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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

ヒストンアセチルトランスビシ酵素(HAT、リジンアセチルトランスビセラーゼとも呼ばれる)の阻害剤は、CBP/p300などの、癌を治療するための潜在的な治療薬です。しかし、これらの阻害剤を検証するための厳格な方法が必要です。検証のための3つのin vitro方法には、組換えアセチルトランスファー酵素によるHATアッセイ、細胞培養におけるヒストンアセチル化のための免疫ブロット法、およびChIP-qPCRが含まれる。

Abstract

リジンアセチルトランスビセラーゼ(KATs)は、ヒストンや他のタンパク質上のリジン残基のアセチル化を触媒し、クロマチンのダイナミクスと遺伝子発現を調節します。CBP/p300などのKATは、多様な癌の腫瘍形成における重要な役割のために、治療標的として激しい調査を受けている。KASのヒストンアセチルトランスビセラーゼ(HAT)機能を標的とした新しい低分子阻害剤の開発は困難であり、潜在的な阻害剤の特異性および効力を検証できる堅牢なアッセイが必要である。

この記事では、新しい HAT 阻害剤 (HATi) に対して厳密な in vitro 検証を提供する 3 つのメソッドのパイプラインについて概説します。これらの方法には、試験管HATアッセイ、クロマチンハイアセチル化阻害(ChHAI)アッセイ、クロマチン免疫沈降定量PCR(ChIP-qPCR)が含まれる。HATアッセイでは、組換えHATは試験管反応でヒストンでインキュベートされ、ヒストンテール上の特定のリジン残基のアセチル化を可能にする。この反応はHATiによってブロックすることができ、部位特異的ヒストンアセチル化の相対的なレベルは、免疫ブロット法を介して測定することができる。HATアッセイで同定された阻害剤は、細胞環境で確認する必要があります。

ChHAIアッセイは、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACi)によって誘発されるヒストンの堅牢な過アセチル化を減衰させる新しいHATiをスクリーニングするために免疫ブロッティングを使用します。ヒストンアセチル化の基底レベルは免疫ブロッティングを介して検出することが困難であり得るので、HDACiの添加は有用である。

HATおよびChHAIアッセイはヒストンアセチル化の世界的な変化を測定するが、特定のゲノム領域におけるアセチル化に関する情報は提供しない。したがって、ChIP-qPCRは、遺伝子調節要素におけるヒストンアセチル化レベルに対するHATiの影響を調べるのに使用される。これはヒストンDNA複合体の選択的免疫沈降とqPCRを介した精製されたDNAの分析によって達成される。これら3つのアッセイは、一緒に、新しいHATiの特異性、効力、および作用機序を慎重に検証することを可能にする。

Introduction

リジンアセチルトランスバシラーゼ(KATs)は、ヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質1、2、3、42,の両方にリジン残基1のアセチル化を触媒する。3,4最近の研究では、KATとそのアセチルトランスファーゼ機能が固形腫瘍の成長を促進できることを明らかに4、5、6、7、8、9 。,5,6,7,8,9例えば、CREB結合タンパク質(CBP)/p300は、癌2,33における多数のシグナル伝達経路を調節する2つのパラパスKAである。CBP/p300はヒストンアセチルトランスファー酵素(HAT)機能をよく特徴付け、ヒストン3リシン27アセチル化(H3K27ac)2、4、5、10、11、活性エンハンサー、プロモーター領域および活性遺伝子転写2,4,5,10,1112、13、1413,の重要12なマーカーを有する。14CBP/p300は、ヒストンおよび他の転写,因子,44、9、15、16、17、189,のアセチル化を介して腫瘍遺伝子の転写を活性化することによって16、17固形腫瘍における増殖促進シグナル伝達経路の重要な共活性化因子として機能する。1518腫瘍の進行におけるその役割のために、CBP/p300および他のKATは、発癌機能,,,,,,4、5、6、7、8、9、18、19、205,6を遮断する新規阻害剤の開発のために調査中である。4789181920A-485とGNE-049は、CBP/p30044,99に対する強力かつ特異的な阻害剤の開発に成功した2つの試みを表しています。CBP/p300および他のKATに対して現在、追加の阻害剤が調査中である。

先に説明したKAT阻害剤(KATi)の品質が問われ、多くの阻害剤が標的効果と悪い特性評価21を示している。そのため、高品質な化学プローブの開発には、新しい薬剤候補の厳密な特性評価と検証が不可欠です。ここでは、新しいKATiの効力と特異性をスクリーニングし、厳密に検証するためのパイプラインを形成する3つのプロトコルがあり、KATsのHAT機能(HATi)を阻害することに特に焦点を当てています。CBP/p300とその阻害剤が例として使用されていますが、これらのプロトコルは、HAT関数7を持つ他のKATに適応することができます。

第1のプロトコルは、精製された組換えp300およびヒストンを制御試験管反応に利用するインビトロヒストンアセチルトランスファー酵素(HAT)アッセイである。このアッセイは、実行が簡単で、費用対効果が高く、低スループット設定で化合物をスクリーニングするために使用することができ、放射性物質を必要としません。このプロトコルでは、組換えp300は、短いインキュベーション期間中にヒストン尾部のリジンアセチル化を触媒し、ヒストンアセチル化のレベルを標準的な免疫ブロッティング手順を使用して測定する。酵素反応は、ヒストンアセチル化を減少させる化合物をスクリーニングするCBP/p300阻害剤の存在または不在で行うことができる。さらに、HATアッセイは、PCAFなどの他の精製KATに対する活性を評価することによって、新規化合物がCBP/p300に選択的であるかどうかを検証するために使用することができる。HATアッセイは、そのシンプルさ、低コスト、および阻害剤の効力/選択性を決定する能力のために、新しい阻害剤を調査するための優れた出発点です。実際、このプロトコルは、多くの場合、in vitroスクリーン55、1010として文献で使用されています。しかしながら、HATアッセイで同定された阻害剤は、試験管反応が生細胞系よりはるかに単純であるため、細胞培養において必ずしも有効であるとは限らない。したがって、細胞培養実験22,23,23において阻害剤をさらに特徴付ける必要がある。

