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Neuroscience

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonate Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61283

Summary

Cet article décrit l’isolement et la culture des neurones sympathiques embryonnaires de rat des ganglions cervicals supérieurs. Il fournit également des protocoles détaillés pour la coloration immunocytochimique et pour préparer des extraits neuronaux pour l’analyse spectrométrique de masse.

Abstract

Des neurones sympathiques des ganglions cervicals supérieurs de rat embryonnaire (SCG) ont été employés comme système de modèle in vitro pour les neurones périphériques pour étudier la croissance axonale, le trafic axonal, la synaptogenèse, la croissance dendritique, la plasticité dendritique et les interactions nerveuses-cibles dans les systèmes de co-culture. Ce protocole décrit l’isolement et la dissociation des neurones des ganglions cervicals supérieurs des embryons de rat E21, suivis de la préparation et du maintien des cultures neuronales pures dans le milieu sans sérum. Puisque les neurones n’adhèrent pas au plastique non couché, les neurones seront cultivés sur des couvercles en verre de 12 mm ou des plaques de 6 puits recouvertes de poly-D-lysine. Après un traitement avec un agent antimitotique (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), ce protocole génère des cultures neuronales saines avec moins de 5% de cellules non neuronales, qui peuvent être maintenues pendant plus d’un mois in vitro. Bien que les neurones embryonnaires de SCG de rat soient multipolaires avec 5-8 dendrites in vivo ; dans des conditions sans sérum, ces neurones ne s’étendent qu’à un seul axone en culture et continuent d’être unipolaires pendant toute la durée de la culture. Cependant, ces neurones peuvent être induits pour étendre les dendrites en présence de l’extrait de membrane de sous-sol, des protéines morphogenétiques d’os (BMP), ou 10% sérum foetal de veau. Ces cultures neuronales homogènes peuvent être utilisées pour la coloration immunocytochimique et pour les études biochimiques. Cet article décrit également le protocole optimisé pour la coloration immunocytochimique pour la protéine-2 associée aux microtubules (MAP-2) dans ces neurones et pour la préparation d’extraits neuronaux pour la spectrométrie de masse.

Introduction

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Les neurones sympathiques dérivés des ganglions cervicals supérieurs embryonnaires (SCG) ont été largement utilisés comme système de culture neuronale primaire pour étudier de nombreux aspects du développement neuronal, y compris la dépendance aux facteurs de croissance, interactions neurone-cible, signalisation neurotransmetteur, croissance axonale, développement de dendrite et plasticité, synaptogenèse et mécanismes de signalisation sous-jacents nerf-cible/ neurone-glia interactions1,2,3,4,5,6,7,8,9. Malgré leur petite taille (environ 10000 neurones /ganglions), il ya trois raisons principales pour le développement et l’utilisation extensive de ce système de culture sont i) étant les premiers ganglions dans la chaîne sympathique, ils sont plus grands, et donc plus facile à isoler, que le reste des ganglions sympathiques10; ii) contrairement aux neurones centraux, les neurones de la SCG sont assez homogènes avec tous les neurones dérivés de la crête neuronale, ayant une taille similaire, la dépendance au facteur de croissance nerveuse et d’être nor-adrenergic. Cela en fait un modèle précieux pour les études morphologiques et génomiques10,,11 et iii) ces neurones peuvent être maintenus dans un milieu défini sans sérum contenant un facteur de croissance nerveuse pendant plus d’un mois10,12. Les neurones perinatal SCG ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes sous-jacents à l’initiation et à l’entretien des dendrites2. C’est principalement parce que, bien que les neurones SCG ont une arborescence dendritique étendue in vivo, ils n’étendent pas les dendrites in vitro en l’absence de sérum, mais peuvent être induits à cultiver des dendrites en présence de certains facteurs de croissance tels que les protéines morphogenétiques osseuses2,12,13.

Cet article décrit le protocole pour isoler et cultiver les neurones embryonnaires de SCG de rat. Au cours des 50 dernières années, les cultures neuronales primaires du SCG ont été principalement utilisées pour des études morphologiques avec un nombre limité d’études examinant les changements génomiques ou protéomiques à grande échelle. Ceci est principalement dû à la petite taille des tissus ayant pour résultat l’isolement de faibles quantités d’ADN ou de protéines, ce qui rend difficile d’effectuer des analyses génomiques et protéomiques sur ces neurones. Cependant, ces dernières années, une sensibilité accrue à la détection a permis le développement de méthodes d’examen du génome, du miRNome et du protéome dans les neurones SCG pendant le développement de la croissance dendritique14,15,16,17. Cet article décrira également la méthode d’analyse morphologique de ces neurones à l’aide de l’immunocytochimie et d’un protocole pour obtenir des extraits de protéines neuronales pour l’analyse spectrométrique de masse.

