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Neuroscience

형태학적 및 프로테오믹 분석을 위한 배아 우수한 자궁 경부 간리아에서 쥐 동정 신경을 배양

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61283

Summary

이 논문은 우수한 자궁 경부 신경교에서 배아 쥐 동정 뉴런의 격리 및 배양에 대해 설명합니다. 또한 면역 세포화학 염색및 질량 분광 분석을 위한 신경 추출물을 준비하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

배아 쥐 우수한 자궁 경부 신경리아 (SCG)에서 동정 뉴런은 축축성장, 축축인 인신 매매, 시냅토 발생, 수지상 성장, 수지상 가소성 및 공동 배양 시스템에서 신경 표적 상호 작용을 연구하기 위해 말초 뉴런을위한 시험관 내 모델 시스템으로 사용되어 왔다. 이 프로토콜은 E21 쥐 배아의 우수한 자궁 경부 중화로부터 뉴런의 격리 및 해리를 설명하고, 혈청이없는 배지에서 순수한 뉴런 배양의 준비 및 유지 보수에 따른다. 뉴런은 코팅되지 않은 플라스틱을 부착하지 않기 때문에 뉴런은 12mm 유리 커버립 또는 폴리 D-리신으로 코팅된 6웰 플레이트에서 배양됩니다. 항미항제(Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside)로 치료한 후, 이 프로토콜은 체외에서 한 달 이상 유지될 수 있는 5% 미만의 비신경 세포를 가진 건강한 뉴런 배양을 생성합니다. 배아 쥐 SCG 뉴런은 생체 내 5-8 원원염으로 다극성이지만; 혈청없는 조건하에서, 이 뉴런은 문화에 있는 단 하나 축록소를 확장하고 문화의 기간 동안 단극성 계속합니다. 그러나, 이들 뉴런은 지하 막 추출물, 뼈 형태유전학 단백질(BMP) 또는 10% 태아 종아리 혈청이 존재하여 수상월을 연장하도록 유도될 수 있다. 이러한 균질성 신경 배양은 면역 세포화학 염색 및 생화학 연구에 사용될 수 있습니다. 이 논문은 또한 이러한 뉴런에서 미세 투과 관련 단백질-2 (MAP-2)에 대한 면역 세포화학 염색및 질량 분석법을 위한 신경 추출물의 제조를 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

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Sympathetic neurons derived from embryonic superior cervical ganglia (SCG) have been widely used as a primary neuronal culture system for studying many aspects of neuronal development including growth factor dependence, neuron-target interactions, neurotransmitter signaling, axonal growth, dendrite development and plasticity, synaptogenesis and signaling mechanisms underlying nerve-target/neuron-glia interactions1,2,3,4,5,6,7,8,9. 그들의 작은 크기에도 불구하고 (약 10000 뉴런 / 신경망), 개발및이 문화 시스템의 광범위한 사용에 대한 세 가지 주요 이유가 있다 i) 공감 체인의 첫 번째 신경리아인, 그들은 더 크고, 따라서 분리하기 쉽게, 공감 신경리아의 나머지 부분보다10; ii) 중앙 뉴런과는 달리, SCG의 뉴런은 신경 문장에서 파생되는 모든 뉴런과 상당히 균일하며 비슷한 크기를 가지고 있으며 신경 성장 인자에 대한 의존도 도 성상입니다. 이는 형태학적 및 유전체연구를 위한 귀중한 모델로 만들며,10, 11 및 iii) 이들 뉴런은 한 달,10,,12이상신경 성장 인자를 함유하는 정의된 혈청 없는 배지에서 유지될 수 있다.10 주산기 SCG 뉴런은 2의 개시 및 유지 보수의 기초메커니즘을 연구하기2위해 광범위하게 사용되어 왔다. 이는 주로 SCG 뉴런이 생체 내 광범위한 수지상 식목을 가지고 있지만, 혈청이 없는 경우 시험관 내 의 원더라이트를 연장하지 는 않지만 뼈 형태유전학 단백질2,,12,,13과같은 특정 성장 인자의 존재속에서 원더라이트를 성장하도록 유도될 수 있기 때문이다.

이 논문은 배아 쥐 SCG 뉴런을 격리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 지난 50 년 동안, SCG에서 1 차적인 신경 배양은 대규모 게놈 또는 proteomic 변경을 검토하는 연구의 제한된 수와 형태학 연구에 주로 사용되었습니다. 이것은 주로 DNA 또는 단백질의 낮은 양의 격리의 결과로 작은 조직 크기 때문, 이러한 뉴런에 게놈과 proteomic 분석을 수행 하기 어렵게. 그러나, 최근 몇 년 동안, 검출 감도가 증가하여 수지상 성장 발달 동안 SCG 뉴런에서 게놈, miRNome 및 프로테아메를 검사하는 방법의발달을가능하게 했다14,15,,16,,17. 이 논문은 또한 질량 분광 분석을 위한 신경 단백질 추출물을 얻기 위하여 면역 세포화학 및 프로토콜을 사용하여 이 뉴런의 형태학 분석을 위한 방법을 설명할 것입니다.

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Protocol

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동물과 관련된 연구에서 수행 된 모든 절차는 캘리포니아 세인트 메리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 세인트 메리 대학의 동물 관리 및 사용 지침은 국립 보건 원 (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf 및 https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf)의 실험실 동물 복지 사무소에서 제공하는 지침에 따라 개발되었습니다.

