Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Culturing Rotte sympatiske neuroner fra Embryonic Superior Cervical Ganglia for morfologisk og proteomisk analyse

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61283

Summary

Dette papir beskriver isolation og dyrkning af embryonale rotte sympatiske neuroner fra den overlegne livmoderhalskræft ganglier. Det giver også detaljerede protokoller for immunokytokemiske farvning og til forberedelse af neuronale ekstrakter til massespektrometrisk analyse.

Abstract

Sympatiske neuroner fra embryonale rotte overlegen cervikal ganglier (SCG) er blevet brugt som en in vitro model system for perifere neuroner til at studere axonal vækst, axonal handel, synaptogenesis, dendritisk vækst, dendritisk plasticitet og nerve-target interaktioner i co-kultur systemer. Denne protokol beskriver isolering og dissociation af neuroner fra den overlegne cervikale ganglier af E21 rotte embryoner, efterfulgt af forberedelse og vedligeholdelse af ren neuronal kulturer i serum-fri medium. Da neuroner ikke overholder ubestrøget plast, neuroner vil blive dyrket på enten 12 mm glas coverslips eller 6-brønd plader belagt med poly-D-lysin. Efter behandling med et antimitotisk middel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside) genererer denne protokol sunde neuronale kulturer med mindre end 5% ikke-neuronale celler, som kan vedligeholdes i over en måned in vitro. Selv om embryonale rotte SCG neuroner er multipolære med 5-8 dendrites in vivo; under serumfrie forhold strækker disse neuroner kun en enkelt aknoson i kulturen og fortsætter med at være unipolar under hele kulturen. Men, disse neuroner kan induceres til at udvide dendritter i overværelse af kælderen membran ekstrakt, knogle morfoogenetiske proteiner (BMPPs), eller 10% føtal kalv serum. Disse homogene neuronale kulturer kan anvendes til immunokokemisk farvning og til biokemiske undersøgelser. Dette papir beskriver også optimeret protokol for immunokyokemisk farvning for mikrotubule associeret protein-2 (MAP-2) i disse neuroner og til fremstilling af neuronal ekstrakter til massespektrometri.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sympatiske neuroner afledt af embryonale overensne cervikale ganglier (SCG) har været meget udbredt som en primær neuronal kultur system til at studere mange aspekter af neuronal udvikling, herunder vækstfaktor afhængighed, neuron-target interaktioner, neurotransmitter signalering, axonal vækst, dendrite udvikling og plasticitet, synaptogenesis og signalering mekanismer underliggende nerve-target/neuron-glia interaktioner1,,2,,3,4,5,6,7,8,9. På trods af deres lille størrelse (ca. 10000 neuroner/ ganglier), er der tre hovedårsager til udviklingen og omfattende brug af dette kultursystem er i) er den første ganglier i den sympatiske kæde, de er større, og derfor lettere at isolere, end resten af den sympatiske ganglia10; ii) i modsætning til centrale neuroner, neuroner i SCG er temmelig homogen med alle de neuroner, der stammer fra den neurale våbenskjold, der har en lignende størrelse, afhængighed af nerve vækstfaktor og er heller ikke-adrenerge. Dette gør dem til en værdifuld model for morfologiske og genomiskeundersøgelser 10,11 og iii) disse neuroner kan opretholdes i et defineret serumfrit medium, der indeholder nervevækstfaktor i over enmåned 10,12. Perinatal SCG neuroner er blevet flittigt brugt til at studere de mekanismer, der ligger til grund for initiering og vedligeholdelse af dendritter2. Dette skyldes primært, selv om SCG neuroner har en omfattende dendritisk arbor in vivo, de ikke udvide dendritter in vitro i mangel af serum, men kan induceres til at vokse dendritter i nærvær af visse vækstfaktorer såsom knogle morfoogenetiske proteiner2,12,13.

Dette papir beskriver protokollen for isolering og dyrkning embryonale rotte SCG neuroner. I løbet af de sidste 50 år har primære neuronale kulturer fra SCG hovedsagelig været anvendt til morfologiske undersøgelser med et begrænset antal undersøgelser, der undersøger de store genomiske eller proteomiske forandringer. Dette skyldes hovedsagelig lille vævsstørrelse, hvilket resulterer i isolering af små mængder DNA eller protein, hvilket gør det vanskeligt at udføre genomiske og proteomiske analyser af disse neuroner. Men i de seneste år, øget påvisning følsomhed har gjort det muligt at udvikle metoder til at undersøge genom, miRNome og proteome i SCG neuroner under dendritisk vækst udvikling14,15,16,17. Dette papir vil også beskrive metoden til morfologisk analyse af disse neuroner ved hjælp af immunokytokemi og en protokol til at opnå neuronal protein ekstrakter til massespektrometrisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle forsøg udført i undersøgelser, der involverer dyr blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Saint Mary's College of California. Retningslinjerne for dyrepleje og -anvendelse på Saint Mary's College blev udviklet på grundlag af de retningslinjer, der blev fastsat af Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf and https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1. Udarbejdelse af kulturmedier (også kaldet kontrolmedium)