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Protocol

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Toutes les procédures effectuées dans des études portant sur des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Saint Mary’s College of California. Les lignes directrices sur les soins et l’utilisation des animaux du Collège Saint Mary’s ont été élaborées sur la base des lignes directrices fournies par le Bureau du bien-être animal de laboratoire de l’Institut national de la santé (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf et https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1. Préparation des supports culturels (également appelé support de contrôle)

  1. Ajouter les ingrédients suivants, dans l’ordre énuméré ci-dessous, à une fiole stérile de 500 ml : 190 ml de DMEM à faible teneur en glucose, 10 ml de sérum bovin sans acide gras de 20 mg/mL (FAF-BSA) en DMEM, 2,8 mL de 200 mM L-glutamine, 4 mL de mélange insuline-sélénium-transferrine 100x, 0,4 mL de 125 μg/mL facteur de croissance nerveuse (dans 0,2% stabilisateur de protéine inerte dans DMEM), et 200 mL de facteur de croissance du nerf F-12 de Ham.
  2. Assurez-vous d’enrober la pipette du milieu contenant la FAF-BSA avant l’ajout de solutions contenant des protéines telles que l’insuline-sélénium-transferrine et la NGF pour éviter le collage de protéines à la pipette.
  3. Faire tourbillonner la fiole pour mélanger les ingrédients après chaque ajout. Bien mélanger avec une pipette de 25 mL après ajout de F-12.
  4. Aliquot les médias culturels dans 10 mL aliquots et stocker à -80 °C. Les aliquots peuvent être stockés pendant six mois sans perte d’activité.

2. Préparation de plaques pour la culture des neurones

  1. Diluer un stock de 1 mg/mL de poly-D-lysine (fabriqué en tampon Tris de 0,5 M, pH 8) à 100 μg/mL avec de l’eau distillée stérile.
  2. Pour l’analyse protéomique ou génomique, un à deux jours avant la dissection, enrober les plaques de 6 puits avec environ 2 mL de stérile 100 g/mL de poly-D-lysine (PDL). Ceci est nécessaire pour assurer l’adhérence cellulaire au puits. Envelopper les assiettes de film adhésif et conserver les assiettes pendant la nuit à 4 °C.
  3. Pour l’analyse morphologique et la microscopie, placez 12 mm2 couvercles en verre allemand prétraités (qui peuvent être nettoyés à l’aide d’un traitement à l’acide nitrique tel que décrit précédemment18 ou acheté) dans chacun des puits d’une plaque de 24 puits.
    1. Enrober les couvercles de 0,3 mL de 100 g/mL stérile de poly-D-lysine (PDL). Conserver les assiettes toute la nuit à 4 °C.
  4. Le jour de la dissection, avant le début de la dissection, retirer la solution de poly-D-lysine des puits et rincer les puits cinq fois avec de l’eau distillée stérile, suivie d’une fois avec un faible taux de glucose DMEM.
  5. Pendant la digestion enzymatique des ganglions (environ une heure avant le placage des cellules), l’asphyxie du DMEM des plaques et le remplacer par 0,3 mL de supports témoins. Conserver les plaques à 35,5 °C sous 5 % de CO2 dans une chambre humidifiée.

3. Configuration de dissection

  1. Préparation de 200 mL de supports pour la dissection (appelée média de dissection)
    1. Ajouter 8 mL de 20 mg/mL d’albumine de sérum bovin sans acide gras (FAF-BSA) dans le faible taux de glucose DMEM (avec 1 mg/mL de glucose) et 2 mL de 100x de pénicilline-streptomycine à 193 mL de L-15 moyen stérile de Leibovitz (ou tout milieu tamponné d’air)
  2. Dans le capot, mettre en place les éléments suivants pour la dissection: quatre tubes coniques stériles de 50 mL avec environ 20 ml de support de dissection dans chaque tube, quatre plats stériles de 35 mm avec 1,5 mL de milieux de dissection, un tube conique stérile de 50 mL avec 20 ml de support de dissection pour la centrifugation, un tube conique stérile de 15 mL pour centrifuger les ganglions , et un tube stérile de 10 ml pour la collecte des cellules dissociées.
  3. Utilisez un stérilisateur de perles sèches pour stériliser une paire de forceps fins (no.4 ou no 5 forceps) pendant au moins une minute.

