Summary
Dette papiret beskriver isolasjon og dyrking av embryonale rotte sympatiske nevroner fra de overlegne cervical ganglia. Det gir også detaljerte protokoller for immunocytokjemisk farging og for å forberede nevronale ekstrakter for massespektrometrisk analyse.
Abstract
Sympatiske nevroner fra embryonale rotte overlegne cervical ganglia (SCG) har blitt brukt som et in vitro-modellsystem for perifere nevroner for å studere aksonal vekst, aksonal smugling, synaptogenesis, dendrittisk vekst, dendrittisk plastisitet og nervemålinteraksjoner i co-kultursystemer. Denne protokollen beskriver isolasjon og dissosiasjon av nevroner fra de overlegne livmorhalsgangene til E21 rotteembryoer, etterfulgt av preparat og vedlikehold av rene nevronale kulturer i serumfritt medium. Siden nevroner ikke holder seg til ubestrøket plast, vil nevroner bli dyrket på enten 12 mm glassdeksler eller 6-brønns plater belagt med poly-D-lysin. Etter behandling med et antimitotisk middel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside), genererer denne protokollen sunne nevronale kulturer med mindre enn 5% ikke-nevronale celler, som kan opprettholdes i over en måned in vitro. Selv om embryonale rotte SCG nevroner er multipolar med 5-8 dendritt in vivo; under serumfrie forhold strekker disse nevronene bare en enkelt axon i kultur og fortsetter å være unipolar i løpet av kulturen. Imidlertid kan disse nevronene induseres til å utvide dendrittene i nærvær av kjellermembranekstrakt, beinmorfogenetiske proteiner (BMPs), eller 10% føtal kalveserum. Disse homogene nevronale kulturene kan brukes til immunocytokjemisk farging og til biokjemiske studier. Dette papiret beskriver også optimalisert protokoll for immunocytokjemisk farging for mikrotubuli assosiert protein-2 (MAP-2) i disse nevronene og for fremstilling av nevronale ekstrakter for massespektrometri.
Introduction
Sympatiske nevroner avledet fra embryonale overlegne cervical ganglia (SCG) har blitt mye brukt som et primært nevronalt kultursystem for å studere mange aspekter av nevronal utvikling, inkludert vekstfaktoravhengighet, neuron-mål interaksjoner, nevrotransmitter signalering, aksonal vekst, dendritt utvikling og plastisitet, synaptogenesis og signalmekanismer underliggende nerve-mål/ neuron-glia interaksjoner1,2,3,4,5,6,7,8,9. Til tross for sin lille størrelse (rundt 10000 nevroner / ganglia), er det tre hovedgrunner til utvikling og utstrakt bruk av dette kultursystemet er i) å være de første gangliaene i den sympatiske kjeden, de er større, og derfor lettere å isolere, enn resten av de sympatiske ganglia10; ii) i motsetning til sentrale nevroner, nevronene i SCG er ganske homogene med alle nevronene blir avledet fra nevrale crest, har en lignende størrelse, avhengighet av nerve vekstfaktor og være nor-adrenerge. Dette gjør dem til en verdifull modell for morfologiske og genomiskestudier 10,,11 og iii) disse nevronene kan opprettholdes i et definert serumfritt medium som inneholder nervevekstfaktor i over en måned10,12. Perinatal SCG nevroner har blitt mye brukt til å studere mekanismene som ligger til grunn for initiering og vedlikehold av dendritt2. Dette skyldes hovedsakelig, selv om SCG-nevroner har en omfattende dendrittisk arbor in vivo, utvider de ikke dendritt in vitro i fravær avserum,men kan induseres til å vokse dendritter i nærvær av visse vekstfaktorer som beinmorfogenetiske proteiner2,12,,13.
Dette papiret beskriver protokollen for å isolere og kultivere embryonale rotte SCG nevroner. I løpet av de siste 50 årene har primære nevronale kulturer fra SCG hovedsakelig blitt brukt til morfologiske studier med et begrenset antall studier som undersøker de store genomiske eller proteomiske endringene. Dette skyldes hovedsakelig liten vevstørrelse som resulterer i isolering av lave mengder DNA eller protein, noe som gjør det vanskelig å utføre genomiske og proteomiske analyser på disse nevronene. Men de siste årene har økt deteksjonsfølsomhet gjort det mulig å utvikle metoder for å undersøke genomet, miRNome og proteome i SCG-nevronene under dendrittisk vekstutvikling14,,15,,16,,17. Dette papiret vil også beskrive metoden for morfologisk analyse av disse nevronene ved hjelp av immunocytochemistry og en protokoll for å oppnå nevronale proteinekstrakter for massespektrologisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer utført i studier som involverte dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Saint Mary's College of California. Retningslinjene for dyrepleie og bruk ved Saint Mary's College ble utviklet basert på retningslinjene fra Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf and https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Utarbeidelse av kulturmedier (også referert til som kontrollmedium)
- Tilsett følgende ingredienser, i rekkefølgen som er oppført nedenfor, til en steril 500 ml kolbe: 190 ml 1x lavglukose DMEM, 10 ml 20 mg/ml fettsyrefri storfe serumalbumin (FAF-BSA) i DMEM, 2,8 ml 200 ml l-glutamin, 4 ml insulin-selen-transferrin blanding, 0,4 ml av 125 μg / ml nerve vekstfaktor (i 0,2% inert protein stabilisator i DMEM), og 200 ml av Hams F-12 medium.