1. 문화 매체 의 준비 (제어 매체라고도 함)

  1. DMEM에서 아래 나열된 순서대로 멸균 500mL 플라스크에 190mL, 20 mg/mL 지방산 프리 소 세럼 알부민(FAF-BSA)의 10mL, DMEM의 10mL, 200mM L-글루타민의 2.8mL, 인슐린 셀레늄-트랜스퍼린 혼합물 4mL, 125 μg/mL 신경 성장 인자(DMEM의 0.2% 불활성 단백질 안정제), 함F-12 중형 200mL.
  2. 파이펫에 단백질의 집착을 방지하기 위해 인슐린 셀레늄 -transferrin 및 NGF와 같은 단백질 함유 용액이 첨가되기 전에 FAF-BSA를 함유하는 배지로 파이펫을 코팅해야 합니다.
  3. 플라스크를 소용돌이치면 각 첨가 후 재료를 섞습니다. F-12를 추가한 후 25mL 파이펫과 철저히 섞으세요.
  4. 알리쿼트 문화 매체는 10mL 알리쿼트에 저장하여 -80°C에 저장한다. 알리쿼트는 활동 손실 없이 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

2. 뉴런 을 배양하기위한 플레이트 준비

  1. 폴리 D-리신 의 1 mg / mL 주식을 희석 (0.5 M 트리스 버퍼, pH 8에서 만든) 멸균 증류수100 μg / mL에.
  2. 프로테오믹 또는 게놈 분석을 위해, 해부 1~2일 전에, 폴리-D-리신(PDL)의 멸균 100 g/mL 약 2mL로 6웰 플레이트를 코팅한다. 이것은 우물에 세포 접착을 보장하기 위해 필요합니다. 접시를 필름으로 감싸고 접시를 4 °C에서 밤새 보관하십시오.
  3. 형태학적 분석 및 현미경 검사법의 경우, 12mm2개의 미리 처리된 독일 유리 커버립(이전에18 설명된 바와 같이 질산 치료를 사용하여 세척할 수 있거나 구입한) 24웰 플레이트의 각 우물에 놓습니다.
    1. 폴리 D-리신(PDL)의 멸균 100g/mL0.3mL로 커버립을 코팅합니다. 접시를 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
  4. 해부의 날에, 해부의 시작 전에, 우물에서 폴리 D-lysine 용액을 제거하고 멸균 증류수와 함께 우물을 5 번 헹구고, 낮은 포도당 DMEM으로 한 번.
  5. 간질 (세포를 도금하기 전에 약 한 시간)의 효소 소화 동안, 플레이트에서 DMEM을 흡인하고 제어 매체의 0.3 mL로 대체합니다. 플레이트를 가습 챔버에 5% CO2 미만으로 35.5°C로 저장합니다.

3. 해부 설정

  1. 해부용 200mL 미디어 준비(해부 미디어라고 함)
    1. 저혈당 DMEM(1 mg/mL 포도당 포함)에 20 mg/mL 지방산 프리 소 세럼 알부민(FAF-BSA)의 8mL과 100x 페니실린-스트렙토마이신 의 2mL를 멸균 라이보비츠의 L-15 중형(또는 공기 완충제 중형)의 193mL에 추가합니다.
  2. 후드에서, 해부에 대한 다음 항목을 설정 : 각 튜브에 해부 미디어의 약 20 mL와 4 50 mL 멸균 원추형 튜브, 해부 미디어의 1.5 mL와 4 멸균 35mm 접시, 원심분리에 대한 해부 미디어의 20 mL, 1 개의 살균 형질 1 개, 1 개의 살균 튜브에 대한 1 개의 살균 형 질 튜브, 1 개의 살균 튜브 1 개 , 및 해리된 세포를 수집하기 위한 멸균 10mL 튜브.
  3. 마른 비드 멸균제를 사용하여 미세 한 쌍의 미세 집게 (4 번 또는 5 번 포셉)를 적어도 1 분 동안 살균하십시오.