  1. Der tilsættes følgende ingredienser i den nedenfor anførte rækkefølge til en steril 500 mL-kolbe: 190 ml 1x dmem med lavt glukose, 10 ml 20 mg/ml fedtsyrefrit kvægserumalbumin (FAF-BSA) i DMEM 2,8 ml L-glutamin på 200 mM, 4 ml 100x insulin-selen-transferrin blanding, 0,4 ml 125 μg/ml nervevækstfaktor (i 0,2 % inert proteinstabilisator i DMEM) og 200 ml af Hams F-12-medie.
  2. Sørg for at belægge pipetten med det medium, der indeholder FAF-BSA, før der tilsætning af proteinholdige opløsninger som insulin-selen-transferrin og NGF for at forhindre stikning af proteiner til pipetten.
  3. Kolben hvirvles om for at blande ingredienserne efter hver tilsætning. Bland grundigt med en 25 ml pipette efter tilsætning af F-12.
  4. Aliquot kulturmedierne i 10 ml aliquots og opbevares ved -80 °C. De aliquots kan opbevares i seks måneder uden tab af aktivitet.

2. Fremstilling af plader til dyrkning af neuroner

  1. En 1 mg/ml-beholdning af poly-D-lysin (fremstillet i 0,5 M Tris buffer, pH 8) til 100 μg/ml med sterilt destilleret vand.
  2. Til proteomisk eller genomisk analyse, en til to dage før dissektionen, pels 6-brønd plader med ca 2 ml steril 100 g/ml poly-D-lysin (PDL). Dette er nødvendigt for at sikre celle vedhæftning til brønden. Pladerne ombrydes med plastfolie, og pladerne opbevares natten over ved 4 °C.
  3. Til morfologisk analyse og mikroskopi skal der sættes 12 mm2 forbehandlede tyske glasdæksler (som kan rengøres ved hjælp af salpetersyrebehandling som beskrevet tidligere18 eller købes) i hver af brøndene på en 24-brøndplade.
    1. Betræksæberne belægges med 0,3 ml sterilt 100 g/ml poly-D-lysin (PDL). Pladerne opbevares natten over ved 4 °C.
  4. På dissektionsdagen fjernes poly-D-lysinopløsningen fra brøndene, før dissektionens begyndelse påbegyndes, og brøndene skylles fem gange med sterilt destilleret vand efterfulgt af en gang med lav glukose DMEM.
  5. Under enzymatisk fordøjelse af ganglier (ca. en time før plating cellerne), aspirere DMEM fra pladerne og erstatte det med 0,3 ml kontrolmedier. Pladerne opbevares ved 35,5 °C under 5% CO2 i et befugtet kammer.

3. Dissektion setup

  1. Udarbejdelse af 200 ml medier til dissektion (kaldet dissektionsmedier)
    1. Der tilsættes 8 ml 20 mg/ml fedtsyrefrit kvægserumalbumin (FAF-BSA) i DMEM med lavt glukose (med 1 mg/ml glukose) og 2 ml 100x penicillin-streptomycin til 193 ml steril Leibovitz's L-15 medium (eller ethvert luftbue buffermedie)
  2. I emhætten skal du opstille følgende elementer til dissektion: fire 50 ml sterile koniske rør med ca. 20 ml dissektionsmedier i hvert rør, fire sterile 35 mm retter med 1,5 ml dissektionsmedier, et sterilt 50 ml konisk rør med 20 ml dissektionsmedier til centrifugering, et sterilt 15 ml konisk rør til centrifugering af gangaltre og et sterilt 10 ml rør til opsamling af de dissocierede celler.
  3. Brug en tør perle sterilisator til at sterilisere et par fine kraftforladelser (nr. 4 eller ingen. 5 kraftæcessiver) i mindst et minut.

