Summary
Detta dokument beskriver isolering och odling av embryonala råtta sympatisk nervceller från den överlägsna livmoderhalscancer ganglier. Det ger också detaljerade protokoll för immunocytochemical färgning och för att förbereda neuronal extrakt för masspektrometrisk analys.
Abstract
Sympatisk nervceller från embryonala råtta överlägsen livmoderhalscancer ganglier (SCG) har använts som en in vitro-modell system för perifera nervceller att studera axonal tillväxt, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritisk tillväxt, dendritisk plasticitet och nerv-mål interaktioner i co-kultur system. Detta protokoll beskriver isolering och dissociation av nervceller från den överlägsna massundersökning ganglier av E21 råtta embryon, följt av beredning och underhåll av rena neuronala kulturer i serum-fri medium. Eftersom nervceller inte följer obestruken plast, nervceller kommer att odlas på antingen 12 mm glas coverslips eller 6-brunnsplattor belagda med poly-D-lysin. Efter behandling med ett antimitotic-medel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside), genererar detta protokoll friska neuronala kulturer med mindre än 5% icke-neuronala celler, som kan upprätthållas i över en månad in vitro. Även om embryonala råtta SCG nervceller är multipolär med 5-8 dendrites in vivo; under serumfria förhållanden sträcker sig dessa nervceller endast en enda axon i kulturen och fortsätter att vara unipolär under den tid som kulturen pågår. Dessa nervceller kan dock induceras att förlänga dendrites i närvaro av källaren membran extrakt, ben morphogenetic proteiner (BMPs), eller 10% fetala kalv serum. Dessa homogena neuronala kulturer kan användas för immunocytochemical färgning och för biokemiska studier. Detta papper beskriver också optimerat protokoll för immunocytochemical färgning för microtubule associerade protein-2 (MAP-2) i dessa nervceller och för utarbetandet av neuronal extrakt för masspektrometri.
Introduction
Sympatiska nervceller som härrör från embryonala överlägsen livmoderhalscancer ganglier (SCG) har använts i stor utsträckning som en primär neuronal kultur system för att studera många aspekter av neuronal utveckling inklusive tillväxtfaktor beroende, neuron-target interaktioner, signalsignalering av signalsubstanser, axonal tillväxt, dendritutveckling och plasticitet, synaptogenes och signalmekanismer underliggande nerv-target/neuron-glia interaktioner1,2,3,4,5,6,77,8,9. Trots deras lilla storlek (runt 10000 nervceller/ganglier), det finns tre huvudsakliga skäl för utveckling och omfattande användning av detta kultursystem är i) är den första ganglierna i den sympatiska kedjan, de är större, och därför lättare att isolera, än resten av de sympatiska ganglierna10; ii) till skillnad från centrala nervceller, nervceller i SCG är ganska homogen med alla nervceller som härrör från neurala krönet, med en liknande storlek, beroende av nervtillväxtfaktor och är inte heller adrenerga. Detta gör dem till en värdefull modell för morfologiska och genomiskastudier 10,11 och iii) dessa nervceller kan bibehållas i ett definierat serumfritt medium som innehåller nervtillväxtfaktor i över en månad10,12. Perinatala SCG nervceller har använts i stor utsträckning för att studera de mekanismer som ligger till grund för inledande och underhåll av dendrites2. Detta beror främst på, även om SCG nervceller har en omfattande dendritisk arbor in vivo, de inte förlänga dendriter in vitro i avsaknad av serum men kan induceras att växa dendriter i närvaro av vissa tillväxtfaktorer såsom ben morfogenetiska proteiner2,12,13.
Detta dokument beskriver protokollet för att isolera och culturing embryonala råtta SCG nervceller. Under de senaste 50 åren har primära neuronala kulturer från SCG främst använts för morfologiska studier med ett begränsat antal studier som undersöker de storskaliga genomiska eller proteomiska förändringarna. Detta beror främst på liten vävnadsstorlek som resulterar i isolering av låga mängder DNA eller protein, vilket gör det svårt att utföra genomiska och proteomiska analyser på dessa nervceller. Under senare år har dock ökad detektionskänslighet möjliggjort utveckling av metoder för att undersöka genomet, miRNom och proteom i SCG-neuronerna under dendritisk tillväxtutveckling14,15,16,17. Detta dokument kommer också att beskriva metoden för morfologisk analys av dessa nervceller med hjälp av immuncytokemi och ett protokoll för att erhålla neuronal protein extrakt för masspektrometrisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som utförts i studier med djur godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Saint Mary's College of California. Riktlinjerna för djurvård och användning vid Saint Mary's College har utvecklats utifrån de riktlinjer som tillhandahålls av Office of Laboratory Animal Welfare vid National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf och https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Förberedelse av kulturmedier (även kallat kontrollmedium)
- Tillsätt följande ingredienser, i nedan angivna ordning, till en steril 500 mL kolv: 190 mL 1x lågglukos-DMEM, 10 mL av 20 mg/ml fettsyrafritt bovint serumalbumin(FAF-BSA) i DMEM, 2,8 mL av 200 mM L-glutamin, 4 mL av 100x insulin-selen-transferrin blandning, 0,4 mL av 125 μg/mL nervtillväxtfaktor (i 0,2% inert protein stabilisator i DMEM), och 200 mL av Hams F-12 medium.
