (0,5 мкг/йл) в трубку при трипсине: соотношение белка 1:10. Пере дайджест образцов при 37 градусов по Цельсию на ночь.
- Добавьте 10 МКЛ из 5% трифтороатетической кислоты (ТФА) и вихря. Инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию в течение 90 минут. Этот шаг необходим для гидролизовки кислотного лабильного сурфакта для предотвращения помех во время масс-спектрометрии.
- Центрифуга образцов на 12000 х г при 4 кк в течение 30 минут и передачи супернатанта в хроматографии сертифицированных чистый стеклянный флакон с предварительной щели тефлон / силиконовые перегородки шапки. g Образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию до анализа масс-спектрометрии.
- Подайм пробные флаконы к жидкой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокой четкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляция и поддержание нейронных культур эмбриональных нейронов SCG
Диссоциированные клетки от крыс эмбриональной SCG были покрыты в поли-D-лизин покрытием пластины или coverslip и поддерживается в сыворотке свободной культуры средств массовой информации, содержащей B-нерв фактор роста. Диссоциированные клетки, содержащие смесь нейронов и глиальных клеток, выглядят круглыми на покрытие(рисунок 1A). В течение 24 часов после покрытия, нейроны расширяют небольшие аксональные процессы с глиальными клетками уплощения и появляются фазо-темные под фазовой контрастноймикроскопии (рисунок 1B). После лечения Ара-С, 99% глиальных клеток устранены и культуры содержат преимущественно нейронные клетки с овальным телом клеток, обширный аксональный рост и без дендритов (Рисунок 1C).
Иммуноцитохимическое окрашивание культурных эмбриональных крыс превосходных нейронов цервикальных ганглиев
Предыдущие исследования показали, что культурные симпатические нейроны, выращенные в среде, свободной от сыворотки, распространяются только аксонами и только расширяют сложную дендритную беседку в присутствии экстракта мембраны подвала, 10% сыворотки или 50 нг/мл костного морфогенетического белка-7 (BMP-7)2,12. В согласии с этими наблюдениями, фазовая контрастная микроскопия показывает, что нейроны, выращенные в присутствии BMP-7 (50 нг/мл) в течение 5 дней, имеют сплющенное клеточное тело с несколькими толстыми конические процессы по сравнению с нейронами, выращенными в сывороточно-свободных средствахуправления (рисунок 2). Идентичность этих процессов как дендритов подтверждается наличием MAP-2, цитоскелетного белка, преимущественно найденного в клеточном организме, идендритов 19,,20. В условиях контроля флуоресцентное окрашивание для MAP-2 наблюдается в цитоплазме и проксимальных аксонах и исключается из ядра (о чем свидетельствует коклекание с ядерным пятном для визуализации ядра(рисунок 3A-3D). После лечения БМП-7 при 50 нг/мл в течение 5 дней иммунореактивность ДЛЯ МАП-2 наблюдается не только в цитоплазме, но и вдендритах (рисунок 3E-3H).
Пример протеомного анализа культурных нейронов SCG, выращенных в средствах управления
E21 крыс симпатической нейронов были культурны в средствах управления в течение 6 дней в пробирке, lysed и подвергаются анализу LC-MS. Образец был запущен в трех репликациях на масс-спектрометре, и белки были определены на основе количества фрагментированных пептидов, наблюдаемых для каждого образца. Было рассчитано обилие белков (от 0 до более чем 300000 произвольных единиц) и оценка доверия к идентификатору белка на основе количества фрагментированных пептидов, наблюдаемых для каждого белка (от 5 до 500). Выборочный набор данных из масс-спектрометрического анализа протеома 30 мкг белка из нейронов SCG, обузначаемых в средствах управления без сыворотки, показан на рисунке 4.