4. Isolering af den overlegne cervikale ganglier fra embryonale rotteunger

  1. Fjernelse af E21-embryoner fra den drægtige rotte
    BEMÆRK: Fjernelse af livmoderhornet kan udføres uden for hætten, hvis det omgivende område er grundigt steriliseret.
    1. Aflive den drægtige rotte ved hjælp af CO2 indånding. Forskydning pelsen fra maveregionen og tør huden i området med 70% alkohol til at sterilisere det.
    2. Ved hjælp af et nyt sæt sterile saks og scepinter, skæres gennem huden og derefter muskellaget til at udsætte livmoderhorn, der indeholder embryoner. Fjern livmoderhornene med embryonerne ved hjælp af et nyt sæt saks og spinces, idet man skal passe på ikke at beskadige tarmene i processen.
    3. Overfør livmoderhornene med embryonerne i en 150 mm2 steril petriskål, og overfør dem i emhætten.
    4. Ved hjælp af et nyt sæt af snævler og saks, fjerne embryoner fra livmoderen horn og adskille embryoner fra fosterhinderne og moderkagen.
    5. For at aflive embryonerne skal embryonerne skæres i rygmarven langs midterlinjen under højre arm. Dette vil også reducere blødningen fra halspulsåren under fjernelsen af SCG.
    6. Disse embryoner overføres til de tilberedte 50 ml koniske rør, der indeholder dissektionsmedier. Sørg for, at embryonerne er nedsænket i medierne. Hvert rør kan rumme op til 3 embryoner.
  2. Isolering af den overlegne cervikal ganglion fra fosteret
    1. Overfør en hvalp fra dissektionsmediet på en steril 150 mm2 petriskål, der er halvt fyldt med fast substrat (enten paraffin- eller silikonepolymer) med dens rygoverflade på underlaget. Brug tre sterile 23 G nåle, pin hvalpen til fadet med en nål under hver arm og en tredje nål gennem munden til omhyggeligt hyperextend halsen.
    2. Skær gennem huden i halsregionen ved hjælp af sterile fine hæcener (nr. 4 eller nr. 5 stænt) for at eksponere spytkirtlerne nedenunder. Fjern disse kirtler ved hjælp af fine stakt.
    3. Find sternocleidomastoid og omohyoid muskler nær kravebenet og luftrør, henholdsvis. Først skæres de tværgående sternocleidomastoid muskler og derefter forsigtigt skære den tynde omohyoid muskel ved hjælp af fine sceft. Når disse muskler er fjernet, bifurcation i halspulsåren på den forreste ende vil være synlig på begge sider af luftrøret, med SCG placeret under denne gaffel i halspulsåren.
    4. Ved hjælp af lukkede snæv, løft forsigtigt halspulsåren for at visualisere SCG. Brug en hæces på hver side af SCG, træk carotis og overføre den til den forberedte sterile 35 mm2 retter. Dette væv vil højst sandsynligt indeholde SCG med halspulsåren, vagus nerve med løkken ganglier samt andre segmenter af muskler eller fedt i området.
    5. Gentag dissektionsprocessen på den anden side. Fjern SKUL'er fra alle embryoner, før du fortsætter med de resterende dissektionstrin, der er beskrevet nedenfor. Fordel det isolerede væv mellem to af de 35 mm2 retter for at lette behandlingen af vævsprøverne.
  3. Efterbehandling af SCG
    1. For at adskille SCG fra det dissekerede væv skal du først bruge fine kraftaffæcener til at fjerne uvedkommende væv, såsom fedt eller muskler, idet du skal passe på at undgå området nær carotisbifurcation.
    2. Når disse væv er blevet fjernet, to ganglier er synlige. Den løkke ganglion er mindre og cirkulær, mens SCG er mandel-formet. Træk forsigtigt på vagus nerve at adskille vagus nerve og nodose ganglier fra carotis og derefter adskille SCG fra halspulsåren.
    3. Brug fine kraftæcessiver til at fjerne kapslen, der omgiver SCG. Overfør SCG til en ny 35 mm kulturskål. Gentag processen med alle de dissekeret vævsprøver.
    4. Coat en steriliseret, bomuld tilsluttet glas pipette med dissektion medier for at forhindre vævet i at holde sig til pipette vægge. Brug pipetten til at erstatte dissektionsmediet med sterile 2 ml kollagen type II (1 mg/ml)/dispase type II (5 mg/ml) i calcium- og magnesiumfri HBSS, og inkubere i 50 min ved 37 °C for at hjælpe med at nedbryde vævene.
      BEMÆRK: Inkubationstiden skal muligvis optimeres med forskellige partier af Collagenase/Dispase og varierer normalt fra 40 min til en time.
    5. Under inkubationen aspirere DMEM fra pladerne og erstatte det med 0,3 ml kontrolmedier. Pladerne opbevares ved 35,5 °C under 5% CO2 i et befugtet kammer.
    6. Efter inkubationen overføres SG'erne i kollagen/dispas til et sterilt konisk rør på 15 ml. Brug dissektionsmediet til at skylle pladerne og overføre opløsningen til røret. Tilføj nok dissektionsmedier til at få lydstyrken op til ca. 10 ml.
    7. Centrifuge ved 200 x g (1000 - 1200 omdr./min.) i 5 minutter ved stuetemperatur for at pellete prøven. Inspirer supernatanten, og pas på ikke at løsne pellet. Opspæle pellet med 10 ml dissektionsmedier. Centrifugering gentages, og supernatanten kasseres.
    8. Udskift med 1 - 2 ml kulturmedium. Ved hjælp af en smal-boring, bøjet-tip sterilpacker pipette (pre-belagt med kultur medium), mekanisk adskille klumper ved forsigtigt triturating 5-6 gange. Lad de større klumper nøjes med omkring et minut. Overfør supernatantcelleaffjedringen til et nyt 10 ml rør.
    9. Gentag denne proces 3 gange mere, med stigende kraft af trituration hver gang for at sikre næsten fuldstændig dissociation af SCGs. Overfør supernatanten efter hver runde af trituration til et 10 ml rør med supernatanten fra den første trituration.
    10. Tilføj nok kultur medier til at opdrage lydstyrken til 8 - 10 ml. Bland forsigtigt celleaffjedringen og kvantificer celletætheden med et hæmocytometer.
    11. Fordel cellesuspensionen i brøndene ved den relevante celletæthed for forsøgene. Bland celleaffjedringen kontinuerligt under plating-processen for at sikre en jævn fordeling af cellerne i brøndene.
      BEMÆRK: Til morfologisk analyse plade cellerne omkring 8.000 celler / godt i en 24 brønd plader og for genomiske og proteomiske protokoller, plade cellerne så højt som 30.000 celler / godt.
    12. Overfør pladerne til en glaseksiccator med sterilt vand i bunden for at skabe et befugtet kammer. Indsprøjt nok CO2 (ca. 120 ml) til at opnå et CO2-miljø på 5 % i ekssiccatoren, før der forsegles. Pladerne fastholdes ved 35,5 °C. Dette kaldes dag 0 i protokollen.
      BEMÆRK: Disse plader kan også vedligeholdes i en almindelig 5% CO2-inkubator. Den metode, der er beskrevet ovenfor, minimerer temperatur- og pH-ændringer og hjælper også med at forhindre krydskontaminering.