- Pass på å belegge pipetten med mediet som inneholder FAF-BSA før tilsetning av proteinholdige løsninger som insulin-selen-transferrin og NGF for å hindre stikker av proteiner til pipetten.
- Virvle kolben for å blande ingrediensene etter hvert tillegg. Bland godt med en 25 ml pipette etter tilsetning av F-12.
- Aliquot kultur media i 10 ml aliquots og lagre på -80 °C. Aliquots kan lagres i seks måneder uten tap av aktivitet.
2. Fremstilling av plater for dyrking av nevroner
- Fortynn en 1 mg/ml bestand av poly-D-lysin (laget i 0,5 M Tris buffer, pH 8) til 100 μg/ml med sterilt destillert vann.
- For proteomisk eller genomisk analyse, en til to dager før disseksjonen, belegg 6-brønnsplater med ca. 2 ml steril 100 g/ml poly-D-lysin (PDL). Dette er nødvendig for å sikre celle vedheft til brønnen. Pakk platene med plastfolie og oppbevar platene over natten ved 4 °C.
- For morfologisk analyse og mikroskopi, plasser 12 mm2 forhåndsbehandlede tyske glassdeksler (som kan rengjøres ved hjelp av salpetersyrebehandling som beskrevettidligere 18 eller kjøpt) i hver av brønnene på en 24-brønns plate.
- Coat dekkglassene med 0,3 ml steril 100 g/ml poly-D-lysin (PDL). Oppbevar platene over natten ved 4 °C.
- På disseksjonsdagen, før disseksjonsstart, fjerner du poly-D-lysinløsningen fra brønnene og skylle brønnene fem ganger med sterilt destillert vann, etterfulgt av en gang med lavt glukose DMEM.
- Under den enzymatiske fordøyelsen av ganglia (omtrent en time før plating cellene), aspirere DMEM fra platene og erstatte den med 0,3 ml kontrollmedier. Oppbevar platene ved 35,5 °C under 5 % CO2 i et fuktet kammer.
3. Disseksjon oppsett
- Utarbeidelse av 200 ml media for disseksjon (referert til som disseksjonsmedier)
- Tilsett 8 ml 20 mg/ml fettsyrefri storfe serumalbumin (FAF-BSA) i lav glukose DMEM (med 1 mg/ml glukose) og 2 ml 100x penicillin-streptomycin til 193 ml sterilt Leibovitz's L-15 medium (eller et luftbufret medium)
- I panseret, sett opp følgende elementer for disseksjon: fire 50 ml sterile koniske rør med ca 20 ml disseksjonsmedi i hvert rør, fire sterile 35 mm retter med 1,5 ml avhandlingsmedier, ett sterilt konisk rør på 50 ml konisk 20 ml avhandlingsmedier for sentrifugering, ett sterilt konisk rør på 15 ml for sentrifugering av , og en steril 10 ml rør for å samle dissosierte celler.
- Bruk en tørr perlesterilisator til å sterilisere et par fine tang (nr.4 eller nr. 5 tang) i minst ett minutt.
4. Isolering av de overlegne cervical ganglia fra embryonale rottevalper
- Fjerning av E21 embryoer fra den gravide rotten
MERK: Fjerning av livmorhornet kan utføres utenfor panseret hvis det omkringliggende området er grundig sterilisert.- Euthanize den gravide rotten ved hjelp av CO2 innånding. Skjær pelsen fra bukregionen og tørk huden i området med 70% alkohol for å sterilisere den.
- Ved hjelp av et nytt sett med steril saks og tang, kutt gjennom huden og deretter muskellaget for å avsløre livmorhornene som inneholder embryoene. Fjern livmorhornene med embryoene ved hjelp av et nytt sett med saks og tang, og ta vare på å ikke skade tarmene i prosessen.
- Overfør livmorhornene med embryoene til en 150 mm2 steril petriskål og overfør dem til panseret.
- Bruk et nytt sett med tang og saks, fjern embryoene fra livmorhornet og skill embryoene fra fostervannsmembranene og morkaken.
- For å euthanize embryoene, kutt ryggmargen til embryoene langs midtlinjen under høyre arm. Dette vil også redusere blødningen fra halspulsåren under fjerning av SCG.