パイプラインの第2のプロトコルは、クロマチンハイパーアセチル化阻害(ChHAI)アッセイである。この細胞ベースアッセイは、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACi)をHATi24と共培養する前にクロマチン中のヒストンを高アセチレートするツールとして利用する。基底ヒストンアセチル化は細胞培養において低く、アセチル化を増加させるためにHDACiを添加せずに免疫ブロット法を介してプローブすることが困難になる。ChHAIアッセイの目的は、HDAC阻害によって引き起こされるヒストンアセチル化の増加を減衰させることができる新しいHATiを同定することです。このアッセイの利点は、その低コスト、実行する比較的容易さ、および試験管HATアッセイよりも生理学的関連性を提供する培養中の細胞の使用を含む。HATアッセイと同様に、このプロトコルはデータ収集に標準免疫ブロット法を使用します。

HATおよびChHAIアッセイは、グローバルヒストンアセチル化を阻害するための新規化合物の効力に関するデータを提供するが、これらの化合物が特定のゲノム領域における修飾にどのような影響を与えるかについての洞察を提供しない。そこで、最終プロトコルであるクロマチン免疫沈降定量ポリメラーゼ連鎖反応(ChIP-qPCR)は、ゲノムの特定の領域におけるDNAタンパク質相互作用を調べる細胞培養実験である。ChIP プロトコルでは、クロマチンは、DNA とタンパク質の相互作用を維持するために架橋されます。次いで、クロマチンを細胞から抽出し、DNA-タンパク質複合体は目的のタンパク質に対して選択的な免疫沈降を受ける(例えば、H3K27acに特異的な抗体を使用)。次いで、dnaを精製し、qPCRを用いて分析します。例えば、ChIP-qPCRは、Cyclin D125のような個々の腫瘍遺伝子におけるヒストンアセチル化を新規HATiがダウンリデンスするかどうかを判断するために使用することができる。ChIP-qPCR はフィールドで使用される一般的な手法ですが、4、10、26を最適化することは困難な場合があります。このプロトコルは、ChIP-qPCR 手順の実行中に発生する可能性のある落とし穴を回避するためのヒントを提供し、データに対して実行する必要がある品質管理チェックを含んでいます。

これら3つのプロトコルを併用すると、新しいHATiの厳密な特性評価と検証が可能になります。さらに、これらの方法は、実行が簡単で、比較的安価であり、グローバルおよび地域ヒストンアセチル化に関するデータを提供するため、多くの利点を提供します。

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Protocol

1. インビトロ HAT アッセイ

  1. バッファ準備
    注: バッファレシピについては 、表 1 を参照してください。
    1. 5xアッセイバッファーと6xナトリウムドデシル硫酸塩(SDS)を準備し、-20 °Cで保存します。 アリコートSDS 1 mLアリコートで。
    2. 10x SDSゲルランニングバッファと10x TBSTを準備し、室温で保存します。
    3. 1x転送バッファーを準備し、4 °Cで保管してください。
      注意: このプロトコルで使用されるすべての化学物質の安全性データシートを確認してください。SDS、DTT、およびブロモフェノールブルーは有毒であり、摂取、吸入、または皮膚または眼に曝されるべきではない。適切な取り扱い手順については、安全データシートを参照してください。危険な化学品を取り扱う際は、化学発煙フードをご使用ください。
  2. 帽子反応
    注:アナカルディン酸は既知のp300阻害剤3 であり、HATアッセイが新しいp300阻害剤を同定する方法を示す例として使用されています。ステップ 1.2.1 の概略については、 補足プロトコル (Schematic 1) を参照してください。
    1. 0.2 mL PCRチューブで以下の酵素反応を調製します:2 μLの5xアッセイバッファー、1 μLの精製p300(0.19 μg/μL)、アナカルディン酸(HATi)1 μL、または1xアッセイバッファーで希釈した1μLの制御、オートクレーブdDH2Oのプレラキュレートを行います。その後、3 μLの100 μMアセチルCoAを加え、精製されたH3.1(0.2 μg/μL)を1 μL加えます。
    2. PCRサーマルサイクラーで30°Cで1時間完全反応混合物をインキュベートします。
    3. 6x SDSサンプルバッファーに対して1:10比で2-メルカプトエタノールを加えます。
    4. PCR サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、6x SDS の 2 μL (2-メルカプトエタノールを加えたもの) を反応ミックスに加えます。
      注意:2-メルカプトエタノールは有毒であり、化学発煙フードの内部で使用する必要があります。適切な取り扱いについては、安全データシートをご覧ください。
    5. 95°Cで熱ブロックで5分間加熱し、氷の上で冷却します。サンプルを-20または-80°Cで保存するか、以下の詳細に従ってゲル電気泳動および免疫ブロットを行ってください。
  3. ゲル電気泳動と免疫ブロット
    注: ゲル電気泳動と免疫ブロッティングに慣れていない場合は、ステップ 1.3.1~ 1.3.17 の実行方法の詳細については、この標準手順27を参照してください。追加情報は、ここに見つけることができます 28,,29,,30,31,32,,33.
    1. ピペット10 μLのサンプル(ステップ1.2.5から)を4〜20%の勾配ポリアクリルアミドゲルのウェルに入れる。タンパク質のラダーのピペット5 μLは、分子量の基準としてウェルの1つに。ゲルタンクを使用して、120 Vで90分間ゲルを実行します。
    2. 転写槽を用いてゲルを100Vでポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜に70分間移動させる。
    3. 転写装置から膜を取り出し、プラスチック容器に入れます。容器に1x TBST(5%ミルクを含む)を加えて膜をブロックし、室温で1時間軽く振ります。
    4. ステップ 1.3.3 から 1x TBST を削除します。選択した部位特異的アセチル抗体(例えば、5%乳を含む1x TBSTで1:5,000希釈でH3K18acまたはH3K27ac一次抗体)を穏やかに振って4°Cで膜を一晩インキュベートします。
    5. 一次抗体溶液を除去します。膜2xを室温で1x TBST(ミルクなし)で洗浄し、各洗浄ごとに15分間穏やかに揺れます。
    6. 2次抗体を1x TBST(5%乳を含む)で1:20,000で希釈し、穏やかな揺れで室温で1時間膜をインキュベートします。
    7. 二次抗体溶液を取り除きます。膜2xを室温で1x TBST(ミルクなし)で洗浄し、各洗浄ごとに15分間穏やかに揺れます。
    8. 膜から1x TBSTを排出します。HRP基質過酸化物溶液とHRP基質ルミノール溶液を1:1比(各1mL)とピペット2mLの膜表面に混合します。
    9. 室温で5分間膜で溶液をインキュベートします。
    10. 膜からペーパータオルに余分な化学発光基材を排出し、X線カセットホルダーの内側にラップで膜を置きます。
    11. X線フィルム処理専用の暗い部屋に移動します。膜を膜の上に置き、カセットを30sで閉じて、膜をX線膜に露出させる。
      注:膜と膜の接触時間は実験的に決定されなければならない。強い信号は短い露出(秒)を必要とし、弱い信号はより長い露出を必要とするかもしれません。
    12. カセットからX線フィルムを取り出し、X線フィルムプロセッサを介してフィルムを動かしてフィルムを処理します。X線フィルムの処理方法については、製造元のマニュアルを参照してください。
    13. ラップから膜を取り出し、穏やかな揺れで室温で5分間ddH2Oで洗います。
    14. 穏やかな揺れで室温で5分間0.2 M NaOHで膜をインキュベートします。
    15. 穏やかな揺れで、室温で5分間、ddH2Oで膜を洗浄します。
    16. 容器に1x TBST(5%ミルクを含む)を加えて膜をブロックし、室温で1時間軽く振ります。
    17. 次の一次抗体希釈液(例えば、最初に使用した抗体がH3K18acであった場合はH3K27ac用プローブ)を加え、4°Cで一晩振る。 すべての抗体プローブが完了するまで、ステップ1.3.4~1.3.17を繰り返します。