4. Isolement des ganglions cervicals supérieurs des chiots embryonnaires de rat

  1. Enlèvement des embryons E21 du rat enceinte
    REMARQUE : Le retrait de la corne utérine peut être effectué à l’extérieur du capot si la zone environnante est complètement stérilisée.
    1. Euthanasier le rat enceinte à l’aide de l’inhalation de CO2. Cisaillez la fourrure de la région abdominale et essuyez la peau dans la région avec 70% d’alcool pour la stériliser.
    2. À l’aide d’un nouvel ensemble de ciseaux et de forceps stériles, couper à travers la peau, puis la couche musculaire pour exposer les cornes utérines contenant les embryons. Retirez les cornes utérines avec les embryons à l’aide d’un nouvel ensemble de ciseaux et de forceps, en prenant soin de ne pas endommager les intestins dans le processus.
    3. Transférer les cornes utérines avec les embryons dans une boîte de Pétri stérile de 150 mm2 et les transférer dans le capot.
    4. À l’aide d’un nouvel ensemble de forceps et de ciseaux, retirer les embryons de la corne utérine et séparer les embryons des membranes amniotiques et du placenta.
    5. Pour euthanasier les embryons, couper la moelle épinière des embryons le long de la ligne médiane sous le bras droit. Ceci réduira également le saignement de l’artère carotide pendant l’enlèvement de la SCG.
    6. Transférez ces embryons dans les tubes coniques préparés de 50 mL contenant des milieus de dissection. Assurez-vous que les embryons sont immergés dans les médias. Chaque tube peut contenir jusqu’à 3 embryons.
  2. Isolement du ganglion cervical supérieur de l’embryon
    1. Transférer un chiot du milieu de dissection sur un plat stérile de 150 mm2 Petri à moitié rempli de substrat solide (cire de paraffine ou polymère de silicone), avec sa surface dorsale sur le substrat. À l’aide de trois aiguilles stériles de 23 G, épingler le chiot dans le plat avec une aiguille sous chaque bras et une troisième aiguille par la bouche pour hyperextenser soigneusement le cou.
    2. Couper à travers la peau dans la région du cou à l’aide de forceps fins stériles (n° 4 ou no 5 forceps) pour exposer les glandes salivaires en dessous. Retirez ces glandes à l’aide de forceps fins.
    3. Localisez les muscles sternocleidomastoid et omohyoïdes près de la clavicule et de la trachée, respectivement. Coupez d’abord les muscles sternocleidomastoid transversaux, puis coupez soigneusement le muscle omohyoïde mince à l’aide de forceps fins. Une fois que ces muscles sont enlevés, la bifurcation dans l’artère carotide à l’extrémité antérieure sera visible de chaque côté de la trachée, avec le SCG situé sous cette fourche dans l’artère carotide.
    4. À l’aide de forceps fermés, soulevez doucement l’artère carotide pour visualiser le SCG. À l’aide d’un forceps de chaque côté de la SCG, retirer la carotide et la transférer dans les plats stériles préparés de 35 mm2. Ce tissu contiendra très probablement le SCG avec l’artère carotide, le nerf vague avec les ganglions nodose ainsi que d’autres segments de muscle ou de graisse dans la région.
    5. Répétez le processus de dissection de l’autre côté. Retirez les SPG de tous les embryons avant de poursuivre les étapes de dissection restantes décrites ci-dessous. Distribuer les tissus isolés entre deux des plats de 35 mm2 pour faciliter le traitement des échantillons de tissus.
  3. Post-traitement de SCG
    1. Pour séparer le SCG du tissu disséqué, utilisez d’abord des forceps fins pour enlever tout tissu étranger, tel que la graisse ou le muscle, en prenant soin d’éviter la zone près de la bifurcation carotide.
    2. Une fois que ces tissus ont été enlevés, deux ganglions sont visibles. Le ganglion nodose est plus petit et circulaire, tandis que le SCG est en forme d’amande. Tirez doucement sur le nerf vague pour séparer le nerf vague et les ganglions nodoses de la carotide, puis séparer le SCG de l’artère carotide.
    3. Utilisez des forceps fins pour enlever la capsule qui entoure le SCG. Transférer le SCG dans un nouveau plat de culture de 35 mm. Répétez le processus avec tous les échantillons de tissus disséqués.
    4. Enrober une pipette en verre stérilisée et colmatée en coton d’un milieu de dissection pour empêcher le tissu d’adhérer aux parois de la pipette. Utilisez la pipette pour remplacer le milieu de dissection par 2 mL stériles de collagène de type II (1 mg/mL)/dispase de type II (5 mg/mL) dans le HBSS sans calcium et magnésium, et incuber pendant 50 min à 37 °C pour aider à décomposer les tissus.
      REMARQUE : Le temps d’incubation peut devoir être optimisé avec différents lots de collagène/dispase et varie habituellement de 40 min à une heure.
    5. Pendant l’incubation, remplacez le DMEM des plaques et remplacez-le par 0,3 mL de support de commande. Conserver les plaques à 35,5 °C sous 5 % de CO2 dans une chambre humidifiée.
    6. Après l’incubation, transférer les SCG dans la collagènease/dispase dans un tube conique stérile de 15 ml. Utilisez le support de dissection pour rincer les plaques et transférer la solution dans le tube. Ajouter suffisamment de supports de dissection pour porter le volume à environ 10 mL.
    7. Centrifugeuse à 200 x g (1000 - 1200 tr/min) pendant 5 minutes à température ambiante pour granuler l’échantillon. Remplacer le supernatant, en prenant soin de ne pas déloger le granulé. Resuspendez le granulé avec 10 mL de support de dissection. Répétez la centrifugation et jetez le supernatant.
    8. Remplacer par 1 à 2 mL de culture moyenne. À l’aide d’une pipette pasteur stérile à bout étroit et à pointe pliée (pré-enduite avec un milieu de culture), dissocient mécaniquement les amas en triturant doucement 5-6 fois. Laissez les plus gros amas se contenter d’environ une minute. Transférer la suspension de cellules supernatantes dans un nouveau tube de 10 mL.
    9. Répétez ce processus 3 fois de plus, avec une force croissante de trituration à chaque fois pour assurer une dissociation presque complète des SCG. Transférer le supernatant après chaque tour de trituration à un tube de 10 mL avec le supernatant de la première trituration.
    10. Ajoutez suffisamment de supports culturels pour porter le volume à 8 à 10 mL. Mélanger délicatement la suspension cellulaire et quantifier la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
    11. Distribuer la suspension cellulaire dans les puits à la densité cellulaire appropriée pour les expériences. Mélanger la suspension cellulaire continuellement pendant le processus de placage pour assurer une distribution uniforme des cellules dans les puits.
      REMARQUE : Pour l’analyse morphologique, plaquez les cellules autour de 8 000 cellules/puits dans une plaque de 24 puits et pour les protocoles génomiques et protéomiques, plaquez les cellules jusqu’à 30 000 cellules/puits.
    12. Transférer les plaques dans un dessiccateur de verre avec de l’eau stérile au fond pour créer une chambre humidifiée. Injecter suffisamment de CO2 (environ 120 mL) pour obtenir un environnement de CO2 de 5 % dans le desiccateur, avant l’étanchéité. Maintenir les plaques à 35,5 °C. C’est ce qu’on appelle le jour 0 dans le protocole.
      REMARQUE : Ces plaques peuvent également être maintenues dans un incubateur régulier de CO2 de 5 %. La méthode décrite ci-dessus minimise les changements de température et de pH et aide également à prévenir la contamination croisée.

