Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analyser för validering av Histone Acetyltransferas hämmare

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

Hämmare av histonacetyltransferaser (HATs, även känd som lysinacetyltransferaser), såsom CBP/p300, är potentiella therapeutics för behandling av cancer. Men, rigorösa metoder för att validera dessa hämmare behövs. Tre in vitro-metoder för validering inkluderar HAT-analyser med rekombinanta acetyltransferaser, immunoblotting för histonacetylation i cellodling, och ChIP-qPCR.

Abstract

Lysinacetyltransferaser (KATs) katalyserar acetylation av lysinrester på histoner och andra proteiner för att reglera kromatindynamik och genuttryck. KATs, såsom CBP/p300, är under intensiv utredning som terapeutiska mål på grund av deras kritiska roll i tumorigenesis av olika cancerformer. Utvecklingen av nya små molekylhämmare som riktar sig mot hitoncetyltransferas (HAT) funktion av KATs är utmanande och kräver robusta analyser som kan validera specificitet och potens av potentiella hämmare.

Denna artikel beskriver en pipeline av tre metoder som ger rigorös in vitro-validering för nya HAT-hämmare (HATi). Dessa metoder inkluderar en teströr HAT-analys, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analys, och Chromatin Immunoprecipitation-kvantitativa PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberas rekombinanta HATs med histoner i en provrörsreaktion, vilket möjliggör acetylering av specifika lysinrester på histonstjärtarna. Denna reaktion kan blockeras av en HATi och de relativa nivåerna av platsspecifik histonacetylation kan mätas via immunoblotting. Hämmare som identifieras i HAT-analysen behöver bekräftas i cellulär miljö.

Den ChHAI analys använder immunoblotting att skärmen för romanen HATi som dämpar den robusta hyperacetylation av histoner framkallas av en histone deacetylase inhibitor (HDACi). Tillägget av en HDACi är till hjälp eftersom basala nivåer av histon acetylation kan vara svårt att upptäcka via immunoblotting.

HAT- och ChHAI-analyserna mäter globala förändringar i histonacetylation, men ger inte information angående acetylation vid specifika genomiska regioner. Därför används ChIP-qPCR för att undersöka effekterna av HATi på nivåerna för histonacetylation vid genreglerande element. Detta åstadkoms genom selektiv immunoprecipitation av histon-DNA-komplex och analys av det renade DNA genom qPCR. Tillsammans, dessa tre analyser möjliggör noggrann validering av specificitet, potens, och verkningsmekanismen för romanen HATi.

Introduction

Lysinacetyltransferaser (KATs) katalyserar acetyleringen av lysinrester på både histon och icke-histonproteiner1,2,3,4. Ny forskning visar att KATs och deras acetyltransferasfunktion kan främja solid tumörtillväxt4,5,6,7,8,9. Till exempel, CREB-bindande protein (CBP)/p300 är två paraloga KATs som reglerar ett flertal signalering vägar i cancer2,3. CBP/p300 har en väl karakteriserad hitonacetyltransferas (HAT) funktion och katalysera Histon 3 Lysin 27 acetylation (H3K27ac)2,4,55,10,11, en viktig markör för aktiva förstärkare, promotorregioner och aktiv gentranskription12,13,14. CBP/p300 fungera som kritiska co-aktivatorer för pro-tillväxt signalering vägar i fasta tumörer genom att aktivera transkription av onkogener genom acetylering av histoner och andra transkriptionsfaktorer4,9,15,16,17,18. På grund av sin roll i tumörprogression, CBP/p300 och andra KATs är under utredning för utveckling av nya hämmare som blockerar deras onkogen funktion4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 och GNE-049 representerar två framgångsrika försök att utveckla potenta och specifika hämmare för CBP/p3004,9. Ytterligare hämmare är för närvarande under utredning för CBP/p300 och andra KATs.

Kvaliteten på tidigare beskrivna KAT-hämmare (KATi) ifrågasätts, med många hämmare som visar upp måleffekter och dålig karakterisering21. Därför är rigorös karakterisering och validering av nya läkemedelskandidater avgörande för utvecklingen av högkvalitativa kemiska sonder. Beskrivs här är tre protokoll som bildar en pipeline för screening och noggrant validera styrkan och specificiteten i romanen KATi, med ett särskilt fokus på att hämma HAT-funktionen (HATi) av KATs. CBP/p300 och deras hämmare används som exempel, men dessa protokoll kan anpassas för andra KATs som har en HAT-funktion7.

