Summary
CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.
Abstract
리신 아세틸 트랜스퍼라제 (KATs)는 크로마티닌 역학 및 유전자 발현을 조절하기 위해 히스톤 및 기타 단백질에 대한 리신 잔류물의 촉매 아세틸화. CBP/p300과 같은 KAT는 다양한 암의 종양 발생에 중요한 역할때문에 치료 대상으로 강도 높은 조사를 받고 있습니다. KATs의 히스톤 아세틸 트랜스퍼라아제(HAT) 기능을 대상으로 하는 새로운 소분자 억제제의 개발은 도전적이며 잠재적 억제제의 특이성과 효능을 검증할 수 있는 강력한 작용이 필요합니다.
이 문서에서는 새로운 HAT 억제제(HATi)에 대한 엄격한 체외 검증을 제공하는 세 가지 방법의 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법에는 시험관 HAT 분석, 크로마티닌 고과실화 억제(ChHAI) 분석, 크로마티닌 면역 침전-정량성 PCR(ChIP-qPCR)이 포함된다. HAT 분석에서 재조합 HAT는 시험관 반응에서 히스톤으로 배양되어 히스톤 꼬리에 특정 리신 잔류물을 아세틸화할 수 있습니다. 이러한 반응은 HATi에 의해 차단될 수 있으며, 현장별 히스톤 아세틸화의 상대적 수준은 면역블로팅을 통해 측정될 수 있다. HAT 분석에서 확인된 억제제는 세포 환경에서 확인되어야 합니다.
ChHAI 분석체는 히스톤 디스틸라제 억제제(HDACi)에 의해 유도된 히스톤의 견고한 hyperacetylation을 감쇠하는 새로운 HATi를 위해 면역 블로팅을 사용합니다. HDACi의 추가는 히스톤 아세틸화의 기저 수준이 면역 블로팅을 통해 검출하기 어려울 수 있기 때문에 도움이 됩니다.
HAT 및 ChHAI 아세서는 히스톤 아세틸화의 글로벌 변화를 측정하지만 특정 게놈 지역에서 아세틸화에 관한 정보를 제공하지는 않습니다. 따라서 ChIP-qPCR은 유전자 조절 원소에서 히스톤 아세틸화 수준에 대한 HATi의 효과를 조사하는 데 사용됩니다. 이는 그의 톤-DNA 복합체의 선택적 면역 침전및 qPCR을 통해 정제된 DNA의 분석을 통해 달성된다. 이 세 가지 에세이는 함께 새로운 HATi의 특이성, 효능 및 작용 메커니즘에 대한 신중한 검증을 가능하게 합니다.
Introduction
리신 아세틸트랜스퍼라제(KATs)는 히스톤과 비히스톤 단백질11,2,,3,,4모두에서 리신 잔류물의 아세틸화를 촉매한다. 최근 연구에 따르면 KAT와 그들의 아세틸트랜스퍼라아제 기능은 고형 종양성장을촉진할 수 있음을4,5,,6,,7,,8,,9. 예를 들어, CREB 결합 단백질(CBP)/p300은 암2,,3에서수많은 신호 경로를 조절하는 두 개의 파라로고우스 KAT이다. CBP/p300은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 기능을 잘 특성화하고 히스톤 3 리신 27아세틸레이션(H3K27ac)22,4,,5,,10,,11,활성 강화, 프로모터 영역 및 활성 유전자전사12,13, 14을위한 중요한마커를14갖는다., CBP/p300은 히스톤 및 기타 전사인자의아세틸화를 통해 종양유전자의 전사를 활성화하여 고형 종양에서 의 프로 성장 신호 전달 경로를 위한 중요한 공동 활성화제로서4,9,15,,16,,,17,,18. 종양 진행에 그들의 역할 때문에, CBP/p300 및 그밖 KATs는 그들의 종양원성기능을막는 새로운 억제제의 발달을 위해 조사되고4,5,,6,7,77,8,,9,,18,,19,,20. A-485 및 GNE-049는 CBP/p3004,,9에대한 강력하고 특정 억제제개발을 성공적으로 시도한 두 가지 성공적인 시도를 나타낸다. 추가 억제제는 CBP/p300 및 그밖 KATs에 대한 현재 조사되고 있습니다.
이전에 설명된 KAT 억제제(KATi)의 품질은 많은 억제제가 표적 효과와 불량한특성화를과시하는 것으로, 의문을 제기하고 있다. 따라서, 새로운 약물 후보의 엄격한 특성화 및 검증은 고품질화학 프로브의 개발에 필수적이다. 여기에 설명된 세 가지 프로토콜은 KAT의 HAT 기능(HATi)을 억제하는 데 중점을 두고 새로운 KATi의 효능과 특이성을 선별하고 엄격하게 검증하기 위한 파이프라인을 형성하는 세 가지 프로토콜입니다. CBP/p300 및 그 억제제는 예로 사용되지만, 이러한 프로토콜은 HAT 함수7을갖는 다른 KAT에 맞게 조정할 수 있다.
첫 번째 프로토콜은 제어 된 시험관 반응에서 정제 된 재조합 p300 및 히스톤을 사용하는 시험관 히트톤 아세틸 트랜스퍼라제 (HAT) 분석입니다. 이 분석법은 수행하기 가 간단하고, 비용 효율적이며, 낮은 처리량 설정에서 화합물을 선별하는 데 사용할 수 있으며 방사성 물질을 필요로하지 않습니다. 이 프로토콜에서, 재조합 p300 촉매는 짧은 잠복기 동안 히스톤 꼬리에 리세틸리제이션과 히스톤 아세틸화의 수준은 표준 면역 blotting 절차를 사용하여 측정된다. 효소 반응은 CBP/p300 억제제의 존재 또는 부재에서 수행될 수 있다. 또한, HAT 분석체는 PCAF와 같은 다른 정제 된 KAT에 대한 활동을 평가하여 새로운 화합물이 CBP / p300에 대한 선택적지 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. HAT 분석은 단순성, 저렴한 비용 및 억제제의 효능/선택성을 결정하는 능력으로 인해 새로운 억제제를 조사하기위한 훌륭한 출발점입니다. 실제로,이 프로토콜은 종종 시험관 내 화면5,,10으로문학에 사용된다 . 그러나, HAT 분석에서 확인된 억제제는 시험관 반응이 살아있는 세포 시스템보다는 훨씬 간단하기 때문에 세포 배양에서 항상 효과적이지는 않다. 따라서, 세포 배양실험(22,,23)에서억제제의 특징을 더 특성화하는 것이 필수적이다.
파이프라인의 두 번째 프로토콜은 크로마틴 고과성 억제(ChHAI) 분석이다. 이 세포 기반 분석은 히스톤 deacetylase 억제제 (HDACi)를 HATi24와공동 인큐베이션하기 전에 크로마틴에서 히스톤을 과대 광고하는 도구로 활용합니다. 기저 히스톤 아세틸화는 세포 배양에서 낮을 수 있으므로, 탈염을 증가시키기 위해 HDACi를 첨가하지 않고 면역 블로팅을 통해 프로브하기가 어렵다. ChHAI 분석의 목적은 HDAC 억제에 의한 히스톤 아세틸화의 증가를 감쇠시킬 수 있는 새로운 HATi를 식별하는 것입니다. 이 분석법의 장점은 낮은 비용, 수행 할 상대적 용이성 및 배양세포의 사용을 포함하며, 이는 시험관 HAT 분석보다 더 많은 생리적 관련성을 제공합니다. HAT 분석과 마찬가지로 이 프로토콜은 데이터 수집에 표준 면역 블로팅을 사용합니다.