- Se till att belägga pipetten med mediet som innehåller FAF-BSA före tillsats av proteinhaltiga lösningar såsom insulin-selen-transferrin och NGF för att förhindra att man fastnar på proteiner på pipetten.
- Snurra kolven för att blanda ingredienserna efter varje tillsats. Blanda noggrant med en 25 mL pipetter efter tillsats av F-12.
- Aliquot kulturen media i 10 mL alikvoter och lagra på -80 °C. Alikvoterna kan lagras i sex månader utan förlust av aktivitet.
2. Beredning av plattor för odling av nervceller
- Späd ett 1 mg/mL-lager av poly-D-lysin (tillverkat i 0,5 M Tris buffert, pH 8) till 100 μg/mL med sterilt destillerat vatten.
- För proteomisk eller genomisk analys, en till två dagar före dissektionen, belägga 6-brunnsplattor med cirka 2 mL steril 100 g/mL av poly-D-lysin (PDL). Detta är nödvändigt för att säkerställa celladhesion till brunnen. Linda plattorna med plastfolie och förvara plattorna över natten vid 4 °C.
- För morfologisk analys och mikroskopi, placera 12 mm2 förbehandlade tyska glasskyddsslips (som kan rengöras med salpetersyrabehandling enligttidigare beskrivning 18 eller inköpta) i var och en av brunnarna i en 24-brunnsplatta.
- Täck täck över täcken med 0,3 mL steril 100 g/mL av poly-D-lysin (PDL). Förvara plattorna över natten vid 4 °C.
- På dagen för dissektionen, innan dissektionens start, avlägsna poly-D-lysinlösningen från brunnarna och skölj brunnarna fem gånger med sterilt destillerat vatten, följt av en gång med lågt glukos DMEM.
- Under den enzymatiska matsmältningen av ganglierna (ungefär en timme före plätering av cellerna), aspirera DMEM från plattorna och ersätta den med 0,3 mL av kontrollmedia. Förvara plattorna vid 35,5 °C under 5 % CO2 i en befuktad kammare.
3. Dissektion setup
- Beredning av 200 mL media för dissektion (benämns Dissektion media)
- Tillsätt 8 mL av 20 mg/mL fettsyre-fritt bovint serumalbumin (FAF-BSA) i lågt glukos DMEM (med 1 mg/mL glukos) och 2 mL av 100x penicillin-streptomycin till 193 mL sterila Leibovitzs L-15 medium (eller något luft-buffrat medium)
- I huven, ställ in följande objekt för dissektion: fyra 50 mL sterila koniska rör med ca 20 mL dissektionsmedia i varje rör, fyra sterila 35 mm rätter med 1,5 mL av dissektionsmedia, ett sterilt 50 mL koniskt rör med 20 mL dissekeringsmedia för centrifugering, ett sterilt 15 mL koniskt rör för centrifugering av ganglierna , och ett sterilt 10 mL-rör för uppsamling av de dissocierade cellerna.
- Använd en torr pärla sterilisator för att sterilisera ett par fina tång (no.4 eller nr 5 tång) i minst en minut.
4. Isolering av de överlägsna cervikala ganglierna från embryonala råttungar
- Avlägsnande av E21 embryon från den dräktiga råttan
OBS: Borttagning av livmoderhornet kan utföras utanför huven om omgivningen är noggrant steriliserad.- Avliva den dräktiga råttan med hjälp av CO2-inandning. Skjår pälsen från bukregionen och torka huden i området med 70% alkohol för att sterilisera den.
- Med hjälp av en ny uppsättning sterila saxar och tlyktor, skär genom huden och sedan muskelskiktet för att exponera livmoderhornen som innehåller embryona. Ta bort livmoderhornen med embryona med hjälp av en ny uppsättning saxar och tlyktor, var noga med att inte skada tarmarna i processen.
- Överför livmoderhornen med embryona till en 150 mm2 steril Petriskål och överför dem i huven.
- Med hjälp av en ny uppsättning tlysen och saxar, ta bort embryona från livmoderhornet och separera embryona från fosterhinnorna och moderkakan.
- För att avliva embryona, skär ryggmärgen av embryona längs mittlinjen under höger arm. Detta kommer också att minska blödningen från halspulsådern under avlägsnandet av SCG.