5. Vedligeholdelse af de dyrkede SCG neuroner og behandlinger

  1. På dag 1 (24 timer efter plating) fjernes halvdelen af kulturmediet forsigtigt og erstattes med 2 μM Ara-C (cytosin β-D-arabinofuranoside, et anti-mitotisk middel). Lad behandlingen være på cellerne i 48 timer. Normalt, denne længde af behandlingen er tilstrækkelig til at fjerne ikke-neuronal celler i kulturen.
  2. På dag 3, forsigtigt aspirere halvdelen af mediet og erstatte med kontrol medium.
  3. På dag 4 er cellerne klar til eksperimentelle behandlinger. Feed kulturer hver anden dag med passende medium, forsigtigt erstatte halvdelen af mediet i brønden med frisk medium.
  4. Dyrkede SCG neuroner i serum-fri medium udvide kun axoner. Hvis forsøg kræver tilstedeværelse af dendritter, behandle celler med enten 10% føtal kalv serum, 75-100 μg/ ml af kælderen membran matrix ekstrakt eller 50 ng/ ml af knogle morfoogenetiske protein-7. Dendritisk vækst observeres inden for 48 timers behandling med udførlig dendritisk lysthus observeret inden for en uge efter behandlingen.

6. Immunostaining dyrkede SCG neuroner

  1. Gradvist erstatte cellekultur medium i brønden med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfat buffer, pH 7,2 i en røghætte.
    1. Fjern halvdelen af kulturmediet i brønden og udskift det forsigtigt med 4% paraformaldehyd. Gentag derefter processen mindst to gange mere, fjerne to tredjedele af medierne i brønden hver gang og erstatte med 4% paraformaldehyd. I slutningen af denne proces, farven på medierne i brønden skulle have ændret sig fra pink til farveløs.
    2. Når alle mediet er blevet erstattet af 4% paraformaldehyd, inkubere brøndene i 15 - 20 minutter ved stuetemperatur.
  2. Med en lignende proces som beskrevet ovenfor erstattes den 4% paraformaldehydopløsning gradvist med fosfat-buffered saltvand (PBS), pH 7.2. Lad i 5 minutter. Skyl brøndene to gange mere i 5 minutter hver med PBS.
    1. Når 4% paraformaldehyd er fjernet, flytte pladerne til bordpladen til yderligere behandling. Dette trin er et godt stoppested, hvor plader kan opbevares ved 4 °C natten over.
  3. Fjern alle PBS. Tilføj nok volumen på 0,1% Triton X-100 i PBS til at dække cellerne. Lad det på kulturerne i 5 minutter at permeabilize neuronerne. Timingen af dette trin er afgørende for at sikre god farvning og samtidig bevare cellernes integritet.
  4. Fjern forsigtigt Triton X-100-opløsningen, og skyl godtingerne tre gange i 5 minutter hver gang med PBS. Fjern PBS-løsningen.
  5. Der tilsættes nok 5% BSA i PBS til at dække cellerne og inkubere ved stuetemperatur i 20 minutter for at reducere ikke-specifik antistofbinding.
  6. Fjern blokeringsopløsningen, og udskift den med et monoklonalt museantistof mod MAP-2 protein fortyndet i 5% BSA i PBS. Lad det primære antistof blive på cellerne natten over ved 4 °C.
  7. Fjern og gem det primære antistof til genbrug. Det primære antistof kan genbruges mindst to gange uden tab af detektionsintensitet.
  8. Skyl tre gange med nok PBS til at dække cellerne. Lad PBS være på cellerne i 10 minutter pr. skylning.
  9. Fjern PBS-opløsningen, og udskift den med fluorescerende kodekonjugeret gedeanti-mus IgG sekundært antistof ved 1:1000 fortynding i 5% BSA i PBS. Inkuber i 2 timer i mørke ved stuetemperatur.
  10. Fjern det sekundære antistof og udskift det med PBS. Skyl brøndene tre gange med PBS i 10 minutter pr. skylning. Skyl brøndene én gang med vand for at fjerne eventuelle salte.
  11. Monter dæksleter på glasdias, der indeholder en dråbe vandigt monteringsmiddel, der er egnet til fluorescerende mærkede prøver. Opbevar objektglassene ved 4 °C i en slidemappe, indtil de er klar til billedbehandling.