HAT 및 ChHAI 분석서는 글로벌 히스톤 아세틸화를 억제하기 위한 새로운 화합물의 효능에 대한 데이터를 제공하지만, 이러한 화합물이 특정 게놈 영역의 수정에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공하지 는 않습니다. 따라서, 최종 프로토콜, 크로마틴 면역 침전-정량적 폴리머라제 연쇄 반응(ChIP-qPCR)은 게놈의 특정 영역에서 DNA 단백질 상호작용을 조사하는 세포 배양 실험이다. ChIP 프로토콜에서, 크로마틴은 DNA 단백질 상호 작용을 보존하기 위하여 교차 연결됩니다. 크로마틴은 세포로부터 추출된 다음 DNA 단백질 복합체가 관심 있는 단백질에 대한 선택적 면역 침전을 겪는다(예를 들어, H3K27ac에 특이적인 항체를 사용하여). DNA는 qPCR을 사용하여 정제되고 분석됩니다. 예를 들어, ChIP-qPCR은 새로운 HATi가 Cyclin D125와같은 개별 종양 유전자에서 히스톤 아세틸레이션을 저하시키는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있다. ChIP-qPCR은 현장에서 사용되는 일반적인 기술이지만4,,10,,26을최적화하기 어려울 수 있다. 이 프로토콜은 ChIP-qPCR 절차를 수행하는 동안 발생할 수 있는 잠재적인 함정을 방지하는 팁을 제공하며 데이터에서 수행해야 하는 품질 관리 검사를 포함합니다.
이 세 가지 프로토콜을 함께 사용하면 새로운 HATi의 엄격한 특성과 검증이 가능합니다. 또한 이러한 방법은 수행하기 쉽고 상대적으로 저렴하며 지역 히스톤 아세틸레이션뿐만 아니라 글로벌에 대한 데이터를 제공하기 때문에 많은 이점을 제공합니다.
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Protocol
1. 체외 HAT 분석
- 버퍼 준비
참고: 버퍼 레시피의 표 1을 참조하십시오.- 5배 분석 버퍼와 6배 의 도데킬 설페이트 나트륨(SDS)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오. 알리쿼트 SDS 에서 1 mL 알리쿼트.
- 10x SDS 젤 러닝 버퍼와 10배 TBST를 준비하고 실온에서 보관하십시오.
- 1x 이송 버퍼를 준비하고 4°C에 보관하십시오.
주의: 이 프로토콜에 사용되는 모든 화학 물질에 대한 안전 데이터 시트를 확인합니다. SDS, DTT 및 브로모페놀 블루는 독성이 있으며 피부 나 눈에 섭취, 흡입 또는 노출되어서는 안됩니다. 적절한 취급 절차를 위해 안전 데이터 시트를 참조하십시오. 위험한 화학 물질을 취급하기 위해 화학 연기 후드를 사용하십시오.
- HAT 반응
참고: 아나카르산은 알려진 p300 억제제3이며 HAT 분석이 새로운 p300 억제제를 식별하는 방법을 보여주는 예로 사용됩니다. 단계 1.2.1의 회로도에 대한 보충 프로토콜 (회로도 1)을참조하십시오.- 0.2 mL PCR 튜브에서 다음과 같은 효소 반응을 준비: 5x 분석 버퍼의 2 μL, 정제 된 p300의 1 μL (0.19 μg/μL), 아나카르산 (HATi) 또는 DMSO 제어는 1x 분석 버퍼및 2 μL의 1x 분석 버퍼및 2 μL의 오토클라브dH2 O-1 의 이 그런 다음 반응에 100 μM 아세틸-CoA의 3 μL과 정제 된 H3.1 (0.2 μg /μL)의 1 μL을 추가합니다.
- PCR 열 사이클러에서 1h에 대해 30°C에서 전체 반응 혼합물을 배양합니다.
- 6x SDS 샘플 버퍼에 1:10 비율로 2-mercaptoethanol을 추가합니다.
- PCR 열 사이클러에서 샘플을 제거하고 반응 혼합물에 6x SDS의 2 μL(2-mercaptoethanol 첨가)을 추가합니다.
주의: 2-mercaptoethanol독성 이며 화학 연기 후드 안에 사용 해야 합니다. 적절한 취급을 위해 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 열 블록에 5 분 동안 95 °C에서 샘플을 가열하고 얼음에 냉각. 샘플을 -20 또는 -80°C에 저장하거나 아래에 자세히 설명된 대로 젤 전기전광 및 면역 블로팅을 수행합니다.
- 겔 전기 전광 및 면역 blotting
참고: 젤 전기 전광 및 면역 blotting에 익숙하지 않은 경우 이 표준절차(27)를 참조하여 1.3.1-1.3.17 단계를 수행하는 방법에 대한 자세한 내용을 확인하십시오. 추가 정보는 여기에서 찾을 수 있습니다28,,29,,30, 31,,,32,,33.31- 피펫 10 μL 의 샘플 (단계 1.2.5.에서) 4-20 % 그라데이션 폴리 아크릴 아미드 젤의 우물로. 파이펫 5 μL 단백질 사다리는 분자량 기준으로서 우물 중 하나에 넣습니다. 젤 탱크를 사용하여 90 분 동안 120 V에서 젤을 실행합니다.
- 이송 탱크를 사용하여 70분 동안 100V에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 젤을 전달한다.
- 전달 장치에서 멤브레인을 제거하고 플라스틱 용기에 놓습니다. 용기에 1x TBST(우유 5%를 함유)를 추가하여 멤브레인을 차단하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.
- 1.3.3 단계에서 1x TBST를 제거합니다. 4°C에서 4°C에서 선택된 부위별 아세틸 항체(예를 들어, H3K18ac 또는 H3K27ac 1차 항체)로 하룻밤 동안 멤브레인을 배양한다.
- 1 차적인 항체 용액을 제거합니다. 실온에서 1x TBST(우유 없음)로 멤브레인 2x를 세척하여 세척할 때마다 15분 동안 부드럽게 흔들어 주세요.
- 1x TBST에서 1:20,000에서 이차 항체를 희석시키고(우유 5%를 함유) 부드러운 흔들림으로 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다.
- 이차 항체 용액을 제거합니다. 실온에서 1x TBST(우유 없음)로 멤브레인 2x를 세척하여 세척할 때마다 15분 동안 부드럽게 흔들어 주세요.
- 멤브레인에서 1x TBST를 배출합니다. HRP 기판 과산화물 용액과 HRP 기판 루미놀 용액을 멤브레인 표면에 결합된 용액의 1:1 비율(각 1mL) 및 파이펫 2 mL로 혼합한다.
- 실온에서 5분 동안 멤브레인으로 용액을 배양합니다.
- 멤브레인에서 종이 타월에 과도한 화학 발광 기판을 빼내고 막을 X 선 카세트 홀더 내부에 플라스틱 랩에 넣습니다.
- 엑스레이 필름 처리 전용 어두운 방으로 이동합니다. 멤브레인 위에 필름을 배치하고 30 s의 카세트를 닫아 엑스레이 필름에 멤브레인을 노출합니다.