5. Entretien des neurones et traitements SCG cultivés

  1. Le jour 1 (24 heures après le placage), retirez soigneusement la moitié des supports de culture et remplacez-le par 2 μM Ara-C (cytosine β-D-arabinofuranoside, un agent anti-mitotique). Laissez le traitement sur les cellules pendant 48 h. Habituellement, cette durée du traitement est suffisante pour éliminer les cellules non neuronales dans la culture.
  2. Le jour 3, augmenter doucement la moitié du milieu et remplacer par un milieu de commande.
  3. Le jour 4, les cellules sont prêtes pour des traitements expérimentaux. Nourrissez les cultures tous les deux jours avec le milieu approprié, en remplaçant doucement la moitié du milieu dans le puits par un milieu frais.
  4. Les neurones SCG cultivés dans le milieu sans sérum ne s’étendent que les axones. Si les expériences nécessitent la présence de dendrites, traiter les cellules avec 10% de sérum de veau foetal, 75-100 μg/mL d’extrait de matrice de membrane de sous-sol ou 50 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse-7. La croissance dendritique est observée dans les 48 heures suivant le traitement avec l’arborescence dendritique élaborée observée dans la semaine suivant le traitement.

6. Immunostaining cultivés neurones SCG

  1. Remplacer progressivement le milieu de culture cellulaire dans le puits par 4% de paraformaldéhyde dans un tampon de phosphate de 0,1 M, le pH 7.2 dans un capot de fumée.
    1. Retirez la moitié du support de culture dans le puits et remplacez-le doucement par 4% de paraformaldéhyde. Ensuite, répétez le processus au moins deux fois de plus, en supprimant les deux tiers des médias dans le puits à chaque fois et en remplaçant par 4% de paraformaldéhyde. À la fin de ce processus, la couleur des médias dans le puits aurait dû changer de rose à incolore.
    2. Une fois que tout le milieu a été remplacé par 4% de paraformaldéhyde, incuber les puits pendant 15 à 20 minutes à température ambiante.
  2. Avec un processus similaire tel que décrit ci-dessus, remplacer progressivement la solution de paraformaldéhyde de 4 % par une solution saline tamponnée par phosphate (PBS), pH 7.2. Laisser reposer 5 minutes. Rincer les puits deux fois de plus pendant 5 minutes chacun avec PBS.
    1. Une fois que le paraformaldéhyde de 4 % est enlevé, déplacez les plaques sur le banc pour un traitement ultérieur. Cette étape est un bon point d’arrêt où les plaques peuvent être stockées à 4 °C pendant la nuit.
  3. Retirez tous les PBS. Ajouter un volume suffisant de 0,1% Triton X-100 dans PBS pour couvrir les cellules. Laissez-le sur les cultures pendant 5 minutes pour perméabiliser les neurones. Le moment de cette étape est essentiel pour assurer une bonne coloration tout en maintenant l’intégrité des cellules.
  4. Retirez soigneusement la solution Triton X-100 et rincez les puits trois fois pendant 5 minutes à chaque fois avec pbs. Supprimez la solution PBS.
  5. Ajouter suffisamment de 5 % de BSA dans pbs pour couvrir les cellules et incuber à température ambiante pendant 20 minutes pour réduire la liaison d’anticorps non spécifique.
  6. Retirez la solution de blocage et remplacez-la par un anticorps monoclonal de souris contre la protéine MAP-2 diluée dans 5% de BSA dans PBS. Laisser l’anticorps primaire sur les cellules pendant la nuit à 4 °C.
  7. Retirez et enregistrez l’anticorps principal pour les réutiliser. L’anticorps primaire peut être réutilisé au moins deux fois sans perte d’intensité de détection.
  8. Rincer trois fois avec suffisamment de PBS pour couvrir les cellules. Laisser pbs sur les cellules pendant 10 minutes par rinçage.
  9. Retirez la solution PBS et remplacez-la par un anticorps secondaire IgG anti-souris à 1:1000 dans 5% BSA dans PBS. Incuber pendant 2 heures dans l’obscurité à température ambiante.
  10. Retirez l’anticorps secondaire et remplacez-le par PBS. Rincer les puits trois fois avec pbs pendant 10 minutes par rinçage. Rincer les puits une fois avec de l’eau pour enlever les sels.
  11. Placez les couvercles sur des lames de verre contenant une goutte de supportant aqueux qui convient aux échantillons étiquetés fluorescents. Conservez les diapositives à 4 °C, dans un dossier de diapositives jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être imagerie.