7. Prøvepræparat til analyse af proteom ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med massespektrometri

  1. Lysis af dyrkede neuroner
    1. Fjern forsigtigt alle kulturmedierne i brøndene. Udskift den med koldt, sterilt calcium og magnesiumfrit fosfat-bufferet saltvand (PBS), pH 7.4. Fjern hurtigt og udskift med PBS og lad det sidde i 5 min. Dette trin er gjort for at fjerne eventuelle proteiner til stede i kulturmediet.
    2. Fjern forsigtigt alle PBS fra alle brøndene til en bestemt behandling. Gentag processen en gang til. Vedligehold plader over is, når lysning cellerne for at minimere neuronal skade og proteolyse.
    3. Der tilsættes 100 - 150 μL 50 mM ammoniumbikarbonat, pH 7,5 (NH4HCO3)til en af brøndene og skrab cellerne ved hjælp af en steril celleskraber. Ved hjælp af en mikropipette, overføre væsken og gentag skrabe processen med alle de brønde til en bestemt behandling. Undersøg brøndene under mikroskopet efter skrabning for at sikre, at de fleste af cellerne er blevet fjernet.
      1. Med det lave antal neuroner, bruge en begrænset volumen til lyse cellerne for at sikre høj nok koncentration til proteomisk analyse.
    4. Opløsningen fryses ved -80 °C natten over for at hjælpe med cellelysis. Lysaterne kan opbevares på dette stadium, indtil de er klar til videre behandling.
    5. Når prøverne er optøet, sprøjtes de gennem en sprøjte med en 26 G eller 28 G nål for mekanisk at lyse cellerne.
    6. Sonikere prøverne i et sonikerende vandbad to gange i 10 minutter. Tilsæt is til vandbadet for at forhindre overophedning og denaturering af proteiner. Centrifuge i 5 minutter ved 4 °C ved 12.000 x g.
    7. Mål proteinkoncentrationen. Typiske proteinkoncentrationer spænder fra 0,4 - 1 μg/μL
  2. Prøve forberedelse og trypsin fordøjelsen til proteom analyse
    1. Der overføres højst 60 μL af lysatet eller 50 μg protein til et DNase-, RNase- og proteasefrit 1,5 ml rør. Hvis lysatets volumen er mindre end 60 μL, tilsættes nok 50 mM ammoniumbikarbonat til at gøre volumen.
    2. Der tilsættes 25 μL 0,2% syre labile overfladeaktivt stof og vortex. Rør i en blokvarmer inkluderes ved 80 °C i 15 minutter. Centrifuge røret ved 12.000 x g for 30 s.
    3. Der tilsættes 2,5 μL 100 mM dithiothreitol og vortex. Dette gør proteinet mere tilgængeligt for alkylering og fordøjelse. Rør ved 60 °C inkuberes i et blokvarmer i 30 minutter. Afkøl til stuetemperatur og centrifuge.
    4. Der tilsættes 2,5 μL 300 mM iodoacetamid til prøven og vortex. Dette trin hjælper med at alke cysterne og forhindrer dem i at reformere disulfide obligationer. Inkuber rørene ved stuetemperatur i mørke i 30 minutter.
    5. Der tilsættes massespektrometrikvalitet trypsin (0,5 μg/μL) til røret ved en trypsin: proteinforhold på 1:10. Fordøje prøverne ved 37 °C natten over.
    6. Der tilsættes 10 μL 5% trifluoretsyre (TFA) og vortex. Prøverne inkuberes ved 37 °C i 90 minutter. Dette trin er nødvendigt for at hydrolysere det sure labile overfladeaktive stof for at forhindre interferens under massespektrometri.
    7. Centrifuge prøverne ved 12.000 x g ved 4 °C i 30 minutter og overfør supernatanten til et kromatograficertificeret klart glasglas med forskåret Teflon/Silicone septumhætter. Prøver kan opbevares ved -20 °C før massespektrometrianalyse.
    8. Prøvehætteglasset underkastes flydende kromatografi kombineret med high definition massespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Isolering og vedligeholdelse af neuronale kulturer af embryonale SCG neuroner
Dissocierede celler fra rotte embryonale SCG blev belagt i en poly-D-lysin belagt plade eller coverslip og vedligeholdes i serum fri kultur medier, der indeholder b-nerve vækstfaktor. De dissocierede celler, der indeholder en blanding af neuroner og gliaceller, ser cirkulære ud ved plettering (figur 1A). Inden for 24 timer efter plating, neuronerne udvide små axonale processer med gliaceller udfladning og vises fase-mørke under fase kontrast mikroskopi (Figur 1B). Efter behandlingen med Ara-C elimineres 99 % af gliacellerne, og kulturerne indeholder overvejende neuronale celler med en ovalcellecelle, ekstensiv aksonal vækst og ingen dendritter (Figur 1C).

Immunokyokemisk farvning af dyrkede embryonale rotte overlegen livmoderhalskræft ganglier neuroner
Tidligere undersøgelser har vist, at dyrkede sympatiske neuroner dyrket i serum-fri medium udvide kun axoner og kun udvide en omfattende dendritisk arbor i nærvær af kælderen membran ekstrakt, 10% serum eller 50 ng/ml knogle morfogenetiske protein-7 (BMP-7)2,12. Efter aftale med disse observationer viser fasekontrastmikroskopi, at neuroner, der dyrkes i tilstedeværelse af BMP-7 (50 ng/ml) i 5 dage, har en flad cellekrop med flere tykke koniske processer sammenlignet med neuroner dyrket i serumfrie kontrolmedier (Figur 2). Identiteten af disse processer som dendritter bekræftes af tilstedeværelsen af MAP-2, et cytoskeletalt protein, der overvejende findes i cellekroppen, og dendritter19,20. Under kontrolforhold observeres fluorescerende farvning for MAP-2 i cytoplasmaet og de proksimale aksler og udelukkes fra kernen (som det fremgår af co-mærkning med en nuklear plet for at visualisere kernen (Figur 3A-3D). Efter behandling med BMP-7 ved 50 ng/ml i 5 dage observeres immunoraktivitet for MAP-2 ikke kun i cytoplasmaet, men også hos dendritter (Figur 3E-3H).