2. ChHAIアッセイ

  1. インビトロ薬物治療とアセチル化ヒストンの分析
    注:A-485は強力でよく特徴付けられるp300 HATiである2,4 .この阻害剤は、細胞培養におけるその有効性および特異性のために残りのアッセイに利用される。MS-275 (エンティナスタット)24 ヒストンアセチル化レベルを著しく増加させ、標準的な免疫ブロット法でアセチル化プローブの検出を容易にするために使用されるHDACiです。見る 補足プロトコル (回路図2)ステップ2.1で使用される薬物希釈液の概略について。
    1. 12ウェルプレートに100,000個のMCF-7細胞をシードし、細胞培養培地の1mLで80〜90%の合流まで細胞を増殖させます。次の実験計画のためにウェルをマーク: ウェル 1: DMSO 制御 (基準点);ウェル2:A-485(3 μM)ウェル3:A-485(10 μM)ウェル4:MS-275(3 μM)ウェル5:MS-275(3 μM)+A-485(3μM)。ウェル6:MS-275(3 μM)+A-485(10 μM)。
      注:MCF-7細胞を培養するには、完全なDMEM培地を使用し、セルが5%CO2で372°Cで増殖できるようにします。完全な DMEM レシピについては、表 1を参照してください。
    2. 播種後24時間で、完全なDMEM培地のピペット4 mLを滅菌15 mL円錐管にする。ピペット2 μL MS-275(DMSOでは6 mM)を培地の4 mLに、最終濃度は3 μM MS-275です。
    3. DMSOのピペット2 μLを、独立した滅菌15 mL円錐管内の培地4 mLにする。
      注意: DMSO の適切な取り扱いについては、安全データシートを確認してください。一部のグローブタイプは、DMSOの処理に対して評価されていません。
    4. 細胞培養培地をウェル4-6およびピペット1mLの3μM MS-275培地(ステップ2.1.2)から各ウェルに吸引する。未使用の希釈MS-275を破棄します。
    5. 希釈したDMSOのウェル1~3及びピペット1mLから各ウェルに細胞培養培地を吸引する。未使用の希釈 DMSO を破棄します。
    6. 細胞をインキュベーターに戻し、4時間インキュベートして、MS-275(ウェル4-6)に曝露した細胞中のアセチル化ヒストンの蓄積を可能にする。
      注:MS-275はHDACiであり、ヒストンハイパーアセチル化24を引き起こすでしょう。この4時間前培養は、MS-275がA-485を添加する前に過アセチル化を誘導できるようにするために必要であり、ヒストンアセチル化22、44を減少させる。
    7. MS-275で4時間のインキュベーションを行った後、次の希釈液を別々の滅菌1.5 mLチューブにピペット処理して準備します:1.0 μLのDMSOから1 mLのDMEM培地。DMEMメディアのDMSOの0.5 μLおよび0.5 μL A-485(6 mM)1 mL;DMEMメディアの0.5 μLおよびA-485(20 mM)の0.5 μL(20 mM);DMEMメディアのDMSOの0.5 μLおよびMS-275(6 mM)の0.5 μL(1 mL)。0.5 μLの A-485 (6 mM) および 0.5 μL MS-275 (6 mM) から 1 mL の DMEM メディア。0.5 μLの A-485 (20 mM) および 0.5 μL の MS-275 (6 mM) から 1 mL の DMEM メディア。
    8. この細胞培地をウェル1~6およびピペット1mLの希釈1からウェル1へ吸引し、希釈2~ウェル2、希釈3~ウェル3、希釈4~ウェル4、希釈5~ウェル5、希釈6~ウェル6に吸引する。
      注: 一般的なルールは、実験グループ間で DMSO (溶媒) の内容をバランスを取り、細胞の毒性や増殖の変化を避けるために、細胞培養で DMSO の含有量を 0.1% 超えないようにすることです。
    9. 培養器に細胞を戻し、20時間培養します。
    10. 20時間後、ウェル1〜6から細胞培養培地を吸引する。
    11. 1 mLのPBSをウェル1-6にピペットして細胞を洗浄する。PBSを吸引する。
    12. 1x受動リシスバッファ100μL( 表1参照)をウェル1~6に加えます。細胞の凍結融解およびリシスのために、細胞培養板(受動リシスバッファー内のサンプル)を一晩で−80 °Cに保存します。
      注意:バッファーを作る前に、すべての化学物質の安全データシートを確認してください。CDTAは、深刻な眼の損傷や刺激を引き起こす可能性があります。
    13. 室温でサンプルを解凍し、穏やかな揺れを10分間行います。サンプルを1.5 mLチューブに分け、すぐに氷の上に置きます。
    14. 各サンプルのタンパク質濃度を測定します。タンパク質濃度は、いくつかの確立されたプロトコル34を用いて決定することができる。
    15. 必要に応じて、1x受動リシスバッファーを使用してサンプル1~6間のタンパク質濃度を平衡化します。
    16. 2-メルカプトエタノールを6x SDSサンプルバッファーに対して1:10の比率で加えます。
    17. サンプル 1~6 に 2-メルカプトエタノールを含む 6x SDS サンプル バッファーを加えた後、最終的な濃度の 1 x SDS サンプル バッファーを得ます。
    18. 95°Cで熱ブロックで5分間加熱し、氷の上で冷却します。サンプルは、ステップ2.1.19まで-20°Cまたは-80°Cで保存することができます。
    19. ピペットは、サンプル1〜6のタンパク質の30 μgを含む体積を4〜20%の勾配ポリアクリルアミドゲル内のウェルに対して行う。プロトコル1に記載されたプロトコルに従って免疫ブロット法を実行する。