- Overfør disse embryoene til de tilberedte 50 ml koniske rørene som inneholder disseksjonsmedier. Kontroller at embryoene er nedsenket i media. Hvert rør kan holde opptil 3 embryoer.
- Isolering av den overlegne cervical ganglion fra embryoet
- Overfør en valp fra disseksjonsmediet til en steril 150 mm2 Petriskål halvfylt med solid substrat (enten parafinvoks eller silikonpolymer), med sin dorsale overflate på underlaget. Bruk tre sterile 23 G nåler, pin valpen til parabolen med en nål under hver arm og en tredje nål gjennom munnen for å forsiktig hyperextend nakken.
- Skjær gjennom huden i nakkeområdet ved hjelp av sterile fine tang (nr. 4 eller nr. 5 tang) for å eksponere spyttkjertlene under. Fjern disse kjertlene ved hjelp av fine tang.
- Finn sternocleidomastoid og omohyoid muskler nær kragebenet og luftrøret, henholdsvis. Først kutte tverrgående sternocleidomastoid muskler og deretter forsiktig kutte den tynne omohyoid muskelen ved hjelp av fine tang. Når disse musklene er fjernet, vil bifurcation i halspulsåren på den fremre enden være synlig på hver side av luftrøret, med SCG plassert under denne gaffelen i halspulsåren.
- Bruk lukkede tang, løft forsiktig halspulsåren for å visualisere SCG. Bruk en tang på hver side av SCG, trekk ut halspulsen og overfør den til de tilberedte sterile 35 mm2 retter. Dette vevet vil mest sannsynlig inneholde SCG med halspulsåren, vagusnerven med nodoseganglia samt andre segmenter av muskel eller fett i området.
- Gjenta disseksjonsprosessen på den andre siden. Fjern SCGs fra alle embryoer før du fortsetter med de gjenværende disseksjonstrinnene som er skissert nedenfor. Fordel det isolerte vevet mellom to av de 35 mm2 rettene for å lette behandlingen av vevsprøvene.
- Etterbehandling av SCG
- For å skille SCG fra det dissekerte vevet, bruk først fine tang for å fjerne overflødig vev, for eksempel fett eller muskel, og vær forsiktig for å unngå området i nærheten av karotisbifurcation.
- Når disse vevene er fjernet, er to ganglia synlige. Nodoseganglionen er mindre og sirkulær, mens SCG er mandelformet. Trekk forsiktig på vagusnerven for å skille vagusnerven og nodosegangliaene fra halspulsåren og deretter skille SCG fra halspulsåren.
- Bruk fine tang for å fjerne kapselen som omgir SCG. Overfør SCG til en ny 35 mm kulturrett. Gjenta prosessen med alle dissekerte vevsprøver.
- Coat en sterilisert, bomull plugget glass pipette med disseksjon media for å hindre vevet fra å følge pipette veggene. Bruk pipetten til å erstatte disseksjonsmediet med steril 2 ml kollagnase type II (1 mg/ml)/dispase type II (5 mg/ml) i kalsium- og magnesiumfri HBSS, og inkuber i 50 min ved 37 °C for å bidra til å bryte ned vevet.
MERK: Inkubasjonstiden må kanskje optimaliseres med forskjellige grupper av Collagenase/Dispase og varierer vanligvis fra 40 min til en time. - Under inkubasjonen aspirerer DMEM fra platene og erstatter den med 0,3 ml kontrollmedier. Oppbevar platene ved 35,5 °C under 5 % CO2 i et fuktet kammer.
- Etter inkubasjonen, overfør SCGs i collagenase / dispase til et sterilt 15 ml konisk rør. Bruk disseksjonsmediet til å skylle platene og overføre løsningen til røret. Tilsett nok disseksjonsmedier til å øke volumet til ca. 10 ml.
- Sentrifuge ved 200 x g (1000 - 1200 o/min) i 5 minutter ved romtemperatur for å pellet prøven. Aspirer den overnaturlige, ta vare på å ikke løsne pellet. Resuspend pellet med 10 ml disseksjonsmedier. Gjenta sentrifugeringen og kast overnatanten.
- Erstatt med 1 - 2 ml kulturmedium. Ved hjelp av en smal-bore, bøyd-tip steril pasteur pipette (pre-belagt med kultur medium), mekanisk dissosiere klumper ved forsiktig triturating 5-6 ganger. La de større klumpene bosette seg i omtrent ett minutt. Overfør den overnaturlige cellefjæringen til et nytt 10 ml rør.
- Gjenta denne prosessen 3 ganger til, med økende triturasjonskraft hver gang for å sikre nesten fullstendig dissosiasjon av SCGs. Overfør supernatanten etter hver runde med triturasjon til et 10 ml rør med supernatant fra første triturasjon.
- Legg nok kulturmedier til å øke volumet til 8 - 10 ml. Bland cellefjæringen forsiktig og kvantifisere celletettheten med et hemocytometer.