- Överför dessa embryon i de beredda koniska rören på 50 mL som innehåller dissektionsmedia. Se till att embryona är nedsänkta i media. Varje rör kan rymma upp till 3 embryon.
- Isolering av den överlägsna cervikala ganglionen från embryot
- Överför en valp från dissektionsmediet på en steril 150 mm2 Petri-skål halvfylld med fast substrat (antingen paraffinvax eller silikonpolymer), med sin ryggyta på substratet. Med hjälp av tre sterila 23 G-nålar, nålar du pup till skålen med en nål under varje arm och en tredje nål genom munnen för att noggrant hyperextend halsen.
- Skär genom huden i halsregionen med hjälp av sterila fina tärnningar (nr 4 eller nr 5 tutent) för att exponera spottkörtlarna under. Ta bort dessa körtlar med hjälp av fina tröpningar.
- Lokalisera sternocleidomastoid och omohyoid muskler nära nyckelbenet och luftstrupen, respektive. Först skär tvärgående sternocleidomastoid muskler och sedan försiktigt skära den tunna omohyoid muskeln med hjälp av fina tlyck. När dessa muskler tas bort, bifurkation i halspulsådern på främre änden kommer att vara synlig på vardera sidan av luftstrupen, med SCG ligger under denna gaffel i halspulsådern.
- Med hjälp av slutna tång, lyft försiktigt halspulsådern för att visualisera SCG. Med hjälp av en tärna på vardera sidan av SCG, dra ut halspulsådern och överföra den till den beredda sterila 35 mm2 rätter. Denna vävnad kommer troligen att innehålla SCG med halspulsådern, vagusnerven med nodose ganglierna samt andra segment av muskler eller fett i området.
- Upprepa dissekeringsprocessen på andra sidan. Ta bort SCGs från alla embryon innan du fortsätter med de återstående dissekeringssteg som beskrivs nedan. Fördela de isolerade vävnaderna mellan två av 35 mm2-disken för att underlätta bearbetningen av vävnadsproverna.
- Efterbearbetning av SCG
- För att separera SCG från dissekerade vävnaden, använd först fina tövråkar för att avlägsna eventuell ovidkommande vävnad, såsom fett eller muskler, var noga med att undvika området nära halspulsådern bifurkation.
- När dessa vävnader har tagits bort, två ganglier är synliga. Den nodose ganglion är mindre och cirkulär, medan SCG är mandel-formad. Dra försiktigt på vagusnerven för att separera vagusnerven och nodose ganglierna från halspulsådern och sedan separera SCG från halspulsådern.
- Använd fina tröt för att ta bort kapseln som omger SCG. Överför SCG till en ny 35 mm kulturskål. Upprepa processen med alla dissekerade vävnadsprover.
- Coat en steriliserad, bomull pluggade glaspipett med dissection media för att förhindra att vävnaden från att följa till pipetten väggar. Använd pipetten för att ersätta dissektionsmediet med steril 2 mL av Collagenas typ II (1 mg/mL)/dispase typ II (5 mg/mL) i kalcium- och magnesiumfri HBSS, och inkubera i 50 min vid 37 °C för att hjälpa till att bryta ner vävnaderna.
OBS: Inkubationstiden kan behöva optimeras med olika partier av Kollagenas/Dispase och varierar vanligtvis från 40 min till en timme. - Under inkubationen aspirerar du DMEM från plattorna och ersätter det med 0,3 mL kontrollmedia. Förvara plattorna vid 35,5 °C under 5 % CO2 i en befuktad kammare.
- Efter inkubationen överför du SVGs i kollagenas/dispase till ett sterilt koniskt rör på 15 mL. Använd dissektionsmediet för att skölja plattorna och överföra lösningen till röret. Lägg till tillräckligt med dissektionsmedia för att få upp volymen till cirka 10 mL.
- Centrifugera vid 200 x g (1000 - 1200 rpm) i 5 minuter vid rumstemperatur för att pelleta provet. Aspirera supernatanten, var noga med att inte rubba pelleten. Resuspend pelleten med 10 mL av dissektion media. Upprepa centrifugeringen och kassera supernatanten.
- Ersätt med 1 - 2 mL av odlingsmedium. Med hjälp av en smalborst, böjd steril pasteurpipett (förbelagd med odlingsmedium), tar man mekaniskt isär klumparna genom att försiktigt triturisera 5-6 gånger. Låt de större klumparna nöja sig med ungefär en minut. Överför den supernatant cellupphängningen till ett nytt 10 mL-rör.
- Upprepa denna process 3 fler gånger, med ökande kraft trituration varje gång för att säkerställa nästan fullständig dissociation av SCGs. Överför supernatanten efter varje omgång trituration till ett 10 mL-rör med supernatanten från den första triturationen.