4. 배아 쥐 새끼로부터 우수한 자궁 경부 간질의 격리

  1. 임신 한 쥐에서 E21 배아의 제거
    참고: 주변 영역이 철저히 살균되면 자궁 경적을 후드 외부에서 제거할 수 있습니다.
    1. CO2 흡입을 사용하여 임신 한 쥐를 안락사시하십시오. 복부 부위에서 털을 깎고 70 %의 알코올로 부위의 피부를 닦아 살균하십시오.
    2. 멸균 가위와 집게의 신선한 세트를 사용하여, 피부를 통해 잘라 다음 근육 층은 배아를 포함하는 자궁 뿔을 노출. 새로운 가위와 집게 세트를 사용하여 배아로 자궁 뿔을 제거하여 그 과정에서 내장을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
    3. 배아와 자궁 뿔을 150mm2 멸균 페트리 접시로 옮기고 후드로 옮긴다.
    4. 새로운 집게와 가위를 사용하여 자궁 경적에서 배아를 제거하고 양막과 태반에서 배아를 분리합니다.
    5. 배아를 안락사시키기 위해 오른팔 아래 의 중간선을 따라 배아의 척수를 잘라냅니다. 이것은 또한 SCG의 제거 도중 경동맥에서 출혈을 감소시킬 것입니다.
    6. 이러한 배아를 해부 매체를 포함하는 준비된 50mL 원내 튜브로 이송한다. 배아가 미디어에 잠겨 있는지 확인합니다. 각 튜브는 최대 3개의 배아를 보유할 수 있습니다.
  2. 배아로부터 우수한 자궁 경부 신경절의 격리
    1. 해부 매체에서 1개의 새끼를 멸균 150mm2 페트리 접시에 고체 기판(파라핀 왁스 또는 실리콘 폴리머)으로 반으로 채워져 기판 위에 등쪽 표면을 전달합니다. 멸균 23G 바늘 3개를 사용하여 새끼를 각 팔 아래에 바늘 1개, 입을 통해 세 번째 바늘로 접시에 고정하여 목을 조심스럽게 과도하게 확장합니다.
    2. 멸균 미세 집게 (4 번 또는 5 번 포셉)를 사용하여 목 부위의 피부를 잘라 내어 침샘을 노출시하십시오. 미세 한 집게를 사용 하 여 이 땀샘을 제거 합니다.
    3. 쇄골과 기관 근처의 흉골마비토이드와 오모로이드 근육을 각각 찾습니다. 먼저 횡단 흉막 균 증 근육을 잘라 하 고 신중 하 게 미세 한 포셉을 사용 하 여 얇은 omohyoid 근육을 잘라. 이러한 근육이 제거되면 전방 끝에 있는 경동맥의 분기가 기관의 양쪽에 표시되며, SCG는 경동맥의 이 포크 아래에 위치합니다.
    4. 닫힌 집게를 사용하여 경동맥을 부드럽게 들어 올려 SCG를 시각화합니다. SCG 양쪽에 하나의 포셉을 사용하여 경동맥을 꺼내 준비된 멸균 35mm2 접시로 옮깁니다. 이 조직은 가장 가능성이 경동맥, 노도스 신경리아와 미주 신경뿐만 아니라 지역에서 근육이나 지방의 다른 세그먼트를 포함 할 것이다.
    5. 다른 쪽에서 해부 프로세스를 반복합니다. 아래에 설명된 나머지 해부 단계를 계속하기 전에 모든 배아에서 SCC를 제거하십시오. 조직 샘플의 처리를 용이하게하기 위해 35mm2 접시 중 두 개 사이에 격리 된 조직을 분배합니다.
  3. SCG의 후처리
    1. 해부된 조직에서 SCG를 분리하려면 먼저 미세 포셉을 사용하여 지방이나 근육과 같은 외부 조직을 제거하여 경동맥 양분 근처의 부위를 피하십시오.
    2. 이러한 조직이 제거되면 두 개의 간골이 표시됩니다. SCG는 아몬드 모양의 반면 노도스 신경절은 작고 원형입니다. 미주 신경을 부드럽게 당겨 미주 신경과 노도스 신경리아를 경동맥에서 분리한 다음 경동맥에서 SCG를 분리합니다.
    3. 미세 한 집게를 사용 하 여 SCG를 둘러싸는 캡슐을 제거 합니다. SCG를 새로운 35mm 문화 요리로 옮기. 모든 해부 된 조직 샘플로 프로세스를 반복합니다.
    4. 소독된 면에 연결된 유리 파이펫을 해부 매체로 코팅하여 조직이 파이펫 벽을 준수하지 못하도록 합니다. 파이펫을 사용하여 해부 매체를 콜라게나아제 형 II(1 mg/mL)/해파형 II(5mg/mL)로 칼슘및 마그네슘이 없는 HBSS로 교체하고, 37°C에서 50분 동안 배양하여 조직을 분해하도록 돕습니다.
      참고: 인큐베이션 시간은 콜라게나아제/디스파스의 다양한 배치로 최적화해야 할 수 있으며 일반적으로 40분에서 1시간 사이입니다.
    5. 인큐베이션 중에 플레이트에서 DMEM을 흡인하고 0.3 mL의 제어 매체로 교체하십시오. 플레이트를 가습 챔버에 5% CO2 미만으로 35.5°C로 저장합니다.
    6. 인큐베이션에 이어, 콜라게나아제/디스파제로 SCCG를 멸균 15mL 원문 튜브로 이송한다. 해부 매체를 사용하여 플레이트를 헹구고 용액을 튜브로 이송합니다. 볼륨을 약 10mL로 끌어올릴 수 있는 충분한 해부 미디어를 추가합니다.
    7. 원심분리기200 x g g(1000 -1200 rpm)에서 실온에서 5분간 샘플을 펠릿합니다. 펠릿을 빼내지 않도록 주의를 기울여 초퍼를 흡인합니다. 10mL의 해부 매체로 펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리를 반복하고 상체를 폐기합니다.
    8. 배양 배지의 1 - 2 mL로 교체하십시오. 좁은 보어, 구부러진 팁 멸균 파스퇴르 파이펫 (배양 매체로 미리 코팅)을 사용하여, 기계적으로 5-6 시간을 세상화하여 덩어리를 해리. 큰 덩어리가 약 1 분 동안 정착하게하십시오. 새로운 10mL 튜브로 상체 세포 현탁액을 전송합니다.
    9. 이 과정을 3회 더 반복하여 SCGs의 거의 완전한 해리를 보장하기 위해 매번 트리튜레이션의 힘이 증가합니다.
    10. 볼륨을 8 - 10 mL로 끌어 올릴 수있는 충분한 문화 매체를 추가합니다. 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하고 세포 밀도를 혈종계로 정량화합니다.
    11. 실험에 적합한 세포 밀도에서 세포 현탁액을 우물에 분배합니다. 도금 과정에서 세포 현탁액을 지속적으로 혼합하여 세포가 우물로 도용되도록 합니다.
      참고: 형태학적 분석을 위해, 24개의 웰 플레이트와 유전체 및 프로테오믹 프로토콜에 약 8,000개의 세포/우물의 세포를 플레이트, 30,000개의 세포/웰만큼 높은 세포플레이트.
    12. 플레이트를 바닥에 멸균된 물로 유리 건조기로 옮기면 가습 챔버를 만듭니다. 밀봉 전에 건조기에서 5%CO2 환경을 얻기 에 충분한 CO2(약 120mL)를 주입한다. 플레이트를 35.5°C로 유지합니다. 이를 프로토콜에서 0일이라고 합니다.
      참고: 이 플레이트는 일반 5% CO2 인큐베이터에서도 유지할 수 있습니다. 위에서 설명한 방법은 온도 및 pH 변화를 최소화하고 교차 오염을 방지하는 데도 도움이 됩니다.