7. Préparation de l’échantillon pour l’analyse du protéome à l’aide d’une chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse

  1. Lysy des neurones cultivés
    1. Retirez doucement tous les supports de culture dans les puits. Remplacez-le par du calcium froid et stérile et de la solution saline tamponnée au phosphate sans magnésium (PBS), pH 7.4. Retirer rapidement et remplacer par PBS et laisser reposer pendant 5 min. Cette étape est faite pour éliminer toutes les protéines présentes dans les milieuux de culture.
    2. Retirez soigneusement tous les PBS de tous les puits pour un traitement particulier. Répétez le processus une fois de plus. Maintenir les plaques au-dessus de la glace lors du lysage des cellules afin de minimiser les dommages neuronaux et la protéolyse.
    3. Ajouter 100 à 150 μL de bicarbonate d’ammonium de 50 mM, pH 7,5 (NH4HCO3)à l’un des puits et gratter les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules stériles. À l’aide d’une micropipette, transférer le liquide et répéter le processus de grattage avec tous les puits pour un traitement particulier. Examiner les puits au microscope après le grattage pour vous assurer que la plupart des cellules ont été enlevées.
      1. Avec le faible nombre de neurones, utiliser un volume limité pour lyser les cellules pour assurer une concentration assez élevée pour l’analyse protéomique.
    4. Congeler la solution à -80 °C pendant la nuit pour aider à la lyse cellulaire. Les lysates peuvent être stockés à ce stade jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être traités ultérieurement.
    5. Une fois décongelés, gicler les échantillons à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 26 G ou 28 G pour lyser mécaniquement les cellules.
    6. Sonifier les échantillons dans un bain d’eau sonicante deux fois pendant 10 minutes. Ajouter de la glace dans le bain d’eau pour éviter la surchauffe et la dénaturation des protéines. Centrifugeuse pendant 5 minutes à 4 °C à 12 000 x g.
    7. Mesurer la concentration de protéines. Les concentrations typiques de protéines varient de 0,4 à 1 μg/μL
  2. Préparation de l’échantillon et digestion de trypsine pour l’analyse du protéome
    1. Transférer un maximum de 60 μL du lysate ou 50 μg de protéines dans un tube de 1,5 mL sans DNase, RNase et protéase. Si le volume du lysate est inférieur à 60 μL, ajouter suffisamment de bicarbonate d’ammonium de 50 m MM pour compenser le volume.
    2. Ajouter 25 μL de surfactant et vortex de 0,2 % d’acide labile. Incuber le tube dans un chauffe-bloc à 80 °C pendant 15 minutes. Centrifuge du tube à 12 000 x g pour 30 s.
    3. Ajouter 2,5 μL de 100 mM de dithiothreitol et de vortex. Cela rend la protéine plus accessible pour l’alkylation et la digestion. Incuber le tube à 60 °C dans un chauffe-bloc pendant 30 minutes. Refroidir à température ambiante et centrifugeuse.
    4. Ajouter 2,5 μL d’iodoacetamide de 300 mM à l’échantillon et au vortex. Cette étape aide à alkylate les cysteines et les empêche de réformer les liens disulfure. Incuber les tubes à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes.
    5. Ajouter la trypsie de type spectrométrie de masse (0,5 μg/μL) au tube à une trypsin : rapport protéique de 1:10. Digèrez les échantillons à 37 °C pendant la nuit.
    6. Ajouter 10 μL d’acide trifluoroacétique à 5 % (TFA) et vortex. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 90 minutes. Cette étape est nécessaire pour hydrolyser le surfactant acide labile pour prévenir les interférences pendant la spectrométrie de masse.
    7. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g à 4 °C pendant 30 minutes et transférer le supernatant vers un flacon en verre transparent certifié chromatographie avec des bouchons de septum en téflon/silicone prééclairé. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C avant l’analyse de spectrométrie de masse.
    8. Soumettez les flacons d’échantillon à la chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse haute définition.

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Representative Results

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Isoler et maintenir les cultures neuronales des neurones embryonnaires scg
Les cellules dissociées du RAT embryonnaire SCG ont été plaquées dans une plaque enduite de poly-D-lysine ou coverslip et maintenues dans les milieux de culture sans sérum contenant le facteur de croissance de b-nerf. Les cellules dissociées contenant un mélange de neurones et de cellules gliales regardent circulaire sur le placage (Figure 1A). Dans les 24 heures suivant le placage, les neurones prolongent de petits processus axonaux avec des cellules gliales aplatissant et apparaissant phase-sombre sous microscopie de contraste de phase (Figure 1B). Après le traitement avec Ara-C, 99% des cellules gliales sont éliminées et les cultures contiennent principalement des cellules neuronales avec un corps cellulaire ovale, une croissance axonale étendue et pas de dendrites (Figure 1C).