- Lägg till tillräckligt med kulturmedia för att få upp volymen till 8 - 10 mL. Blanda cellupphängningen försiktigt och kvantifiera celltätheten med en hemocytometer.
- Fördela cellupphängningen i brunnarna vid lämplig celltäthet för experimenten. Blanda cellupphängningen kontinuerligt under pläteringsprocessen för att säkerställa jämn fördelning av celler i brunnarna.
OBS: För morfologisk analys, platta cellerna runt 8 000 celler/brunn i en 24 brunnsplattor och för genomiska och proteomiska protokoll, platta cellerna så högt som 30 000 celler/brunn. - Överför plattorna till en glasutsikator med sterilt vatten i botten för att skapa en befuktad kammare. Injicera tillräckligt med CO2 (runt 120 mL) för att få en 5% CO2-miljö i exsikatorn, före försegling. Underhåll plattorna vid 35,5 °C. Detta kallas För dag 0 i protokollet.
OBS: Dessa plattor kan också underhållas i en vanlig 5% CO2 inkubator. Den ovan beskrivna metoden minimerar temperatur- och pH-förändringar och hjälper även till att förhindra korskontaminering.
5. Underhåll av de odlade SCG nervceller och behandlingar
- På dag 1 (24 timmar efter plätering), försiktigt ta bort hälften av odlingsmedia, och ersätta med 2 μM Ara-C (cytosin β-D-arabinofuranoside, ett anti-mitotiska medel). Låt behandlingen vara kvar på cellerna i 48 h. Vanligtvis är denna behandlingslängd tillräcklig för att eliminera icke-neuronala celler i kulturen.
- På dag 3, försiktigt aspirera halva mediet och ersätta med kontrollmedium.
- Dag 4 är cellerna redo för experimentella behandlingar. Mata kulturer varannan dag med lämpligt medium, försiktigt ersätta hälften av mediet i brunnen med färskt medium.
- Odlade SCG nervceller i serum-free medium sträcker sig endast axoner. Om experiment kräver närvaro av dendrites, behandla celler med antingen 10% fetala kalv serum, 75-100 μg/mL av källaren membran matrisextrakt eller 50 ng/mL av ben morphogenetic protein-7. Dendritisk tillväxt observeras inom 48 timmar efter behandling med utarbetad dendritisk berså observerats inom en vecka efter behandling.
6. Immunfärgning odlade SCG nervceller
- Gradvis ersätta cellkultur mediet i brunnen med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfat buffert, pH 7,2 i en rök huva.
- Ta bort hälften av odlingsmedierna i brunnen och byt ut det försiktigt mot 4% paraformaldehyd. Upprepa sedan processen minst två gånger till, ta bort två tredjedelar av media i brunnen varje gång och ersätta med 4% paraformaldehyd. I slutet av denna process, färgen på media i brunnen borde ha förändrats från rosa till färglös.
- När allt medium har ersatts av 4% paraformaldehyd, inkubera brunnarna i 15 - 20 minuter vid rumstemperatur.
- Med en liknande process enligt ovan, ersätt gradvis lösningen med paraformaldehyd med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2. Låt det vara 5 minuter. Skölj brunnarna ytterligare två gånger i 5 minuter vardera med PBS.
- När 4% paraformaldehyd avlägsnats, flytta plattorna till bänkskivan för vidare bearbetning. Detta steg är en bra stopppunkt där plattor kan förvaras vid 4 °C över natten.
- Ta bort alla PBS. Lägg till tillräckligt med volym på 0,1% Triton X-100 i PBS för att täcka cellerna. Lämna det på kulturerna i 5 minuter för att genomsyra nervcellerna. Tidpunkten för detta steg är avgörande för att säkerställa god färgning samtidigt som integriteten hos cellerna.
- Ta försiktigt ut Lösningen Triton X-100 och skölj brunnarna tre gånger i 5 minuter varje gång med PBS. Ta bort PBS-lösningen.
- Tillsätt tillräckligt med 5% BSA i PBS för att täcka cellerna och inkubera i rumstemperatur i 20 minuter för att minska icke-specifik antikroppsbindning.
- Ta bort den blockerande lösningen och ersätt den med en monoklonal antikropp för mus mot MAP-2-protein utspädd i 5% BSA i PBS. Låt den primära antikroppen vara kvar på cellerna över natten vid 4 °C.
- Ta bort och spara den primära antikroppen för återanvändning. Den primära antikroppen kan återanvändas minst två gånger utan förlust av detektionsintensitet.
- Skölj tre gånger med tillräckligt med PBS för att täcka cellerna. Låt PBS på cellerna i 10 minuter per skölj.
- Ta bort PBS-lösningen och ersätt den med fluorescerande tag-konjugerad Get anti-Mouse IgG sekundär antikropp vid 1:1000 utspädning i 5% BSA i PBS. Inkubera i 2 timmar i mörker vid rumstemperatur.