- Fordel cellesuspensjonen i brønnene ved riktig celletetthet for eksperimentene. Bland cellesuspensjonen kontinuerlig under platingprosessen for å sikre jevn fordeling av celler i brønnene.
MERK: For morfologisk analyse, plate cellene rundt 8000 celler / brønn i en 24 brønnplater og for genomiske og proteomiske protokoller, plate cellene så høyt som 30.000 celler / godt. - Overfør platene til en glassdesiccator med sterilt vann nederst for å skape et fuktet kammer. Injiser nok CO2 (rundt 120 ml) for å få et 5 % CO2-miljø i desiccatoren før tetningen. Vedlikehold platene ved 35,5 °C. Dette kalles dag 0 i protokollen.
MERK: Disse platene kan også vedlikeholdes i en vanlig 5% CO2 inkubator. Metoden som er beskrevet ovenfor, minimerer temperatur- og pH-endringer og bidrar også til å forhindre krysskontaminering.
5. Vedlikehold av de kultiverte SCG nevroner og behandlinger
- På dag 1 (24 timer etter plating), forsiktig fjerne halvparten av kulturmediene, og erstatte med 2 μM Ara-C (cytosin β-D-arabinofuranoside, et anti-mitotisk middel). La behandlingen stå på cellene i 48 timer. Vanligvis er denne lengden på behandlingen tilstrekkelig til å eliminere ikke-nevronale celler i kulturen.
- På dag 3, forsiktig aspirere halvparten av mediet og erstatte med kontrollmedium.
- På dag 4 er cellene klare for eksperimentelle behandlinger. Mate kulturer annenhver dag med riktig medium, forsiktig erstatte halvparten av mediet i brønnen med frisk medium.
- Kultiverte SCG-nevroner i serumfritt medium strekker seg bare axons. Hvis eksperimenter krever tilstedeværelse av dendritter, behandle celler med enten 10% fosterkalv serum, 75-100 μg / ml kjeller membran matrise ekstrakt eller 50 ng / ml bein morfogenetisk protein-7. Dendrittisk vekst observeres innen 48 timer etter behandling med forseggjort dendrittisk arbor observert innen en uke etter behandling.
6. Immunostaining kultiverte SCG nevroner
- Gradvis erstatte cellekulturmediet i brønnen med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,2 i en røykhette.
- Fjern halvparten av kulturmediene i brønnen og erstatt den forsiktig med 4% paraformaldehyd. Gjenta deretter prosessen minst to ganger til, fjerne to tredjedeler av mediet i brønnen hver gang og erstatte med 4% paraformaldehyd. På slutten av denne prosessen skal fargen på media i brønnen ha endret seg fra rosa til fargeløs.
- Når alt mediet er erstattet av 4% paraformaldehyd, inkubere brønnene i 15 - 20 minutter ved romtemperatur.
- Med en lignende prosess som beskrevet ovenfor, gradvis erstatte 4% paraformaldehyd løsning med fosfat-bufret saltvann (PBS), pH 7.2. La stå i 5 minutter. Skyll brønnene to ganger til i 5 minutter hver med PBS.
- Når 4% paraformaldehyd er fjernet, flytt platene til benkeplaten for videre behandling. Dette trinnet er et godt stoppested hvor plater kan lagres ved 4 °C over natten.
- Fjern alle PBS. Legg til nok volum på 0,1% Triton X-100 i PBS for å dekke cellene. La det stå på kulturene i 5 minutter for å gjennomsyre nevronene. Tidspunktet for dette trinnet er avgjørende for å sikre god farging samtidig som cellene opprettholder integriteten.
- Fjern Triton X-100-oppløsningen forsiktig og skyll brønnene tre ganger i 5 minutter hver gang med PBS. Fjern PBS-løsningen.
- Tilsett nok 5% BSA i PBS for å dekke cellene og inkubere ved romtemperatur i 20 minutter for å redusere ikke-spesifikk antistoffbinding.
- Fjern blokkeringsløsningen og erstatt den med et monoklonalt musestoff mot MAP-2-protein fortynnet i 5 % BSA i PBS. La det primære antistoffet stå på cellene over natten ved 4 °C.
- Fjern og lagre det primære antistoffet for gjenbruk. Det primære antistoffet kan gjenbrukes minst to ganger uten tap av deteksjonsintensitet.
- Skyll tre ganger med nok PBS til å dekke cellene. La PBS på cellene i 10 minutter per skylling.
- Fjern PBS-løsningen og erstatt den med fluorescerende tag-konjugert Geit anti-Mus IgG sekundært antistoff på 1:1000 fortynning i 5% BSA i PBS. Inkuber i 2 timer i mørket ved romtemperatur.
- Fjern det sekundære antistoffet og bytt det ut med PBS. Skyll brønnene tre ganger med PBS i 10 minutter per skylling. Skyll brønnene en gang med vann for å fjerne salter.