참고: 필름과 멤브레인 간의 접촉 시간은 실험적으로 결정되어야 합니다. 강력한 신호는 짧은 노출(초)이 필요하며 신호가 약하면 노출이 길어질 수 있습니다. - 카세트에서 엑스레이 필름을 제거하고 X-ray 필름 프로세서를 통해 필름을 실행하여 필름을 처리합니다. X선 필름을 처리하는 방법에 대한 구체적인 지침은 제조업체 설명서를 참조하십시오.
- 플라스틱 랩에서 멤브레인을 제거하고 부드러운 흔들림으로 실온에서 5 분 동안 ddH2O로 세척하십시오.
- 0.2 M NaOH로 멤브레인을 실내 온도에서 5 분 동안 부드럽게 흔들어 보배하십시오.
- 부드러운 흔들림으로 실온에서 5 분 동안 ddH2O로 멤브레인을 씻으하십시오.
- 용기에 1x TBST(우유 5%를 함유)를 추가하여 멤브레인을 차단하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.
- 다음 1차 항체 희석(예를 들어, 첫 번째 항체가 H3K18ac인 경우 H3K27ac에 대한 프로브)를 추가하고 4°C에서 하룻밤 동안 흔들어 줍니다. 모든 항체 프로브가 완료될 때까지 1.3.4-1.3.17단계를 반복한다.
2. ChHAI 분석
- 체외 약물 치료 및 아세틸화 히스톤 분석
참고 : A-485는 강력하고 잘 특징p300 HATi입니다2,4 . 이 억제제는 세포 배양에서의 효능 및 특이성 때문에 나머지 소약에서 활용될 것이다. MS-275 (엔티노스타트)24 HDACi는 히스톤 아세틸화 수준을 현저히 증가시키고 표준 면역 블로팅으로 아세틸화 프로브를 쉽게 검출하는 데 사용됩니다. 참조 보충 프로토콜 (회로도 2) 2.1 단계에서 사용되는 약물 희석제의 회로도에 대해.- 종자 100,000 MCF-7 세포12 웰 플레이트에 세포가 세포 배양 배지의 1 mL에서 80-90 %의 합류로 성장 할 수 있습니다. 다음 실험 설계에 대한 우물 표시: 음 1: DMSO 제어(기준점); 웰 2: A-485 (3 μM); 웰 3: A-485 (10 μM); 웰 4: MS-275 (3 μM); 웰 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); 웰 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
참고: MCF-7 세포를 배양하려면 완전한 DMEM 미디어를 사용하고 세포가 5% CO2로37°C에서 성장할 수 있도록 합니다. 전체 DMEM 레시피는 표 1을 참조하십시오. - 파종 후 24시간, 완전한 DMEM 매체의 파이펫 4 mL에서 멸균 15mL 원문 튜브. 3 μM MS-275의 최종 농도를 위해 4mL의 배지에 MS-275(DMSO내 6mM)의 피펫 2 μL.
- 별도의 멸균 15mL 원문 튜브에서 배지4mL에 DMSO의 파이펫 2 μL.
주의: 안전 데이터 시트를 확인하여 DMSO의 적절한 취급을 확인하십시오. 일부 장갑 유형은 DMSO 를 취급하기 위한 평가되지 않습니다. - 우물 4-6 및 파이펫 1 mL의 3 μM MS-275의 세포 배양 배지를 각각 양으로 배양한다. 사용하지 않은 희석 된 MS-275를 폐기하십시오.
- 세포 배양 배지를 우물 1-3 및 파이펫 1 mL의 희석DMSO(단계 2.1.3)에서 각각의 우물로 흡인시한다. 사용하지 않은 희석DMSO를 폐기하십시오.
- 세포를 인큐베이터로 반환하고 MS-275 (우물 4-6)에 노출 된 세포에서 아세틸화 된 히스톤의 축적을 허용하기 위해 4 h에 대한 인큐베이터로 보배식하십시오.
참고 : MS-275는 HDACi이며 히스톤 과아 세틸화(24)를일으킬 것입니다. 이 4 h 사전 배양은 MS-275가 A-485의 첨가 전에 hyperacetylation을 유도할 수 있도록 하는 데 필요하며, 이는 히스톤 아세틸화2,,4를감소시킨다. - MS-275를 가진 4 시간 의 배양 후, 파이펫팅하여 별도의 멸균 1.5 mL 튜브에서 다음과 같은 희석을 준비 : DMSO의 1.0 μL 에서 DMEM 매체의 1 mL; DMSO의 0.5 μL 및 0.5 μL A-485 (6mMM) ~ DMEM 매체의 1mL; DMSO의 0.5 μL 및 A-485(20mMM)의 0.5 μL ~ DMEM 매체의 1mL; DMSO의 0.5 μL 및 MS-275(6mM)의 0.5 μL 에서 DMEM 매체의 1mL; A-485(6mM)의 0.5 μL 및 MS-275(6mM)의 0.5 μL 에서 DMEM 매체의 1mL; A-485(20mMM)의 0.5 μL 과 MS-275(6mM)의 0.5 μL ~ DMEM 매체 1mL.
- 웰 1-6 및 파이펫 1 mL의 희석 1~ 1, 희석 2 대 2, 희석 3 대 3, 희석 4 ~ 잘 4, 희석 5 ~ 5, 희석 6~6을 흡인한다.
참고: 일반적인 규칙은 세포 독성 및 증식의 변화를 피하기 위해 세포 배양에서 0.1%의 DMSO 함량을 초과하지 않고 실험 군 간의 DMSO(용매) 함량의 균형을 맞추는 것입니다. - 세포를 인큐베이터및 배양에 20시간 동안 반납한다.
- 20 시간 후, 우물 1-6에서 세포 배양 배지를 흡인한다.
- PBS의 1mL를 1-6으로 배관하여 셀을 세척한다. PBS를 흡인합니다.
- 1x 수동 용해 버퍼의 100 μL을 우물 1-6에 추가합니다(표 1참조). 세포 배양 플레이트(수동 용해 완충제의 샘플 포함)를 하룻밤 -80°C에서 저장하여 세포의 동결 해동 및 용액을 위해 밤새 보관하십시오.
주의: 버퍼를 만들기 전에 모든 화학 물질에 대한 안전 데이터 시트를 확인하십시오. CDTA는 심각한 눈 손상과 자극을 일으킬 수 있습니다. - 실온에서 10분 동안 부드러운 흔들림으로 샘플을 해동합니다. 샘플을 1.5mL 튜브로 분리하고 즉시 얼음 위에 놓습니다.
- 각 샘플의 단백질 농도를 측정합니다. 단백질 농도는 몇 가지 잘 확립 된 프로토콜(34)을사용하여 결정 될 수있다.
- 필요에 따라 1x 수동 용해 버퍼를 사용하여 시료 1-6(동일한 부피)의 단백질 농도를 평형화합니다.
- 1:10 비율로 6x SDS 샘플 버퍼에 2-mercaptoethanol을 추가합니다.
- 6x SDS 샘플 버퍼를 2-mercaptoethanol로 추가하여 1-6을 1x SDS 샘플 버퍼의 최종 농도로 샘플링합니다.
- 열 블록에 5 분 동안 95 °C에서 샘플을 가열하고 얼음에 냉각. 샘플은 2.1.19 단계까지 -20 °C 또는 -80 °C에서 저장할 수 있습니다.
- 4-20% 그라데이션 폴리아크릴아미드 젤에서 우물에 1-6시료를 위한 단백질 30μg를 함유한 피펫. 프로토콜 1에 설명된 프로토콜에 따라 면역 블로팅 절차를 수행합니다.
- 종자 100,000 MCF-7 세포12 웰 플레이트에 세포가 세포 배양 배지의 1 mL에서 80-90 %의 합류로 성장 할 수 있습니다. 다음 실험 설계에 대한 우물 표시: 음 1: DMSO 제어(기준점); 웰 2: A-485 (3 μM); 웰 3: A-485 (10 μM); 웰 4: MS-275 (3 μM); 웰 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); 웰 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
3. ChIP-qPCR
참고: 아래 프로토콜은 p300억제제에 대해 예로 설명되어 있다.
- 버퍼 준비
참고: 버퍼 레시피의 표 1을 참조하십시오. ChIP 프로토콜의 일반적인 단계(예: 버퍼 레시피, 세척 시간 및 원심분리 시간)는 제조업체의 시판 가능한 키트(재료 표참조)와 문헌35,,36에서수정 및 조정된다.- ChIP 희석 완충제, 핵 부종 버퍼, 낮은 소금 세척 버퍼, 높은 소금 세척 버퍼, LiCl 세척 버퍼 및 TE 버퍼를 준비하십시오. 4 °C에 보관하십시오.
- SDS 용해 버퍼, 10배 글리신 버퍼 및 ChIP 용출 버퍼를 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
주의: 버퍼를 만들기 전에 모든 화학 물질에 대한 안전 데이터 시트를 확인하여 적절한 취급을 보장하십시오.
- 약물 치료
참고: 3.2 단계에서 사용되는 약물 희석제의 회로도에 대한 보충프로토콜(Schematic 3)을참조하십시오. Supplementary Protocol- 종자 MCF-7 세포는 2개의 15cm 배양 배기에서 세포를 전체 DMEM 배지의 12mL에서 90%로 성장시다. 다음 실험 디자인에 대한 요리 표시: 접시 1: DMSO 제어 (기준점); 접시 2 : A-485 (3 μM).
참고: MCF-7 셀을 배양하기 위해 완전한 DMEM 미디어를 사용하고 5% CO2로37°C에서 성장한다. 전체 DMEM 레시피는 표 1을 참조하십시오. - 멸균 15mL 원물 튜브에서, DMEM 매체의 파이펫 12 mL 및 파이펫 6 μL DMSO. 잘 섞으세요.
- 별도의 멸균 15mL 원문 튜브에서, 파이펫 12 mL의 DMEM 미디어및 파이펫 6 μL 의 A-485 (DMSO6 mM)의 최종 농도는 3 μM A-485의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. 잘 섞으세요.
- 접시 1과 2에서 미디어를 흡인.
- DMEM(3.2.2.2단계)에 희석DM의 12mL을 접시 1에 추가합니다.
- DMEM(3.2.3.3.)에 3 μM A-485의 12mL을 접시 2에 추가합니다.
- 세포 배양 접시를 인큐베이터에 반환하고 24 시간 동안 배양하십시오.
- 종자 MCF-7 세포는 2개의 15cm 배양 배기에서 세포를 전체 DMEM 배지의 12mL에서 90%로 성장시다. 다음 실험 디자인에 대한 요리 표시: 접시 1: DMSO 제어 (기준점); 접시 2 : A-485 (3 μM).
- 셀 고정
- 파이펫 330 μL (mL당 27.5 μL)의 37% 포름알데히드를 전체 미디어에 넣고 부드럽게 플레이트를 소용돌이쳐 혼합합니다.
주의: 포름알데히드는 독성이 있습니다. 적절한 취급 절차를 위해 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 실온에서 10분 동안 배양하십시오.
- 파이펫 2 mL 의 10 x 글리신 플레이트에 혼합 소용돌이.
- 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- 인큐베이션 후, 얼음에 요리를 놓고 프로테아제 억제제 칵테일의 알리쿼트해.
- 3.1 단계에서 준비된 버퍼를 사용하여 DMSO 및 A-485 샘플 모두에 대해 다음 솔루션을 준비합니다.
- 프로테아제 억제제 칵테일 1:1,000 희석을 가진 PBS 2mL
- 프로테아제 억제제 칵테일의 1:1,000 희석을 가진 핵 팽창 버퍼 1mL
- 프로테아제 억제제 칵테일의 1:1,000 희석과 SDS 용해 버퍼의 0.5 mL
- 세포 배양 접시에서 미디어를 흡인하고 차가운 PBS의 15 mL로 두 번 세포를 씻는다.
- 프로테아제 억제제 칵테일(3.3.6.1단계)을 가진 PBS의 파이펫 2 mL은 세포 배양 접시에 한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 용액으로 들어올립니다.
- 세포 현탁액을 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 필요한 경우 추가 PBS로 남은 셀을 수집합니다.
- 세포를 펠릿에 5 분 동안 4 °C에서 800 x g에서 튜브를 회전시.
- 프로테아제 억제제 칵테일(3.3.6.2단계)을 펠릿에 대고 핵 부종 버퍼의 초나탄 및 파이펫 1 mL을 흡인한다. 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 10 분 동안 배양하십시오.
- 4°C에서 2,700 x g의 튜브를 5분 동안 펠릿 핵에 원심분리합니다.
- 프로테아제 억제제 칵테일(3.3.6.3단계)을 펠릿에 흡기하여 SDS 용해 버퍼의 상피 및 파이펫 0.5mL을 흡인한다. 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 10 분 동안 배양하십시오.
- 크롬마틴 샘플을 -80°C에서 3.4.1단계까지 저장하거나 즉시 3.4단계로 진행한다.
- 파이펫 330 μL (mL당 27.5 μL)의 37% 포름알데히드를 전체 미디어에 넣고 부드럽게 플레이트를 소용돌이쳐 혼합합니다.
- DNA 초음파 처리
- 피펫(각각 130μL)을 사용하여 DMSO 샘플(3.3.14단계)에서 2개의 DNA 초음파 튜브로 크로마틴 130 μL을 전송한다.
- 파이펫(각각 130μL)을 사용하여 A-485 샘플(3.3.14단계)에서 2개의 DNA 초음파 튜브로 크로마틴 130 μL을 전송한다.
- 다음 초음파 처리기 설정을 사용하여 약 150-200 개의 기본 쌍 조각으로 DNA를 초음파 처리하십시오 : 175의 피크 인시던트 파워 (W), 10 %, 버스트 당 200 사이클 및 430의 치료 시간.
참고: 초음파 처리 설정은 모델과 설정 간에 다를 수 있으며 다른 세포주에 적합한 단편 크기를 달성하려면 조정해야 할 수 있습니다. - 초음파 처리 후 얼음에 샘플을 유지합니다.
- 초음파 염색체를 1.5 mL 튜브로 옮기고 파이펫과 원심분리기를 4°C에서 x g 10분 동안 10분 동안 피펫과 원심분리기를 사용하여 이물질을 펠릿으로 옮긴다.
- 새로운 튜브에 상체 (초음파 염색체 포함)를 피펫하고 파편을 폐기합니다. 초음파 염색체는 -80 °C에서 저장할 수 있습니다.
- 크로마틴 면역 침전 (ChIP)
참고: 3.5단계에서 IP 그룹의 회로도에 대한 보충프로토콜(회로도 3)을참조하십시오. Supplementary Protocol- 3.4.6단계에서 DMSO 및 A-485 샘플에 대한 초음파 염색체의 단백질 함량을 측정한다. 단백질 함량은 잘 확립된프로토콜(34)을사용하여 측정될 수 있다.