- Ta bort den sekundära antikroppen och ersätt den med PBS. Skölj brunnarna tre gånger med PBS i 10 minuter per skölj. Skölj brunnarna en gång med vatten för att ta bort eventuella salter.
- Montera täcken på glasglas som innehåller en droppe vattenhaltigt fäste som är lämpligt för fluorescerande märkta prover. Förvara bilderna i 4 °C, i en diamapp tills de är klara för avbildning.
7. Provberedning för analys av proteomet med hjälp av vätskekromatografi i kombination med masspektrometri
- Lys av odlade nervceller
- Ta försiktigt bort alla odlingsmedier i brunnarna. Ersätt den med kall, steril kalcium och magnesiumfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7.4. Ta bort snabbt och ersätt med PBS och låt den sitta i 5 min. Detta steg görs för att ta bort alla proteiner som finns i kulturmedia.
- Ta försiktigt bort alla PBS från alla brunnar för en viss behandling. Upprepa processen en gång till. Underhåll plattor över is när du ska hålla cellerna för att minimera neuronala skador och proteolys.
- Tillsätt 100 - 150 μL av 50 mM ammoniumbikarbonat, pH 7,5 (NH4HCO3) till en av brunnarna och skrapa celler med hjälp av en steril cellskrapa. Med hjälp av en mikropipette, överför vätskan och upprepa skrapprocessen med alla brunnar för en viss behandling. Undersök brunnarna under mikroskopet efter skrapningen för att försäkra dig om att de flesta av cellerna har tagits bort.
- Med det låga antalet nervceller, använd en begränsad volym för att lysa cellerna för att säkerställa tillräckligt hög koncentration för proteomisk analys.
- Frys lösningen vid -80 °C över natten för att hjälpa till med celllys. Lysaterna kan förvaras i detta skede tills de är klara för vidare bearbetning.
- När du tinat, spruta proverna genom en spruta med en 26 G eller 28 G nål för att mekaniskt lysa cellerna.
- Sonikera proverna i ett sonikerande vattenbad två gånger i 10 minuter. Tillsätt is i vattenbadet för att förhindra överhettning och denaturering av proteiner. Centrifugera i 5 minuter vid 4 °C vid 12 000 x g.
- Mät proteinkoncentrationen. Typiska proteinkoncentrationer varierar från 0,4 - 1 μg/μL
- Provberedning och trypsin-matsmältning för proteomanalys
- Överför maximalt 60 μL av lysaten eller 50 μg protein till ett DNase-, RNase- och proteasfritt 1,5 mL-rör. Om volymen av lysate är mindre än 60 μL, tillsätt tillräckligt 50 mM ammoniumbikarbonat för att göra upp volymen.
- Tillsätt 25 μL av 0,2% syra labile tensider och virvel. Inkubera röret i en blockvärmare vid 80 °C i 15 minuter. Centrifugera röret vid 12 000 x g i 30 s.
- Tillsätt 2,5 μL på 100 mM dithiothreitol och virvel. Detta gör proteinet mer tillgängligt för alkylering och matsmältning. Inkubera röret vid 60 °C i en blockvärmare i 30 minuter. Kyl till rumstemperatur och centrifug.
- Tillsätt 2,5 μL av 300 mM iodoacetamid till provet och vortex. Detta steg hjälper till att alkylera cysteinerna och hindrar dem från att reformera disulfidbindningarna. Inkubera rören i rumstemperatur i mörker i 30 minuter.
- Lägg till masspektrometri grade trypsin (0,5 μg/μL) till röret vid en trypsin: proteinförhållandet 1:10. Smält proverna vid 37 °C över natten.
- Tillsätt 10 μL av 5% trifluoroättiksyra (TFA) och virvel. Inkubera proverna vid 37 °C i 90 minuter. Detta steg är nödvändigt att hydrolysera den syra labila tensid för att förhindra störningar under masspektrometri.
- Centrifugera proverna vid 12 000 x g vid 4 °C i 30 minuter och överför supernatant till en kromatograficertifierad klarglasflaska med preslits Teflon/Silikonsepumlock. Prover kan förvaras vid -20 °C före masspektrometrianalys.
- Underställ provdyalarna vätskekromatografi i kombination med masspektrometri med hög definition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolera och underhålla neuronala kulturer av embryonala SCG nervceller
Dissociated celler från råtta embryonala SCG var pläterade i en poly-D-lysin belagda platta eller täckslip och underhålls i serum fri kultur media som innehåller b-nerv growth factor. De dissocierade cellerna som innehåller en blandning av nervceller och gliaceller ser cirkulära vid plätering (Figur 1A). Inom 24 timmar efter plätering, nervcellerna förlänga små axonal processer med gliaceller platta och visas fas-mörkt under faskontrast mikroskopi (Figur 1B). Efter behandlingen med Ara-C elimineras 99% av gliacellerna och kulturerna innehåller övervägande neuronala celler med en oval cellkropp, omfattande axonal tillväxt och inga dendrites (Figur 1C).
Immuncytokemiska färgning av odlade embryonala råtta överlägsen livmoderhalscancer ganglier nervceller
Tidigare studier har visat att odlade sympatiska nervceller som odlas i serumfritt medium sträcker sig endast axoner och endast sträcker ut en utarbetad dendritisk berså i närvaro av källarmembranextrakt, 10% serum eller 50 ng/mL benmorfogande protein-7 (BMP-7)2,12. I samförstånd med dessa observationer, visar faskontrastmikroskopi att nervceller som odlas i närvaro av BMP-7 (50 ng/mL) i 5 dagar har en tillplattad cellkropp med flera tjocka avsmalnande processer när de jämförs med nervceller som odlas i serumfria kontrollmedier (Figur 2). Identiteten på dessa processer som dendrites bekräftas av förekomsten av MAP-2, ett cytoskeletalt protein som huvudsakligen finns i cellkroppen och dendriterna19,20. Under kontrollförhållanden observeras fluorescerande färgning för MAP-2 inom cytoplasman och proximala axoner och uteslutas från kärnan (vilket framgår av co-märkning med en nukleär fläck för att visualisera kärnan (Figur 3A-3D). Efter behandling med BMP-7 vid 50 ng/mL i 5 dagar observeras immunoreaktivitet för MAP-2 inte bara i cytoplasman utan även i dendrites (Figur 3E-3H).
Prov proteomisk analys av odlade SCG nervceller odlas i kontroll media
E21 råtta sympatiska nervceller var odlade i kontroll media för 6 dagar in vitro, lysed och utsätts för LC-MS analys. Provet gjordes i tre replikat på masspektrometern och proteinerna identifierades baserat på antalet fragmenterade peptider som observerades för varje prov. Överflödet av proteinerna (allt från 0 till över 300000 godtyckliga enheter) och konfidenspoäng för protein-ID baserat på antalet fragmenterade peptider som observerades för varje protein (från 5 - 500) beräknades. En provdatauppsättning från masspektrometrisk analys av proteomet av 30 μg-protein från SCG-neuroner som odlas i serumfria kontrollmedier visas i figur 4.
Det fanns 13, 134 peptider detekteras i provet som motsvarade 1287 proteiner. Av dessa, 1100 av vilka var närvarande i alla tre tekniska replikat med normaliserade överflöd värden större än 500. Av dessa 1100 proteiner identifierades 90 proteiner genom närvaron av en enda peptidträff, som endast täckte en liten del av proteinet. Därför var det svårt att avgöra om identifieringen var korrekt och dessa proteiner hade en låg protein konfidenspoäng (score <10). Dessa proteiner eliminerades från analysen och de återstående 1010 proteiner analyserades ytterligare med hjälp av Gene ontologi för att avgöra om protokollet var framgångsrik i att upptäcka proteiner med olika lokalisering och funktion.
Gen ontologi analys av denna datauppsättning utfördes med hjälp av Panther klassificering databas (http://www.pantherdb.org/) för att avgöra om denna datauppsättning ingår proteiner med olika cellulära lokalisering eller molekylära och biologiska funktioner och att undersöka om det fanns sambanden mellan de identifierade proteiner och kända vägar21. Analysen visade att även om över 700 av proteinerna var cytoplasmatiska, att datauppsättningen innehöll proteiner som var lokaliserade till andra regioner i cellen inklusive kärnan, membranet, flera cellulära organeller, och cellkorsningar (Figur 4A). Analysen visade också att över 400 proteiner hade katalytisk aktivitet, och omkring 300 proteiner var involverade i signalvägar (figur 4B och figur 4C). Dessutom innehöll datasetet proteiner som är involverade i olika signalvägar. Tabell 1 visar fem av de proteiner i G-protein signalering, celladhesion, tillväxtfaktor signalering väg och synaptiska vesikel människohandel vägar, respektive, som identifierades i dataset.
Figur 1: Förändringar i morfologin hos odlade E21 råtta embryonala SCG nervceller över tiden. Representativa faskontrastmikroskopibilder vid 10x förstoring av dissocierade celler från E21 råtta SCG 20 min efter plätering (A), en dag efter plätering (B) och efter 48 timmars Ara-C-behandling (5 dagar efter bordläggning) (C). Notera förekomsten av gliaceller (pilar) och axonal förlängning (pilhuvuden) i (B), och avsaknad av gliaceller och nervceller som visar omfattande axonal tillväxt i (C). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Förändringar i neuronal morfologi av E21 råtta SCG nervceller efter behandling med BMP-7. Efter eliminering av icke-neuronala celler, odlade SCG nervceller behandlades med kontroll media (A) eller BMP-7 vid 50 ng/mL (B) för 5 dagar. Representativa faskontrastmikrografer (10x förstoring) visar den cirkulära neuronala cellkroppen med axoner i styrnerv (A) och nervceller med flera korta dendritliknande processer när de behandlas med BMP-7 (pilar, B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Immunfärgning för MAP-2 protein i odlade embryonala råtta sympatiska nervceller. Efter eliminering av icke-neuronala celler, odlade SCG nervceller behandlades med kontroll media (A-D) eller BMP-7 vid 50 ng/mL (E-H) i 5 dagar och immunstained med hjälp av en mus monoklonala antikroppar mot MAP-2 och co-märkt med en nukleär markör. Representativa mikrografer som visar immuncytokemiska färgning av nervcellerna med mikrotubuli associerat protein-2 (MAP-2) (C,G), en nukleär fläck (D,H) med faskontrastmikrografer (B,F) och en sammanfogning av de tre kanalerna (A,E). Immuncytokemiska färgning för mikrotubuli associerade protein-2 är närvarande i cellkroppen och proximala axoner av kontroll nervceller (C) och färgning för MAP-2 protein i cellkroppen och dendriter i BMP-7 behandlade nervceller (G). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Klassificering och distribution av proteiner som identifierats i proteomanalysen av odlade E21-råtta SCG-nervceller. Protein-ID för de 1100 proteinerna utsattes för gen ontologi analys på Panther klassificeringssystem för att undersöka fördelningen av proteiner i datamängden med avseende på cellulär lokalisering (A), cellulär funktion och biologiska processer de var inblandade i (B) och molekylär funktion klass baserat på proteinstruktur (C). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| A) Proteiner som är involverade i biologisk vidhäftning | ||
| UniProt-anslutnings-ID | Genens namn | Symbol för genen |
| Q9Z1Y3 | Cadherin-2 | Cdh2 |
| O35112 | CD166 antigen | Alcam |
| P49134 | Integrin beta-1 | Itgb1 |
| D3ZES7 | Plexin A4 | Plxna4 |
| F1LP44 | Integrin subenhet alfa L | Itgal |
| B) Proteiner som är involverade i tillväxtfaktorsignalering | ||
| P35213 | 14-3-3 protein beta/alfa | Ywhab |
| Q5BJ92 | Serine/Treonin-protein fosfatas 4 katalytisk subenhet | Ppp4c |
| P47196 | Rac – alfa serin/treonin proteinkinas | Akt1 |
| P62994 | Tillväxtfaktor receptorbundet protein 2 | Grb2 |
| P21708 | Mitogen-aktiverad proteinkinas 3 | Karta3 |
| C) Proteiner som är involverade i G-protein kopplade signalering väg | ||
| P08753 | Guaninnukleotidbindande protein G(k) subenhet alfa | Gnai3 |
| D4ABV5 | Calmodulin-2 | Lugn2 |
| P18266 | Glykogen syntas kinas-3 beta | Gsk3b |
| P09456 | cAMP-beroende proteinkinas typ I-alfa-regleringsunderenhet | Prkar1a |
| P53534 | Glykogenfosforylas | Pygb (hjärnform) |
| D) Proteiner som är inblandade i synaptisk vesikelhandel | ||
| P47861 | Synaptotagmin-5 | Syt5 |
| P63045 | Vesikel-associerat membranprotein 2 | Vamp2 |
| P61265 | Syntaxin-1B | Stx1b |
| Q63537 | Synapsin-2 | Syn2 |
| P60881 | Synaptosomalt-tillhörande protein 25 | Fäst25 |
Tabell 1: Representativa proteiner som identifierats i proteomdata från odlade råttor embryonala SCG-nervceller, klassificerade med sina biologiska funktioner. Proteomdata med de 1100 proteinerna utsattes för genontologianalys med hjälp av Panther-klassificeringssystemet. Nedan anges de fem proteiner som identifierats för fyra biologiska vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta papper beskriver protokollen för odling sympatisk nervceller från överlägsen livmoderhalscancer ganglier av embryonala råtta valpar. Fördelarna med att använda denna modell system är att det är möjligt att få en homogen population av nervceller ger ett liknande svar på tillväxtfaktorer, och eftersom tillväxtfaktorn kraven för dessa nervceller har varit väl -karakteriseras, är det möjligt att växa dessa nervceller in vitro i definierade medier, under serum-fria förhållanden10. Även om protokollet beskriver processen för att isolera SCG från E21 råtta ungar, kan detta protokoll användas för dissekering av SCG från råtta ungar från E17 till E21 och för dissekering av embryonala musen SCG10,22,23. Detta dissekeringsprotokoll kan också användas för att isolera SCG från postnatala råttor med mindre modifiering av de inledande stegen. Dessa ändringar inkluderar eliminering av behov av C-sektionen, dödshjälp av de postnatala djur som använder koldioxid och sterilisering av de postnatala ungarna efter dödshjälp genom nedsänkning av ungarna i 70% alkohol, innan de överförs till dissekeringsmedia10. Detta neuronala culturing protokoll kan också anpassas för att studera axonal vägledning, axonal transport och synapsbildning med hjälp av Campenot kammare och mikrofluidiskakammare 24,25. Dessa nervceller kan också vara co-odlade med nervceller från den dorsala roten ganglier eller spinal motor nervceller eller med kardiomyocyter att studera de neuronala interaktioner och neuron – mål interaktioner i det perifera nervsystemet26,27,28,29.
Användningen av odlade SCG nervceller för immunocytochemical studier är väl dokumenterad. Det protokoll som beskrivs i papperet ger en bra utgångspunkt för att arbeta med de flesta antikroppar. Det finns dock antikroppar, såsom de som upptäcker kärnproteiner som kan kräva en ändring av fixeringsprotokollet och permeabiliseringsprotokollet. När det gäller fosfo-SMAD-antikropp har behandling med 100% metanol vid -20 °C använts för fixering och permeabilisering av nervcellerna30,31.
De viktigaste begränsningarna av att arbeta i detta modellsystem härrör från den lilla storleken på SCGs i embryonala råttungar, vilket resulterar i litet antal nervceller. Detta resulterar i en begränsad mängd nukleinsyror eller protein som kan erhållas från dissekering av en kull av ungar. Detta kan vara problematiskt för genomisk och proteomisk analys, särskilt vid jämförelse mellan flera behandlingar i en dissektion. Också, Det är inte möjligt att erhålla SCG neuronala kulturer från ett enda embryo. Alla experimenten utförs därför på poolade prover som erhålls från SCG av alla råttembryon i en kull. En annan begränsning av systemet är att SCG nervceller har lägre DNA-transfektion effektivitet (10 - 20%, opublicerade observationer) och högre toxicitet efter transfektion jämfört med centrala nervceller32. Även om denna transfektion effektivitet är bra för morfologiska studier med enskilda nervceller, är det svårt att utföra molekylära eller biokemiska studier för att upptäcka/bekräfta genuttryck förändringar.
Under senare år har dock odlade SCG nervceller använts för studier som undersöker de mekanismer som ligger till grund för dendritisk tillväxt och för transkriptom och miRNome analyser14,15,33. Som anges tidigare, på grund av låga proteinmängder, odlade nervceller från embryonala SCG har inte använts tidigare för proteomisk analys. Detta protokoll och representativa resultat ger belägg för att även med låg koncentration av prover, nuvarande högupplösta masspektrometri instrument skulle kunna användas för proteomiska studier på dessa nervceller. Även om provberedningsprotokollet som beskrivs här är för SCG nervceller, kan detta protokoll användas för beredning av alla prov med låg proteinkoncentration för LC-MS-analys. En av begränsningarna är att små variationer i proteinkoncentration eller effektivitet av trypsin matsmältningen kan resultera i ofullständig fragmentering och en dramatisk minskning av antalet proteiner som upptäcks av LC-MS. Därför är det viktigt att säkerställa att startproteinkoncentrationerna är så nära 50 μg med ett 10:1-förhållande protein: trypsin. Också, Det är en god praxis att alikvotera massa spectrometry-grade trypsin för att förhindra flera frys-tina cykler.
En annan begränsning av protokollet är att det endast fanns ett begränsat antal transmembrane proteiner som detekterades i proteomet. Medan den sura labila ytaktiva har visat sig vara ett effektivt ytaktiva medel för masspektrometri, en tidigare studie på odlade celler fann att dessa ytaktiva ämnen kan något öka antalet cytoplasmatiska proteiner och minska membranproteinerna i proteomic profil34. Också, Det har föreslagits att pre-digestion med hjälp av en bakteriell endopeptidas såsom Lys-C, före trypsin matsmältningen kan förbättra effektiviteten i trypsin matsmältningen av membran bundna proteiner och förhindra membranet proteinfragment från att behållas på LCkolumnerna 35.
Sammanfattningsvis, denna uppsats ger detaljerade protokoll för växande odlade råtta embryonala sympatiska nervceller och för att utföra morfologiska och proteomiska studier på dessa nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av fakulteten utvecklingsfonden och Summer Research Program bidrag vid Saint Mary's College of California. Författarna vill också tacka Dr Pamela Lein vid University of California i Davis och Dr Anthony Iavarone på UC Berkeley Mass spektrometri anläggning för deras råd under utvecklingen av dessa protokoll. Författarna vill också tacka Haley Nelson i Office of College Communications vid Saint Mary's College of California för hennes hjälp med videoproduktion och redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid - Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