Coloration immunocytochimique des neurones ganglionnaires embryonnaires de rat cultivés supérieurs
Des études antérieures ont montré que les neurones sympathiques cultivés cultivés dans un milieu sans sérum ne s’étendent que contre les axones et ne prolongent qu’une arborescence dendritique élaborée en présence d’extrait de membrane du sous-sol, 10% sérum ou 50 ng/mL os morphogénétique protéine-7 (BMP-7)2,12. En accord avec ces observations, la microscopie de contraste de phase montre que les neurones cultivés en présence de BMP-7 (50 ng/mL) pendant 5 jours ont un corps cellulaire aplati avec plusieurs processus coniques épais par rapport aux neurones cultivés dans des milieux de contrôle sans sérum (Figure 2). L’identité de ces processus en tant que dendrites est confirmée par la présence de MAP-2, une protéine cytosqueletale principalement trouvée dans le corps cellulaire et les dendrites19,20. Dans des conditions de contrôle, la coloration fluorescente du MAP-2 est observée dans le cytoplasme et les axones proximaux et exclue du noyau (comme en témoigne le co-étiquetage avec une tache nucléaire pour visualiser le noyau (Figure 3A-3D). Après le traitement avec BMP-7 à 50 ng/mL pendant 5 jours, l’immunoréactivité pour MAP-2 est observée non seulement dans le cytoplasme, mais aussi dans les dendrites (Figure 3E-3H).

Exemple d’analyse protéomique des neurones SCG cultivés dans les milieuaux témoins
Les neurones sympathiques de rat E21 ont été cultivés dans les médias témoins pendant 6 jours in vitro, lysés et soumis à l’analyse de LC-MS. L’échantillon a été exécuté en trois répliques sur le spectromètre de masse et les protéines ont été identifiées en fonction du nombre de peptides fragmentés observés pour chaque échantillon. L’abondance des protéines (allant de 0 à plus de 300000 unités arbitraires) et le score de confiance pour l’identification protéique en fonction du nombre de peptides fragmentés observés pour chaque protéine (allant de 5 à 500) ont été calculés. Un ensemble d’échantillons provenant de l’analyse spectrométrique de masse du protéome de 30 μg de protéines provenant de neurones SCG cultivés dans des milieux de contrôle sans sérum est illustré à la figure 4.

Il y avait 13 134 peptides détectés dans l’échantillon qui correspondaient à 1287 protéines. De ce nombre, 1100 étaient présents dans les trois répliques techniques dont les valeurs d’abondance normalisées étaient supérieures à 500. De ces 1100 protéines, 90 protéines ont été identifiées par la présence d’un seul coup de peptide, qui ne couvrait qu’une petite partie de la protéine. Par conséquent, il était difficile de déterminer si l’identification était correcte et ces protéines avaient un faible score de confiance en protéines (score <10). Ces protéines ont été éliminées de l’analyse et les 1010 protéines restantes ont été analysées en utilisant l’ontologie de gène pour déterminer si le protocole a réussi à détecter des protéines avec la localisation et la fonction différentes.

L’analyse de l’ontologie génique de cet ensemble de données a été effectuée à l’aide de la base de données de classification Panther (http://www.pantherdb.org/) afin de déterminer si cet ensemble de données comprenait des protéines ayant différentes fonctions cellulaires de localisation ou moléculaires et biologiques et d’examiner s’il y avait des liens entre les protéines identifiées et les voies connues21. L’analyse a montré que, bien que plus de 700 des protéines étaient cytoplasmiques, cet ensemble de données contenait des protéines qui ont été localisées à d’autres régions de la cellule, y compris le noyau, la membrane, plusieurs organites cellulaires, et les jonctions cellulaires (Figure 4A). L’analyse a également révélé que plus de 400 protéines avaient une activité catalytique, et environ 300 protéines ont été impliquées dans les voies de signalisation (figure 4B et figure 4C). En outre, l’ensemble de données contenait des protéines impliquées dans diverses voies de signalisation. Le tableau 1 montre cinq des protéines de la signalisation des protéines G, de l’adhérence cellulaire, de la voie de signalisation des facteurs de croissance et des voies de trafic de vésicules synaptiques, respectivement, qui ont été identifiées dans l’ensemble de données.

Figure 1
Figure 1 : Changements dans la morphologie des neurones SGC embryonnaires de rat E21 cultivés au fil du temps. Images de microscopie de contraste de phase représentative à 10x grossissement des cellules dissociées de E21 rat SCG 20 min après le placage (A), un jour après le placage (B) et après 48 heures de traitement Ara-C (5 jours après le placage) (C). Notez la présence de cellules gliales (flèches) et d’extension axonale (têtes de flèche) dans (B), et l’absence de cellules gliales et de neurones montrant une croissance axonale étendue dans (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Changements dans la morphologie neuronale des neurones SCG de rat E21 suivant le traitement avec BMP-7. Après l’élimination des cellules non neuronales, les neurones SCG cultivés ont été traités avec des supports de contrôle (A) ou BMP-7 à 50 ng/mL (B) pendant 5 jours. Les micrographes de contraste de phase représentative (grossissement 10x) montrent le corps circulaire de cellule neuronale avec des axones dans les neurones témoins (A) et les neurones avec de multiples processus courts de dendrite-like lorsqu’ils sont traités avec BMP-7 (flèches, B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Immunostaining pour la protéine MAP-2 dans les neurones sympathiques embryonnaires cultivés de rat. Après l’élimination des cellules non neuronales, les neurones SCG cultivés ont été traités avec des supports témoins (A-D) ou BMP-7 à 50 ng/mL (E-H) pendant 5 jours et immunostained à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris contre MAP-2 et co-étiqueté avec un marqueur nucléaire. Micrographes représentatifs montrant la coloration immunocytochimique des neurones avec la protéine associée aux microtubules-2 (MAP-2) (C,G), une tache nucléaire (D,H) avec des micrographes de contraste de phase (B,F) et une fusion des trois canaux (A,E). La coloration immunocytochimique pour la protéine-2 associée aux microtubules est présente dans le corps cellulaire et les axones proximaux des neurones témoins (C) et la coloration de la protéine MAP-2 dans le corps cellulaire et les dendrites dans les neurones traités BMP-7 (G). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Classification et distribution des protéines identifiées dans l’analyse du protéome des neurones SCG de rat E21 cultivés. Les ID protéiques des 1100 protéines ont été soumis à l’analyse de l’ontologie des gènes sur le système de classification Panther afin d’examiner la distribution des protéines dans l’ensemble de données relatives à la localisation cellulaire (A),la fonction cellulaire et les processus biologiques dans lesquels elles ont participé (B) et la classe de fonction moléculaire basée sur la structure protéique (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