Prøve proteomisk analyse af dyrkede SCG neuroner dyrket i kontrol medier
E21 rotte sympatiske neuroner blev dyrket i kontrol medier i 6 dage in vitro, lysed og udsat for LC-MS analyse. Prøven blev foretaget i tre replikater på massespektrometeret, og proteinerne blev identificeret på grundlag af antallet af fragmenterede peptider observeret for hver prøve. Proteinernes overflod (fra 0 til over 300000 vilkårlige enheder) og konfidensscore for protein-id baseret på antallet af fragmenterede peptider observeret for hvert protein (fra 5 til 500) blev beregnet. Et prøvedatasæt fra massespektrometrisk analyse af proteomen af 30 μg protein fra SCG-neuroner, der dyrkes i serumfrie kontrolmedier, er vist i figur 4.

Der blev påvist 13,134 peptider i prøven, som svarede til 1287 proteiner. Af disse var 1100 til stede i alle tre tekniske replikater med normaliserede overflodsværdier på over 500. Af disse 1100 proteiner blev 90 proteiner identificeret ved tilstedeværelsen af et enkelt peptid hit, som kun dækkede en lille del af proteinet. Derfor var det vanskeligt at afgøre, om identifikationen var korrekt, og disse proteiner havde en lav proteintillidsscore (score <10). Disse proteiner blev elimineret fra analysen, og de resterende 1010 proteiner blev yderligere analyseret ved hjælp af Gene ontology at afgøre, om protokollen var en succes i påvisning af proteiner med forskellige lokalisering og funktion.

Gen ontologi analyse af dette datasæt blev udført ved hjælp af Panther klassificering database (http://www.pantherdb.org/) for at afgøre, om dette datasæt omfattede proteiner med forskellige cellulære lokalisering eller molekylære og biologiske funktioner og for at undersøge, om der var forbindelser mellem de identificerede proteiner og kendte veje21. Analysen viste, at selv om over 700 af proteinerne var cytoplasmatiske, indeholdt dette datasæt proteiner, der var lokaliseret til andre områder af cellen, herunder kernen, membranen, flere cellulære organeller og cellekryds (Figur 4A). Analysen viste også, at over 400 proteiner havde katalytisk aktivitet, og omkring 300 proteiner var involveret i signalveje (Figur 4B og Figur 4C). Desuden indeholdt datasættet proteiner, der var involveret i forskellige signalveje. Tabel 1 viser fem af de proteiner i G-protein signalering, celle vedhæftning, vækstfaktor signalering vej, og synaptiske vesicle menneskehandel veje, henholdsvis, der blev identificeret i datasættet.

Figure 1
Figur 1: Ændringer i morfologien af dyrkede E21 rotte embryonale SCG neuroner over tid. Repræsentativ fase kontrast mikroskopi billeder ved 10x forstørrelse af dissocierede celler fra E21 rotte SCG 20 min efter plating (A), en dag efter plating (B) og efter 48 timers Ara-C behandling (5 dage efter plating) (C). Bemærk tilstedeværelsen af gliaceller (pile) og axonal forlængelse (pilespidser) i (B), og fravær af gliaceller og neuroner viser omfattende axonal vækst i (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ændringer i neuronal morfologi af E21 rotte SCG neuroner efter behandling med BMP-7. Efter eliminering af ikke-neuronale celler blev dyrkede SCG-neuroner behandlet med kontrolmedier (A) eller BMP-7 ved 50 ng/ml (B) i 5 dage. Repræsentative fase kontrast mikrografer (10x forstørrelse) viser den cirkulære neuronal celle krop med axoner i kontrol neuroner (A) og neuroner med flere korte dendrite-lignende processer, når de behandles med BMP-7 (pile, B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Immunstaining for MAP-2 protein i dyrkede embryonale rotte sympatiske neuroner. Efter eliminering af ikke-neuronale celler blev kultiverede SCG-neuroner behandlet med kontrolmedier (A-D) eller BMP-7 ved 50 ng/ml (E-H) i 5 dage og immunstained ved hjælp af et monoklonalt museantistof mod MAP-2 og mærket med en nuklear markør. Repræsentative mikrografer, der viser immunokokemisk farvning af neuronerne med mikrotubuli associeret protein-2 (MAP-2) (C,G), en nuklear plet (D,H) med fasekontrastmikrografier (B,F) og en sammenlægning af de tre kanaler (A,E). Immunocytokemiske farvning for mikrotubule associeret protein-2 er til stede i cellen kroppen og proksimale axoner af kontrol neuroner (C) og farvning for MAP-2 protein i cellen kroppen og dendritter i BMP-7 behandlede neuroner (G). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Klassificering og distribution af proteiner identificeret i proteomanalysen af dyrkede E21 rotte SCG-neuroner. Protein-id'er for de 1100 proteiner blev underkastet genintologi analyse på Panther klassifikationssystem for at undersøge fordelingen af proteiner i datasættet med hensyn til cellulære lokalisering (A),cellulære funktion og biologiske processer, de var involveret i (B) og molekylær funktion klasse baseret på protein struktur (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