Det första protokollet är en in vitro-hitonacetyltransferas (HAT) analys som utnyttjar renad rekombinant p300 och histoner i en kontrollerad provrörsreaktion. Denna analys är enkel att utföra, är kostnadseffektiv, kan användas för att skärmen föreningar i en låg genomströmning inställning, och kräver inte radioaktiva material. I detta protokoll, rekombinanta p300 katalyserar lysin acetylation på histon svansar under en kort inkubationstid och nivåerna av histon acetylering mäts med hjälp av standard immunoblotting förfaranden. Den enzymatiska reaktionen kan utföras i närvaro eller frånvaro av CBP/p300-hämmare till skärm för föreningar som minskar histonacetylation. Dessutom kan HAT-analysen användas för att kontrollera om nya föreningar är selektiva för CBP/p300 genom att bedöma deras verksamhet mot andra renade KATs, såsom PCAF. DEN HAT-analysen är en utmärkt utgångspunkt för att undersöka nya inhibitorer på grund av dess enkelhet, låg kostnad, och förmågan att bestämma styrkan / selektivitet av en hämmare. I själva verket är detta protokoll ofta används i litteraturen som en in vitro-skärm5,10. Emellertid, hämmare identifieras i HAT-analysen är inte alltid effektiva i cellodling eftersom ett provrör reaktion är mycket enklare än en levande cell system. Därför är det väsentligt att ytterligare karakterisera hämmare i cellodlingsexperiment22,23.

Det andra protokollet i pipelinen är Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analys. Denna cell baserad analys utnyttjar histon deacetylase-hämmare (HDACi) som ett verktyg för att hyperacetylate histoner i kromatin före co-inkubation med en HATi24. Basal histon acetylering kan vara låg i cellodling, vilket gör det svårt att sond för via immunoblotting utan tillsats av en HDACi att öka acetylering. Syftet med ChHAI analysen är att identifiera romanen HATi som kan dämpa ökningen av histon acetylation orsakad av HDAC hämning. Fördelarna med denna analys inkluderar dess låga kostnad, relativt lätt att utföra, och användning av celler i kultur, som ger mer fysiologisk relevans än provröret HAT analys. I likhet med HAT-analysen använder detta protokoll vanlig immunoblotting för datainsamling.

HAT och ChHAI analyser ger data om styrkan av nya föreningar för att hämma globala histon acetylation, men ger inte insikt i hur dessa föreningar påverkar ändringar vid specifika genomiska regioner. Därför är det slutliga protokollet, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) ett cellodlingsexperiment som undersöker DNA-protein interaktioner vid specifika regioner i arvsmassan. I ChIP-protokollet korskopplas kromatin för att bevara DNA-protein interaktioner. Kromatin extraheras sedan från celler och DNA-proteinkomplexet genomgår selektiv immunoprecipitation för proteinet av intresse (t.ex. med hjälp av en antikropp som är specifik för H3K27ac). DNA:t renas sedan och analyseras med hjälp av qPCR. Till exempel kan ChIP-qPCR användas för att avgöra om en roman HATi downregulates histonacetylation vid enskilda onkogener, såsom Cyclin D125. Medan ChIP-qPCR är en vanlig teknik som används i fältet, kan det vara svårt att optimera4,10,26. Det här protokollet innehåller tips för att undvika potentiella fallgropar som kan uppstå när du utför Proceduren ChIP-qPCR och innehåller kvalitetskontroller som bör utföras på data.