A) Protéines impliquées dans l’adhérence biologique
ID d’adhésion UniProt Nom du gène Symbole de gène
Q9Z1Y3 Cadherin-2 Cdh2
O35112 Antigène CD166 Alcam
P49134 Intégrine bêta-1 Itgb1
D3ZES7 Plexin A4 Plxna4
F1LP44 Integrin sous-unité alpha L Itgal
B) Protéines impliquées dans la signalisation des facteurs de croissance
P35213 14-3-3 protéine bêta/alpha Ywhab
Q5BJ92 Phosphatase catalytique de protéines de sérine/thréonine 4 Ppp4c
P47196 Rac – alpha sérine/thréonine protéine kinase Akt1
P62994 Protéine liée aux récepteurs du facteur de croissance 2 Grb2
P21708 Protéines kinase 3 activées par mitogène Mapk3
C) Protéines impliquées dans la voie de signalisation couplée aux protéines G
P08753 Protéine de liaison de nucléotide de Guanine G(k) sous-unité alpha Gnai3
D4ABV5 Calmodulin-2 Calme2
P18266 Glycogène synthase kinase-3 bêta Gsk3b
P09456 sous-unité de régulation de la kinase de protéine dépendante de l’AMP Prkar1a
P53534 Glycogène phosphorylase Pygb (forme cérébrale)
D) Protéines impliquées dans le trafic de vésicule synaptique
P47861 Synaptotagmin-5 Syt5
P63045 Protéine membranaire associée aux vésicules 2 Vamp2
P61265 Syntaxin-1B Stx1b
Q63537 Synapsine-2 Syn2
P60881 Protéine associée à la synaptosomale 25 Snap25

Tableau 1 : Protéines représentatives identifiées dans les données du protéome provenant de neurones sCG embryonnaires de rats cultivés, classées par leurs fonctions biologiques. Les données de protéome avec les 1100 protéines ont été soumises à l’analyse d’ontologie de gène utilisant le système de classification de Panther. Vous trouverez ci-dessous les cinq principales protéines identifiées pour quatre voies biologiques.

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Discussion

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Cet article décrit les protocoles pour cultiver des neurones sympathiques des ganglions cervical supérieurs des chiots embryonnaires de rat. Les avantages de l’utilisation de ce système modèle sont qu’il est possible d’obtenir une population homogène de neurones fournissant une réponse similaire aux facteurs de croissance, et puisque les exigences de facteur de croissance pour ces neurones a été bien caractérisé, il est possible de cultiver ces neurones in vitro dans des médias définis, dans des conditions sans sérum10. Bien que le protocole décrit le processus d’isolement scg des chiots de rat E21, ce protocole peut être utilisé pour la dissection de SCG des chiots rat de E17 à E21 et pour la dissection de la souris embryonnaire SCG10,22,23. Ce protocole de dissection peut également être utilisé pour isoler SCG des rats postnatals avec modification mineure aux étapes initiales. Ces modifications comprennent l’élimination des besoins en césarienne, l’euthanasie des animaux postnatals utilisant du dioxyde de carbone et la stérilisation des chiots postnatals après l’euthanasie par immersion des chiots dans 70 % d’alcool, avant de les transférer dans les milieux de dissection10. Ce protocole de culture neuronale peut également être adapté pour l’étude de l’orientation axonale, du transport axonal et de la formation de synapse à l’aide de chambres Campenot et de chambres microfluidiques24,25. Ces neurones peuvent également être co-cultivés avec des neurones des ganglions racinaires dorsales ou des neurones moteurs spinaux ou avec des cardiomyocytes pour étudier les interactions neuronales et les neurones – interactions cibles dans le système nerveux périphérique26,27,28,29.

L’utilisation des neurones scg cultivés pour des études immunocytochimiques est bien documentée. Le protocole décrit dans le document fournit un bon point de départ pour travailler avec la plupart des anticorps. Cependant, il existe des anticorps, tels que ceux qui détectent les protéines nucléaires qui peuvent nécessiter une modification du protocole de fixation et du protocole de perméabilisation. Dans le cas de l’anticorps phospho-SMAD, le traitement avec 100% de méthanol à -20 °C a été utilisé pour fixer et perméabiliser les neurones30,31.