В образце было обнаружено 13 134 пептида, которые соответствовали 1287 белкам. Из них 1100 из них присутствовали во всех трех технических тиражах с нормализованным изобилием значений, более 500. Из этих 1100 белков, 90 белков были определены наличием одного пептидного хита, который покрывал лишь небольшую часть белка. Таким образом, было трудно определить, если идентификация была правильной, и эти белки имели низкий балл доверия белка (оценка Lt;10). Эти белки были исключены из анализа, а остальные 1010 белков были дополнительно проанализированы с помощью генной онтологии, чтобы определить, был ли протокол успешным в обнаружении белков с различной локализацией и функцией.
Генно-онтологический анализ этого набора данных был выполнен с использованием базы данных классификации Panther (http://www.pantherdb.org/), чтобы определить, если этот набор данных включены белки с различными клеточной локализации или молекулярно-биологических функций и изучить, существуют ли связи между выявленными белками и известныхпутей 21. Анализ показал, что, хотя более 700 белков были цитоплазмическими, этот набор данных содержал белки, которые были локализованы в других регионах клетки, включая ядро, мембрану, несколько клеточных органелл и клеточных соединений(рисунок 4A). Анализ также показал, что более 400 белков имели каталитической активности, и около 300 белков были вовлечены в сигнальных путей(рисунок 4B и рисунок 4C). Кроме того, набор данных содержал белки, участвующие в различных сигнальных путях. Таблица 1 показывает пять белков в G-белковой сигнализации, клеточной адгезии, факторе роста, сигнализирующих о пути, и синаптических путях торговли пузырьками, соответственно, которые были определены в наборе данных.
Рисунок 1: Изменения в морфологии культурных E21 крыс эмбриональных нейронов SCG с течением времени. Представитель фазы контрастной микроскопии изображения при 10x увеличении диссоциированных клеток от E21 крысы SCG 20 мин после покрытия (A), на следующий день после покрытия (B) и после 48 часов лечения Ara-C (5 дней после покрытия) (C). Обратите внимание на наличие глиальных клеток (стрелки) и аксонального расширения (наконечники стрел) в(B),и отсутствие глиальных клеток и нейронов, показывающих обширный аксональный рост в (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Изменения в нейрональной морфологии E21 крысы SCG нейронов после лечения BMP-7. После ликвидации не нейрональных клеток, культурные нейроны SCG были обработаны средствами управления (A) или BMP-7 при 50 ng/mL (B) в течение 5 дней. Репрезентативные фазовые контрастные микрографы (увеличение в 10 раз) показывают круговое тело нейрональной клетки с аксонами в контрольных нейронах(A)и нейронами с несколькими короткими дендритными процессами при лечении BMP-7 (стрелки, B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Иммуностимулятор для белка MAP-2 в культурных эмбриональных крыс симпатических нейронов. После ликвидации не нейрональных клеток, культурные нейроны SCG лечились с помощью средств управления (A-D) или BMP-7 на 50 нг/мл (E-H) в течение 5 дней и иммунотонных с помощью мыши моноклональных антител против MAP-2 и совместно помечены с ядерным маркером. Репрезентативные микрографы, показывающие иммуноцитохимическое окрашивание нейронов с помощью микротрубочек, связанных с белком-2 (MAP-2) (C,G), ядерноепятно (D,H) с микрографами фазовогоконтраста (B,F)и слиянием трех каналов (A,E). Иммуноцитохимическое окрашивание микротрубочек, связанных с белком-2, присутствует в клеточном организме и проксимальных аксонах контрольных нейронов(С)и окрашивание белка MAP-2 в клеточном организме и дендритов в обработанных BMP-7 нейронах(G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Классификация и распределение белков, выявленных в протеомном анализе культурных нейронов E21 крыс SCG. Белковые IDs для 1100 белков были подвергнуты генно-онтологический анализ на системе классификации пантеры для изучения распределения белков в наборе данных в отношении клеточной локализации(A ), клеточной функции и биологических процессов, в которых они были вовлечены ( B ) имолекулярнойфункции класса на основе структуры белка (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| A) Белки, участвующие в биологической адгезии | ||