- Monter dekkglassene på glasssklier som inneholder en dråpe vandig monteringsvæske som passer for fluorescerende merkede prøver. Oppbevar lysbildene ved 4 °C, i en lysbildemappe til de er klare for bildebehandling.
7. Prøve forberedelse for analyse av proteom ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med massespektrometri
- Lysis av kultiverte nevroner
- Fjern forsiktig alle kulturmediene i brønnene. Bytt den ut med kaldt, sterilt kalsium og magnesiumfritt fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7.4. Fjern raskt og bytt ut med PBS og la den sitte i 5 min. Dette trinnet er gjort for å fjerne eventuelle proteiner som finnes i kulturmediene.
- Fjern nøye alle PBS fra alle brønnene for en bestemt behandling. Gjenta prosessen en gang til. Hold plater over is når du lyser cellene for å minimere nevronal skade og proteolyse.
- Tilsett 100 - 150 μL på 50 mM ammoniumbikarbonat, pH 7.5 (NH4HCO3) til en av brønnene og skrap celler ved hjelp av en steril celleskraper. Bruk en mikropipette til å overføre væsken og gjenta skrapprosessen med alle brønnene for en bestemt behandling. Undersøk brønnene under mikroskopet etter skraping for å sikre at de fleste cellene er fjernet.
- Med det lave antallet nevroner, bruk et begrenset volum for å lyse cellene for å sikre høy nok konsentrasjon for proteomisk analyse.
- Frys oppløsningen ved -80 °C over natten for å hjelpe til med cellelys. Lysates kan lagres på dette stadiet til klar for videre behandling.
- Når de er tint, spruter du prøvene gjennom en sprøyte med en 26 G eller 28 G nål for å mekanisk lyse cellene.
- Sonicate prøvene i et sonikering vannbad to ganger i 10 minutter. Tilsett is i vannbadet for å forhindre overoppheting og denaturation av proteiner. Sentrifuge i 5 minutter ved 4 °C ved 12 000 x g.
- Mål proteinkonsentrasjonen. Typiske proteinkonsentrasjoner varierer fra 0,4 - 1 μg/μL
- Eksempel forberedelse og trypsin fordøyelsen for proteome analyse
- Overfør maksimalt 60 μL av lysatet eller 50 μg protein til et DNase-, RNase- og proteasefritt 1,5 ml rør. Hvis volumet av lysatet er mindre enn 60 μL, tilsett nok 50 mM ammoniumbikarbonat for å gjøre opp volumet.
- Tilsett 25 μL 0,2 % surt labile overflateaktivt middel og virvel. Inkuber røret i en blokkvarmer ved 80 °C i 15 minutter. Sentrifuger røret ved 12 000 x g i 30 s.
- Tilsett 2,5 μL på 100 mM dithiothreitol og vortex. Dette gjør proteinet mer tilgjengelig for alkylasjon og fordøyelse. Inkuber røret ved 60 °C i en blokkvarmer i 30 minutter. Avkjøl til romtemperatur og sentrifuge.
- Tilsett 2,5 μL på 300 mM iodoacetamid i prøven og virvelen. Dette trinnet bidrar til å alkylate cysteinene og hindrer dem i å reformere disulfidbindingene. Inkuber rørene ved romtemperatur i mørket i 30 minutter.
- Tilsett massespektrometri klasse trypsin (0,5 μg / μL) til røret ved en trypsin: protein ratio på 1:10. Fordøy prøvene ved 37 °C over natten.
- Tilsett 10 μL av 5 % trifluoretaksyre (TFA) og virvel. Inkuber prøvene ved 37 °C i 90 minutter. Dette trinnet er nødvendig for å hydrolysere syrelaboratorisk overflateaktivt middel for å forhindre interferens under massespektrometri.
- Sentrifuger prøvene ved 12 000 x g ved 4 °C i 30 minutter og overfør supernatant til et kromatografisertifisert hetteglass med preslit Teflon/Silikon septum caps. Prøver kan lagres ved -20 °C før massespektrometrianalyse.
- Forsøksoppleggene mot flytende kromatografi kombinert med hd-massespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolere og vedlikeholde nevronale kulturer av embryonale SCG-nevroner
Dissosierte celler fra rotte embryonale SCG ble belagt i en poly-D-lysinbelagt plate eller dekklips og opprettholdt i serumfrie kulturmedier som inneholder b-nervevekstfaktor. De dissosierte cellene som inneholder en blanding av nevroner og glialceller ser sirkulære ut på plating (figur 1A). Innen 24 timer etter plating utvider nevronene små aksonale prosesser med glialceller som flater ut og vises fase-mørk under fasekontrastmikroskopi (figur 1B). Etter behandlingen med Ara-C elimineres 99 % av glialcellene, og kulturene inneholder hovedsakelig nevronale celler med en oval cellekropp, omfattende aksonal vekst og ingen dendritt (figur 1C).