Les principales limites de travail dans ce système modèle proviennent de la petite taille des SCG chez les chiots rats embryonnaires, ce qui se traduit par un petit nombre de neurones. Il en résulte une quantité limitée d’acides nucléiques ou de protéines qui peuvent être obtenues à partir de la dissection d’une portée de chiots. Cela peut être problématique pour l’analyse génomique et protéomique, en particulier lors de la comparaison entre plusieurs traitements dans une dissection. En outre, il n’est pas possible d’obtenir des cultures neuronales SCG à partir d’un seul embryon. Toutes les expériences sont donc réalisées sur des échantillons mis en commun qui sont obtenus à partir de SCG de tous les embryons de rats dans une portée. Une autre limitation du système est que les neurones SCG ont une efficacité de transfection de l’ADN inférieure (10 - 20%, observations non publiées) et une toxicité plus élevée après la transfection par rapport aux neurones centraux32. Bien que cette efficacité de transfection soit très bien pour les études morphologiques avec des neurones individuels, il est difficile d’effectuer des études moléculaires ou biochimiques pour détecter/confirmer les changements d’expression génique.

Cependant, ces dernières années, les neurones SCG cultivés ont été utilisés pour des études examinant les mécanismes sous-jacents à la croissance dendritique et pour les analyses de transcriptome et miRNome14,15,33. Comme indiqué précédemment, en raison de faibles quantités de protéines, les neurones cultivés de SCG embryonnaire n’ont pas été utilisés auparavant pour l’analyse protéomique. Ce protocole et les résultats représentatifs fournissent la preuve que même avec une faible concentration d’échantillons, les instruments actuels de spectrométrie de masse haute définition pourraient être utilisés pour des études protéomiques sur ces neurones. Bien que le protocole de préparation de l’échantillon décrit ici est pour les neurones SCG, ce protocole peut être utilisé pour la préparation de n’importe quel échantillon avec une faible concentration de protéines pour l’analyse LC-MS. L’une des limites est que de petites variations de la concentration ou de l’efficacité des protéines de la digestion de la trypsine peuvent entraîner une fragmentation incomplète et une diminution spectaculaire du nombre de protéines détectées par la LC-MS. Par conséquent, il est essentiel de s’assurer que les concentrations de protéines de départ sont aussi proches de 50 μg avec un rapport de 10:1 de protéines: trypsin. En outre, il est une bonne pratique d’aliquot la trypsie de masse spectrométrie-grade pour empêcher les cycles de gel-dégel multiples.

Une autre limitation du protocole est qu’il n’y avait qu’un nombre limité de protéines transmembrane détectées dans le protéome. Alors que le surfactant acide labile s’est avéré être un surfactant efficace pour la spectrométrie de masse, une étude précédente sur les cellules cultivées a constaté que ces surfactants peuvent augmenter légèrement le nombre de protéines cytoplasmiques et diminuer les protéines membranaires dans le profil protéomique34. En outre, il a été suggéré que la pré-digestion à l’aide d’une endopeptidase bactérienne comme Lys-C, avant la digestion de trypsine peut améliorer l’efficacité de la digestion de trypsine des protéines liées à la membrane et empêcher les fragments de protéines membranaires d’être conservés sur les colonnes LC35.

En résumé, cet article fournit des protocoles détaillés pour la croissance des neurones sympathiques embryonnaires de rat cultivés et pour effectuer des études morphologiques et protéomiques sur ces neurones.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ces travaux ont été appuyés par le Fonds de développement de la faculté et la subvention du Programme de recherche d’été du Saint Mary’s College of California. Les auteurs tiennent également à remercier la Dre Pamela Lein de l’Université de Californie à Davis et le Dr Anthony Iavarone de l’UC Berkeley Mass spectrometry facility pour leurs conseils lors de l’élaboration de ces protocoles. Les auteurs tiennent également à remercier Haley Nelson au Bureau des communications collégiales du Saint Mary’s College of California pour son aide à la production vidéo et au montage vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D nanoACQUITY Waters Corporation
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
BMP-7 R&D Systems 354-BP
Bovine Serum Alumin Sigma-Aldrich 5470
Cell scraper Corning CLS-3010
Collagenase Worthington Biochemical 4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates Fisher Scientific 07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) ATCC 30-2200
Dispase II Roche 4942078001
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11885
Fatty Acid Free BSA Calbiochem 126609 20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 Ted Pella Inc 5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection Ted Pella Inc 1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mm Neuvitro Corporation GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated Thermo Fisher Scientific A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) Thermo Fisher Scientific 14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) Thermo Fisher Scientific 41400-045
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Leibovitz L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
Mounting media for glass coverslips Thermo Fisher Scientific P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) BioLegend SMI 52
Nerve growth factor Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) BT5017 Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye Spectrum Chemicals P1010
Penicillin-Streptomycin (100X) Thermo Fisher Scientific 15140
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P0899
Prionex Millipore 529600 10% solution, 100 mL
RapiGest SF Waters Corporation 186001861 5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry Waters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing grade Thermo Fisher Scientific 28904 10 X 1 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin Promega or NEB V511A, P8101S 100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials Waters Corporation 186000385c

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References

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Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonate Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis
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Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).More

Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).

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