3. ChIP-qPCR

注: p300 の阻害剤については、以下のプロトコルを例に説明します。

  1. バッファ準備
    注: バッファレシピについては、表 1を参照してください。以下のChIPプロトコルの一般的なステップ(例えば、バッファレシピ、洗浄時間および遠心時間)は、市販キット(資料表を参照)のメーカーの推奨と文献35、36から変更され、36適応される。
    1. ChIP希釈バッファー、核膨潤緩衝液、低塩洗浄バッファー、高塩洗浄バッファー、LiCl洗浄バッファーおよびTEバッファーを準備する。4 °Cで保管。
    2. SDS溶解バッファー、10xグリシンバッファーおよびChIP溶出バッファーを準備します。室温で保管してください。
      注意:適切な取り扱いを確実にするために、バッファーを作る前にすべての化学物質の安全データシートを確認してください。
  2. 薬物治療
    注: ステップ 3.2 で使用される薬物希釈の概略については、 補足プロトコル (Schematic 3) を参照してください。
    1. 2つの15cm培養皿にMCF-7細胞をシードし、完全なDMEM培地の12 mLで90%の合流度に細胞を成長させます。次の実験設計のために皿をマークします: ディッシュ 1: DMSO コントロール (基準点);皿2:A-485(3 μM)。
      注:MCF-7細胞を培養するには、完全なDMEM培地を使用し、5%CO2で372°Cで成長してください。完全な DMEM レシピについては、表 1を参照してください。
    2. 滅菌15 mL円錐管で、DMEM培地のピペット12 mLおよびDMSOのピペット6 μL。よく混ぜます。
    3. 別の滅菌15 mL円錐管で、ピペット12 mLのDMEM培地とピペット6 μLのA-485(DMSOでは6 mM)で、最終的な濃度は3μM A-485を得る。よく混ぜます。
    4. ディッシュ1と2からメディアを吸引します。
    5. DMEMに希釈DMSOの12 mLを加えます(ステップ3.2.2.)をディッシュ1に追加します。
    6. DMEMの3μM A-485の12 mLを皿2に加えます(ステップ3.2.3.
    7. 培養物をインキュベーターに戻し、24時間インキュベートする。
  3. 細胞固定
    1. ピペット330 μL(27.5 μL/mL)のホルムアルデヒドを完全な培地に対し、プレートをそっと旋回して混合します。
      注意:ホルムアルデヒドは有毒です。適切な取り扱い手順については、安全データシートを参照してください。
    2. 室温で10分間インキュベートします。
    3. ピペット2mLの10xグリシンをプレートにし、旋回して混合する。
    4. 室温で5分間インキュベートします。
    5. インキュベーションの後、皿を氷の上に置き、プロテアーゼ阻害剤カクテルのアリコートを解凍します。
    6. ステップ3.1で用意したバッファを使用して、DMSOとA-485の両方のサンプルに対して、以下のソリューションを準備します。
      1. プロテアーゼ阻害剤カクテルの1:1,000希釈を用いたPBSの2 mL
      2. 1:1000希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテルを用いた核膨潤緩衝液1mL
      3. プロテアーゼ阻害剤カクテルの1:1,000希釈を有するSDS溶解バッファーの0.5 mL
    7. 培地を細胞培養皿から吸引し、15mLの冷たいPBSで細胞を2回洗浄する。
    8. ピペット2 mLのPBSをプロテアーゼ阻害剤カクテル(ステップ3.3.6.1)を用いて細胞培養皿にする。セルスクレーパーを使用してセルを溶液に持ち上げます。
    9. 細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移します。必要に応じて、追加の PBS で残りのセルを収集します。
    10. スピンチューブは、4°Cで800 x g で5分間細胞をペレット化する。
    11. 上清とピペット1mLの核膨潤緩衝液をプロテアーゼ阻害剤カクテル(ステップ3.3.6.2)でペレットに吸引する。ペレットを再び懸濁し、氷の上で10分間インキュベートします。
    12. 4 °Cで2,700 x g で、ペレット核に5分間遠心分離します。
    13. 上清とピペット0.5mLのプロテアーゼ阻害剤カクテル(ステップ3.3.6.3)をペレットに吸引する。ペレットを再び懸濁し、氷の上で10分間インキュベートします。
    14. クロマチンサンプルを-80 °Cで保管し、ステップ3.4.1まで、またはステップ3.4に直ちに進みます。
  4. DNA超音波処理
    1. 130 μL のクロマチンを DMSO サンプル (ステップ 3.3.14) からピペット (130 μL) を使用して 2 つの DNA 超音波処理チューブに移します。
    2. 130 μL のクロマチンを A-485 サンプル (ステップ 3.3.14) からピペット (130 μL) を使用して 2 つの DNA 超音波処理チューブに移します。
    3. 次のソシレーター設定を使用して約150-200塩基ペア断片にDNAを超音波処理:175のピークインシデントパワー(W)、デューティファクター10%、バーストあたり200サイクル、430秒の処理時間。
      注: 超音波処理の設定はモデルによって異なる場合があり、設定は、異なるセルラインに適切なフラグメントサイズを達成するために調整する必要があります。
    4. 超音波処理後に氷の上にサンプルを保管してください。
    5. 超音波クロマチンをピペットと遠心分離機を4°Cで10,000 x g で1.5 mLチューブに移し、ペレットデブリに10分間移動します。
    6. 上清(超音波クロマチンを含む)を新しいチューブにピペットし、破片を捨てます。超音波クロマチンは-80°Cで保存することができます。
  5. クロマチン免疫沈降(ChIP)
    注: ステップ 3.5 の IP グループの概略については、 補足プロトコル (Schematic 3) を参照してください。
    1. DMSOおよびステップ3.4.6のA-485サンプルの超音波クロマチンのタンパク質含有量を測定します。タンパク質含有量は、確立されたプロトコル34を用いて測定することができる。
      注:このプロトコルは、分かりやすくするために、タンパク質の含有量が等しく、100 μLの超音波クロマチンが使用されると仮定します。それ以外の場合、タンパク質の含有量は、等しい体積内のすべてのサンプル間で平衡化する必要があります。
    2. DMSO超音波クロマチンのピペット100 μLを2つの1.5 mLチューブ(それぞれ100 μL)にします。各チューブにChIP希釈バッファーのピペット400 μL(プロテアーゼ阻害剤カクテルの1:1,000希釈を含む)を各チューブに合計体積を500 μLまで取り出し、1本のチューブから5μLの溶液を取り出し、DMSO入力として-20°Cで保存します。
    3. ピペット100 μLのA-485超音波クロマチンを2つの1.5 mLチューブ(それぞれ100 μL)にします。各チューブにChIP希釈バッファーのピペット400 μL(プロテアーゼ阻害剤カクテルの1:1000希釈液を含む)を各チューブに合計体積を500 μLまで取り出し、1つのチューブから5μLの溶液を取り出し、-20°Cで-20°CでA-485入力として保存します。
    4. ピペットを使用して、DMSOおよびA-485サンプルの対応するチューブに免疫沈降(IP)抗体(例えば非特異的IgG対照またはH3K27ac特異的抗体)を加える:IGG抗体を有するIP#1 DMSOクロマチン(5-10μg)H3K27ac抗体(5-10 μg)を用いてDMSOクロマチンを#2 IP;IgG抗体を用いてA-485クロマチンを#3 IP(5-10 μg);H3K27ac抗体(5-10 μg)を用いたIP#4 A-485クロマチン。
    5. 各チューブに20μLのプロテインA磁気ビーズを加えます。ビーズがうまく再中断されていることを確認してください。
    6. サンプルを4°Cで一晩回転させます。
    7. タンパク質Aのペレットは、磁気セパレータを用いて磁気ビーズを使用し、上清を除去する。ビーズを邪魔しないでください。
    8. 低塩洗浄バッファーの500 μL~1 mLでビーズを洗浄し、4°Cで5分間回転させます。 素早くスピンダウンし、磁気セパレータを使用してビーズをペレットにし、上清を取り除きます。
    9. 高塩洗浄バッファーの500 μL~1 mLでビーズを洗浄し、4°Cで5分間回転させます。 素早くスピンダウンし、磁気セパレータを使用してビーズをペレットにし、上清を取り除きます。
    10. LiCl洗浄バッファーの500 μL~1 mLでビーズを洗浄し、4°Cで5分間回転させます。 素早くスピンダウンし、磁気セパレータを使用してビーズをペレットにし、上清を取り除きます。
    11. 500 μL ~1 mL の TE バッファーでビーズを洗浄し、4 °C で 5 分間回転させます。 クイックスピンダウンを実行します。ステップ 3.5.14 まで、このビードを TE バッファに保管します。
    12. 入力サンプル(ステップ 3.5.2 および 3.5.3 から)をフリーザーから取り除き、氷の上に保管します。
    13. プロテイナーゼKのアリコートを解凍する。
    14. 磁気セパレータを使用してビーズをペレットにし、ビーズからTEバッファを取り除きます(ステップ3.5.11から)。
    15. 入力サンプルを含むすべてのサンプルに100 μLのChIP溶出バッファー+ 1 μL のプロテインナーゼ K を加えます。サーモサイクラーを用いて、62°Cで2時間揺れるサンプルをインキュベートします。
    16. 2時間後、サーモサイクラーを用いてサンプルを95°Cに10分間加熱する。
    17. サンプルを室温まで冷却します。
    18. 磁気セパレータを使用してペレット磁気ビーズを使用し、新しい1.5 mLチューブに上清(対象のDNAを含む)を移動します。
    19. 標準 PCR クリーンアップ キットを使用して DNA を精製します。
    20. 精製されたDNAは-20°Cで貯えることができるし、標準的なqPCRの議定書のテンプレートとして使用することができる。qPCR を実行するための製造元のプロトコルに従ってください。
  6. ChIP-qPCR データ分析
    注:ChIP-qPCRの結果を分析する2つの一般的な方法は、IgG抗体と1%入力法に対するフォールド濃縮です。両方の分析方法のための優れたテンプレートは、商業的なソースによって提供され、関心の各IP抗体/ターゲットのフォールド濃縮を迅速に計算するために使用することができます37.
    1. フォールディングと% 入力を計算するには、各抗体(非特異的IgG、IP H3K27ac抗体、および1%入力)について取得したqPCRデータからΔCt値をコピーして、分析テンプレートの対応する領域に貼り付け、フォールディングと収率入力が自動的に入力されます。