A) Proteiner involveret i biologisk vedhæftning
UniProt tiltrædelses-id Gennavn Gensymbol
Q9Z1Y3 Cadherin-2 Cdh2
O35112 CD166 antigen Alcam
P49134 Integrin beta-1 Itgb1
D3ZES7 Plexin A4 Plxna4
F1LP44 Integrin-underenhed alfa L Itgal
B) Proteiner involveret i vækstfaktor signalering
P35213 14-3-3 protein beta/alpha Ywhab
Q5BJ92 Serin/Threonine-protein fosfatase 4 katalytisk underenhed Ppp4c
P47196 Rac – alfa serine/threonin protein kinase Akt1
P62994 Vækstfaktorreceptorbundet protein 2 Grb2
P21708 Mitogenaktiveret proteinkinase 3 Kort 3
C) Proteiner involveret i G-protein koblet signalvej
P08753 Guanine nukleotidbindende protein G(k) subunit alpha Gnai3
D4ABV5 Calmodulin-2 Rolig2
P18266 Glykogen syntase kinase-3 beta Gsk3b
P09456 cAMP-afhængig proteinkinase type I-alpha regulatorisk underenhed Prkar1a
P53534 Glykogen fosforlase Pygb (hjerneform)
D) Proteiner, der er involveret i synaptisk vesicle handel
P47861 Synaptotagmin-5 Syt5
P63045 Vesicle-associeret membranprotein 2 Vamp2
P61265 Syntaksin-1B Stx1b
kr. Synapsin-2 Syn2
P60881 Synaptosomal-associeret protein 25 Snap25

Tabel 1: Repræsentative proteiner identificeret i proteomdata fra dyrkede rottepromiske SCG-neuroner, klassificeret efter deres biologiske funktioner. Proteomedataene med de 1100 proteiner blev underkastet genintologianalyse ved hjælp af Panther-klassifikationssystemet. Nedenfor er de fem bedste proteiner identificeret for fire biologiske veje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dette papir beskriver protokollerne for dyrkning sympatiske neuroner fra overlegen livmoderhalskræft ganglier af embryonale rotte hvalpe. Fordelene ved at bruge denne model system er, at det er muligt at opnå en homogen population af neuroner giver en lignende reaktion på vækstfaktorer, og da vækstfaktoren krav til disse neuroner har været godt karakteriseret, er det muligt at dyrke disse neuroner in vitro i definerede medier, under serum-fri betingelser10. Selv om protokollen beskriver processen for isolering af SCG fra E21 rotteunger, kan denne protokol anvendes til dissektion af SCG fra rotteunger fra E17 til E21 og til dissektion af embryonal mus SCG10,22,23. Denne dissektion protokol kan også bruges til at isolere SCG fra postnatal rotter med mindre ændring af de indledende trin. Disse ændringer omfatter eliminering af behovet for C-sektion, dødshjælp af de postnatale dyr ved hjælp af kuldioxid, og sterilisering af postnatal hvalpe efter dødshjælp ved nedsænkning af hvalpene i 70% alkohol, før overføre dem til dissektionsmedier10. Denne neuronale dyrkningsprotokol kan også tilpasses til undersøgelse af axonal vejledning, axonal transport og synapse dannelse ved hjælp af Campenot kamre og mikrofluidickamre 24,25. Disse neuroner kan også co-dyrkes med neuroner fra dorsale rod ganglier eller spinal motor neuroner eller med kardiomyocytter at studere neuronal interaktioner og neuron – målrette interaktioner i det perifere nervesystem26,27,28,29.

Brugen af dyrkede SCG neuroner til immunokyokemiske undersøgelser er veldokumenteret. Den protokol, der er beskrevet i papiret, giver et godt udgangspunkt for at arbejde med de fleste antistoffer. Der er dog antistoffer, såsom dem, der påerer nukleare proteiner, som kan kræve en ændring af fikseringsprotokollen og permeabiliseringsprotokollen. Ved fosfor-SMAD-antistof er behandling med 100 % methanol ved -20 °C blevet anvendt til fastgørelse og permeabilisering afneuronerne 30,31.

De vigtigste begrænsninger ved at arbejde i denne model system stammer fra den lille størrelse af S SKO I embryonale rotte hvalpe, hvilket resulterer i et lille antal neuroner. Dette resulterer i en begrænset mængde nukleinsyrer eller protein, der kan opnås ved dissektion af et kuld af hvalpe. Dette kan være problematisk for genomisk og proteomisk analyse, især når man sammenligner mellem flere behandlinger i en dissektion. Det er heller ikke muligt at få SCG neuronal kulturer fra et enkelt foster. Alle forsøg udføres derfor på poolede prøver, der er fremstillet af SCG af alle rotteembryoner i et kuld. En anden begrænsning af systemet er, at SCG neuroner har lavere DNA transfektion effektivitet (10 - 20%, ikke-offentliggjorte observationer) og højere toksicitet efter transfektion sammenlignet med centrale neuroner32. Selv om denne transfektionseffektivitet er fin til morfologiske undersøgelser med individuelle neuroner, er det vanskeligt at udføre molekylære eller biokemiske undersøgelser for at detektere/bekræfte ændringer i genekspressionen.