När de används tillsammans, dessa tre protokoll möjliggör en rigorös karakterisering och validering av romanen HATi. Dessutom, dessa metoder erbjuder många fördelar eftersom de är lätta att utföra, relativt billiga och ge data om globala samt regionala histon acetylation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. IN VITRO HAT-analys

  1. Förberedelse av buffert
    OBS: Se tabell 1 för buffertrecept.
    1. Förbered 5x analysbuffert och 6x Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) och förvara vid -20 °C. Aliquot SDS i 1 mL alikvoter.
    2. Förbered 10x SDS gel kör buffert och 10x TBST och förvara i rumstemperatur.
    3. Förbered 1x överföringsbuffert och förvara vid 4 °C.
      FÖRSIKTIGHET: Kontrollera säkerhetsdatablad för alla kemikalier som används i detta protokoll. SDS, DTT, och bromophenol blå är giftiga och bör inte intas, inhaleras, eller utsätts för huden eller ögonen. Vänligen se säkerhetsdatablad för korrekt hanteringsrutiner. Var god använd en kemisk rökhuv för hantering av farliga kemikalier.
  2. HAT reaktion
    OBS: Anakarsyra är en känd p300-hämmare3 och används som exempel för att visa hur HAT-analysen kan identifiera nya p300-hämmare. Se Tilläggsprotokoll (Schematisk 1) för ett schematiskt av steg 1.2.1.
    1. Förbered följande enzymatiska reaktion i ett 0,2 mL PCR-rör: 2 μL 5x-analysbuffert, 1 μL av renad p300 (0,19 μg/μL ), 1 μL anakarsyra (HATi) eller DMSO-kontroll utspädd i 1x-analysbuffert och 2 μL autoklaverad ddH2O. Pre-inkubera denna blandning i 10 min vid rumstemperatur. Tillsätt sedan 3 μL av 100 μM Acetyl-CoA och 1 μL renat H3.1 (0,2 μg/μL) till reaktionen.
    2. Inkubera den kompletta reaktionsblandningen vid 30 °C i 1 h i en PCR termisk cycler.
    3. Tillsätt 2-merkaptoanol vid ett 1:10-förhållande till 6x SDS-provbufferten.
    4. Ta bort prover från PCR termisk cycler och tillsätt 2 μL av 6x SDS (med 2-merkaptoetanol tillsatt) till reaktionsmixen.
      VAR FÖRSIKTIG: 2-merkaptoetanol är giftigt och ska användas inuti en kemisk rökhuva. Vänligen se säkerhetsdatablad för korrekt hantering.
    5. Värmeprover vid 95 °C i 5 min på ett värmeblock och kyl på is. Förvara proverna vid -20 eller -80 °C eller utför gelelektrofores och immunblottering enligt detaljer nedan.
  3. Gelelektrofores och immunoblotting
    OBS: Om det inte är bekant med gelelektrofores och immunoblotting, se detta standardförfarande27 för ytterligare detaljer om hur du utför steg 1.3.1-1.3.17. Ytterligare information hittar du här28,29,30,31,32,33.
    1. Pipett 10 μL av prover (från steg 1.2.5.) in i brunnarna i en 4-20% gradient polyakrylamidgel. Pipett 5 μL proteinstege i en av brunnarna som molekylviktsreferens. Kör gelen vid 120 V i 90 min med hjälp av en geltank.