참고: 단순성으로 이 프로토콜은 단백질 함량이 동일하고 초음파 처리된 크로마틴의 100 μL이 사용될 것이라고 가정합니다. 그렇지 않으면 단백질 함량은 동일한 볼륨의 모든 샘플 간에 평형화되어야 합니다. - 피펫 100 μL 의 DMSO 초음파 염색체는 2개의 1.5mL 튜브 (각각 100 μL)에. 각 튜브에 ChIP 희석 버퍼(프로테아제 억제제 칵테일의 1:1,000 희석 포함)의 파이펫 400 μL은 각 튜브에 최대 500 μL의 용액을 제거하고 -20°C에서 DMSO 입력으로 저장한다.
- 파이펫 100 μL 의 A-485 초음파 염색질 은 2 개의 1.5 mL 튜브 (각각 100 μL). 각 튜브에 ChIP 희석 버퍼(프로테아제 억제제 칵테일의 1:1000 희석 포함)의 파이펫 400 μL은 각 튜브에 최대 500 μL의 용액을 제거하고 -20°C에서 A-485 입력으로 저장한다.
- 파이펫을 사용하여, DMSO 및 A-485 샘플에 대한 해당 튜브에 면역 침전(IP) 항체(예를 들어 비특이적 IgG 제어 또는 H3K27ac 특이항체)를 추가합니다: IGG 항체를 이용한 IP #1 DMSO 크로마틴(5-10 μg); H3K27ac 항체를 가진 IP #2 DMSO 크로마틴 (5-10 μg); IGG 항체를 가진 IP #3 A-485 크로마틴 (5-10 μg); H3K27ac 항체(5-10 μg)를 가진 IP #4 A-485 크로마틴.
- 단백질 20 μL을 각 튜브에 마그네틱 구슬을 넣습니다. 구슬이 잘 재주중단되었는지 확인합니다.
- 샘플을 4°C에서 하룻밤 사이에 회전시합니다.
- 단백질 자극체 마그네틱 분리기와 상복부 분리제 제거. 구슬을 방해하지 마십시오.
- 구슬을 500 μL에서 1mL로 씻어 낮은 소금 세척 버퍼를 세척하고 4 °C에서 5 분 동안 회전하십시오. 빠른 스핀 다운을 수행하고, 마그네틱 분리기로 구슬을 펠릿하고, 상체를 제거합니다.
- 구슬을 500 μL에서 1mL로 씻어 고염 세척 버퍼를 세척하고 4 °C에서 5 분 동안 회전하십시오. 빠른 스핀 다운을 수행하고, 마그네틱 분리기로 구슬을 펠릿하고, 상체를 제거합니다.
- LiCl 세척 버퍼의 500 μL내지 1mL로 구슬을 세척하고 4°C에서 5분 동안 회전합니다. 빠른 스핀 다운을 수행하고, 마그네틱 분리기로 구슬을 펠릿하고, 상체를 제거합니다.
- 구슬을 500 μL에서 1mL까지 TE 버퍼로 세척하고 4°C에서 5분 동안 회전합니다. 빠른 스핀 다운을 수행합니다. 3.5.14 단계까지 구슬을 TE 버퍼에 보관하십시오.
- 냉동고에서 입력 샘플(3.5.2 및 3.5.3 단계에서)을 제거하고 얼음을 유지합니다.
- 프로틴아제 K의 알리쿼트 해동.
- 자성 분리기를 사용하여 구슬을 펠렛하고 구슬에서 TE 버퍼를 제거합니다(3.5.11 단계부터).
- 입력 샘플을 포함한 모든 샘플에 100 μL ChIP 용출 버퍼 + 1 μL K의 1 μL을 추가합니다. 온도 사이클러를 사용하여 2 시간 동안 62 °C에서 흔들림시 샘플을 배양하십시오.
- 2 시간 후, 열 시료를 95°C로 열면 10분 동안 열이 사이클러를 사용한다.
- 샘플을 실온으로 식힙니다.
- 새로운 1.5mL 튜브에 자기 분리기 및 전사체(관심의 DNA 포함)를 사용하는 펠렛 자기 구슬.
- 표준 PCR 정리 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다.
- 정제 된 DNA는 -20 °C에 저장될 수 있으며 표준 qPCR 프로토콜의 템플릿으로 사용할 수 있습니다. qPCR을 실행하기 위한 제조업체 프로토콜을 따릅니다.
- 3.4.6단계에서 DMSO 및 A-485 샘플에 대한 초음파 염색체의 단백질 함량을 측정한다. 단백질 함량은 잘 확립된프로토콜(34)을사용하여 측정될 수 있다.
- ChIP-qPCR 데이터 분석
참고: ChIP-qPCR 결과를 분석하는 두 가지 일반적인 방법은 IgG 항체 및 1% 입력 방법에 비해 접힌 농축이다. 상용 소스에 의해 제공되는 두 분석 방법에 대한 우수한 템플릿은 관심있는 각 IP 항체 /목표(37)에대한 접이식 농축을 신속하게 계산하는 데 사용할 수 있습니다.- 접이식 농축 및 %입력을 계산하기 위해 각 항체(비특이적 IgG, IP H3K27ac 항체 및 1% 입력)에 대해 얻은 qPCR 데이터로부터 ΔCt 값을 분석 템플릿및 폴드 농축 및 수율%입력에서 해당 영역으로 복사하여 붙여넣습니다.
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Representative Results
시험관 내 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 분석은 히스톤 기판을 향해 p300 HAT 활성을 억제하는 화합물을 탐사하는 데 사용될 수 있다. 도 1A는 HAT 분석에 대한 실험 적인 회로도를 제공합니다. 알려진 HATi3,38인아나카르산은 12.5-100 μM의 농도 범위에서 이 분석에서 활용되었다.3 100 μM에서 아나카르산 다운조절은 히스톤 3, 리신 9, 18에서 p300의 촉매처리된 히스톤 아세틸화를 대조하는 DMSO처리(도 1B,레인 5 대 레인 1)이다. 낮은 약물 투여량이 p300 HAT 활성을 크게 억제하지 못할 수 있기 때문에 농도 범위가 이 분석에서 활용되었다(도1B,차선 2-4 대 레인 1). 레인 6에서는, 아니 아세틸-CoA는 반응에 첨가되지 않았고 p300 촉매및 재조합 H3.1(그림 1B)에히스톤 아세틸화의 기저 수준에 대한 부정적인 제어 역할을 한다. p300 및 H3.1 단백질 수준은 로딩제어(도 1B)로활용되었다. 이러한 면역블롯 결과는 ImageJ39(도 1C)를사용하여 정량화되었다. 접이식 변화는 각 샘플의 대역 강도를 각 아세틸화 프로브에 대한 DMSO 제어의 대역 강도와 비교하여 계산하였다. 100 μM에서 아나카르산에 대한 정량화는 DMSO 대조군에 비해 H3K18ac 및 H3K9ac의 강력한 감소를 나타내며, 도 1B의시각적 결과를 확인한다.