Men i de senere år, dyrkede SCG neuroner er blevet brugt til undersøgelser undersøge de mekanismer, der ligger til grund for dendritiske vækst og for transcriptome og miRNomeanalyser 14,15,33. Som tidligere nævnt har dyrkede neuroner fra embryonal SCG på grund af små proteinmængder ikke tidligere været anvendt til proteomisk analyse. Denne protokol og repræsentative resultater giver bevis for, at selv med lav koncentration af prøver, nuværende high definition massespektrometri instrumenter kan anvendes til proteomiske undersøgelser på disse neuroner. Selv om den her beskrevne protokol til prøveforberedelse er for SCG-neuroner, kan denne protokol anvendes til fremstilling af enhver prøve med lav proteinkoncentration til LC-MS-analyse. En af begrænsningerne er, at små variationer i proteinkoncentration eller effektivitet af trypsinfordring kan resultere i ufuldstændig fragmentering og et dramatisk fald i antallet af proteiner, der påvises ved LC-MS. Derfor er det afgørende at sikre, at begyndende proteinkoncentrationer er så tæt på 50 μg med et 10:1-forhold af protein: trypsin. Også, Det er en god praksis at aliquot massespektrometri-grade trypsin at forhindre flere fryse-tø cykler.

En anden begrænsning af protokollen er, at der kun blev påvist et begrænset antal transmembrane proteiner i proteomen. Mens det sure labile overfladeaktive stof har vist sig at være et effektivt overfladeaktivt stof til massespektrometri, viste en tidligere undersøgelse af dyrkede celler, at disse overfladeaktive stoffer kan øge antallet af cytoplasmatiske proteiner en smule og nedsætte membranproteinerne i den proteomiske profil34. Det er også blevet foreslået, at præ-fordøjelse ved hjælp af en bakteriel endopeptidase såsom Lys-C, før trypsin fordøjelsen kan forbedre effektiviteten af trypsin fordøjelse af membran bundet proteiner og forhindre membran protein fragmenter fra at blive bevaret på LC kolonner35.

Sammenfattende, dette papir giver detaljerede protokoller for dyrkning dyrkede rotte embryonale sympatiske neuroner og for at udføre morfologiske og proteomiske undersøgelser af disse neuroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Fakultetets Udviklingsfond og Summer Research Program tilskud på Saint Mary's College of California. Forfatterne vil også gerne takke Dr. Pamela Lein ved University of California i Davis og Dr. Anthony Iavarone på UC Berkeley Mass spektrometri facilitet for deres råd under udviklingen af disse protokoller. Forfatterne vil også gerne takke Haley Nelson i Office of College Communications på Saint Mary's College of California for hendes hjælp med videoproduktion og redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D nanoACQUITY Waters Corporation
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
BMP-7 R&D Systems 354-BP
Bovine Serum Alumin Sigma-Aldrich 5470
Cell scraper Corning CLS-3010
Collagenase Worthington Biochemical 4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates Fisher Scientific 07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) ATCC 30-2200
Dispase II Roche 4942078001
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11885
Fatty Acid Free BSA Calbiochem 126609 20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 Ted Pella Inc 5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection Ted Pella Inc 1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mm Neuvitro Corporation GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated Thermo Fisher Scientific A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) Thermo Fisher Scientific 14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) Thermo Fisher Scientific 41400-045
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Leibovitz L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
Mounting media for glass coverslips Thermo Fisher Scientific P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) BioLegend SMI 52
Nerve growth factor Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) BT5017 Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye Spectrum Chemicals P1010
Penicillin-Streptomycin (100X) Thermo Fisher Scientific 15140
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P0899
Prionex Millipore 529600 10% solution, 100 mL
RapiGest SF Waters Corporation 186001861 5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry Waters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing grade Thermo Fisher Scientific 28904 10 X 1 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin Promega or NEB V511A, P8101S 100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials Waters Corporation 186000385c

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
  2. Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. (2018).
  3. Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7, (5), 599-604 (1997).
  4. Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14, (3), 203-215 (1996).
  5. Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53, (1-2), 206-217 (1998).
  6. Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161, (1), 96-106 (1994).
  7. Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62, (1-2), 13-26 (1997).
  8. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 176-189 (2017).
  9. Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22, (24), 10772-10780 (2002).
  10. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
  11. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, (3), 597-605 (1995).
  12. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128, (2), 337-348 (1988).
  13. Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7, (3), 904-912 (1987).
  14. Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6, (7), 21754 (2011).
  15. Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, (7), 917-934 (2019).
  16. Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16, (8), 1516-1529 (2010).
  17. Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150, (6), 666-677 (2019).
  18. Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
  19. Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315, (2), 314-318 (1984).
  20. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245, (3), 131-134 (1998).
  21. Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
  22. Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42, (4), (2000).
  23. Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76, (9), 1003-1013 (2016).
  24. Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. 625-632 (2009).
  25. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36, (46), 11573-11584 (2016).
  26. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (1), 82 (2016).
  27. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
  28. Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
  29. Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. 1832-1835 (2009).
  30. Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
  31. Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108, (4), 1057-1071 (2009).
  32. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33, (2), 95-103 (2004).
  33. Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8, (1), 100 (2007).
  34. Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87, (4), 5 (2014).
  35. Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
Culturing Rotte sympatiske neuroner fra Embryonic Superior Cervical Ganglia for morfologisk og proteomisk analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).More

Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter