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Cancer Research

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289

Summary

Inhibitoren von Histonacetyltransferasen (HATs, auch bekannt als Lysin-Acetyltransferasen), wie CBP/p300, sind potenzielle Therapeutika zur Behandlung von Krebs. Es sind jedoch strenge Methoden zur Validierung dieser Inhibitoren erforderlich. Drei In-vitro-Methoden zur Validierung umfassen HAT-Assays mit rekombinanten Acetyltransferasen, Immunoblotting für Histonacetylierung in der Zellkultur und ChIP-qPCR.

Abstract

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) katalysieren die Acetylierung von Lysinrückständen auf Histonen und anderen Proteinen, um die Chromatindynamik und Genexpression zu regulieren. KATs, wie CBP/p300, werden aufgrund ihrer kritischen Rolle bei der Tumorgenese verschiedener Krebsarten intensiv als therapeutische Ziele untersucht. Die Entwicklung neuartiger kleiner Molekülinhibitoren, die auf die Histonacetyltransferase(HAT)-Funktion von KATs abzielen, ist anspruchsvoll und erfordert robuste Tests, die die Spezifität und Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren validieren können.

Dieser Artikel skizziert eine Pipeline von drei Methoden, die eine strenge In-vitro-Validierung für neuartige HAT-Hemmer (HATi) bieten. Diese Methoden umfassen einen Testfürhorn HAT, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) Assay, und Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Im HAT-Test werden rekombinante HATs mit Histonen in einer Reagenzreaktion inkubiert, was eine Acetylierung spezifischer Lysinrückstände an den Histonschwänzen ermöglicht. Diese Reaktion kann durch ein HATi blockiert werden und die relativen Niveaus der standortspezifischen Histonacetylierung können mittels Immunoblotting gemessen werden. Inhibitoren, die im HAT-Test identifiziert wurden, müssen in der zellulären Umgebung bestätigt werden.

Der ChHAI-Assay verwendet Immunoblotting, um neuartige HATi zu prüfen, die die robuste Hyperacetylierung von Histonen dämpfen, die durch einen Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDACi) induziert wird. Die Zugabe eines HDACi ist hilfreich, da basalen Niveaus der Histon-Acetylierung kann schwierig sein, über Immunoblotting zu erkennen.

Die HAT- und ChHAI-Assays messen globale Veränderungen in der Histonacetylierung, liefern jedoch keine Informationen über die Acetylierung in bestimmten genomischen Regionen. Daher wird ChIP-qPCR verwendet, um die Auswirkungen von HATi auf Histon-Acetylierungsniveaus bei Gen-Regulierungselementen zu untersuchen. Dies wird durch selektive Immunpräzipitation von Histon-DNA-Komplexen und Analyse der gereinigten DNA durch qPCR erreicht. Zusammen ermöglichen diese drei Assays eine sorgfältige Validierung der Spezifität, Potenz und des Wirkmechanismus neuartiger HATi.

Introduction

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) katalysieren die Acetylierung von Lysinrückständen auf Histon- und Nicht-Histonproteinen1,2,3,4. Jüngste Forschung zeigt, dass KATs und ihre Acetyltransferase-Funktion solidesTumorwachstum4,5,6,7,8,9fördern kann. Zum Beispiel sind CREB-bindendes Protein (CBP)/p300 zwei paralogende KATs, die zahlreiche Signalwege bei Krebs regulieren2,3. CBP/p300 haben eine gut charakterisierte Histon-Acetyltransferase (HAT)-Funktion und katalysieren Histon 3 Lysin 27 Acetylierung (H3K27ac)2,4,5,10,11, ein wichtiger Marker für aktive Enhancer, Promotorregionen und aktive Gentranskription12,13,14. CBP/p300 dienen als kritische Co-Aktivatoren für wachstumsfördernde Signalwege bei soliden Tumoren durch Aktivierung der Transkription von Onkogenen durch Acetylierung von Histonen und anderen Transkriptionsfaktoren4,9,15,16,17,18. Aufgrund ihrer Rolle bei der Tumorprogression werden CBP/p300 und andere KATs für die Entwicklung neuartiger Inhibitoren untersucht, die ihre onkogene Funktion blockieren4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 und GNE-049 stellen zwei erfolgreiche Versuche dar, potente und spezifische Inhibitoren für CBP/p3004,9zu entwickeln. Weitere Inhibitoren werden derzeit für CBP/p300 und andere KATs untersucht.

Die Qualität der zuvor beschriebenen KAT-Hemmer (KATi) wird in Frage gestellt, wobei viele Inhibitoren Zielwirkungen und eine schlechte Charakterisierung zeigen21. Daher ist eine strenge Charakterisierung und Validierung neuartiger Wirkstoffkandidaten für die Entwicklung hochwertiger chemischer Sonden unerlässlich. Hier sind drei Protokolle beschrieben, die eine Pipeline zum Screening bilden und die Wirksamkeit und Spezifität neuartiger KATi streng validieren, mit einem besonderen Schwerpunkt auf der Hemmung der HAT-Funktion (HATi) von KATs. CBP/p300 und ihre Inhibitoren werden als Beispiele verwendet, aber diese Protokolle können für andere KATs angepasst werden, die eine HAT-Funktion haben7.

Das erste Protokoll ist ein In-vitro-Histon-Acetyltransferase (HAT)-Assay, der gereinigte rekombinante p300 und Histone in einer kontrollierten Reagenzröhrenreaktion verwendet. Dieser Test ist einfach durchzuführen, ist kostengünstig, kann verwendet werden, um Verbindungen in einer niedrigen Durchsatzeinstellung zu überprüfen, und erfordert keine radioaktiven Materialien. In diesem Protokoll werden rekombinante p300 Katalysen Lysin-Acetylierung an Histonschwänzen während einer kurzen Inkubationszeit und die Konzentrationen der Histonacetylierung mit Standard-Immunoblotting-Verfahren gemessen. Die enzymatische Reaktion kann in Gegenwart oder Abwesenheit von CBP/p300-Inhibitoren durchgeführt werden, um auf Verbindungen zu überprüfen, die die Histonacetylierung reduzieren. Darüber hinaus kann der HAT-Test verwendet werden, um zu überprüfen, ob neuartige Verbindungen selektiv für CBP/p300 sind, indem ihre Aktivität mit anderen gereinigten KATs, wie PCAF, bewertet wird. Der HAT-Test ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für die Untersuchung neuartiger Inhibitoren aufgrund seiner Einfachheit, niedrigen Kosten und der Fähigkeit, die Wirksamkeit/Selektivität eines Inhibitors zu bestimmen. Tatsächlich wird dieses Protokoll in der Literatur oft als In-vitro-Bildschirmverwendet 5,10. Jedoch, Inhibitoren im HAT-Assay identifiziert sind nicht immer wirksam in der Zellkultur, weil eine Reagenzglasreaktion ist viel einfacher als ein lebendes Zellsystem. Daher ist es wichtig, Inhibitoren in Zellkulturexperimenten weiter zu charakterisieren22,23.

Das zweite Protokoll in der Pipeline ist der Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) Assay. Dieser zellbasierte Assay nutzt Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDACi) als Werkzeug, um Histonen in Chromatin vor der Co-Inkubation mit einem HATi24zu hyperacetylate Histone in Chromatin. Basal-Histon-Acetylierung kann in der Zellkultur niedrig sein, was es schwierig macht, über Immunoblotting zu sondieren, ohne dass ein HDACi hinzugefügt wird, um die Acetylierung zu erhöhen. Der Zweck des ChHAI-Assays ist es, neuartige HATi zu identifizieren, die die Zunahme der Histonacetylierung durch HDAC-Hemmung abschwächen können. Die Vorteile dieses Tests sind seine niedrigen Kosten, relative Leichtigkeit zu erfüllen, und die Verwendung von Zellen in der Kultur, die mehr physiologische Relevanz als das Reagenzglas HAT Assay bietet. Ähnlich wie der HAT-Test verwendet dieses Protokoll Standard-Immunoblotting für die Datenerfassung.

Die HAT- und ChHAI-Assays liefern Daten über die Wirksamkeit neuartiger Verbindungen zur Hemmung der globalen Histonacetylierung, geben aber keinen Einblick, wie diese Verbindungen Modifikationen in bestimmten genomischen Regionen beeinflussen. Daher ist das endgültige Protokoll, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR), ein Zellkulturexperiment, das DNA-Protein-Wechselwirkungen an bestimmten Regionen des Genoms untersucht. Im ChIP-Protokoll ist Chromatin vernetzt, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten. Das Chromatin wird dann aus Zellen extrahiert und der DNA-Protein-Komplex erhält eine selektive Immunpräzipitation für das Protein von Interesse (z.B. mit einem Antikörper speziell für H3K27ac). Die DNA wird dann gereinigt und mit qPCR analysiert. Beispielsweise kann ChIP-qPCR verwendet werden, um festzustellen, ob ein neuartiges HATi die Histonacetylierung bei einzelnen Onkogenen, wie Cyclin D125, herunterreguliert. Während ChIP-qPCR eine gängige Technik ist, die im Feld verwendet wird, kann es schwierig sein,4,10,26zu optimieren. Dieses Protokoll enthält Tipps zur Vermeidung potenzieller Fallstricke, die bei der Ausführung der ChIP-qPCR-Prozedur auftreten können, und enthält Qualitätskontrollen, die für die Daten durchgeführt werden sollten.

Zusammen ermöglichen diese drei Protokolle die strenge Charakterisierung und Validierung neuartiger HATi. Darüber hinaus bieten diese Methoden viele Vorteile, da sie einfach durchzuführen, relativ günstig sind und Daten über globale sowie regionale Histon-Acetylierung liefern.

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Protocol

1. In-vitro-HAT-Test

  1. Puffervorbereitung
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Pufferrezepte.
    1. 5x Assaypuffer und 6x Natriumdodecylsulfat (SDS) vorbereiten und bei -20 °C lagern. Aliquot SDS in 1 ml Aliquots.
    2. 10x SDS-Gellaufpuffer und 10x TBST vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.
    3. 1x Transferpuffer vorbereiten und bei 4 °C lagern.
      VORSICHT: Überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt auf alle in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien. SDS, DTT und Bromphenolblau sind giftig und sollten nicht aufgenommen, eingeatmet oder der Haut oder den Augen ausgesetzt werden. Für ordnungsgemäße Handhabungsverfahren finden Sie ein Sicherheitsdatenblatt. Bitte verwenden Sie eine chemische Rauchhaube für den Umgang mit gefährlichen Chemikalien.
  2. HAT-Reaktion
    HINWEIS: Anacardinsäure ist ein bekannter p300-Hemmer3 und wird als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie der HAT-Assay neuartige p300-Inhibitoren identifizieren kann. Eine Schaltplanversion von Schritt 1.2.1 finden Sie unter Ergänzendes Protokoll (Schema 1).
    1. Bereiten Sie die folgende enzymatische Reaktion in einem 0,2 ml PCR-Rohr vor: 2 l 5x Assay-Puffer, 1 l gereinigte p300 (0,19 g/l), 1 l Anakardieinsäure (HATi) oder DMSO-Kontrolle verdünnt in 1x Assay-Puffer und 2 l autoklavierte ddH2O. Dann fügen Sie der Reaktion 3 l mit 100 m Acetyl-CoA und 1 l gereinigtem H3,1 (0,2 g/l) hinzu.
    2. Inkubieren Sie das komplette Reaktionsgemisch bei 30 °C für 1 h in einem PCR-Thermocycler.
    3. Fügen Sie 2-Mercaptoethanol im Verhältnis 1:10 zum 6x SDS-Probenpuffer hinzu.
    4. Entfernen Sie Proben aus dem PCR-Thermocycler und fügen Sie dem Reaktionsmix 2 l 6x SDS (mit 2-Mercaptoethanol zugesetzt) hinzu.
      VORSICHT: 2-Mercaptoethanol ist giftig und sollte in einer chemischen Rauchhaube verwendet werden. Zur ordnungsgemäßen Handhabung lesen Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt.
    5. Wärmeproben bei 95 °C für 5 min auf einem Wärmeblock und auf Eis abkühlen. Lagern Sie die Proben bei -20 oder -80 °C oder führen Sie Gelelektrophorese und Immunoblotting wie unten beschrieben durch.
  3. Gelelektrophorese und Immunoblotting
    HINWEIS: Wenn Sie mit Der Gelelektrophorese und Immunoblotting nicht vertraut sind, finden Sie dieses Standardverfahren27, um weitere Informationen zur Durchführung der Schritte 1.3.1-1.3.17 zu erhalten. Weitere Informationen finden Sie hier28,29,30,31,32,33.
    1. Pipette 10 l Proben (ab Schritt 1.2.5.) in die Brunnen eines 4-20% Gradienten Polyacrylamid-Gels. Pipette 5 l Proteinleiter in einen der Brunnen als Molekulargewichtsreferenz. Führen Sie das Gel bei 120 V für 90 min mit einem Geltank.
    2. Übertragen Sie das Gel mit einem Transfertank 70 min auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) membran bei 100 V.
    3. Entfernen Sie die Membran aus dem Transfergerät und legen Sie sie in einen Kunststoffbehälter. Blockieren Sie die Membran, indem Sie 1x TBST (mit 5% Milch) in den Behälter geben und bei Raumtemperatur 1 h sanft schütteln.
    4. Entfernen Sie den 1x TBST aus Schritt 1.3.3. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit ausgewählten ortsspezifischen Acetyl-Antikörpern (z.B. H3K18ac oder H3K27ac Primärantikörper bei einer Verdünnung von 1:5.000 in 1x TBST mit 5% Milch) bei 4 °C mit sanftem Schütteln.
    5. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran 2x mit 1x TBST (keine Milch) bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 15 min jede Wäsche.
    6. Den Sekundärantikörper bei 1:20.000 in 1x TBST (mit 5% Milch) verdünnen und die Membran bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln 1 h bebrüten.
    7. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran 2x mit 1x TBST (keine Milch) bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 15 min jede Wäsche.
    8. 1x TBST von der Membran abtropfen lassen. Mischen Sie HRP-Substratperoxidlösung und HRP-Substrat-Luminol-Lösung in einem Verhältnis von 1:1 (jeweils 1 ml) und Pipette 2 ml der kombinierten Lösung zur Membranoberfläche.
    9. Inkubieren Sie die Lösung mit der Membran für 5 min bei Raumtemperatur.
    10. Überschüssiges chemilumineszierendes Substrat aus der Membran auf ein Papiertuch abtropfen lassen und die Membran in Plastikfolie in einen Röntgenkassettenhalter legen.
    11. Bewegen Sie sich in einen dunklen Raum, der der Röntgenfilmverarbeitung gewidmet ist. Setzen Sie die Membran einem Röntgenfilm aus, indem Sie den Film auf die Membran legen und die Kassette für 30 s schließen.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt des Kontakts zwischen Film und Membran muss experimentell bestimmt werden. Starke Signale benötigen kurze Belichtungen (Sekunden) und schwächere Signale benötigen möglicherweise längere Belichtungen.
    12. Entfernen Sie den Röntgenfilm aus der Kassette und verarbeiten Sie ihn, indem Sie ihn über einen Röntgenfilmprozessor ausführen. In den Herstellerhandbüchern finden Sie spezifische Anweisungen zur Verarbeitung des Röntgenfilms.
    13. Entfernen Sie die Membran von der Kunststofffolie und waschen Sie sie mit ddH2O für 5 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
    14. Inkubieren Sie die Membran mit 0,2 M NaOH für 5 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
    15. Waschen Sie die Membran mit ddH2O für 5 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
    16. Blockieren Sie die Membran, indem Sie 1x TBST (mit 5% Milch) in den Behälter geben und bei Raumtemperatur 1 h sanft schütteln.
    17. Fügen Sie die nächste primäre Antikörperverdünnung hinzu (z. B. Sonde für H3K27ac, wenn der erste Antikörper verwendet wurde H3K18ac) und schütteln Sie über Nacht bei 4 °C. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4-1.3.17, bis alle Antikörpersonden abgeschlossen sind.