5. 배양 된 SCG 뉴런 및 치료의 유지 보수

  1. 1일(도금 후 24시간)에 배양 매체의 절반을 주의 깊게 제거하고 2μM 아라-C(시토신 β-D-아라비노푸라노사이드, 항미토제)로 교체한다. 48 h의 세포에 치료를 둡니다. 일반적으로, 치료의이 길이 배양에서 비 신경 세포를 제거 하기에 충분 하다.
  2. 3일째에는 중간 크기의 절반을 부드럽게 흡인하고 제어 매체로 교체합니다.
  3. 4일째에, 세포는 실험적인 처리를 위한 준비가 되어 있습니다. 적절한 매체로 격일마다 배양을 공급하여 우물의 중간 크기의 절반을 신선한 매체로 부드럽게 대체합니다.
  4. 세럼이 없는 배지에서 배양된 SCG 뉴런은 축축한 것만 확장합니다. 실험이 원점의 존재를 필요로하는 경우, 10 % 태아 송아지 혈청, 지하 막 매트릭스 추출물의 75-100 μg / mL 또는 뼈 형태 유전학 단백질-7의 50 ng / mL로 세포를 치료하십시오. 수지상 성장은 치료의 1 주일 이내에 관찰 정교한 수지상 식목처리48 시간 이내에 관찰된다.

6. 면역 염색 배양 SCG 뉴런

  1. 0.1 M 인산염 완충제에서 4% 파라포름알데히드, pH 7.2를 연기 후드로 웰에 세포 배양 배지를 점진적으로 대체한다.
    1. 우물의 배양 매체의 절반을 제거하고 4% 파라포름알데히드로 부드럽게 교체하십시오. 그런 다음 매번 미디어의 3분의 2를 제거하고 4%의 파라포름알데히드로 교체하여 적어도 두 번 이상 프로세스를 반복합니다. 이 과정이 끝나면 우물의 미디어 색상이 분홍색에서 무색으로 바뀌었어야합니다.
    2. 모든 매체가 4% 파라포름알데히드로 대체되면 실온에서 15-20분 동안 우물을 배양합니다.
  2. 전술한 바와 유사한 공정으로, 4% 파라포름알데히드 용액을 인산염 완충식식염(PBS), pH 7.2로 점진적으로 대체한다. 5분간 그대로 둡니다. PBS로 5분 동안 우물을 두 번 더 헹구는 다.
    1. 4% 파라포름알데히드가 제거되면 플레이트를 벤치탑으로 이동하여 추가 처리를 합니다. 이 단계는 플레이트를 하룻밤 사이에 4°C로 저장할 수 있는 좋은 정지 지점입니다.
  3. 모든 PBS를 제거합니다. PBS에 0.1% 트리톤 X-100의 충분한 부피를 추가하여 세포를 덮습니다. 뉴런을 투과화하기 위해 5 분 동안 배양에 둡니다. 이 단계의 타이밍은 세포의 무결성을 유지하면서 좋은 염색을 보장하는 데 중요합니다.
  4. Triton X-100 용액을 조심스럽게 제거하고 PBS로 매번 5 분 동안 우물을 세 번 헹구습니다. PBS 솔루션을 제거합니다.
  5. PBS에 충분한 5% BSA를 추가하여 세포를 커버하고 20분 동안 실온에서 배양하여 비특이적 항체 결합을 줄입니다.
  6. 차단 용액을 제거하고 PBS에서 5% BSA로 희석된 MAP-2 단백질에 대한 마우스 단일 클론 항체로 대체하십시오. 4°C에서 하룻밤 동안 세포에 1차 항체를 둡니다.
  7. 제거하고 재사용을 위해 1 차 항체를 저장합니다. 1차 항체는 검출 강도의 손실 없이 적어도 두 번 재사용할 수 있다.
  8. 세포를 덮을 충분한 PBS로 세 번 헹구는 다. 헹구기 당 10 분 동안 세포에 PBS를 둡니다.
  9. PBS 용액을 제거하고 PBS에서 5% BSA에서 1:1000 희석에서 형광 태그-공액 염소 대마우스 IgG 이차 항체로 교체하십시오. 실온에서 어둠 속에서 2 시간 동안 배양하십시오.
  10. 이차 항체를 제거하고 PBS로 대체하십시오. 헹구기 당 10 분 동안 PBS로 우물을 세 번 헹구습니다. 우물을 물로 한 번 헹구어 소금을 제거합니다.
  11. 형광 라벨이 부착된 시료에 적합한 수성 장착제 한 방울을 포함하는 유리 슬라이드에 커버립을 장착합니다. 슬라이드를 4°C에서 슬라이드 폴더에 저장하여 이미징을 준비합니다.