    2. Överför gelen till ett polyvinyliden difluoridmembran (PVDF) vid 100 V i 70 min med hjälp av en överföringstank.
    3. Ta bort membranet från överföringsapparaturen och placera det i en plastbehållare. Blockera membranet genom att tillsätta 1x TBST (innehållande 5% mjölk) till behållaren och skaka försiktigt i 1 h vid rumstemperatur.
    4. Ta bort 1x TBST från steg 1.3.3. Inkubera membranet över natten med utvalda platsspecifika acetylantikroppar (t.ex. H3K18ac eller H3K27ac primära antikroppar vid en 1:5 000 utspädning i 1x TBST som innehåller 5% mjölk) vid 4 °C med skonsam skakning.
    5. Ta bort den primära antikroppslösningen. Tvätta membranet 2x med 1x TBST (ingen mjölk) vid rumstemperatur med skonsam skakning i 15 min varje tvätt.
    6. Späd den sekundära antikroppen vid 1:20 000 i 1x TBST (innehållande 5% mjölk) och inkubera membranet i 1 h vid rumstemperatur med varsam skakning.
    7. Ta bort den sekundära antikroppslösningen. Tvätta membranet 2x med 1x TBST (ingen mjölk) vid rumstemperatur med skonsam skakning i 15 min varje tvätt.
    8. Töm 1x TBST från membranet. Blanda HRP substratperoxidlösning och HRP substrat luminollösning i en 1:1-ratio (1 mL av varje) och pipettering 2 mL av den kombinerade lösningen till membranytan.
    9. Inkubera lösningen med membranet i 5 min i rumstemperatur.
    10. Dränera överskott chemiluminescent substrat från membranet på en pappershandduk och placera membranet i plastfolie inuti en röntgen kassetthållare.
    11. Flytta till ett mörkt rum som är dedikerat till röntgenfilmbearbetning. Exponera membranet för en röntgenfilm genom att placera filmen ovanpå membranet och stänga kassetten i 30 s.
      OBS: Tidpunkt för kontakt mellan film och membran måste bestämmas experimentellt. Starka signaler kommer att behöva korta exponeringar (sekunder) och svagare signaler kan behöva längre exponeringar.
    12. Ta bort röntgenfilmen från kassetten och bearbeta filmen genom att köra den genom en röntgenfilmsprocessor. Se tillverkarens handböcker för specifika anvisningar om hur du bearbetar röntgenfilmen.
    13. Ta ut membranet från plastfolie och tvätta det med ddH2O i 5 min vid rumstemperatur med varsam skakning.
    14. Inkubera membranet med 0,2 M NaOH i 5 min vid rumstemperatur med varsam skakning.
    15. Tvätta membranet med ddH2O i 5 min vid rumstemperatur med varsam skakning.
    16. Blockera membranet genom att tillsätta 1x TBST (innehållande 5% mjölk) till behållaren och skaka försiktigt i 1 h vid rumstemperatur.
    17. Tillsätt nästa primära antikroppsutspädning (t.ex. probe för H3K27ac om den första antikroppen som användes var H3K18ac) och skaka över natten vid 4 °C. Upprepa steg 1.3.4-1.3.17 tills alla antikroppssonder är slutförda.