2. ChHAI-Test

  1. In-vitro-Arzneimittelbehandlungen und Analyse von acetylierten Histonen
    ANMERKUNG: A-485 ist ein potenter und gut charakterisierter p300 HATi2,4 . Dieser Inhibitor wird in den verbleibenden Assays aufgrund seiner Wirksamkeit und Spezifität in der Zellkultur verwendet werden. MS-275 (Entinostat)24 ist ein HDACi, das die Histon-Acetylierung deutlich erhöht und verwendet wird, um die leichtere Detektion von Acetylierungssonden mit Standard-Immunoblotting zu erleichtern. Siehe Zusatzprotokoll (Schemat 2) für ein Schema der in Schritt 2.1 verwendeten Arzneimittelverdünnungen.
    1. Samen 100.000 MCF-7-Zellen in einer 12-Well-Platte und lassen Sie Zellen bis zu 80-90% Konfluenz in 1 ml Zellkulturmedium wachsen. Markieren Sie die Brunnen für das folgende experimentelle Design: gut 1: DMSO-Steuerung (Referenzpunkt); gut 2: A-485 (3 m); gut 3: A-485 (10 m); gut 4: MS-275 (3 m); gut 5: MS-275 (3 m) + A-485 (3 m); gut 6: MS-275 (3 m) + A-485 (10 m).
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Kultivierung von MCF-7-Zellen komplette DMEM-Medien und lassen Sie Zellen bei 37 °C mit 5%CO2wachsen. Siehe Tabelle 1 für das vollständige DMEM-Rezept.
    2. Bei 24 h nach der Aussaat Pipette 4 ml komplettes DMEM-Medium zu einem sterilen 15 ml konischen Rohr. Pipette 2 l MS-275 (6 mM in DMSO) auf das Medium 4 ml für eine Endkonzentration von 3 m MS-275.
    3. Pipette 2 l DMSO bis 4 ml Medium in einem separaten sterilen 15 ml konischen Rohr.
      VORSICHT: Bitte überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt auf ordnungsgemäße Handhabung von DMSO. Einige Handschuhtypen sind nicht für die Handhabung von DMSO bewertet.
    4. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium von den Brunnen 4-6 und der Pipette 1 ml von 3 m MS-275 in medium (Schritt 2.1.2) zu jedem Brunnen. Entsorgen Sie nicht verwendete verdünnte MS-275.
    5. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium von den Brunnen 1-3 und pipette 1 ml verdünntem DMSO (Schritt 2.1.3) zu jedem Brunnen. Entsorgen Sie nicht verwendete verdünnte DMSO.
    6. Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und brüten Sie 4 h, um die Ansammlung von acetylierten Histonen in Zellen zu ermöglichen, die MS-275 ausgesetzt sind (Brunnen 4-6).
      HINWEIS: MS-275 ist ein HDACi und wird Histon-Hyperacetylierung24verursachen. Diese 4 h Vorinkubation ist notwendig, damit MS-275 eine Hyperacetylierung vor der Zugabe von A-485 induzieren kann, wodurch die Histonacetylierung2,4reduziert wird.
    7. Nach 4 h Inkubation mit MS-275 die folgenden Verdünnungen in separaten sterilen 1,5 ml-Rohren durch Pipettieren vorbereiten: 1,0 l DMSO bis 1 ml DMEM-Medien; DMSO 0,5 l und DMEM-Medien von 0,5 l A-485 (6 mM) bis 1 ml; DMSO 0,5 l und 0,5 l A-485 (20 mM) bis 1 ml DMEM-Medien; DMSO 0,5 l und MS-275 (6 mM) bis 1 ml DMEM-Medien 0,5 l; 0,5 l A-485 (6 mM) und 0,5 l MS-275 (6 mM) bis 1 ml DMEM-Medien; 0,5 l A-485 (20 mM) und 0,5 l MS-275 (6 mM) bis 1 ml DMEM-Medien.
    8. Das Zellkulturmedium von den Brunnen 1-6 und die Pipette 1 ml Verdünnung 1 bis gut 1, Verdünnung 2 bis gut 2, Verdünnung 3 bis gut 3, Verdünnung 4 bis gut 4, Verdünnung 5 bis gut 5 und Verdünnung 6 bis gut 6.
      HINWEIS: Eine allgemeine Regel besteht darin, den DMSO-Gehalt (Lösungsmittel) zwischen versuchsweisen Gruppen auszugleichen und den DMSO-Gehalt in der Zellkultur nicht zu überschreiten, um zelluläre Toxizität und Veränderungen in der Proliferation zu vermeiden.
    9. Bringen Sie die Zellen für 20 h in den Inkubator und die Kultur zurück.
    10. Nach 20 h, aspirieren Sie die Zellkultur Medium aus Brunnen 1-6.
    11. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS auf die Bohrungen 1-6 pfeifen. Aspirieren Sie die PBS.
    12. Fügen Sie 100 l 1x passivelylyse Puffer (siehe Tabelle 1) zu Den Brunnen 1-6. Zellkulturplatte (mit Proben im passiven Lysepuffer) bei 80 °C über Nacht für Gefriertau und Lyse von Zellen lagern.
      VORSICHT: Bitte überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt auf alle Chemikalien, bevor Sie Puffer herstellen. CDTA kann schwere Augenschäden und Reizungen verursachen.
    13. Proben bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln 10 min auftauen. Proben in getrennte 1,5 ml-Rohre geben und sofort auf Eis legen.
    14. Messen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe. Die Proteinkonzentration kann mit mehreren etablierten Protokollen bestimmt werden34.
    15. Gleichgewichtsproteinkonzentration zwischen den Proben 1-6 (in gleichem Volumen) mit 1x passivem Lysepuffer, um sie bei Bedarf zu verdünnen.
    16. Fügen Sie 2-Mercaptoethanol im Verhältnis 1:10 zum 6x SDS-Probenpuffer hinzu.
    17. 6x SDS-Probenpuffer mit 2-Mercaptoethanol zu den Proben 1-6 zu einer Endkonzentration von 1x SDS-Probenpuffer hinzufügen.
    18. Wärmeproben bei 95 °C für 5 min auf einem Wärmeblock und auf Eis abkühlen. Die Proben können bis Schritt 2.1.19 bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden.
    19. Pipette ein Volumen, das 30 g Protein für Proben 1-6 zu den Brunnen in einem 4-20% Gradient polyacrylamidgel enthält. Durchführung eines Immunoblotting-Verfahrens gemäß protokollarisch, das in Protokoll 1 beschrieben ist.

3. ChIP-qPCR

HINWEIS: Das folgende Protokoll wird als Beispiel für Inhibitoren von p300 beschrieben.

  1. Puffervorbereitung
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Pufferrezepte. Die unten aufgeführten allgemeinen Schritte des ChIP-Protokolls (z.B. Pufferrezepte, Wasch- und Zentrifugationszeiten) werden an die Empfehlungen des Herstellers eines handelsüblichen Kits (siehe Materialtabelle)und aus der Literatur35,36angepasst.
    1. Bereiten Sie ChIP-Verdünnungspuffer, Kernschwellungspuffer, salzarmen Waschpuffer, hohen Salzwaschpuffer, LiCl-Waschpuffer und TE-Puffer vor. Bei 4 °C lagern.
    2. Bereiten Sie SDS-Lysepuffer, 10-fach-Glylyinpuffer und ChIP-Elutionspuffer vor. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
      VORSICHT: Bitte überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt für alle Chemikalien, bevor Sie Puffer herstellen, um eine ordnungsgemäße Handhabung zu gewährleisten.
  2. Drogenbehandlung
    HINWEIS: Siehe Zusatzprotokoll (Schematic 3) für einen Schaltplan der in Schritt 3.2 verwendeten Arzneimittelverdünnungen.
    1. Saat MCF-7 Zellen in zwei 15 cm Kulturschalen und wachsen Zellen zu 90% Konfluenz in 12 ml des gesamten DMEM Mediums. Markieren Sie die Gerichte für das folgende experimentelle Design: Schale 1: DMSO-Steuerung (Referenzpunkt); Schale 2: A-485 (3 m).
      HINWEIS: Für die Kultivierung von MCF-7-Zellen verwenden Sie komplette DMEM-Medien und wachsen bei 37 °C mit 5%CO2. Siehe Tabelle 1 für das vollständige DMEM-Rezept.
    2. In einem sterilen 15 ml konischen Rohr, Pipette 12 ml DMEM-Medien und Pipette 6 l DMSO. Gut mischen.
    3. In einem separaten sterilen 15 ml konischen Rohr, Pipette 12 ml DMEM-Medien und Pipette 6 l A-485 (6 mM in DMSO) um eine Endkonzentration von 3 m A-485 zu erhalten. Gut mischen.
    4. Aspirieren Sie die Medien von Dish 1 und 2.
    5. Fügen Sie die 12 ml verdünnter DMSO in DMEM (Schritt 3.2.2.) zu Schale 1 hinzu.
    6. Fügen Sie die 12 ml von 3 m A-485 in DMEM (Schritt 3.2.3.) zu Schale 2 hinzu.
    7. Die Zellkulturgerichte in den Inkubator zurückgeben und 24 Stunden lang brüten.
  3. Zellfixierung
    1. Pipette 330 l (27,5 l pro ml) von 37% Formaldehyd auf das gesamte Medium und wirbeln die Platte vorsichtig zu mischen.
      VORSICHT: Formaldehyd ist giftig. Für ordnungsgemäße Handhabungsverfahren finden Sie ein Sicherheitsdatenblatt.
    2. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Pipette 2 ml 10x Glycin auf die Platte und wirbeln zu mischen.
    4. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Nach der Inkubation Die Gerichte auf Eis legen und einen Aliquot-Von-Protease-Hemmer-Cocktail auftauen.
    6. Bereiten Sie die folgenden Lösungen sowohl für die DMSO- als auch für die A-485-Beispiele vor, indem Sie die in Schritt 3.1 vorbereiteten Puffer verwenden.
      1. 2 ml PBS mit einer Verdünnung des Protease-Inhibitor-Cocktails von 1:1.000
      2. 1 ml Kernschwellungspuffer mit einer Verdünnung des Proteaseinhibitor-Cocktails von 1:1.000
      3. 0,5 ml SDS-Lysepuffer mit einer Verdünnung des Protease-Inhibitor-Cocktails von 1:1.000
    7. Die Medien aus der Zellkultur zu aspirieren und die Zellen zweimal mit 15 ml kalten PBS zu waschen.
    8. Pipette 2 ml PBS mit dem Protease-Hemmer-Cocktail (Schritt 3.3.6.1) zu den Zellkulturgerichten. Heben Sie die Zellen mit einem Zellschaber in eine Lösung.
    9. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenrohr. Sammeln Sie ggf. die verbleibenden Zellen mit zusätzlichen PBS.
    10. Spin-Rohre bei 800 x g bei 4 °C für 5 min, um die Zellen zu pellet.
    11. Aspirieren Sie den Überstand und die Pipette 1 ml Kernschwellungspuffer mit dem Protease-Hemmer-Cocktail (Schritt 3.3.6.2) zum Pellet. Das Pellet wieder aufsetzen und 10 min auf Eis brüten.
    12. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 2.700 x g bei 4 °C für 5 min zu Pelletkernen.
    13. Aspirieren Sie den Überstand und die Pipette 0,5 ml SDS-Lysepuffer mit dem Protease-Hemmer-Cocktail (Schritt 3.3.6.3) zum Pellet. Das Pellet wieder aufsetzen und 10 min auf Eis brüten.
    14. Bewahren Sie die Chromatinproben bis Schritt 3.4.1 bei -80 °C auf oder fahren Sie sofort mit Schritt 3.4 fort.
  4. DNA-Beschallung
    1. Übertragen Sie 130 l Chromatin aus der DMSO-Probe (Schritt 3.3.14) mit einer Pipette (jeweils 130 l) auf zwei DNA-Beschallungsröhren.
    2. Übertragen Sie 130 l Chromatin aus der A-485-Probe (Schritt 3.3.14) mit einer Pipette (jeweils 130 l) auf zwei DNA-Beschallungsröhren.
    3. Beschallen Sie die DNA auf etwa 150-200 Basenpaarfragmente mit den folgenden Sonicator-Einstellungen: Peak Incident Power (W) von 175, Duty Factor von 10%, 200 Zyklen pro Burst und 430 s Behandlungszeit.
      HINWEIS: Die Sonication-Einstellungen können zwischen den Modellen variieren, und die Einstellungen müssen möglicherweise angepasst werden, um eine angemessene Fragmentgröße für verschiedene Zelllinien zu erreichen.
    4. Halten Sie Proben nach der Beschallung auf Eis.
    5. Das beschallte Chromatin mit einer Pipette und Zentrifuge bei 10.000 x g bei 4 °C 10 min in ein 1,5 ml-Rohr geben.
    6. Pipette der Überstand (enthält beschalltes Chromatin) zu einem neuen Rohr und entsorgen Sie die Trümmer. Beschalltes Chromatin kann bei -80 °C gelagert werden.
  5. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
    HINWEIS: Siehe Ergänzendes Protokoll (Schematic 3) für einen Schaltplan der IP-Gruppen in Schritt 3.5.
    1. Messen Sie den Proteingehalt des beschallten Chromatins für die DMSO- und A-485-Proben aus Schritt 3.4.6. Der Proteingehalt kann mit den etablierten Protokollen34gemessen werden.
      HINWEIS: Der Einfachheit halber geht dieses Protokoll davon aus, dass der Proteingehalt gleich ist und 100 l beschalltes Chromatin verwendet werden. Andernfalls muss der Proteingehalt zwischen allen Proben in gleichem Volumen ausgeglichen werden.
    2. Pipette 100 l DMSO beschalltes Chromatin auf zwei 1,5 ml-Röhren (je 100 l). Pipette 400 l ChIP-Verdünnungspuffer (mit einer Verdünnung des Protease-Inhibitor-Cocktails von 1:1.000) zu jeder Röhre, um das Gesamtvolumen von bis zu 500 l zu bringen. Entfernen Sie 5 l der Lösung aus einem der Rohre und lagern Sie bei -20 °C als DMSO-Eingang.
    3. Pipette 100 l A-485 beschalltes Chromatin auf zwei 1,5 ml Röhren (je 100 l). Pipette 400 l ChIP-Verdünnungspuffer (mit einer Verdünnung des Protease-Inhibitor-Cocktails von 1:1000) zu jeder Röhre, um ein Gesamtvolumen von bis zu 500 l zu bringen. Entfernen Sie 5 l der Lösung aus einem der Rohre und lagern Sie bei -20 °C als A-485 Eingang.
    4. Mit einer Pipette den Immunpräzipitationsantikörper (z. B. unspezifische IgG-Kontrolle oder H3K27ac-spezifische Antikörper) in die entsprechenden Tuben für die DMSO- und A-485-Proben geben: IP-#1 DMSO-Chromatin mit IgG-Antikörper (5-10 g); IP-#2 DMSO-Chromatin mit H3K27ac-Antikörper (5-10 g); IP-#3 A-485-Chromatin mit IgG-Antikörper (5-10 g); IP-#4 A-485-Chromatin mit H3K27ac-Antikörper (5-10 g).
    5. Fügen Sie jeder Röhre 20 L Protein A-Magnetperlen hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Perlen gut resuspended sind.
    6. Drehen Sie die Proben über Nacht bei 4 °C.
    7. Pellet das Protein A magnetische Perlen mit einem magnetischen Separator und entfernen Sie den Überstand. Stören Sie die Perlen nicht.
    8. Waschen Sie die Perlen mit 500 l bis 1 ml des salzarmen Waschpuffers und drehen Sie sie 5 min bei 4 °C. Führen Sie einen schnellen Spin down durch, pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator, und entfernen Sie den Überstand.
    9. Waschen Sie die Perlen mit 500 l bis 1 ml des hochsalzigen Waschpuffers und drehen Sie sie 5 min bei 4 °C. Führen Sie einen schnellen Spin down durch, pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator, und entfernen Sie den Überstand.
    10. Waschen Sie die Perlen mit 500 l bis 1 ml des LiCl-Waschpuffers und drehen Sie sie 5 min bei 4 °C. Führen Sie einen schnellen Spin down durch, pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator, und entfernen Sie den Überstand.
    11. Waschen Sie die Perlen mit 500 l bis 1 ml TE-Puffer und drehen Sie sie 5 min bei 4 °C. Führen Sie einen schnellen Spin down durch. Bewahren Sie die Perlen bis Schritt 3.5.14 im TE-Puffer auf.
    12. Entfernen Sie Eingangsproben (ab Schritt 3.5.2 und 3.5.3) aus dem Gefrierschrank und halten Sie auf Eis.
    13. Tauen Sie ein Aliquot von Proteinase K.
    14. Pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator und entfernen Sie den TE-Puffer aus den Perlen (ab Schritt 3.5.11).
    15. Fügen Sie jeder Probe, einschließlich der Input-Proben, 100 L ChIP-Elutionspuffer + 1 L Proteinase K hinzu. Mit einem Thermocycler Proben mit Schütteln bei 62 °C für 2 h inkubieren.
    16. Nach 2 h, Wärmeproben auf 95 °C für 10 min mit einem Thermocycler.
    17. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur.
    18. Pellet-Magnetperlen mit einem magnetischen Separator und Transferüberstand (enthält die DNA von Interesse) auf eine neue 1,5 ml Röhre.
    19. Reinigen Sie die DNA mit einem Standard-PCR-Reinigungskit.
    20. Die gereinigte DNA kann bei -20 °C gespeichert und als Schablone in Standard-qPCR-Protokollen verwendet werden. Befolgen Sie die Herstellerprotokolle zum Ausführen von qPCR.
  6. ChIP-qPCR Datenanalyse
    HINWEIS: Zwei gängige Methoden zur Analyse der ChIP-qPCR-Ergebnisse sind die Faltenanreicherung über den IgG-Antikörper und die 1%-Eingabemethode. Eine ausgezeichnete Vorlage für beide Analysemethoden wird von einer kommerziellen Quelle zur Verfügung gestellt, um schnell Faltenanreicherung für jeden IP-Antikörper / Ziel von Interesse37zu berechnen.
    1. Um die Falzanreicherung und % Input zu berechnen, kopieren und fügen Sie die "Ct-Werte" aus den qPCR-Daten für jeden Antikörper (unspezifisches IgG, IP H3K27ac Antikörper und 1% Input) automatisch in den entsprechenden Bereich in der Analysevorlage ein, und die Fold Enrichment und Yield % Input werden automatisch aufgepoplgen.

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Representative Results

Der In-vitro-Histon-Acetyltransferase (HAT)-Assay kann verwendet werden, um nach Verbindungen zu suchen, die die p300 HAT-Aktivität in Richtung eines Histonsubstrats hemmen. Abbildung 1A enthält einen experimentellen Schaltplan für den HAT-Test. Anacardinsäure, eine bekannte HATi3,38, wurde in diesem Test in einem Konzentrationsbereich von 12,5-100 m verwendet. Bei 100 m reguliert Anacardinsäure p300 katalysierte Histon-Acetylierung bei Histone 3, Lysines 9 und 18 im Vergleich zur Kontrolle der DMSO-Behandlung(Abbildung 1B, Spur 5 versus Spur 1). Ein Konzentrationsbereich wurde in diesem Test verwendet, weil niedrigere Arzneimitteldosierungen p300 HAT Aktivität nicht stark hemmen können(Abbildung 1B, Bahnen 2-4 versus Spur 1). In Lane 6 wurde der Reaktion kein Acetyl-CoA hinzugefügt und dient als Negativkontrolle für die p300-Katalyse und für basale Gehalte der Histonacetylierung auf rekombinante H3.1 (Abbildung 1B). P300 und H3.1 Proteingehalte wurden als Belastungskontrollen verwendet (Abbildung 1B). Diese Immunoblot-Ergebnisse wurden mit ImageJ39 (Abbildung 1C) quantifiziert. Faltenänderungen wurden berechnet, indem die Bandintensität jeder Probe mit der Bandintensität der DMSO-Steuerung für jede Acetylierungssonde verglichen wurde. Die Quantifizierung für Anacardinsäure bei 100 M zeigt eine starke Reduktion von H3K18ac und H3K9ac im Vergleich zur DMSO-Steuerung und bestätigt die visuellen Ergebnisse in Abbildung 1B.