7. 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로테오메의 분석을 위한 샘플 준비

  1. 배양 된 뉴런의 리시스
    1. 우물의 모든 배양 매체를 부드럽게 제거합니다. 차갑고 멸균된 칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 식염수(PBS), pH 7.4로 교체하십시오. 빨리 제거하고 PBS로 교체하고 5 분 동안 앉을 수 있습니다. 이 단계는 배양 매체에 존재하는 모든 단백질을 제거하기 위해 수행됩니다.
    2. 특정 치료를 위해 모든 우물에서 모든 PBS를 조심스럽게 제거하십시오. 프로세스를 한 번 더 반복합니다. 세포를 용해할 때 얼음 위에 플레이트를 유지하여 신경 손상과 프로테오리시스를 최소화합니다.
    3. 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 우물 중 하나에 50mM 암모늄 중탄산염, pH 7.5 (NH4HCO3)의100 - 150 μL을 추가합니다. 마이크로 파이프를 사용하여 액체를 옮기고 특정 치료를 위해 모든 우물로 긁는 공정을 반복하십시오. 대부분의 세포가 제거되었는지 확인하기 위해 긁힌 후 현미경의 밑에 우물을 검사합니다.
      1. 뉴런의 수가 적으면 제한된 부피를 사용하여 세포를 lyse하여 프로테오믹 분석을 위한 충분한 농도를 보장합니다.
    4. 세포 용액을 밤새 -80 °C로 동결하여 세포 용액을 돕습니다. 용액은 추가 처리를 위해 준비될 때까지 이 단계에서 저장할 수 있습니다.
    5. 해동되면 26 G 또는 28 G 바늘로 주사기를 통해 샘플을 분출하여 세포를 기계적으로 lyse하십시오.
    6. 초음파 처리 수조에서 샘플을 10 분 동안 두 번 초음파 처리합니다. 수조에 얼음을 추가하여 단백질의 과열및 변질을 방지합니다. 원심분리기는 12,000 x g에서4 °C에서 5 분 동안.
    7. 단백질 농도를 측정합니다. 일반적인 단백질 농도는 0.4- 1 μg/μL 범위
  2. 프로테오메 분석을 위한 샘플 제제 및 트립신 소화
    1. 최대 60μL 또는 50 μg의 단백질을 DNase, RNase 및 프로테아제없는 1.5 mL 튜브로 전달합니다. 용액의 부피가 60 μL 미만인 경우, 부피를 구성하기에 충분한 50mM 암모늄 중탄산염을 추가합니다.
    2. 0.2%의 산성 비순계활성제와 소용돌이의 25 μL을 추가합니다. 튜브를 80°C의 블록 히터에 15분 동안 배양합니다. 30 s에 대 한 12,000 x g에서 튜브원심 분리.
    3. 100mM 디티오스레이톨과 소용돌이의 2.5 μL을 추가합니다. 이것은 단백질을 alkylation 및 소화를 위해 더 접근하게 합니다. 튜브를 블록 히터에서 60°C에서 30분 동안 배양합니다. 실온과 원심분리기로 식힙니다.
    4. 샘플 과 소용돌이에 300mM 요오도아세타미드의 2.5 μL을 추가합니다. 이 단계는 시스테인을 알킬 수 있도록 하고 이황화물 결합을 개혁하는 것을 방지합니다. 어둠 속에서 실온에서 튜브를 30분 동안 배양합니다.
    5. 트립신에서 튜브에 질량 분광법 등급 트립신 (0.5 μg /μL)을 추가 : 1:10의 단백질 비율. 하룻밤 사이에 37°C에서 샘플을 소화합니다.
    6. 5% 트리플루오로아세산(TFA)과 소용돌이의 10μL을 추가합니다. 샘플을 37°C에서 90분간 배양합니다. 이 단계는 질량 분석 중에 간섭을 방지하기 위해 산성 음순 계면활성제를 가수분해하는 데 필요합니다.
    7. 원심 분리기 샘플을 4°C에서 4°C에서 30분 동안 12,000 x g로 원심분리하고, 프리 슬릿 테플론/실리콘 중격 캡을 장착한 크롬토그래피 인증 클리어 글래스 바이알로 상류체를 전달합니다. 샘플은 질량 분석 전에 -20°C에서 저장할 수 있습니다.
    8. 고화질 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피에 샘플 바이알을 피사체.

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Representative Results

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배아 SCG 뉴런의 신경 배양을 고립시키고 유지
쥐 배아 SCG로부터 해리된 세포는 폴리-D-리신 코팅 플레이트 또는 커버슬립으로 도금되어 b-신경 성장 인자를 함유한 혈청 자유 배양 배지에서 유지하였다. 뉴런과 신경교 세포의 혼합물을 포함하는 해리된 세포는 도금 시 원형으로보입니다(도 1A). 도금 24시간 이내에 뉴런은 국외 세포가 평평해지고 위상 암흑이 나타나는 작은 축축 과정을확장합니다(그림 1B). 아라-C로 치료한 후, 교반세포의 99%가 제거되고 배양은 타원형 세포 체, 광범위한 축축산 및 훈장 없음을 가진 주로 뉴런 세포를 함유하고있다(도 1C).

배양 배아 쥐 우수한 자궁 경부 신경신경의 면역 세포화학 염색
이전 연구에 따르면 혈청이 없는 배지에서 재배된 배양된 교감 뉴런은 축축산만 을 확장하고 지하 막 추출물, 10% 혈청 또는 50 ng/mL 뼈 형태유전학 단백질-7(BMP-7)2,,12의존재에서 정교한 수지상식 식소를 연장하는 것으로 나타났다. 이러한 관찰에 동의하여, 상 대비 현미경 검사법은 5일 동안 BMP-7(50 ng/mL)의 존재에서 자란 뉴런이 혈청 없는 대조군에서 자란 뉴런과 비교할 때 다중 두꺼운 테이퍼 공정을 갖는 평평한 세포 체를 갖는 것을나타낸다(그림 2). 이러한 공정의 정체성은 MAP-2, 세포체및 원원에서 주로 발견되는 사이토켈레탈 단백질의 존재에 의해 확인된다19,,20. 제어 조건하에서, MAP-2에 대한 형광 염색은 세포질 및 근해 축축 내에서 관찰되고 핵에서 제외됩니다(핵을 시각화하기 위해 핵 얼룩과 공동 라벨링하여 입증된 바와같이(도 3A-3D). 5일 동안 50 ng/mL에서 BMP-7로 치료한 후, MAP-2에 대한 면역반응성은 세포질뿐만 아니라 원원에서도 관찰된다(도3E-3H).

제어 매체에서 자란 배양된 SCG 뉴런의 샘플 프로테오믹 분석
E21 쥐 교감 뉴런은 시험관내에서 6일 동안 대조군에서 배양되었고, lc-MS 분석을 실시하였다. 샘플은 질량 분광계상에 3개의 복제체로 실행되었고, 단백질은 각 시료에 대해 관찰된 단편화된 펩타이드의 수에 기초하여 확인되었다. 단백질의 풍부(0에서 300000 이상 임의 단위까지) 및 각 단백질에 대해 관찰된 단편화된 펩타이드의 수에 기초한 단백질 ID에 대한 신뢰도 점수(5-500에 이르는)가 계산되었다. 혈청 없는 대조군 배지에서 배양된 SCG 뉴런으로부터 30 μg 단백질의 프로테아메의 질량 분광 분석에서 설정된 샘플 데이터는 도 4에도시된다.

13, 134펩타이드가 1287개의 단백질에 대응하는 샘플에서 검출되었다. 이 중 1100은 500보다 큰 정규화된 풍부값으로 세 가지 기술 복제모두에 존재했다. 이 1100단백질 중 90개의 단백질은 단백질의 작은 부분만 커버한 단일 펩타이드 히트의 존재에 의해 확인되었다. 따라서, 식별이 정확한지 여부를 결정하기 어려웠고 이러한 단백질은 단백질 신뢰도 점수(점수&10)를 가졌다. 이러한 단백질은 분석에서 제거되었고 나머지 1010단백질은 유전자 종양학을 사용하여 프로토콜이 다른 국소화 및 기능을 가진 단백질검출에 성공했는지 여부를 결정하기 위해 추가로 분석되었다.

이 데이터 세트의 유전자 온톨로지 분석은 표범 분류 데이터베이스(http://www.pantherdb.org/)를 사용하여 수행되었으며, 이 데이터 세트가 상이한 세포 국소화 또는 분자 및 생물학적 기능을 가진 단백질을 포함하고 있는지 확인하고 확인된 단백질과 공지된경로(21)사이의 연관성이 있는지 여부를 검사하였다. 분석 결과 700개 이상의 단백질이 세포질이었지만, 그 데이터 세트에는 핵, 막, 여러 세포 세포기관 및 세포 접합(도4A)을포함한 세포의 다른 부위에 국한된 단백질이 포함되어 있는 것으로 나타났다. 분석은 또한 400개 이상의 단백질이 촉매 활성을 가지고 있으며, 약 300개의 단백질이 신호경로(도 4B 및 도 4C)에관여했다는 것을 밝혔습니다. 또한, 데이터셋에는 다양한 신호 경로에 관여하는 단백질이 포함되어 있었다. 표 1은 G 단백질 신호, 세포 접착, 성장 인자 신호 경로 및 시냅스 소포 인신 매매 경로에서 각각 5가지 단백질을 나타내며, 이는 데이터 집합에서 각각 확인되었다.

Figure 1
그림 1: 시간이 지남에 따라 배양 된 E21 쥐 배아 SCG 뉴런의 형태에 변화가 있습니다. 대표적인 상 대비 현미경 이미지는 도금 후 20분(A), 도금(B) 후 1일 후,A아라-C 처리(도금 후 5일 후) (C)로부터 분리된 세포의B10배배배율(A)C 신경교 세포 (화살표) 및 축 축 확장 (화살표 헤드)의 존재(B),신경교 세포및 뉴런의 부재(C)에서광범위한 축 하 성장을 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: BMP-7로 치료 후 E21 쥐 SCG 뉴런의 뉴런 형태에 대한 변화. 비신경 세포의 제거에 따라, 배양된 SCG 뉴런은 5일 동안 50 ng/mL(B)에서 대조군 미디어(A) 또는 BMP-7로 치료되었다. 대표적인 상 대비 현미경(10x 배율)은 BMP-7(화살표, B)로치료할A때 여러 개의 짧은 점막과 같은 과정을 가진 축축이 있는 원형 뉴런 세포 체를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 배양배 쥐 교감 뉴런에서 MAP-2 단백질에 대한 면역 염색. 비신경 세포의 제거에 따라, 배양된 SCG 뉴런은 5일 동안 대조군(A-D) 또는 BMP-7로 치료되었고, MAP-2에 대한 마우스 단클론 항체를 이용하여 면역염색을 하고 핵마커와 공동 표지하였다.A-DE-H 현미경-2(MAP-2)를 가진 뉴런의 면역세포화학적 염색을 나타내는 대표적인 현미경 그래프(MAP-2)(C,G),핵얼룩(D,H)을상 대비현미경(B,F)및 3개의채널(A,E)의병합한다. 마이크로투블러 관련 단백질-2에 대한 면역세포화학염색은 BMP-7 치료뉴런(G)에서 세포체 및 근접축(C) 및 MAP-2 단백질에 대한 염색에 존재한다.CG 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 배양된 E21 쥐 SCG 뉴런의 프로테아메 분석에서 확인된 단백질의 분류 및 분포. 1100단백질을 위한 단백질 ID는 세포국화(A), 세포 기능 및 생물학적 과정에 관한 데이터 세트의 단백질 분포를A검사하기 위해 Panther 분류 시스템에 대한 유전자 종양학 분석을 실시하였다(B) 및 단백질 구조(C)에 기초한 분자 기능 클래스.BC 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