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Representative Results

インビトロヒストンアセチルトランスファーゼ(HAT)アッセイは、ヒストン基質に対するp300 HAT活性を阻害する化合物をプローブするために使用することができる。図1Aは、HATアッセイの実験用回路図を提供する。アナカルディン酸は、公知のHATi33,3838であり、12.5〜100μMの濃度範囲でこのアッセイに利用された。100 μMでは、アナカルディン酸はヒストン3でp300を触媒し、リジン9および18は対照DMSO処理に対して(図1B、レーン5対レーン1)を触媒した。このアッセイでは、低用量の薬物投与量がp300 HAT活性を大きく阻害しない可能性があるため、濃度範囲が利用された(図1B、レーン2-4対レーン1)。レーン6では、アセチルCoAは反応に添加されず、p300触媒および組換えH3.1上のヒストンアセチル化の基底レベルに対する陰性制御として機能しない(図1B)。p300およびH3.1タンパク質レベルは、負荷制御として利用された(図1B)。これらのイムノブロット結果は、ImageJ39を用いて定量した(図1C)。折り畳み変化は、各サンプルのバンド強度を、各アセチル化プローブのDMSO制御のバンド強度と比較することによって算出した。100μMでのアナカルド酸の定量化は、DmSO制御に対するH3K18acおよびH3K9acの強力な減少を示し、図1Bにおける視覚結果を確認する。

クロマチンハイパーアセチル化阻害(ChHAI)アッセイでは、HDACiは、HATi24と共培養する前にクロマチン中のヒストンを高アセチル化するツールとして使用され、例えばp300阻害剤A-4852、4。2,4このアッセイの目的は、HDACiによって誘導されたヒストン過アセチル化を減衰させるHATiの有効性を決定することにある。図2Aは、ChHAIアッセイの実験用回路図を提供する。このアッセイでは、ヒストン3上で強くアップレギュレートされたアセチル化を有するMCF-7細胞の治療は、いくつかのリシン残基(図2B、レーン4対レーン1)に対する。H3K18acおよびH3K27acの基底レベルは低く、ChHAIアッセイにHDACiを添加することの利点を示した(図2B、レーン1-3)。A-485をMS-275に添加するとH3K18およびH3K27でヒストンアセチル化が増加したが、H3K9では増加しない(図2B、レーン4-6)。重要なことに、H3K9acは、細胞培養2においてp300によって調節されず、この実験においてA−485の特異性を示す。これらのイムノブロット結果を図2Cで定量した。折り畳み変化は、各サンプルのバンド強度を、各アセチル化プローブのMS−275単独のバンド強度(Lane4)と比較して算出した。H3K18acおよびH3K27ac基底レベルが検出されなかったため、レーン1-3は定量化されなかった。

クロマチン免疫沈降定量ポリメラーゼ連鎖反応(ChIP-qPCR)は、ゲノムの特定の領域におけるDNAタンパク質相互作用を調べる細胞培養実験です。オンコジーン発現25を制御する遺伝子調節要素におけるHATiの効果を調べるのに用いることができる。図3Aは、ChIP-qPCRプロトコルの実験用概略図を示しています。3 μM A-485で24時間処理したMCF-7細胞は、H3K27acで富化ヒストンDNA複合体の免疫沈降を介してChIP-qPCRを行った(図3)。精製したDNAをサイクリンD1プロモーター配列について分析した。ChIP-qPCRプライマーは、ゲノム内の特定のDNA配列に対して設計され、沈殿したDNAの相対的な量を検出するために使用されます。沈殿したDNAの量は、調査中のゲノム領域における対象タンパク質の豊富さを反映しています。実際、DMSOサンプルにおいて、IgG対照抗体によって沈殿したDNAは、サイクリンD1プロモーターに対するqPCR反応においてH3K27ac抗体よりも高いCt値を生成する(図3B)。これは、非特異的IgG制御が、Cyclin D1プロモーターでH3K27ac特異的抗体よりも少ないDNAタンパク質複合体を沈殿させたことを示している。これは、非特異的IgG制御に対するH3K27acの632.73倍の濃縮に変換されます(図3B)。

このフォールド濃縮は、H3K27ac特異的抗体が正常に免疫沈降アセチル化ヒストンを免疫化し、H3K27acがCyclin D1プロモーターで濃縮されたことを示す証拠を提供する。H3K27ac抗体の品質を検証した後、DMSOとA-485処理された基との比較を行うことができます。図3Cに示すように、A-485は%Input法(n=2の代表的な結果)を用いたDMSO制御に対して、Cyclin D1プロモーターでのH3K27ac濃縮を減少させます。重要なことに、A-485は、細胞培養22,44においてH3K27acを有意に減少することが知られている。

ChIP-qPCR の生の %Input 値は、実験的な傾向が再現可能であるにもかかわらず、独立した生物学的複製の間で非常に可変的である可能性があります。従って、DMSO制御の正規化されたパーセントとしてデータを提示して、コントロールと薬物治療10との再現性比を示すのに有用であり得る。例えば、 図3Dでは、A-485がサイクリンD1プロモーター(n=2)でH3K27ac占有率を著しくダウンレジションします。統計分析は、学生のt検定(*P<0.05)に基づいて行われました。

Figure 1
図1:アナカルド酸は、HATアッセイでp300酵素活性を阻害する。(A) HATアッセイの模式図で、酵素反応を描写した。(B) アナカルディン酸は、100 μM(レーン5)でH3K18およびH3K9でp300酵素活性を強力に阻害し、ヒストンアセチル化を100μM(レーン5)対DMSO制御処理(レーン1)でダウンレギュレーションした。レーン6は、反応にアセチルCoAを欠き、ヒストンアセチル化の陰性対照として役立った。(C)(B)で生じる免疫ブロットを定量化した。C折り畳み変化は、各サンプルのバンド強度を、各アセチル化プローブのDMSO制御のバンド強度と比較することによって算出した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:p300阻害剤A-485は、ChHAIアッセイにおいてヒストン過アセチル化を強力に減衰させる。(A) ChHAIアッセイの概略図。(B)MCF-7細胞において、HDAC阻害剤MS-275は、H3K18、K27およびK9(レーン4)とDMSO制御(レーン1)でヒストンアセチル化を強力にアップレレートした。既知のp300 HAT阻害剤であるA-485をMS-275に添加すると、H3K18およびK27におけるヒストンアセチル化の増加は減少したが、H3K9(レーン5-6対レーン4)は減少しなかった。(C)(B)で生じる免疫ブロットを定量化した。C折り畳み変化は、各サンプルのバンド強度を、各アセチル化プローブのMS−275単独のバンド強度(Lane4)と比較して算出した。H3K18acおよびH3K27ac基底レベルが検出されなかったため、レーン1-3は定量化されなかった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:p300阻害剤A-485は、ChIP-qPCRで測定したサイクリンD1プロモーターでH3K27acレベルを低下させる。(A) ChIP-qPCR プロトコルの概略図。(B) IgGおよびH3K27ac免疫沈降に対するサイクリンD1プロモーターのqPCR Ct値の代表値。IgG対照は、より高いCt値を有し、H3K27ac抗体が非特異的IgG抗体に対してH3K27acに対して正常に濃縮されたことを示す。(C) A-485 (3 μM) 24 h のダウンレギュレーション H3K27ac の処置は、MCF-7 細胞における DMSO 制御処理と比較して (n=2 の代表的な結果)(D) 2つの独立したChIP実験からの%入力をDMSO制御の割合としてDMSO制御に正規化した。MCF-7細胞におけるA-485による治療は、サイクリンD1プロモーターにおけるH3K27ac占有率を有意にダウンレジデンシーにする。統計分析は、学生のt検定(*P<0.05)に基づいて行われました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