Im Chromatin Hyperacetylierungsinhibition (ChHAI) Assay wird HDACi als Werkzeug verwendet, um Histonen in Chromatin vor der Co-Inkubation mit einem HATi24,wie p300-Hemmer A-4852,4,zu hyperacetylieren. Der Zweck dieses Tests ist es, die Wirksamkeit von HATi zur Dämpfung der durch HDACi induzierten Histonhyperacetylierung zu bestimmen. Abbildung 2A enthält einen experimentellen Schaltplan für den ChHAI-Assay. In diesem Test, Behandlung von MCF-7-Zellen mit HDACi MS-275 stark upregulierte Acetylierung auf Histon 3, auf mehrere Lysinrückstände(Abbildung 2B, Spur 4 versus Spur 1). Die Basalwerte von H3K18ac und H3K27ac waren niedrig, was die Vorteile des Hinzufügens eines HDACi im ChHAI-Assay zeigt (Abbildung 2B, Bahnen 1-3). Die Zugabe von A-485 mit MS-275 dämmt die erhöhte Histon-Acetylierung bei H3K18 und H3K27, aber nicht H3K9(Abbildung 2B, Bahnen 4-6). Wichtig ist, dass H3K9ac nicht durch p300 in zellkultur2reguliert wird, was die Spezifität von A-485 in diesem Experiment zeigt. Diese Immunoblot-Ergebnisse wurden in Abbildung 2Cquantifiziert. Faltenänderungen wurden berechnet, indem die Bandintensität jedes Samples mit der Bandintensität von MS-275 allein (Lane 4) für jede Acetylierungssonde verglichen wurde. Die Bahnen 1-3 wurden nicht quantifiziert, da H3K18ac und H3K27ac Basalwerte nicht nachgewiesen wurden.

Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) ist ein Zellkulturexperiment, das DNA-Protein-Wechselwirkungen an bestimmten Regionen des Genoms untersucht. Es kann verwendet werden, um die Auswirkungen von HATi auf Gen-Regulierungselemente zu untersuchen, die die Onkogenexpression25kontrollieren. Abbildung 3A enthält einen experimentellen Schaltplan für das ChIP-qPCR-Protokoll. MCF-7-Zellen, die 24 Stunden lang mit 3 M A-485 behandelt wurden, wurden ChIP-qPCR durch Immunpräzipitation von Histon-DNA-Komplexen, angereichert mit H3K27ac , unterzogen (Abbildung 3). Die gereinigte DNA wurde für die Cyclin D1-Promotorsequenz analysiert. ChIP-qPCR Primer sind gegen eine bestimmte DNA-Sequenz im Genom ausgelegt und werden verwendet, um die relative Menge der gefällten DNA zu erkennen. Die Menge der gefällten DNA spiegelt die Fülle des Proteins wider, das in der untersuchten Genomregion von Interesse ist. Tatsächlich ergibt die durch den IgG-Kontrollantikörper ausgefällte DNA in der DMSO-Probe einen höheren Ct-Wert als der H3K27ac-Antikörper in der qPCR-Reaktion für den Cyclin-D1-Promotor (Abbildung 3B). Dies deutet darauf hin, dass die unspezifische IgG-Kontrolle weniger DNA-Protein-Komplexe auslöste als der H3K27ac-spezifische Antikörper am Cyclin D1-Promotor. Dies bedeutet eine 632,73-fache Anreicherung von H3K27ac gegenüber der unspezifischen IgG-Steuerung (Abbildung 3B).

Diese Faltenanreicherung belegt, dass der H3K27ac-spezifische Antikörper erfolgreich immunpräzipierte acetylated Histone immunistitierte Histone neriert hat und dass H3K27ac am Cyclin D1-Promotor angereichert ist. Nach Der Validierung der Qualität des H3K27ac-Antikörpers kann ein Vergleich zwischen den behandelten DMSO- und A-485-Gruppen vorgenommen werden. Wie in Abbildung 3Cdargestellt, reduziert A-485 die H3K27ac-Anreicherung am Cyclin D1-Promotor im Vergleich zur DMSO-Steuerung mit der %Input-Methode (repräsentatives Ergebnis von n=2). Wichtig ist, dass A-485 bekannt ist, um H3K27ac in der Zellkultur signifikant zu reduzieren2,4.

ChIP-qPCR Raw %Input-Werte können zwischen unabhängigen biologischen Replikationen sehr variabel sein, obwohl der experimentelle Trend reproduzierbar ist. Daher kann es nützlich sein, die Daten als normalisierte Prozent der DMSO-Kontrolle darzustellen, um das reproduzierbare Verhältnis zwischen Kontrolle und medikamentöser Behandlung zu zeigen10. In Abbildung 3Dreguliert Beispielsweise A-485 die H3K27ac-Belegung am Cyclin D1-Promoter (n=2) deutlich herunter. Die statistische Analyse basierte auf dem t-Test des Studenten (*P < 0,05).

Figure 1
Abbildung 1: Anacardinsäure hemmt die enzymatische Aktivität p300 in einem HAT-Assay. (A) Ein schematisches Diagramm des HAT-Assays, der die enzymatische Reaktion darstellt. (B) Anacardinsäure hemmte die enzymatische Aktivität p300 stark und regulierte die Histonacetylierung bei H3K18 und H3K9 bei 100 m (Spur 5) im Vergleich zur DMSO-Kontrollbehandlung (Spur 1). Lane 6 fehlt Acetyl-CoA in der Reaktion und diente als negative Kontrolle für Histon-Acetylierung. (C) Die Immunoblot-Ergebnisse in (B) wurden quantifiziert. Faltenänderungen wurden berechnet, indem die Bandintensität jeder Probe mit der Bandintensität der DMSO-Steuerung für jede Acetylierungssonde verglichen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: p300-Hemmer A-485 dämmen die Histonhyperacetylierung im ChHAI-Assay stark. (A) Ein schematisches Diagramm des ChHAI-Assays. (B) In MCF-7-Zellen, HDAC-Hemmer MS-275 stark upreguliert Histon-Acetylierung bei H3K18, K27 und K9 (Spur 4) im Vergleich zur DMSO-Steuerung (Spur 1). Die Zugabe von A-485, einem bekannten p300 HAT-Hemmer, mit MS-275 dämte die Zunahme der Histonacetylierung bei H3K18 und K27 ab, nicht aber H3K9 (Spur 5-6 versus Spur 4). (C) Die Immunoblot-Ergebnisse in (B) wurden quantifiziert. Faltenänderungen wurden berechnet, indem die Bandintensität jedes Samples mit der Bandintensität von MS-275 allein (Lane 4) für jede Acetylierungssonde verglichen wurde. Die Bahnen 1-3 wurden nicht quantifiziert, da H3K18ac und H3K27ac Basalwerte nicht nachgewiesen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: p300-Hemmer A-485 verringert den H3K27ac-Spiegel am Cyclin D1-Promotor, gemessen mit ChIP-qPCR. (A) Ein schematisches Diagramm des ChIP-qPCR-Protokolls. (B) Repräsentative qPCR Ct-Werte für den Cyclin D1-Promotor für die IgG- und H3K27ac-Immunpräzipitationen. Die IgG-Steuerung hatte einen höheren Ct-Wert, was darauf hindeutet, dass der H3K27ac-Antikörper erfolgreich für H3K27ac gegenüber dem unspezifischen IgG-Antikörper angereichert wurde. (C) A-485 (3 m) Behandlung für 24 h downregulierte H3K27ac am Cyclin D1 Promoter im Vergleich zur DMSO-Kontrollbehandlung in MCF-7-Zellen (repräsentatives Ergebnis von n=2). (D) Der %Input aus zwei unabhängigen ChIP-Experimenten wurde als Prozentsatz der DMSO-Steuerung auf die DMSO-Steuerung normalisiert. Die Behandlung mit A-485 in MCF-7-Zellen reguliert die H3K27ac-Belegung am Cyclin D1-Promotor signifikant. Die statistische Analyse basierte auf dem t-Test des Studenten (*P < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Puffer Rezept
10X Glycinpuffer 18,74 g Glycin mit PBS bis zur Auflösung und PBS zu 200 ml hinzufügen.
10X Running Buffer 250 mM Tris, 1,9 m Glycin, 1% SDS
30,0 g Tris-Basis, 144,0 g Glycin und 10,0 g SDS in 1000 ml H2O auflösen. Der pH-Wert des Puffers sollte 8,3 betragen, und es ist keine pH-Einstellung erforderlich. Bewahren Sie den Laufpuffer bei Raumtemperatur auf und verdünnen Sie ihn vor Gebrauch auf 1X.
10X TBST 2,42 g Tris-Basis, 8g NaCl, 2 ml 50% Tween 20, ddH2O zu 1 Liter hinzufügen
1X TBST mit 5% Milch 5g Milchpulver pro ca. 100 ml 1X TBST
5X Assay-Puffer: 500 mM HEPES, pH 7,5, 0,4 % Triton X-100
5X Passiver Lysepuffer einen wässrigen Vorrat mit 125 mM Tris, pH 7,8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) Triton X-100 und 50% (vol/vol) Glycerin in ddH2O herstellen.
6X Natriumdodecylsulfat (SDS) 0,375 M Tris pH 6,8, 6 ml Glycerin, 1,2 g SDS, 0,93 g 1,4-Dithiothreitol (DTT), 6 mg Bromphenolblau, Wasser zu 10 ml hinzufügen.
ChIP-Verdünnungspuffer 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl
ChIP-Elutionspuffer 1% SDS (w/v) und 0,1 M NaHCO3 in autoklavierter ddH2O
Komplettes DMEM für MCF-7-Zellen: Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt durch 10% Rinderkalbserum (BCS), Penicillin (10 Einheiten/ml) und Streptomycin (10 mg/ml)
Hoher Salzwaschpuffer 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl.
LiCl-Waschpuffer 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0.
Niedriger Salzwaschpuffer 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl.
Kernschwellungspuffer 5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40
SDS-Lysepuffer 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.0
TE-Puffer 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA.
Transferpuffer 25 mM Tris, 190 mM Glycin, 20% Methanol und pH-Wert prüfen und ggf. auf pH 8,3 einstellen.

Tabelle 1: Rezepte der verwendeten Puffer und Lösung.

Ergänzende Dateien: Ergänzende experimentelle Schaltpläne für Protokolle 1-3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) Acetylat mehrere Lysinrückstände an Histonschwänzen und Transkriptionsfaktoren zur Regulierung der Gentranskription2,3. Die Arbeit der letzten zwei Jahrzehnte hat gezeigt, dass KATs, wie CBP/p300, PCAF und GCN5, mit onkogenen Transkriptionsfaktoren interagieren und dazu beitragen, das Tumorwachstum in mehreren soliden Tumortypen4,5,9,15,16,17,18zu fördern. Aufgrund ihrer sich abzeichnenden Rolle bei der Förderung des Tumorwachstums werden KATs als neue Ziele in der Krebsbehandlung untersucht. Neuartige KAT-Hemmer (KATi) müssen sorgfältig und streng auf Wirksamkeit, Selektivität und Sicherheit getestet werden, bevor sie in die Klinik wechseln. Jüngste Erkenntnisse haben gezeigt, dass zuvor beschriebene KATi-Verbindungen Zielwirkungen aufweisen und schlecht charakterisiert waren, bevor sie in der wissenschaftlichen Literatur als chemische Sonden weit verbreitet waren21. Daher sind strenge Methoden für die KATi-Charakterisierung erforderlich. Beschrieben sind drei Protokolle, die zusammen verwendet werden können, um neuartige Inhibitoren zu charakterisieren und zu validieren, die auf die Histonacetyltransferase (HAT)-Funktion von KATs abzielen: ein in vitro HAT-Assay, der ChHAI-Assay und ChIP-qPCR. Diese Protokolle verwenden CBP/p300 und ihre Inhibitoren als Beispiele, aber diese Methoden können leicht für zukünftige Anwendungen bei der Untersuchung anderer KATs angepasst werden.

Der HAT-Assay ist einfach und eine kostengünstige Möglichkeit, Verbindungen auf Potenz bei der Hemmung der HAT-Funktion in einem Reagenzglas zu überprüfen. Gereinigte HATs (entweder rekombinant4,10 oder immunpräzipierte40) können in diesem Test getestet werden, aber rekombinantes CBP/p300 wird als Beispiel in diesem Protokoll verwendet. CBP/p300 haben eine enzymatische HAT-Domäne, die eine Acetylgruppe von Acetyl-CoA auf einen Lysinrückstand auf einem Zielsubstrat3überträgt. Die am stärksten charakterisierten CBP/p300 Histon-Targets sind Histone 3 Lysin 18 und 27 (H3K18 bzw. H3K27)2,3,10,11. Im HAT-Assay wird die gereinigte p300 HAT-Domäne mit Acetyl-CoA und Histone 3.1 als Substrat inkubiert. Während der Inkubationszeit wird p300 die Acetylierung auf mehrere H3.1-Rückstände katalysieren, einschließlich H3K18 und H3K27. Die relative Häufigkeit der Acetylierung an diesen Rückständen kann durch Immunoblotting gemessen werden. Diese Reagenzglasreaktion kann verwendet werden, um neuartige Verbindungen zu prüfen, die an p300 binden und seine HAT-Aktivität (HATi) hemmen. Beispielsweise reguliert Anacardinsäure, ein bekanntes HATi38, die Histonacetylierung sowohl bei H3K18 als auch bei H3K9 im Vergleich zur DMSO-Steuerung stark nach unten(Abbildung 1B, Spur 5 versus Spur 1). Es ist von entscheidender Bedeutung, Acetyl-CoA zu den experimentellen Reaktionen hinzuzufügen (Abbildung 1B, Bahnen 1-5) oder p300 Katalyse der Histonacetylierung wird nicht auftreten (Abbildung 1B, Lane 6). Das Fehlen von Acetyl-CoA kann auch als Negativkontrolle für p300 Katalyse und für basale Niveaus der Histonacetylierung auf rekombinanten H3.1 verwendet werden.

Bei der Durchführung des HAT-Assays ist es wichtig sicherzustellen, dass jede Reaktion die gleiche Menge an p300, H3.1 und Acetyl-CoA erhält. Die H3.1- und p300-Werte im Immunoblot dienen als Ladekontrolle für das Gel. Für diesen Test können standortspezifische Histon-Acetyl-Antikörper oder ein Pan-Acetyl-Antikörper zur Immunoblotting verwendet werden. Bei der Optimierung zur Verbesserung der Immunoblot-Qualität ist es wichtig, validierte Antikörper für die Immunoblotting zu verwenden und zunächst den Empfehlungen des Herstellers zur Verdünnung von Antikörpern zu folgen. Die im Protokollabschnitt verwendeten Antikörperverdünnungen sind als Referenz und die Verdünnungen können basierend auf den Ergebnissen erster Experimente geändert werden (z. B. wenn das Signal zu stark ist, kann der Antikörper weiter verdünnt werden). Aufgrund seiner Einfachheit ist der HAT-Assay ein ausgezeichnetes Startexperiment für das Screening neuartiger Inhibitoren. Der HAT-Assay hat jedoch Nachteile. Ein hauptanliegen des HAT-Tests ist, dass Verbindungen, die in einem Reagenzglas wirksam sind, sich in einem lebenden System als unwirksam erweisen können. Dies ist ein Problem, weil die zusammengesetzte Wirksamkeit in der Zellkultur durch Zellpermeabilitätsprobleme, Zellstoffwechsel und zusammengesetzte Stabilität verändert werden kann. Darüber hinaus haben KATs, insbesondere CBP/p300, viele Protein-Protein-Wechselwirkungen, die ihre KAT-Aktivität in der Zellkultur regulieren3,41,42. Daher ist es wichtig, die im HAT-Assay identifizierten Inhibitoren in Zellkulturexperimenten20,23weiter zu charakterisieren.

Der Chromatin Hyperacetylierungsinhibition (ChHAI) Assay ist das zweite Protokoll in der Pipeline und ist nützlich für die Validierung der Auswirkungen von neuartigen Inhibitoren in der Zellkultur. Dieser Test nutzt HDAC-Hemmer (HDACi)24, um Histon-Hyperacetylierung in Zellen zu induzieren, weil die basale Acetylierung zu niedrig sein kann, um sie auf einem Immunoblot zu erkennen. Die Zelllinien der Wahl werden mit einem HDACi vorbebrütet, um die Ansammlung von acetyliertem Chromatin vor der Zugabe eines HATi zu ermöglichen. Nach der Co-Inkubation der HDACi und HATi werden die Zellen lysiert und Standard-Immunoblotting-Verfahren für bestimmte Histon-Acetylierungsstellen unterzogen. Der Zweck dieses Tests ist es, die Wirksamkeit von neuartigen HATi zur Dämpfung der durch HDACi induzierten Histonhyperacetylierung zu bestimmen. Zellen, die HDACi ausgesetzt sind, sollten eine signifikant höhere Histonacetylierung aufweisen als Zellen, die dem DMSO-Lösungsmittel ausgesetzt sind(Abbildung 2B, Spur 4 versus Spur 1). Die Zugabe des HATi zusammen mit dem HDACi wird erwartet, dass das Immunoblot-Signal im Vergleich zur HDACi-Behandlung allein zu reduzieren(Abbildung 2B, Bahnen 5-6 versus Spur 4). Basale Gehalte der Histonacetylierung (Abbildung 2B, Bahnen 1-3) sind schwer zu erkennen und unterstreichen die Bedeutung des Hinzufügens eines HDACi in diesem Protokoll. MS-275 (Entinostat) wird als Beispiel verwendet, aber andere HDACi können verwendet werden24,43. MS-275 hat variable berichtete hemmende Konzentrationen im Vergleich zu HDACs der Klasse I und hemmt im Allgemeinen HDAC1 und HDAC3 mit Nanomolar bis zu niedrigen mikromolaren Konzentrationen bzw.43,44. Eine breite Palette von MS-275-Konzentrationen wird in der Literatur45,46,47, aber eine 3-M-Behandlung bietet eine robuste und reproduzierbare Erhöhung der Histon-Acetylierung in MCF-7-Zellen. Daher kann es vorteilhaft sein, einen Anfangsbildschirm mit einer breiten Palette von HDACi- und HATi-Konzentrationen durchzuführen, um die optimale Konzentration für den ChHAI-Assay zu bestimmen, wenn eine andere Zelllinie verwendet wird.

Ähnlich wie beim HAT-Test muss das Immunoblot-Protokoll möglicherweise optimiert werden, um Qualitätsergebnisse durch den Einsatz geeigneter Antikörper, optimaler Antikörperverdünnungen und sorgfältig kontrollierter Probenbelastung zu erzielen. Eine sorgfältig kontrollierte Probenbelastung ist für den Erfolg dieses Protokolls unerlässlich und kann durch gleichgerechnungtes Ausgleichen des Proteingehalts aller Proben und durch Pipettieren gleicher Probenmenge in die Brunnen des Immunoblot-Gels erreicht werden. Ein Pan-Acetyl-Antikörper kann in diesem Protokoll zur Sondierung verwendet werden. Jedoch, Es sollte mit standortspezifischen Acetyl-Antikörpern ergänzt werden, weil KATs Spezifität für bestimmte Histonlysinrückstände haben und HATi nicht alle Histon-Acetylierungsstellen in der Zellkultur1,2,4,5,10,11. Inhibitoren, die bei der Verringerung der Histonacetylierung sowohl in den HAT- als auch in den ChHAI-Assays wirksam sind, sind starke Kandidaten für die weitere Bewertung. Wichtig ist, dass die HAT- und ChHAI-Assays die Einschränkung haben, nur Daten über globale Veränderungen in der Histonacetylierung bereitzustellen. Diese Einschränkung schafft die Notwendigkeit, die Auswirkungen neuartiger HATi auf bestimmte Regionen des Genoms zu charakterisieren.

Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) ist das letzte Protokoll in der Pipeline und wertet DNA-Protein-Wechselwirkungen an bestimmten Regionen des Genoms aus. In diesem Test werden mit H3K27ac angereicherte genomische Regionen durch Immunpräzipitation (IP) gereinigt und mit DNA-Primern in qPCR analysiert. Diese Technik bietet mechanistische Einblicke in die Auswirkungen von Histonmodifikationen bei Genpromotoren und Enhancern. ChIP-qPCR ist eine robuste Technik und ist kostengünstiger als die Sequenzierung des Ganzen Genoms (z. B. ChIP-seq), aber es kann schwierig sein, sie aufgrund vieler Schritte zu optimieren, die das Ergebnis beeinflussen. Der schwierigste Schritt zur korrekten Optimierung ist Schritt 3.5, die Immunpräzipitation. Dieser Schritt ist schwer zu optimieren, da, wenn die gereinigte DNA in Schritt 3.5.20 stark verdünnt ist, es zu schlechten Ergebnissen in der qPCR-Reaktion führen kann (z.B. keine Verstärkung der Zielgensequenz und sehr hohe Ct-Werte). Der Erfolg des IP-Schritts hängt von mehreren Faktoren ab, wie der Häufigkeit des Proteinziels und der Qualität des IP-Antikörpers. Es ist entscheidend, die Qualität des IP H3K27ac Antikörpers im Vergleich zur IgG-Steuerung zu validieren, um den Erfolg des IP-Schritts zu überprüfen. In Abbildung 3Bzeigt der H3K27ac-spezifische Antikörper beispielsweise eine 632,73-fache Anreicherung über die unspezifische IgG-Steuerung. Dies deutet darauf hin, dass der H3K27ac Antikörper qualitativ hochwertig ist und dass H3K27ac am Cyclin D1-Promotor angereichert ist. Nach der Validierung des IP-Antikörpers kann ein Vergleich zwischen den behandelten DMSO- und A-485-Gruppen durchgeführt werden. Wie in Abbildung 3Cdargestellt, reduziert A-485 die H3K27ac-Anreicherung am Cyclin D1-Promotor im Vergleich zur DMSO-Steuerung mit der %Input-Methode (repräsentatives Ergebnis von n=2). Wenn sich der IP-Antikörper als minderwertig erweist und in ersten Experimenten keine Faltenanreicherung zeigt, versuchen Sie, die Zellzahlen in Schritt 3.2.1 zu erhöhen. Höhere Zellzahlen können dazu beitragen, die schlechte Antikörperqualität zu kompensieren, indem der Gesamtproteingehalt des Lysats erhöht wird und mehr Protein zur IP-Reaktion hinzugefügt werden kann.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder Offenlegungen zu machen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Stipendien von James und Esther King Biomedical Research Program (6JK03 und 20K07) und Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 und 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation und UF Health Cancer Center unterstützt. Darüber hinaus möchten wir uns bei Dr. Zachary Osking und Dr. Andrea Lin für die Unterstützung während des Publikationsprozesses bedanken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

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