Immunocytokjemisk farging av kultiverte embryonale rotte overlegne cervical ganglia nevroner
Tidligere studier har vist at kultiverte sympatiske nevroner dyrket i serumfritt medium strekker seg bare aksoner og bare utvider en forseggjort dendrittisk arbor i nærvær av kjellermembranekstrakt, 10% serum eller 50 ng / ml beinmorfogenetisk protein-7 (BMP-7)2,12. I samsvar med disse observasjonene viser mikroskopi med fasekontrast at nevroner dyrket i nærvær av BMP-7 (50 ng/ml) i 5 dager har en flatcellekropp med flere tykke koniske prosesser sammenlignet med nevroner dyrket i serumfrie kontrollmedier (figur 2). Identiteten til disse prosessene som dendritter er bekreftet av tilstedeværelsen av MAP-2, et cytoskeletalt protein som hovedsakelig finnes i cellekroppen og dendrittene19,20. Under kontrollforhold observeres fluorescerende farging for MAP-2 innenfor cytoplasma og proksimale aksoner og utelukkes fra kjernen (som det fremgår av samtidig merking med en kjernefysisk flekk for å visualisere kjernen (figur 3A-3D). Etter behandling med BMP-7 ved 50 ng/ml i 5 dager observeres immunoreaktivitet for MAP-2 ikke bare i cytoplasma, men også hos dendritt (figur 3E-3H).
Eksempel proteomisk analyse av kultiverte SCG-nevroner dyrket i kontrollmedier
E21 rottesympatitiske nevroner ble dyrket i kontrollmedier i 6 dager in vitro, lysed og utsatt for LC-MS-analyse. Prøven ble kjørt i tre repliker på massespektrometeret og proteinene ble identifisert basert på antall fragmenterte peptider observert for hver prøve. Overflod av proteiner (alt fra 0 til over 300000 vilkårlige enheter) og tillit score for protein ID basert på antall fragmenterte peptider observert for hvert protein (fra 5 - 500) ble beregnet. Et eksempeldatasett fra massespektrometrisk analyse av proteomet av 30 μg protein fra SCG-nevroner dyrket i serumfrie kontrollmedier er vist i figur 4.
Det var 13, 134 peptider oppdaget i prøven som tilsvarte 1287 proteiner. Av disse var 1100 til stede i alle tre tekniske replikeringer med normaliserte overflodsverdier større enn 500. Av disse 1100 proteinene ble 90 proteiner identifisert ved tilstedeværelse av en enkelt peptidhit, som bare dekket en liten del av proteinet. Derfor var det vanskelig å avgjøre om identifikasjonen var riktig og disse proteinene hadde lav proteintillitsscore (score <10). Disse proteinene ble eliminert fra analysen, og de resterende 1010-proteinene ble videre analysert ved hjelp av gentologi for å avgjøre om protokollen var vellykket i å oppdage proteiner med forskjellig lokalisering og funksjon.
Genontologianalyse av dette datasettet ble utført ved hjelp av Panther-klassifiseringsdatabasen (http://www.pantherdb.org/) for å avgjøre om dette datasettet inkluderte proteiner med forskjellige cellulære lokaliserings- eller molekylære og biologiske funksjoner, og for å undersøke om det var sammenhenger mellom de identifiserte proteinene og kjente veier21. Analysen viste at selv om over 700 av proteinene var cytoplasmatiske, inneholdt dette datasettet proteiner som ble lokalisert til andre regioner av cellen, inkludert kjernen, membranen, flere cellulære organeller og cellekryss (figur 4A). Analysen viste også at over 400 proteiner hadde katalytisk aktivitet, og rundt 300 proteiner var involvert i signalveier (figur 4B og figur 4C). I tillegg inneholdt datasettet proteiner involvert i ulike signalveier. Tabell 1 viser fem av proteinene i G-proteinsignalering, celleadhesjon, vekstfaktorsignalvei og synaptiske vesikkelsmuglingsveier som ble identifisert i datasettet.