バッファー レシピ
10Xグリシンバッファー 18.74 g のグリシンを PBS と共に溶解するまで 200 ml に加え、PBS を加える。
10X 実行バッファ 250 mM トリス、1.9 Mグリシン、1% SDS
H2Oの1000 mlにトリスベースの30.0 g、グリシンの144.0 g、および10.0 gのSDSを溶解する。バッファのpHは8.3で、pH調整は必要ありません。稼働中のバッファーを室温で保管し、使用前に 1X に希釈します。
10X TBST トリスベースの2.42グラム、NaClの8g、50%Tween 20の2ml、1リットルにddH2Oを加える
1X TBST 5%ミルク 1X TBSTのおよそ100mlあたり5gの粉ミルク
5Xアッセイバッファー: 500 mM HEPES, pH 7.5, 0.4 % トリトン X-100
5X受動ライシスバッファー 125 mMトリス、pH 7.8、10 mM 1,2-CDTA、10 mM DTT、5 mg/ml BSA、5%(vol/vol)トリトンX-100および50%(vol/vol)グリセロールを含む水性在庫をddH2Oで作ります。
6Xナトリウムドデシル硫酸塩(SDS) 0.375 MトリスpH 6.8、6 mlグリセロール、1.2 g SDS、0.93 g 1,4-ジチオトレイトール(DTT)、6mgのブロモフェノールブルー、10 mlに水を加える。
ChIP希釈バッファー 0.01% SDS, 1.1% トリトン X-100, 1.2 mM EDTA, 167 mM トリス-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl
ChIP溶出バッファー オートクレーブ ddH2O で 1% SDS (w/v) および 0.1 M NaHCO3
MCF-7 セルの完全な DMEM: ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)は、10%ウシ子牛血清(BCS)、ペニシリン(10単位/ml)、ストレプトマイシン(10mg/ml)を添加
高塩洗浄バッファー 0.1% SDS, 1% トリトン X-100, 2 mM EDTA, 200 mM トリス-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl.
LiCl洗浄バッファー 0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% デオキシコール酸ナトリウム, 1 mM EDTA, 100 mM トリス-HCl pH 8.0.
低塩洗浄バッファー 0.1% SDS, 1% トリトン X-100, 2 mM EDTA, 200 mM トリス-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl.
核膨潤緩衝液 5 mM パイプ pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40
SDS ライシスバッファー 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM トリス-HCl pH 8.0
TE バッファ 10 mM トリス-HCl pH 8.0、1 mM EDTA。
転送バッファ 25 mMトリス、190 mMグリシン、20%メタノール、pHをチェックし、必要に応じてpH 8.3に調整します。

表1:使用するバッファとソリューションのレシピ。

補足ファイル: プロトコル 1-3 の補足実験回路図.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

リジンアセチルトランスビセラーゼ(KATs)は、ヒストンの尾部および転写因子上のリジン残基を数個アセチル化して、遺伝子転写22,33を調節する。過去20年間の作業は、CBP / p300、PCAFおよびGCN5のようなKATが発癌性転写因子と相互作用し、いくつかの固形腫瘍タイプ44、5、9、15、16、17、185,9,15,16,17,18で腫瘍の成長を促進することを明らかにした。腫瘍の成長を促進する上での彼らの新たな役割のために、KATsは癌治療の新しい標的として調査されている。新しいKAT阻害剤(KATi)は、診療所での使用に移行する前に、効力、選択性、安全性について慎重かつ厳格にテストする必要があります。最近の証拠は、以前に記述されたKATi化合物が標的効果を示し、化学プローブ21として科学文献で広く使用される前に十分に特徴付けられなかったことを示している。したがって、KATiの特性評価には厳密な方法が必要です。ここでは、KASのヒストンアセチルトランスファーゼ(HAT)機能を標的とする新規阻害剤を特徴付け、検証するために一緒に使用できる3つのプロトコルがあります:in vitro HATアッセイ、ChHAIアッセイ、およびChIP-qPCR。これらのプロトコルは、CBP/p300およびその阻害剤を例として使用しますが、これらの方法は他のKATを調査する上で将来の応用に容易に適応することができます。

HATアッセイは、試験管内のHAT機能を阻害する際の効力について化合物をスクリーニングするシンプルで費用対効果の高い方法です。精製されたHAT(組換え44、1010または免疫沈降40)は、このアッセイで試験することができるが、組換えCBP/p300はこのプロトコルの例として使用される。CBP/p300は、アセチル基を標的基板上のリジン残基にアセチルCoAから転移させる酵素的なHATドメインを有する3。最も特徴のあるCBP/p300ヒストンターゲットはヒストン3リジン18と27(H3K18とH3K27、それぞれ)2、3、10、113,10,11である。2HATアッセイでは、精製されたp300 HATドメインを基質としてアセチルCoAおよびヒストン3.1とインキュベートする。インキュベーション期間中、p300はH3K18およびH3K27を含むいくつかのH3.1残基に対するアセチル化を触媒する。これらの残基に対するアセチル化の相対的な存在量は、免疫ブロット法を介して測定することができる。この試験管反応は、p300に結合し、そのHAT活性(HATi)を阻害する新規化合物をスクリーニングするために使用することができる。例えば、アナカルド酸は、公知のHATi38であり、DMSO制御と比較してH3K18およびH3K9の両方でヒストンアセチル化を強力にダウンレジレクションする(図1B、レーン5対レーン1)。実験的反応(図1B、レーン1-5)またはp300のヒストンアセチル化の触媒反応が起こらないにはアセチルCoAを添加することが極めて重要である(図1B、レーン6)。アセチルCoAの不在はまた、組換えH3.1のp300触媒およびヒストンアセチル化の基底レベルの陰性対照として使用することができる。

HATアッセイを行う場合、各反応が同量のp300、H3.1およびアセチルCoAを確実に受け取ることが重要である。免疫ブロットのH3.1およびp300レベルはゲルの負荷制御として役立つ。このアッセイのために、部位特異的ヒストンアセチル抗体または汎アセチル抗体は、免疫ブロットに使用することができる。イムノブロットの品質を向上させるために最適化する場合、免疫ブロットに検証済みの抗体を使用し、最初に抗体希釈に関するメーカーの推奨に従うことは重要です。プロトコルセクションで使用される抗体希釈は参照用であり、希釈は初期実験の結果に基づいて変更することができます(例えば、シグナルが強すぎる場合、抗体をさらに希釈することができます)。そのシンプルさのために、HATアッセイは新しい阻害剤をスクリーニングするための優れた開始実験です。しかし、HATアッセイには欠点があります。HATアッセイの主な懸念は、試験管で有効な化合物が生きているシステムでは効果がないことが証明されることである。これは、細胞培養における化合物の有効性が細胞透過性の問題、細胞代謝、および化合物安定性によって変化する可能性があるため、問題である。さらに、KATs、具体的にはCBP/p300は,、細胞培養3、41、4241におけるそれらのKAT活性を3調節する多くのタンパク質とタンパク質相互作用を有する。42したがって、細胞培養実験20,23,23においてHATアッセイで同定された阻害剤をさらに特徴付ける必要がある。