| Идентификатор присоединения UniProt | Имя гена | Символ гена |
| 9'1Y3 | Кадхерин-2 | Cdh2 |
| O35112 | Антиген CD166 | Alcam |
| P49134 | Интегрин бета-1 | Itgb1 |
| D3ЗЕС7 | Плексин А4 | Plxna4 |
| F1LP44 | Подразделение Integrin альфа L | Итгал |
| B) Белки, участвующие в сигнализации фактора роста | ||
| P35213 | 14-3-3 белка бета/альфа | Иваб |
| 5BJ92 | Серин/Трионин-белок фосфатазы 4 каталитический субъединит | Ppp4c |
| P47196 | Рак — альфа-серин/триониновый протеин киназа | Акт1 |
| P62994 | Рецептор фактора роста связанный протеин 2 | Grb2 |
| P21708 | Митоген-активированная белковая киназа 3 | Mapk3 |
| C) Белки, участвующие в G-белковых соединенных сигнальных путей | ||
| P08753 | Гуанин нуклеотид-связывающий белок G(k) субъединица альфа | Гнай3 |
| D4ABV5 | Кальводулин-2 | Спокойствие2 |
| P18266 | Гликоген синтаза киназы-3 бета | Gsk3b |
| P09456 | cAMP-зависимый протеин kinase тип I-альфа регулятивное subunit | Prkar1a |
| P53534 | Фосфорилаза гликогена | Пигб (форма мозга) |
| D) Белки, участвующие в синаптической торговле пузырьками | ||
| P47861 | Синаптотагмин-5 | Syt5 |
| P63045 | Везикул-ассоциированный мембранный белок 2 | Вамп2 |
| P61265 | Синтаксин-1B | Stx1b |
| No63537 | Синапсин-2 | Syn2 |
| P60881 | Синептосомный белок 25 | Snap25 |
Таблица 1: Репрезентативные белки, идентифицированные в данных протеома из культурных эмбриональных нейронов SCG крыс, классифицированных по их биологическим функциям. Данные протеома с 1100 белками подверглись генно-онтологический анализ с использованием системы классификации пантеры. Ниже перечислены пять лучших белков, идентифицированных для четырех биологических путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья описывает протоколы для культивирования симпатических нейронов от превосходных ганглиев шейки матки эмбриональных щенков крыс. Преимущества использования этой модели системы в том, что можно получить однородную популяцию нейронов, обеспечивающих аналогичную реакцию на факторы роста, и так как требования фактора роста для этих нейронов был хорошо охарактеризован, можно выращивать эти нейроны in vitro в определенных средствах массовой информации, в условиях, свободных отсыворотки 10. Хотя протокол описывает процесс изоляции SCG от E21 крыс щенков, этот протокол может быть использован для вскрытия SCG от крыс щенков от E17 до E21 и для вскрытия эмбриональной мыши SCG10,22,23. Этот протокол вскрытия также может быть использован для изоляции SCG от послеродовых крыс с незначительными изменениями в начальных шагах. Эти изменения включают устранение необходимости кесарева сечения, эвтаназия послеродовых животных с использованием двуокиси углерода, и стерилизация послеродовых щенков после эвтаназии путем погружения щенков в 70% алкоголя, до передачи их в вскрытие средствмассовой информации 10. Этот протокол культивирования нейронов также может быть адаптирован для изучения аксонального руководства, аксонального транспорта и формирования синапса с помощью камер Campenot и микрофлюидныхкамер 24,,25. Эти нейроны также могут быть совместно культуры с нейронами из спинного корня ганглиев или спинномозговых моторных нейронов или с кардиомиоцитов для изучения нейронных взаимодействий и нейронов - целевые взаимодействия впериферической нервной системе 26,27,28,29.