Figur 1: Endringer i morfologien til kultiverte E21 rotte embryonale SCG nevroner over tid. Representative fase kontrast mikroskopi bilder ved 10x forstørrelse av dissosierte celler fra E21 rotte SCG 20 min etter plating (A), en dag etter plating (B) og etter 48 timer med Ara-C behandling (5 dager etter plating) (C). Legg merke til tilstedeværelsen av glialceller (piler) og aksonal forlengelse (pilhoder) i (B), og fravær av glialceller og nevroner som viser omfattende aksonal vekst i (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Endringer i nevronal morfologi av E21 rotte SCG nevroner etter behandling med BMP-7. Etter eliminering av ikke-nevronale celler ble kultiverte SCG-nevroner behandlet med kontrollmedier (A) eller BMP-7 ved 50 ng/ml (B) i 5 dager. Representative fase kontrast mikrografer (10x forstørrelse) viser den sirkulære nevronale cellekroppen med aksoner i kontroll nevroner(A) og nevroner med flere korte dendritt-lignende prosesser når de behandles med BMP-7 (piler, B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Immunstaining for MAP-2 protein i kultiverte embryonale rotte sympatiske nevroner. Etter eliminering av ikke-nevronale celler ble kultiverte SCG-nevroner behandlet med kontrollmedier (A-D) eller BMP-7 ved 50 ng /ml (E-H) i 5 dager og immunostained ved hjelp av et mus monoklonalt antistoff mot MAP-2 og samtidig merket med en kjernefysisk markør. Representative mikrografer som viser immunocytokjemisk farging av nevronene med mikrotubuli assosiert protein-2 (MAP-2) (C,G),en kjernefysisk flekk (D,H) med fasekontrastmikrografer (B,F) og en sammenslåing av de tre kanalene (A,E). Immunocytokjemisk farging for mikrotubuli assosiert protein-2 er tilstede i cellekroppen og proksimale aksoner av kontroll nevroner (C) og farging for MAP-2 protein i cellekroppen og dendritt i BMP-7 behandlede nevroner (G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Klassifisering og distribusjon av proteiner identifisert i proteomanalysen av kultiverte E21 rotte SCG nevroner. Protein-ID-er for de 1100 proteinene ble utsatt for gentologianalyse på Panther-klassifiseringssystemet for å undersøke fordelingen av proteiner i datasettet med hensyn til cellulær lokalisering (A), cellulær funksjon og biologiske prosesser de var involvert i (B) og molekylær funksjonsklasse basert på proteinstruktur (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| A) Proteiner involvert i biologisk vedheft | ||
| UniProt-id for tiltredelse | Gennavn | Gen symbol |
| 9Z1Y3 (andre kvartal 2013) | Cadherin-2 Leilighet | Cdh2 |
| O35112 | CD166 antigen | Alcam |
| P49134 | Integrin beta-1 | Itgb1 Leilighet |
| D3ZES7 | Plexin A4 | Plxna4 |
| F1LP44 | Integrin underenhet alfa L | Itgal |
| B) Proteiner involvert i vekstfaktor signalering | ||
| P35213 | 14-3-3 protein beta/alfa | Ywhab (andre) |
| 5. kvartal 2017 | Serin/tregangin-protein fosfatase 4 katalytisk subenhet | Ppp4c |
| P47196 | Rac – alfa serine / treonin protein kinase | Akt1 |
| P62994 | Vekstfaktor reseptor bundet protein 2 | Grb2 |
| P21708 | Mitogenaktivert protein kinase 3 | Kartk3 |
| C) Proteiner involvert i G-protein skrevet signalvei | ||
| P08753 | Guanin kjerneotid-bindende protein G (k) subunit alfa | Gnai3 |
| D4ABV5 | Calmodulin-2 Leilighet | Rolig2 |
| P18266 | Glykogen syntase-3 beta | Gsk3b |
| P09456 | cAMP-avhengig protein kinase type I-alfa regulatoriske underenhet | Prkar1a |
| P53534 | Glykogenfosforylase | Pygb (hjerneform) |
| D) Proteiner involvert i synaptisk vesikkelhandel | ||
| P47861 | Synaptotagmin-5 | Syt5 |
| P63045 | Vesikkel-assosiert membranprotein 2 | Vamp2 Leilighet |
| P61265 | Syntaxin-1B | Stx1b Leilighet |
| 63537 andre kvartal | Synapsin-2 Leilighet | Syn2 (andre personer) |
| P60881 | Synaptosomal-assosiert protein 25 | Snap25 |
Tabell 1: Representative proteiner identifisert i proteomedataene fra kultiverte rotte embryonale SCG-nevroner, klassifisert etter deres biologiske funksjoner. Proteomedataene med 1100 proteiner ble utsatt for gentologianalyse ved hjelp av Panther-klassifiseringssystemet. Nedenfor er de fem beste proteinene identifisert for fire biologiske veier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret beskriver protokollene for å dyrke sympatiske nevroner fra overlegne cervical ganglia av embryonale rottevalper. Fordelene ved å bruke dette modellsystemet er at det er mulig å oppnå en homogen populasjon av nevroner som gir en lignende respons på vekstfaktorer, og siden vekstfaktorkravene for disse nevronene har blitt godt karakterisert, er det mulig å vokse disse nevronene in vitro i definerte medier, under serumfrie forhold10. Selv om protokollen beskriver prosessen for å isolere SCG fra E21 rottevalper, kan denne protokollen brukes til disseksjon av SCG fra rottevalper fra E17 til E21 og for disseksjon av embryonisk mus SCG10,22,23. Denne disseksjonsprotokollen kan også brukes til å isolere SCG fra postnatale rotter med mindre endring av de første trinnene. Disse endringene inkluderer eliminering av behov for C-seksjon, eutanasi av postnatale dyr ved hjelp av karbondioksid, og sterilisering av postnatale valper etter eutanasi ved nedsenking av valpene i 70% alkohol, før de overføres til disseksjonsmedier10. Denne nevronale kulteringsprotokollen kan også tilpasses for å studere aksonal veiledning, aksonal transport og synapsedannelse ved hjelp av Campenot-kamre og mikrofluidiskekamre 24,,25. Disse nevronene kan også være co-kultivert med nevroner fra ryggrot ganglia eller spinal motor neurons eller med kardiomyocytter for å studere nevronale interaksjoner og nevron - mål interaksjoner i perifert nervesystem26,27,28,29.