A) 생물학적 접착에 관여하는 단백질
유니프로트 가입 ID 유전자 이름 유전자 기호
Q9Z1Y3 카데린-2 Cdh2
O35112 CD166 항원 알캄 (알캠)
P49134 인테그린 베타-1 Itgb1
D3ZES7 플렉스인 A4 플렉스나4
F1LP44 인테그린 서브유닛 알파 L 이갈 (주)
B) 성장 인자 신호에 관여하는 단백질
P35213 14-3-3 단백질 베타/알파 이합
Q5BJ92 세린/스레오닌 단백질 인산염 4촉매 서브유닛 Ppp4c
P47196 락 – 알파 세린/스레오닌 단백질 키나아제 Akt1
P62994 성장 인자 수용체 바운드 단백질 2 Grb2
P21708 미토겐 활성화 단백질 키나아제 3 Mapk3
C) G 단백질 결합 신호 경로에 관여하는 단백질
P08753 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 G(k) 서브유닛 알파 그나이3
D4ABV5 칼모둘린-2 Calm2
P18266 글리코겐 신타제 키나세-3 베타 Gsk3b
P09456 cAMP 의존성 단백질 키나아제 타입 I-알파 조절 하위 유닛 프라카르1아
P53534 글리코겐 인스포릴라제 파이그Gb (뇌 형태)
D) 시냅스 소포 인신매매에 관여하는 단백질
P47861 시냅토타그민-5 Syt5
P63045 소포 관련 막 단백질 2 뱀파이어2
P61265 구문신-1B Stx1b
Q63537 시냅신-2 Syn2
P60881 시냅토소말 관련 단백질 25 스냅25

표 1: 배양된 쥐 배아 SCG 뉴런으로부터 프로테아메 데이터에서 확인된 대표적인 단백질은 생물학적 기능에 의해 분류된다. 1100 단백질을 이용한 프로테아메 데이터는 팬더 분류 시스템을 사용하여 유전자 종양학 분석을 실시하였다. 아래에 나열된 상위 5가지 단백질은 4개의 생물학적 통로를 위해 확인되었습니다.

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Discussion

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이 논문은 배아 쥐 새끼의 우수한 자궁 경부 신경교에서 동정 신경을 배양하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 모델 시스템을 사용하는 장점은 성장 인자에 유사한 반응을 제공하는 뉴런의 균일한 집단을 얻을 수 있고, 이러한 뉴런에 대한 성장 인자 요구 사항이 잘 특징적이기 때문에, 혈청이 없는 조건 하에서 정의된 매체에서 이러한 뉴런을 성장시킬 수있다. 프로토콜은 E21 쥐 새끼로부터 SCG를 격리하는 과정을 설명하지만, 이 프로토콜은 E17에서 E21까지 의 랫 트 새끼에서 SCG의 해부및 배아 마우스 SCG10,,22,,23의해부에 사용될 수 있다. 이 해부 프로토콜은 또한 초기 단계에 사소한 수정과 산후 쥐에서 SCG를 격리하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 수정에는 C-섹션에 대한 필요성 제거, 이산화탄소를 이용한 산후 동물의 안락사, 70% 알코올에 새끼를 침수하여 안사후 새끼의 살균, 해부 미디어10으로이송하기 전의 제거 등이 포함된다. 이 신경 배양 프로토콜은 또한 캄페노 챔버와 미세 유체 챔버(24,,25)를사용하여 축축골 지도, 축축한 수송 및 시냅스 형성을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 이러한 뉴런은 또한 등쪽 뿌리 신경낭 또는 척추 운동 뉴런또는 심근세포와 함께 신경 작용 과 뉴런을 연구할 수 있습니다 – 말초 신경계에서의 표적 상호작용(26,,27,,28,,29).

면역 세포화학 연구를 위한 배양된 SCG 뉴런의 사용은 잘 문서화되어 있습니다. 논문에 기재된 프로토콜은 대부분의 항체와 함께 일하기 위한 좋은 출발점을 제공한다. 그러나, 고정 프로토콜 및 과립 프로토콜에 대한 수정을 요구할 수 있는 핵 단백질을 검출하는 것과 같은 항체가 있다. 인-SMAD 항체의 경우- -20°C에서 100% 메탄올을 사용한 치료는 뉴런30,,31을고정 및 투과화하는 데 사용되어 왔다.