2. ChHAI-analys

  1. In vitro läkemedelsbehandlingar och analys av acetylerade histoner
    OBS: A-485 är en potent och väl karakteriserad p300 HATi2,4 . Denna inhibitor kommer att utnyttjas i de återstående analyserna på grund av dess effekt och specificitet i cellodling. MS-275 (Entinostat)24 är en HDACi som markant ökar nivåerna för histonacetylation och används för att underlätta enklare upptäckt av acetyleringssonder med vanlig immunoblotting. Se Kompletterande protokoll (Schematisk 2) för en schematisk av läkemedlet utspädningar som används i steg 2.1.
    1. Seed 100.000 MCF-7 celler i en 12 väl platta och tillåta celler att växa till 80-90% konfluency i 1 mL av cellodling medium. Markera brunnarna för följande experimentella design: brunn 1: DMSO-kontroll (referenspunkt); brunn 2: A-485 (3 μM); brunn 3: A-485 (10 μM); brunn 4: MS-275 (3 μM); brunn 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); brunn 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      OBS: För culturing MCF-7 celler, använd kompletta DMEM-medier och låta celler växa vid 37 °C med 5% CO2. Se tabell 1 för komplett DMEM recept.
    2. Vid 24 h efter seedning, pipettera 4 mL av komplett DMEM media till en steril 15 mL koniska röret. Pipett 2 μL ms-275 (6 mM i DMSO) till 4 mL medium för en slutkoncentration på 3 μM MS-275.
    3. Pipett 2 μL dmso till 4 mL medium i ett separat sterilt 15 mL koniskt rör.
      VAR FÖRSIKTIG: Kontrollera säkerhetsdatabladet för korrekt hantering av DMSO. Vissa handsktyper är inte klassade för hantering av DMSO.
    4. Aspirera cellodlingsmediet från brunnarna 4-6 och pipetten 1 mL på 3 μM MS-275 i medium (steg 2.1.2) till varje brunn. Kassera oanvänd utspädd MS-275.
    5. Aspirera cellodlingsmediet från brunnarna 1-3 och pipetten 1 mL av utspädd DMSO (steg 2.1.3) till varje brunn. Kassera oanvänd utspädd DMSO.
    6. Återför cellerna till inkubatorn och inkubera i 4 h för att möjliggöra ackumulering av acetylerade histoner i celler som utsätts för MS-275 (brunnar 4-6).
      OBS: MS-275 är en HDACi och kommer att orsaka hiton hyperacetylation24. Denna 4 h pre-inkubation är nödvändig för att tillåta MS-275 att inducera hyperacetylation före tillsats av A-485, vilket minskar histonacetylation2,4.
    7. Efter 4 h inkubation med MS-275, bered följande spädningar i separata sterila 1,5 mL-rör genom pipettering: 1,0 μL DMSO till 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO och 0,5 μL A-485 (6 mM) till 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO och 0,5 μL av A-485 (20 mM) till 1 mL DMEM-media; 0,5 μL DMSO och 0,5 μL ms-275 (6 mM) till 1 mL DMEM-media, 0,5 μL av A-485 (6 mM) och 0,5 μL ms-275 (6 mM) till 1 mL DMEM-media; 0,5 μL av A-485 (20 mM) och 0,5 μL ms-275 (6 mM) till 1 mL DMEM-media.
    8. Aspirera cellodlingsmediet från brunnarna 1-6 och pipettering 1 mL av spädning 1 till väl 1, utspädning 2 till väl 2, utspädning 3 till väl 3, utspädning 4 till väl 4, utspädning 5 till väl 5, och utspädning 6 till väl 6.
      OBS: En allmän regel är att balansera DMSO (lösningsmedel) innehåll mellan experimentella grupper och inte överstiga 0,1% DMSO innehåll i cellodling för att undvika cellulär toxicitet och förändringar i spridning.
    9. Återför cellerna till inkubatorn och kulturen i 20 h.
    10. Efter 20 h, aspirera cellodlingsmediet från brunnarna 1-6.
    11. Tvätta cellerna genom pipettering av 1 mL PBS till brunnarna 1-6. Aspirera PBS.
    12. Tillsätt 100 μL av 1x passiv lysbuffert (se tabell 1) till brunnarna 1-6. Förvara cellodlingsplatta (med prov i passiv lysbuffert) vid −80 °C över natten för frys-tö och lys av celler.
      VAR FÖRSIKTIG: Kontrollera säkerhetsdatablad för alla kemikalier innan du gör buffertar. CDTA kan orsaka allvarliga ögonskador och irritation.
    13. Tina prover i rumstemperatur med varsam skakning i 10 min. Överför prover till separata 1,5 mL rör och omedelbart placera på is.
    14. Mät proteinkoncentration av varje prov. Proteinkoncentrationen kan bestämmas med hjälp av flera väletablerade protokoll34.
    15. Jämviktsproteinkoncentration mellan prov 1-6 (i lika volym) med användning av 1x passiv lysbuffert för att späda ut, efter behov.
    16. Tillsätt 2-merkaptoetanol vid en 1:10-förhållande till 6x SDS provbuffert.
    17. Tillsätt 6x SDS-provbuffert med 2-merkaptoetanol till proverna 1-6 till en slutkoncentration av 1x SDS-provbuffert.
    18. Värmeprover vid 95 °C i 5 min på ett värmeblock och kyl på is. Prover kan förvaras vid -20 °C eller -80 °C fram till steg 2.1.19.
    19. Pipettera en volym som innehåller 30 μg protein för prover 1-6 till brunnarna i en 4-20% gradient polyakrylamid gel. Utför immunoblottingsprocedur enligt protokoll som beskrivs i protokoll 1.

3. ChIP-qPCR

OBS: Protokollet nedan beskrivs för inhibitorer av p300 som ett exempel.