クロマチンハイパーアセチル化阻害(ChHAI)アッセイは、パイプラインの第2のプロトコルであり、細胞培養における新規阻害剤の効果を検証するのに有用である。このアッセイは、基底アセチル化が低すぎて24免疫ブロットで検出できないため、HDAC阻害剤(HDACi)24を利用して細胞内でヒストン過アセチル化を誘導する。選択した細胞株は、HATiを添加する前にアセチル化クロマチンの蓄積を可能にするためにHDACiで事前インキュベートされる。HDACiとHATiを共培養した後、細胞は、特定のヒストンアセチル化部位に対する標準的な免疫ブロット法を行い、その後に行われます。このアッセイの目的は、HDACiによって誘導されたヒストン過アセチル化を減衰させる新規HATiの有効性を決定することにある。HDACiに曝露された細胞は、DMSO溶媒に曝露された細胞よりも有意に高いヒストンアセチル化レベルを有する必要がある(図2B、レーン4対レーン1)。HDACiと一緒にHATiを添加すると、HDACi治療単独と比較してイムノブロット信号が減少することが期待される(図2B、レーン5-6対レーン4)。ヒストンアセチル化の基底レベル(図2B、レーン1-3)は検出が困難であり、このプロトコルにHDACiを追加することの重要性を強調しています。MS-275 (エンチノスタット) は例として使用されますが、他の HDACi は24,,43を使用することができます。MS-275は、クラスI HDACに対する可変的に報告された阻害濃度を有し、一般的に、ナノモルを用いてHDAC1およびHDAC3を低微小モル濃度に阻害し、それぞれ43、44である。43,MS-275濃度の広い範囲は、文献45、46、4746,47で使用されていますが、3μMの治療はMCF-7細胞のヒストンアセチル化の堅牢で再現性の高い増加を提供します。45したがって、HDACiおよびHATi濃度の広い範囲で初期画面を実行し、異なる細胞株を使用する場合にChHAIアッセイの最適濃度を決定することが有益である可能性があります。

HATアッセイと同様に、適切な抗体、最適な抗体希釈、および慎重に制御されたサンプルローディングを使用して、品質結果を得るためにイムノブロットプロトコルを最適化する必要があります。慎重に制御されたサンプルローディングは、このプロトコルの成功に不可欠であり、すべてのサンプルのタンパク質含有量を平衡化し、同量のサンプルをイムノブロットゲルのウェルにピペット処理することによって達成することができます。パンアセチル抗体は、このプロトコルでのプローブに使用できます。,しかし、KATは特定のヒストンリジン残基に対して特異性を有し、HATiは細胞培養1、2、4、5、10、112,において全てのヒストンアセチル化1部位に影響を及ぼさないので10、11部位特異的アセチル抗体を補うべきである。5,4HATおよびChHAIアッセイの両方でヒストンアセチル化を低減する上で強力である阻害剤は、さらなる評価のための有力な候補である。重要なことに、HATおよびChHAIアッセイにはヒストンアセチル化のグローバルな変化に関するデータのみを提供するという制限があります。この制限により、ゲノムの特定の領域における新規HATiの効果を特徴付ける必要性が生じます。

クロマチン免疫沈降定量ポリメラーゼ連鎖反応(ChIP-qPCR)は、パイプラインの最終プロトコルであり、ゲノムの特定の領域におけるDNAタンパク質相互作用を評価します。本アッセイでは、H3K27acに富んだゲノム領域を免疫沈降(IP)を介して精製し、qPCRでDNAプライマーを用いて分析します。この技術は、HATiが遺伝子プロモーターおよびエンハンサーにおけるヒストン修飾にどのように影響するかについての機械的な洞察を提供する。ChIP-qPCR は堅牢な技術であり、全ゲノムシーケンシング (例: ChIP-seq) よりもコストが低いが、結果に影響を与える多くのステップのために最適化することは困難な場合があります。正しく最適化する最も困難なステップは、ステップ3.5、免疫沈降です。このステップは、工程3.5.20で精製されたDNAが高希釈されている場合、qPCR反応で悪い結果を引き起こす可能性があるため、最適化が困難である(例えば、標的遺伝子配列の増幅がなく、ΔCt値が非常に高い)。IPステップの成功は、目的のタンパク質標的の存在量やIP抗体の品質など、いくつかの要因に依存します。IPステップの成功を検証するためには、IGG制御に対してIP H3K27ac抗体の品質を検証することが重要です。例えば、 図3Bでは、H3K27ac特異的抗体は、非特異的IgG制御に対して632.73倍の濃縮を示す。これは、H3K27ac抗体が高品質であり、H3K27acがサイクリンD1プロモーターで濃縮されていることを示しています。IP抗体の検証後、DMSOとA-485処理されたグループとの比較が可能です。 図3Cに示すように、A-485は%Input法(n=2の代表的な結果)を用いたDMSO制御に対して、Cyclin D1プロモーターでのH3K27ac濃縮を減少させます。IP抗体が低品質であることが判明し、最初の実験でフォールディング濃縮を示さない場合は、ステップ3.2.1で細胞数を増やしてみてください。細胞数が高いほど、ライセートの総タンパク質含有量を増加させることで、抗体の質が悪いことを補い、IP反応に多くのタンパク質を添加することができます。

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Disclosures

著者は、利益相反や開示を行う必要はありません。

Acknowledgments

この研究は、ジェームズとエステルキング生物医学研究プログラム(6JK03と20K07)、バンクヘッドコーリーがん研究プログラム(4BF02と6BC03)、フロリダ州保健省、フロリダ乳がん財団、UF健康がんセンターからの助成金によって支えられました。また、公開プロセス中のザカリー・オスキング博士とアンドレア・リン博士のサポートに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

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References

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癌研究、問題162、リジンアセチルトランスファー酵素、KATs、CBP/p300、ヒストンアセチルトランスビシラーゼ阻害剤、スクリーニング方法、ヒストンアセチル化、エピジェネティクス、癌、遺伝子調節
ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ
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Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

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