Bruken av kultiverte SCG-nevroner for immunocytokjemiske studier er godt dokumentert. Protokollen som er beskrevet i papiret gir et godt utgangspunkt for å arbeide med de fleste antistoffer. Det finnes imidlertid antistoffer, for eksempel de som oppdager kjernefysiske proteiner som kan kreve en endring av fikseringsprotokollen og permeabiliseringsprotokollen. Ved fosfo-SMAD-antistoff har behandling med 100 % metanol ved -20 °C blitt brukt til å fikse og gjennomsyrenevronene 30,31.
De viktigste begrensningene ved å jobbe i dette modellsystemet stammer fra den lille størrelsen på SCGs i embryonale rottevalper, noe som resulterer i et lite antall nevroner. Dette resulterer i en begrenset mengde nukleinsyrer eller protein som kan oppnås ved disseksjon av ett kull av valper. Dette kan være problematisk for genomisk og proteomisk analyse, spesielt når man sammenligner mellom flere behandlinger i en disseksjon. Det er heller ikke mulig å få SCG nevronale kulturer fra et enkelt embryo. Alle forsøkene utføres derfor på samlede prøver som er hentet fra SCG av alle rotteembryoer i et kull. En annen begrensning av systemet er at SCG nevroner har lavere DNA transfection effektivitet (10 - 20%, upubliserte observasjoner) og høyere toksisitet etter transfection sammenlignet med sentrale nevroner32. Selv om denne transfection effektiviteten er greit for morfologiske studier med individuelle nevroner, er det vanskelig å utføre molekylære eller biokjemiske studier for å oppdage / bekrefte genuttrykksendringer.
Men de siste årene har kultiverte SCG-nevroner blitt brukt til studier som undersøker mekanismene som ligger til grunn for dendrittisk vekst og for transkripsjons- og miRNome-analyser14,,15,,33. Som angitt tidligere, på grunn av lave proteinmengder, har kultiverte nevroner fra embryonale SCG ikke tidligere blitt brukt til proteomisk analyse. Denne protokollen og representative resultater gir bevis for at selv med lav konsentrasjon av prøver, kan dagens HD-massespektrometriinstrumenter brukes til proteomiske studier på disse nevronene. Selv om prøveforberedelsesprotokollen som er beskrevet her er for SCG-nevroner, kan denne protokollen brukes til fremstilling av en hvilken som helst prøve med lav proteinkonsentrasjon for LC-MS-analyse. En av begrensningene er at små variasjoner i proteinkonsentrasjon eller effektivitet av trypsinfordøyelsen kan resultere i ufullstendig fragmentering og en dramatisk reduksjon i antall proteiner som oppdages av LC-MS. Derfor er det viktig å sikre at startproteinkonsentrasjoner er så nær 50 μg med et 10:1-forhold av protein: trypsin. Det er også en god praksis å aliquot massespektrometri-grade trypsin for å hindre flere fryse-tine sykluser.
En annen begrensning av protokollen er at det bare var et begrenset antall transmembraneproteiner som ble oppdaget i proteomet. Mens syre labile overflateaktivt middel har vist seg å være et effektivt overflateaktivt middel for massespektrometri, fant en tidligere studie på kultiverte celler at disse overflateaktive stoffer kan øke antall cytoplasmatiske proteiner og redusere membranproteinene i proteomisk profil34. Det har også blitt foreslått at pre-fordøyelsen ved hjelp av en bakteriell endopeptidase som Lys-C, før trypsin fordøyelsen kan forbedre effektiviteten av trypsin fordøyelsen av membran bundet proteiner og hindre membran protein fragmenter blir beholdt på LC kolonner35.
Oppsummert gir dette papiret detaljerte protokoller for voksende kultiverte rotte embryonale sympatiske nevroner og for å utføre morfologiske og proteomiske studier på disse nevronene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Faculty Development Fund og Summer Research Program stipend ved Saint Mary's College of California. Forfatterne vil også takke Dr. Pamela Lein ved University of California ved Davis og Dr. Anthony Iavarone ved UC Berkeley Mass spektrometri anlegget for deres råd under utviklingen av disse protokollene. Forfatterne vil også takke Haley Nelson i Office of College Communications ved Saint Mary's College of California for hennes hjelp med videoproduksjon og redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