크로마틴 고과성 억제(ChHAI) 분석에서 HDACi는 p300 억제제 A-4852,4와같은 HATi24와공동 배양하기 전에 크로마틴에서 히스톤을 과대 광고하는 도구로사용된다. 이 분석의 목적은 HDACi에 의해 유도된 히스톤 과아세틸화를 감쇠시키기 위한 HATi의 효능을 결정하는 것이다. 도 2A는 ChHAI 분석에 대한 실험 회로도를 제공합니다. 이 분석에서, HDACi MS-275를 가진 MCF-7 세포의 치료는 히스톤 3에 강하게 조절된 아세틸화3, 여러 리신 잔류물(도2B,레인 4 대 레인 1)에 대해 강하게 강화하였다. H3K18ac 및 H3K27ac의 기저 수준은 낮았으며 ChHAI 분석서(그림2B,차선 1-3)에 HDACi를 추가하는 이점을 보여 주어 있습니다. MS-275를 가진 A-485의 첨가는 H3K18 및 H3K27에서 증가된 히스톤 아세틸화를 감쇠시키지만 H3K9(도2B,차선 4-6)는 아닙니다. 중요한 것은, H3K9ac는 세포 배양2에서p300에 의해 조절되지 않으며, 본 실험에서 A-485의 특이성을 보여준다. 이러한 면역블롯 결과는 도 2C에서정량화되었다. 접이식 변화는 각 샘플의 대역 강도를 각 아세틸화 프로브에 대해 MS-275 단독으로(Lane 4)의 대역 강도와 비교하여 계산하였다. H3K18ac 및 H3K27ac 기저 레벨이 검출되지 않았기 때문에 차선 1-3은 정량화되지 않았다.
크로마틴 면역 침전-정량적 폴리머라제 연쇄 반응(ChIP-qPCR)은 게놈의 특정 영역에서 DNA 단백질 상호 작용을 조사하는 세포 배양 실험이다. 종양 유전자발현(25)을제어하는 유전자 조절 원소에서 HATi의 효과를 조사하는 데 사용될 수 있다. 도 3A는 ChIP-qPCR 프로토콜에 대한 실험 회로도를 제공합니다. MCF-7 세포는 24시간 동안 3μM A-485로 처리된 H3K27ac(그림3)에서농축된 히스톤-DNA 복합체의 면역침전을 통해 ChIP-qPCR을 실시하였다. 정제된 DNA는 Cyclin D1 프로모터 서열을 위해 분석되었다. ChIP-qPCR 프라이머는 게놈의 특정 DNA 서열에 대해 설계되었으며 침전 된 DNA의 상대적 양을 검출하는 데 사용됩니다. 침전된 DNA의 양은 조사 중인 게놈 부위에 관심 있는 단백질의 풍부를 반영합니다. 실제로, DMSO 샘플에서, IgG 대조군 항체에 의해 침전된 DNA는 사이클린 D1 프로모터(도3B)에대한 qPCR 반응에서 H3K27ac 항체보다 더 높은 Ct 값을 생성한다. 이는 비특이적 IgG 대조군이 Cyclin D1 프로모터에서 H3K27ac 특이적 항체보다 DNA 단백질 복합체가 적다는 것을 나타낸다. 이는 비특이적 IgG제어(그림 3B)를통해 H3K27ac의 632.73배 농축을 의미합니다.
이러한 접이식 농축은 H3K27ac 특이적 항체가 성공적으로 면역절전된 아세틸화 히스톤과 Cyclin D1 프로모터에서 H3K27ac가 농축된다는 증거를 제공한다. H3K27ac 항체의 품질을 검증한 후, DMSO와 A-485 처리된 군 간의 비교가 이루어질 수 있다. 도 3C에도시된 바와 같이, A-485는 %입력 방법(n=2의 대표적인 결과)을 사용하여 Cyclin D1 프로모터 대 DMSO 제어에서 H3K27ac 농축을 감소시킨다. 중요한 것은, A-485는 세포 배양2,,4에서H3K27ac를 현저히 감소시키는 것으로 알려져 있다.
ChIP-qPCR 원시 %입력 값은 실험 적인 추세가 재현 가능에도 불구하고 독립적 인 생물학적 복제 사이에 매우 가변적 일 수 있습니다. 따라서, 대조군과 약물치료(10)간의 재현 가능한 비율을 나타내기 위해 DMSO 제어의 정규화된 백분율로 데이터를 제시하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 도 3D에서A-485는 Cyclin D1 프로모터(n=2)에서 H3K27ac 점유율을 크게 감소시합니다. 통계 분석은 학생의 t-테스트(*P< 0.05)를 기반으로 했습니다.
도 1: 아나카르산은 HAT 분석에서 p300 효소 활성을 억제합니다. (A)효소 반응을 묘사한 HAT 분석의 회로도. (B)아나카르산은 DMSO 대조군 처리(레인 1)에 비해 H3K18 및 H3K9에서 100 μM(차선 5)에서 p300 효소 활성을 강력하게 억제하고 히스톤 아세틸화를 저하시켰다. 레인 6 반응에 아 세 틸-CoA 부족 하 고 히스톤 아 세 틸 화에 대 한 부정적인 제어 역할을. (C)면역blot 결과 (B)는 정량화되었다. 접이식 변화는 각 샘플의 대역 강도를 각 아세틸화 프로브에 대한 DMSO 제어의 대역 강도와 비교하여 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: p300 억제제 A-485는 ChHAI 분석에서 히스톤 치아세틸화를 강력하게 감쇠시합니다. (A)ChHAI 분석기의 회로도. (B)MCF-7 세포에서 HDAC 억제제 MS-275는 DMSO 제어(레인 1)에 비해 H3K18, K27 및 K9(레인 4)에서 강력하게 강화된 히스톤 아세틸레이션을 강화하였다. MS-275를 가진 알려진 p300 HAT 억제제인 A-485의 첨가는 H3K18 및 K27에서 히스톤 아세틸화의 증가를 완화시켰지만 H3K9(차선 5-6 대 4)는 증가하였다. (C)면역blot 결과 (B)는 정량화되었다. 접이식 변화는 각 샘플의 대역 강도를 각 아세틸화 프로브에 대해 MS-275 단독으로(Lane 4)의 대역 강도와 비교하여 계산하였다. H3K18ac 및 H3K27ac 기저 레벨이 검출되지 않았기 때문에 차선 1-3은 정량화되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: p300 억제제 A-485는 ChIP-qPCR에 의해 측정된 사이클린 D1 프로모터에서 H3K27ac 수준을 감소시다. (A)ChIP-qPCR 프로토콜의 회로도. (B)IgG 및 H3K27ac 면역 침전을 위한 Cyclin D1 프로모터에 대한 대표적인 qPCR Ct 값. IgG 대조군은 더 높은 Ct 값을 보였으며, 이는 H3K27ac 항체가 비특이적 IgG 항체를 통해 H3K27ac에 성공적으로 농축되었음을 나타냅니다. (C)McF-7 세포에서 DMSO 대조군 치료에 비해 Cyclin D1 프로모터에서 24h 다운레귤러 H3K27ac에 대한 A-485 (3 μM) 처리(n=2의 대표적인 결과). (D)두 개의 독립적인 ChIP 실험으로부터의 %입력은 DMSO 제어의 백분율로 DMSO 제어로 정규화되었다. MCF-7 세포에서 A-485를 가진 처리는 Cyclin D1 프로모터에서 H3K27ac 점유율을 현저하게 다운조절합니다. 통계 분석은 학생의 t-테스트(*P< 0.05)를 기반으로 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 | 제조 법 | |
| 10X 글리신 버퍼 | 18.74 g의 글리신이 PBS를 사용하여 용해될 때까지 200ml에 PBS를 추가합니다. | |
| 10배 실행 버퍼 | 250 mM 트리스, 1.9 M 글리신, 1% SDS 30.0 g의 트리스 베이스, 글리신 144.0 g, SDS 10.0 g을 H2O 1000 ml에 녹입니다. 버퍼의 pH는 8.3이어야 하며 pH 조정이 필요하지 않습니다. 실행 중인 버퍼를 실온에 저장하고 사용하기 전에 1X로 희석합니다. |
|
| 10X TBST | 트리스 베이스 2.42 g, NaCl 8g, 50% 트웬 20 2ml 2ml, ddH2O를 1리터에 추가 | |
| 우유 5%를 곁들인 1X TBST | 약 100ml 당 5g 의 분말 우유 1X TBST | |
| 5X 분석 버퍼: | 500 mM HEPES, pH 7.5, 0.4 % 트리톤 X-100 | |
| 5X 패시브 리시스 버퍼 | ddH2O에서 125mM Tris, pH 7.8, 10mM 1,2-CDTA, 10mM DTT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) 트리톤 X-100 및 50% (vol/vol) 글리세롤을 함유한 수성 재고를 만듭니다. | |
| 6X 나트륨 도데실 황산염 (SDS) | 0.375 M Tris pH 6.8, 6 ml 글리세롤, 1.2 g SDS, 0.93 g 1,4-디티오트레이톨 (DTT), 6 mg 브로모페놀 블루, 10 ml에 물을 추가합니다. | |
| ChIP 희석 버퍼 | 0.01% SDS, 1.1% 트리톤 X-100, 1.2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl | |
| ChIP 용출 버퍼 | 오토클레이브 ddH2O의 SDS(w/v) 및 0.1 M NaHCO3 | |
| MCF-7 셀에 대한 완전한 DMEM: | 덜벡코의 수정 독수리 매체(DMEM)는 10% 소 송아지 세럼(BCS), 페니실린(10단위/ml), 연쇄절제술(10mg/ml)으로 보충 | |
| 높은 소금 세척 버퍼 | 0.1% SDS, 1% 트리톤 X-100, 2mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl. | |
| LiCl 세척 버퍼 | 0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% 디옥시콜레이트 나트륨, 1mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0. | |
| 낮은 소금 세척 버퍼 | 0.1% SDS, 1% 트리톤 X-100, 2mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl. | |
| 핵 부종 완충제 | 5mM 파이프 pH 8.0, 85mM KCl, 0.5% NP-40 | |
| SDS 리시스 버퍼 | 1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris-HCl pH 8.0 | |
| TE 버퍼 | 10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA. | |
| 전송 버퍼 | 25 mM Tris, 190 mM 글리신, 20 % 메탄올 및 pH를 확인하고 필요한 경우 pH 8.3에 적응하십시오. | |
표 1: 사용되는 버퍼 및 솔루션의 레시피입니다.
보충 파일: 프로토콜 1-3에 대 한 보충 실험 회로도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
리신 아세틸트랜스퍼라제(KATs)는 유전자전사를조절하기 위한 히스톤 꼬리 및 전사 인자에 대한 여러 리신 잔류물을 아세틸레이트2,3. 지난 2년간의 연구에 따르면 CBP/p300, PCAF 및 GCN5와 같은 KAT는 종양 발생 성 전사 인자와 상호 작용하고 여러 고형 종양 유형4,,5,9,9,15,,16,,17,,18에서종양 성장을 촉진하는 데 도움을 주는 것으로 나타났습니다. 종양 성장을 촉진하는 그들의 새로운 역할 때문에, KAT는 암 처리에 있는 새로운 표적으로 조사되고 있습니다. 새로운 KAT 억제제 (KATi)는 클리닉에서 사용하기 위해 이동하기 전에 효능, 선택성 및 안전을 위해 신중하고 엄격하게 테스트해야합니다. 최근 증거는 이전에 KATi 화합물이 표적 효과를 나타내고 화학 프로브21로과학 문헌에서 널리 사용되기 전에 제대로 특성화되었다는 것을 보여주었습니다. 따라서 KATi 특성화에는 엄격한 방법이 필요합니다. 여기에 설명된 세 가지 프로토콜은 KAT의 히스톤 아세틸 트랜스퍼라아제(HAT) 기능을 대상으로 하는 새로운 억제제를 특성화하고 검증하는 데 사용할 수 있는 세 가지 프로토콜입니다: 시험관 내 HAT 분석, ChHAI 분석, ChIP-qPCR. 이러한 프로토콜은 CBP/p300 및 억제제를 예로 사용하지만 이러한 방법은 다른 KAT를 조사하는 데 향후 적용을 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.
HAT 분석은 간단하고 테스트 튜브에서 HAT 기능을 억제하는 효능에 대한 화합물을 선별하는 비용 효율적인 방법입니다. 정제 된 HATs (재조합44,10 또는 면역 침전40)는이분석에서 테스트 할 수 있지만 재조합 CBP / p300은 이 프로토콜의 예로 사용된다. CBP/p300은 아세틸-코A에서 대상 기판3의리신 잔류물으로 아세틸 그룹을 전송하는 효소 HAT 도메인을 갖는다. 가장 특징적인 CBP/p300 히스톤 대상은 히스톤 3 리신 18 및 27 (H3K18 및 H3K27, 각각)2,,3,,10,,11이다. HAT 분석에서 정제 된 p300 HAT 도메인은 아세틸-코아와 히스톤 3.1을 기판으로 배양합니다. 인큐베이션 기간 동안 p300은 H3K18 및 H3K27을 포함한 여러 H3.1 잔류물에서 아세틸화를 촉매합니다. 이러한 잔류물상에 대한 아세틸화의 상대적 풍부는 면역블로팅을 통해 측정될 수 있다. 이 시험관 반응은 p300에 결합하고 HAT 활동 (HATi)을 억제하는 새로운 화합물을 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 알려진HATi(38)인아나카르산은 DMSO 대조군(도1B,레인 5 대 레인 1)에 비해 H3K18 및 H3K9 모두에서 히스톤 아세틸레이션을 강력하게 다운조절한다. 아세틸-코아를 실험반응(도 1B,차선 1-5) 또는 p300 의 이세틸화에 추가하는 것이 매우 중요하다(도1B,레인 6). 아 세 틸-CoA의 부재는 또한 p300 촉매에 대 한 부정적인 제어와 재조합 H3.1에 히스톤 아 세 틸화의 기저 수준에 대 한 사용할 수 있습니다.
HAT 분석기를 수행할 때 각 반응이 동일한 양의 p300, H3.1 및 아세틸-CoA를 수신하도록 하는 것이 중요합니다. 면역블롯의 H3.1 및 p300 수준은 젤에 대한 적재 제어역할을 한다. 이 분석의 경우, 사이트별 히스톤 아세틸 항체 또는 범아세틸 항체는 면역블로팅에 사용될 수 있다. 면역 blot 품질을 향상 시키기 위해 최적화 하는 경우 면역 blotting에 대 한 검증 된 항체를 사용 하 고 처음에 항체 희석에 대 한 제조 업체의 권장 사항을 따르는 것이 중요 하다. 프로토콜 섹션에 사용되는 항체 희석제는 초기 실험결과에 기초하여 희석을 변화시킬 수 있다(예를 들어, 신호가 너무 강하면 항체가 더 희석될 수 있음). 단순성으로 인해 HAT 분석은 새로운 억제제 를 선별하기위한 훌륭한 시작 실험입니다. 그러나 HAT 분석에는 단점이 있습니다. HAT 분석의 주요 관심사는 시험관에서 효과적인 화합물이 살아있는 시스템에서 효과가 없다는 것을 증명할 수 있다는 것입니다. 이것은 세포 배양에 있는 화합물 효험이 세포 투과성 문제점, 세포 대사 및 화합물 안정성에 의해 변경될 수 있기 때문에 문제입니다. 또한, KAT, 특히 CBP/p300은 세포 배양3,,41,,42에서KAT 활성을 조절하는 많은 단백질 단백질 상호 작용을 갖는다. 따라서, 상기 세포배양 실험에서 HAT 분석에서 확인된억제제(20,,23)를추가로 특성화하는 것이 필수적이다.
크로마틴 Hyperacetylation 억제(ChHAI) 분석은 파이프라인내의 두 번째 프로토콜이며 세포 배양에서 새로운 억제제의 효과를 검증하는 데 유용합니다. 이 분석체는 HDAC 억제제(HDACi)24를 사용하여 기저 아세틸화가 면역블롯에서 검출하기에는 너무 낮을 수 있기 때문에 세포에서 히스톤 과아세틸화를 유도한다. 선택의 세포주는 HATi의 첨가 전에 아세틸화 크로마틴의 축적을 허용하기 위해 HDACi로 사전 배양됩니다. HDACi 및 HATi를 공동 배양 한 후, 세포는 용액을 하고 특정 히스톤 아세틸화 부위에 대한 표준 면역 blotting 절차를 받게됩니다. 이 분석의 목적은 HDACi에 의해 유도된 히스톤 과아세틸화를 감쇠시키기 위한 새로운 HATi의 효능을 결정하는 것이다. HDACi에 노출된 세포는 DMSO 용매에 노출된 세포보다 히스톤 아세틸화수준이 현저히 높아야한다(도 2B,레인 4 대 레인 1). HDACi와 함께 HATi를 첨가하면 HDACi 처리에 만 하여 면역블롯 신호를 감소시킬 것으로예상된다(도 2B,차선 5-6 대 레인 4). 히스톤 아세틸레이션의 기저수준(도 2B,레인 1-3)은 감지하기 어렵고 이 프로토콜에 HDACi를 추가하는 것의 중요성을 강조합니다. MS-275(Entinostat)는 예로 사용되지만 다른 HDACi는24,,43을사용할 수 있다. MS-275는 클래스 I HDAC에 비해 변변보고 억제 농도를 가지고 있으며 일반적으로 나노 몰러 농도가 낮은 마이크로몰러 농도로 HDAC1 및 HDAC3을 억제하며, 각각43,,44. 광범위한 MS-275 농도는 문헌45,,46,,47에사용되지만, 3 μM 치료는 MCF-7 세포에서 히스톤 아세틸화의 견고하고 재현 가능한 증가를 제공한다. 따라서, 상이한 세포주 사용 시 ChHAI 분석에 대한 최적의 농도를 결정하기 위해 광범위한 HDACi 및 HATi 농도를 가진 초기 화면을 수행하는 것이 유리할 수 있다.
HAT 분석과 유사하게, 면역블롯 프로토콜은 적절한 항체, 최적의 항체 희석제 및 신중하게 제어된 시료 로딩의 사용을 통해 품질 결과를 얻기 위해 최적화되어야 할 수도 있다. 신중하게 제어된 시료 적재는 이 프로토콜의 성공을 위해 필수적이며 모든 샘플의 단백질 함량을 평형화하고 동일한 양의 샘플을 면역블롯 젤의 우물로 피펫팅하여 달성할 수 있습니다. 범 아 세 틸 항체는이 프로토콜에서 프로빙에 사용할 수 있습니다. 그러나, KATs가 특정 히스톤 리신 잔류물 및 HATi에 대한 특이성을 가지고 있기 때문에 사이트별 아세틸 항체로 보충되어야 하며, HATi는 세포 배양1,,2,4,,,5,,10,,11에서모든 히스톤 아세틸화 부위에 영향을 미치지 않는다. HAT과 ChHAI 어약모두에서 히스톤 아세틸화를 줄이는 데 강력한 억제제는 추가 평가를 위한 강력한 후보입니다. 중요한 것은 HAT 및 ChHAI 분석은 히스톤 아세틸레이션의 글로벌 변화에 대한 데이터만 제공하는 데 한계가 있습니다. 이 제한은 게놈의 특정 지구에 새로운 HATi의 효력을 특성화할 필요가 있습니다.
크로마틴 면역 침전-정량적 폴리머라제 연쇄 반응(ChIP-qPCR)은 파이프라인의 최종 프로토콜이며 게놈의 특정 영역에서 DNA 단백질 상호 작용을 평가한다. 이 분석에서, H3K27ac에서 농축된 게놈 영역은 면역 침전(IP)을 통해 정제되고 qPCR에서 DNA 프라이머를 사용하여 분석된다. 이 기술은 HATi가 유전자 프로모터 및 증강제에서 히스톤 수정에 미치는 영향에 대한 기계적 통찰력을 제공합니다. ChIP-qPCR은 견고한 기술이며 전체 게놈 시퀀싱(예: ChIP-seq)보다 비용이 적게 들지만 결과에 영향을 미치는 많은 단계로 인해 최적화하기가 어려울 수 있습니다. 올바르게 최적화하는 가장 어려운 단계는 면역 침전단계 인 3.5 단계입니다. 이 단계는 3.5.20 단계에서 정제된 DNA가 매우 희석되면 qPCR 반응에 나쁜 결과를 초래할 수 있기 때문에 최적화하기 어렵다(예를 들어, 표적 유전자 서열및 매우 높은 ΔCt 값의 증폭 없음). IP 단계의 성공은 관심있는 단백질 표적의 풍부와 IP 항체의 품질과 같은 여러 가지 요인에 의존한다. IP 단계의 성공을 확인하기 위해 IGG 대조군대 IP H3K27ac 항체의 품질을 검증하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 도 3B에서,H3K27ac 특이적 항체는 비특이적 IgG 대조군을 통해 632.73배 농축을 표시한다. 이는 H3K27ac 항체가 고품질이며 H3K27ac가 Cyclin D1 프로모터에서 농축된다는 것을 나타냅니다. IP 항체의 검증 후, DMSO와 A-485 처리된 집단 간의 비교가 이루어질 수 있다. 도 3C에도시된 바와 같이, A-485는 %입력 방법(n=2의 대표적인 결과)을 사용하여 Cyclin D1 프로모터 대 DMSO 제어에서 H3K27ac 농축을 감소시킨다. IP 항체가 낮은 품질임을 입증하고 초기 실험에서 접힌 농축을 나타내지 않으면 3.2.1 단계에서 세포 수를 늘려보십시오. 세포 수가 높을수록 용액의 총 단백질 함량을 증가시킴으로써 항체 품질을 보정하는 데 도움이 될 수 있으며 더 많은 단백질을 IP 반응에 첨가할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이나 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 제임스와 에스더 킹 생물 의학 연구 프로그램 (6JK03 및 20K07)과 Bankhead-Coley 암 연구 프로그램 (4BF02 및 6BC03), 플로리다 보건부, 플로리다 유방암 재단 및 UF 건강 암 센터의 보조금에 의해 지원되었습니다. 또한, 우리는 출판 과정에서 그들의 지원에 대한 박사 Zachary Osking과 안드레아 린 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
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