이 모델 시스템에서 작업의 주요 한계는 배아 쥐 새끼에 있는 SCGs의 작은 크기에서 유래합니다, 뉴런의 작은 수 귀착됩니다. 이것은 새끼의 한 쓰레기의 해부에서 얻을 수 있는 핵산 또는 단백질의 한정된 양 결과. 이것은 유전체및 proteomic 분석을 위해 문제가 될 수 있습니다, 특히 한 해부에서 다중 처리 사이 를 비교할 때. 또한 단일 배아로부터 SCG 뉴런 배양을 얻을 수 없다. 따라서 모든 실험은 쓰레기에 있는 모든 쥐 배아의 SCG에서 얻어진 풀링된 견본에, 수행됩니다. 시스템의 또 다른 한계는 SCG 뉴런이 중앙뉴런(32)에비해 DNA 형질 효율(10-20%, 미공개 관찰)과 더 높은 독성을 가지고 있다는 것이다. 이 경피 효율은 개별 적인 뉴런을 가진 형태학 연구 결과에 대 한 괜 찮 아 요, 그것은 감지/유전자 발현 변화를 확인 하는 분자 또는 생 화학 연구를 수행 하기 어렵다.

그러나, 최근 몇 년 동안, 배양된 SCG 뉴런은 수지상 성장의 근본적인 기전을 검토하고 전사및 miRNome 분석14,,15,,33에대한 연구를 위해 사용되어 왔다. 앞서 나타난 바와 같이, 낮은 단백질 양으로 인해, 배아 SCG에서 배양 된 뉴런은 프로테오믹 분석을 위해 이전에 사용되지 않았습니다. 이 프로토콜 및 대표적인 결과는 샘플의 낮은 농도에도 불구하고, 현재 고화질 질량 분석 기기가 이 뉴런에 대한 프로테오믹 연구에 사용될 수 있다는 증거를 제공합니다. 여기에 설명된 샘플 준비 프로토콜은 SCG 뉴런을 위한 것이지만, 이 프로토콜은 LC-MS 분석을 위한 낮은 단백질 농도를 가진 임의의 시료의 제조를 위해 사용될 수 있다. 한계 중 하나는 단백질 농도 또는 트립신 소화의 효율성에 있는 작은 변이 불완전한 단편화 및 LC-MS에 의해 검출된 단백질의 수에 있는 극적인 감소귀착될 수 있다는 것입니다. 따라서, 단백질 농도를 시작하는 것이 단백질의 10:1 비율로 50 μg에 가깝다는 것을 확인하는 것이 중요합니다: 트립신. 또한, 여러 동결 해동 주기를 방지하기 위해 질량 분석 등급 트립신을 알리트하는 것이 좋습니다.

프로토콜의 또 다른 제한은 프로테오메에서 검출된 막 이상 단백질의 제한된 수만이 있었다는 것입니다. 산성 비순색 계면활성제는 질량 분광법을 위한 효과적인 계면활성제로 나타났지만, 배양된 세포에 대한 이전 연구에 따르면 이러한 계면활성제는 세포질 단백질의 수를 약간 증가시키고 프로테오믹프로파일(34)에서막 단백질을 감소시킬 수 있음을 발견했다. 또한, Lys-C와 같은 세균성 내피티다아제를 이용한 사전 소화가 트립신 소화 전에 막 바운드 단백질의 트립신 소화의 효율을 향상시키고 멤브레인 단백질 단편이 LC컬럼(35)에유지되는 것을 방지할 수 있다는 것이 제안되고 있다.

요약하자면, 이 논문은 배양된 쥐 배아 교감 뉴런을 재배하고 이러한 뉴런에 대한 형태학적 및 프로테오믹 연구를 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 세인트 메리 의 캘리포니아 대학에서 교수 개발 기금 과 여름 연구 프로그램 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 또한 데이비스에 캘리포니아 대학의 파멜라 린 박사와 UC 버클리 질량 분광시설에서 안토니 이아바론 박사에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 또한 비디오 제작 및 편집에 대한 그녀의 도움에 대한 세인트 메리 의 캘리포니아 대학의 대학 커뮤니케이션 사무실에서 헤일리 넬슨에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D nanoACQUITY Waters Corporation
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
BMP-7 R&D Systems 354-BP
Bovine Serum Alumin Sigma-Aldrich 5470
Cell scraper Corning CLS-3010
Collagenase Worthington Biochemical 4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates Fisher Scientific 07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) ATCC 30-2200
Dispase II Roche 4942078001
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11885
Fatty Acid Free BSA Calbiochem 126609 20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 Ted Pella Inc 5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection Ted Pella Inc 1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mm Neuvitro Corporation GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated Thermo Fisher Scientific A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) Thermo Fisher Scientific 14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) Thermo Fisher Scientific 41400-045
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Leibovitz L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
Mounting media for glass coverslips Thermo Fisher Scientific P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) BioLegend SMI 52
Nerve growth factor Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) BT5017 Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye Spectrum Chemicals P1010
Penicillin-Streptomycin (100X) Thermo Fisher Scientific 15140
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P0899
Prionex Millipore 529600 10% solution, 100 mL
RapiGest SF Waters Corporation 186001861 5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry Waters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing grade Thermo Fisher Scientific 28904 10 X 1 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin Promega or NEB V511A, P8101S 100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials Waters Corporation 186000385c

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References

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형태학적 및 프로테오믹 분석을 위한 배아 우수한 자궁 경부 간리아에서 쥐 동정 신경을 배양
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Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).More

Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).

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