Использование культурных нейронов SCG для иммуноцитохимических исследований хорошо документировано. Протокол, описанный в документе, является хорошей отправной точкой для работы с большинством антител. Тем не менее, есть антитела, такие как те, которые обнаруживают ядерные белки, которые могут потребовать изменения протокола фиксации и протокола промеабилизации. В случае фосфо-SMAD антитела, лечение 100% метанола при -20 градусов по Цельсию был использован для фиксации и permeabilizingнейронов 30,31.
Основные ограничения работы в этой модели системы вытекают из небольшого размера SCGs в эмбриональных щенков крыс, что приводит к небольшому количеству нейронов. Это приводит к ограниченному количеству нуклеиновых кислот или белка, которые могут быть получены от вскрытия одного помета щенков. Это может быть проблематичным для геномного и протеомного анализа, особенно при сравнении между несколькими лечениями в одном вскрытии. Кроме того, невозможно получить SCG нейронных культур из одного эмбриона. Поэтому все эксперименты проводятся на объединяются образцы, которые получены из SCG всех эмбрионов крыс в помете. Другим ограничением системы является то, что scg нейроны имеют более низкую эффективность трансфекции ДНК (10 - 20%, неопубликованные наблюдения) и более высокую токсичность после трансфекции по сравнению с центральныминейронами 32. Хотя эта эффективность трансфекции отлично подаем на морфологические исследования с отдельными нейронами, трудно проводить молекулярные или биохимические исследования для обнаружения/подтверждения изменений экспрессии генов.
Тем не менее, в последние годы, культурные нейроны SCG были использованы для изучения механизмов, лежащих в основе дендритного роста и для транскриптома и miRNomeанализы 14,15,33. Как указывалось ранее, из-за низкого количества белка, культурные нейроны из эмбриональных SCG ранее не использовались для протеомного анализа. Этот протокол и репрезентативные результаты свидетельствуют о том, что даже при низкой концентрации образцов, текущие инструменты массы высокой четкости массы могут быть использованы для протеомных исследований на этих нейронах. Хотя протокол подготовки образца, описанный здесь для нейронов SCG, этот протокол может быть использован для подготовки любого образца с низкой концентрацией белка для анализа LC-MS. Одним из ограничений является то, что небольшие колебания концентрации белка или эффективности пищеварения трипсина могут привести к неполной фрагментации и резкому сокращению количества белков, обнаруженных LC-MS. Поэтому крайне важно обеспечить, чтобы начальная концентрация белка была как можно ближе к 50 мкг при соотношении белка 10:1: трипсина. Кроме того, это хорошая практика, чтобы aliquot масс-спектрометрии класса трипсина для предотвращения нескольких циклов замораживания оттепели.
Еще одним ограничением протокола является то, что в протеоме было обнаружено лишь ограниченное количество трансмембранных белков. В то время как кислотный половый приверактант был показан как эффективный сурфактант для массовой спектрометрии, предыдущее исследование на культурных клетках показало, что эти сурфактанты могут немного увеличить количество цитоплазмических белков и уменьшить мембранные белки в протеомномпрофиле 34. Кроме того, было высказано предположение, что предварительное переваривание с использованием бактериальной эндопптидазы, такие как Lys-C, до усвоения трипсина может повысить эффективность переваривания трипсина мембранных белков и предотвратить мембранные фрагменты белка от сохранения на LC колонки35.
Таким образом, в настоящем документе приводятся подробные протоколы для выращивания культурных крыс эмбриональных симпатических нейронов и для выполнения морфологических и протеомных исследований на этих нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом развития факультета и грантом Летней исследовательской программы в Колледже Святой Марии в Калифорнии. Авторы также хотели бы поблагодарить д-ра Памелу Лейн (Pamela Lein) из Калифорнийского университета в Дэвисе и д-ра Энтони Иавароне (Anthony Iavarone) из Калифорнийского университета в Беркли за их советы в ходе разработки этих протоколов. Авторы также хотели бы поблагодарить Хейли Нельсон в Управлении коммуникаций колледжа в колледже Сент-Мэри в Калифорнии за ее помощь в производстве видео и редактирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