  1. Förberedelse av buffert
    OBS: Se tabell 1 för buffertrecept. De allmänna stegen i ChIP-protokollet (t.ex. buffertrecept, tvätttider och centrifugeringstider) nedan modifieras och anpassas från tillverkarens rekommendationer av en kommersiellt tillgänglig sats (se Table of Materials) och frånlitteraturen 35,36.
    1. Förbered ChIP utspädningsbuffert, nukleisvullnaffert, låg salttvättbuffert, hög salttvättbuffert, LiCl-tvättbuffert och TE-buffert. Förvaras vid 4 °C.
    2. Förbered SDS-lysbuffert, 10x glyginbuffert och ChIP elueringsbuffert. Förvaras i rumstemperatur.
      VAR FÖRSIKTIG: Var vänlig kontrollera säkerhetsdatabladet för alla kemikalier innan du gör buffertar för att säkerställa korrekt hantering.
  2. Läkemedelsbehandling
    OBS: Se Tilläggsprotokoll ( Schematisk 3) för en schematisk av läkemedlet utspädningar som används i steg 3.2.
    1. Frö MCF-7 celler i två 15 cm kultur rätter och växa celler till 90% konfluency i 12 mL av komplett DMEM medium. Märk rätterna för följande experimentella design: Skål 1: DMSO-kontroll (referenspunkt); Maträtt 2: A-485 (3 μM).
      OBS: För culturing MCF-7 celler, använd kompletta DMEM media och växa vid 37 °C med 5% CO2. Se tabell 1 för komplett DMEM recept.
    2. I ett sterilt koniskt rör på 15 mL, pipettering 12 mL DMEM-media och pipett 6 μL DMSO. Blanda väl.
    3. I ett separat sterilt 15 mL koniskt rör, pipettera 12 mL DMEM-media och pipettering 6 μL av A-485 (6 mM i DMSO) för att få en slutkoncentration på 3 μM A-485. Blanda väl.
    4. Aspirera media från Dish 1 och 2.
    5. Tillsätt 12 mL utspädd DMSO i DMEM (steg 3.2.2.) till Skål 1.
    6. Tillsätt 12 mL på 3 μM A-485 i DMEM (steg 3.2.3.) i Skålen 2.
    7. Returnera cellodlingsfaten till inkubatorn och inkubera i 24 h.
  3. Fixering av celler
    1. Pipett 330 μL (27,5 μL per mL) av 37% formaldehyd till det kompletta mediet och snurra försiktigt plattan för att blanda.
      FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd är giftigt. Vänligen se säkerhetsdatablad för korrekt hanteringsrutiner.
    2. Inkubera i 10 min i rumstemperatur.
    3. Pipett 2 mL av 10x glycin till plattan och virvla för att blanda.
    4. Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
    5. Efter inkubation, placera rätter på is och tina en alikvot av proteashämmare cocktail.
    6. Förbered följande lösningar för både DMSO- och A-485-proverna med hjälp av de buffertar som bereds i steg 3.1.
      1. 2 mL PBS med en 1:1 000 utspädning av proteashämmare cocktail
      2. 1 mL av nukleisvullnadsbuffert med en 1:1 000 utspädning av proteashämmare-cocktailen
      3. 0,5 mL SDS-lysbuffert med en utspädning av proteashämmare 1:1 000
    7. Aspirera media från cellodlingsfaten och tvätta cellerna två gånger med 15 mL kall PBS.
    8. Pipett 2 mL PBS med proteashämrarcocktailen (steg 3.3.6.1) till cellodlingsrätterna. Lyft cellerna i lösning med hjälp av en cellskrapa.
    9. Överför cellupphängningen till ett mikrocentrifugrör. Samla återstående celler med ytterligare PBS om det behövs.
    10. Spinnrör vid 800 x g vid 4 °C i 5 min för att pelleta cellerna.
    11. Aspirera supernatanten och pipetten 1 mL av kärnorsvullnadsbuffert med proteashämpelcocktailen (steg 3.3.6.2) till pelleten. Resuspend pelleten och ruvar på is i 10 min.
    12. Centrifugera rören vid 2 700 x g vid 4 °C i 5 min till pelletkärnor.
    13. Aspirera supernatanten och pipetten 0,5 mL SDS-lysbuffert med proteashämmare-cocktailen (steg 3.3.6.3) till pelleten. Resuspend pelleten och ruvar på is i 10 min.
    14. Förvara kromatinproverna vid -80 °C till steg 3.4.1 eller fortsätt omedelbart till steg 3.4.
  4. DNA ultraljudsbehandling
    1. Överför 130 μL kromatin från DMSO-prov (steg 3.3.14) till två DNA-ultraljudsbehandlingsrör med hjälp av en pipett (130 μL vardera).
    2. Överför 130 μL kromatin från A-485 prov (steg 3.3.14) till två DNA-ultraljudsbehandlingsrör med hjälp av en pipett (130 μL vardera).
    3. Sonicate DNA till ungefär 150-200 baspar fragment med hjälp av följande sonicator inställningar: Peak Incident Power (W) av 175, Duty Factor på 10%, 200 Cykler per Burst och 430 s behandlingstid.
      OBS: Sonication inställningar kan skilja sig mellan modeller och inställningar kan behöva justeras för att uppnå lämplig fragmentstorlek för olika cellinjer.
    4. Håll prover på is efter ultraljudsbehandling.
    5. Överför den sonicated kromatin till en 1,5 mL rör med hjälp av en pipett och centrifug vid 10.000 x g vid 4 ° C för 10 min till pellet skräp.
    6. Pipett supernatanten (innehåller sonicated kromatin) till ett nytt rör och kassera skräp. Sonicated kromatin kan lagras vid -80 °C.
  5. Chromatin immunprecipitation (ChIP)
    OBS: Se Tilläggsprotokoll (Schematisk 3) för en schematisk av IP-grupperna i Steg 3.5.
    1. Mät proteinhalten i det sonicated kromatin för DMSO och A-485 prover från Steg 3.4.6. Proteinhalten kan mätas med hjälp av väletablerade protokoll34.
      OBS: För enkelhetens skull kommer detta protokoll att anta att proteinhalten är lika och 100 μL sonicat kromatin kommer att användas. Annars måste proteininnehållet ekvillibreras mellan alla prover i lika stor volym.
    2. Pipett 100 μL DMSO sonicated kromatin till två 1,5 mL rör (100 μL vardera). Pipett 400 μL av ChIP-spädningsbuffert (innehållande en 1:1 000 utspädning av proteashämmarecocktailen) till varje rör för att få total volym upp till 500 μL. Ta bort 5 μL av lösningen från ett av rören och förvara vid -20 °C som DMSO Input.
    3. Pipett 100 μL av A-485 sonicated kromatin till två 1,5 mL rör (100 μL vardera). Pipett 400 μL av ChIP-spädningsbuffert (innehållande en 1:1000-spädning av proteashämmarecocktailen) till varje rör för att få total volym upp till 500 μL. Avlägsna 5 μL av lösningen från ett av rören och förvara vid -20 °C som A-485 Input.
    4. Lägg med hjälp av en pipett till immunprecipitationsantikroppen (IP) (t.ex. icke-specifik IgG-kontroll eller H3K27ac specifik antikropp) till motsvarande rör för DMSO- och A-485-proverna: IP #1 DMSO-kromatin med IgG-antikropp (5-10 μg); IP #2 DMSO kromatin med H3K27ac antikropp (5-10 μg); IP #3 A-485 kromatin med IgG-antikropp (5-10 μg); IP #4 A-485 kromatin med H3K27ac antikropp (5-10 μg).
    5. Tillsätt 20 μL protein A magnetiska pärlor till varje rör. Se till att pärlorna är väl återanvänds.
    6. Rotera proverna över natten vid 4 °C.
    7. Pellet proteinet En magnetisk pärlor med hjälp av en magnetisk separator och ta bort supernatanten. Stör inte pärlorna.
    8. Tvätta pärlorna med 500 μL till 1 mL av lågsalttvättbufferten och rotera i 5 min vid 4 °C. Utför en snabb snurra ner, pellet pärlorna med hjälp av en magnetisk separator, och ta bort supernatanten.
    9. Tvätta pärlorna med 500 μL till 1 mL av den höga salttvättbufferten och rotera i 5 min vid 4 °C. Utför en snabb snurra ner, pellet pärlorna med hjälp av en magnetisk separator, och ta bort supernatanten.
    10. Tvätta pärlorna med 500 μL till 1 mL av LiCl-tvättbufferten och rotera i 5 min vid 4 °C. Utför en snabb snurra ner, pellet pärlorna med hjälp av en magnetisk separator, och ta bort supernatanten.
    11. Tvätta pärlorna med 500 μL till 1 mL TE-buffert och rotera i 5 min vid 4 °C. Utför en snabb snurra ner. Förvara pärlorna i TE-bufferten till steg 3.5.14.
    12. Avlägsna Ingångsprover (från steg 3.5.2 och 3.5.3) från frys och håll på is.
    13. Tina en alikvot av Proteinase K.
    14. Pellet pärlorna med hjälp av en magnetisk separator och ta bort TE-bufferten från pärlorna (från steg 3.5.11).
    15. Tillsätt 100 μL ChIP elueringsbuffert + 1 μL Proteinase K till varje prov, inklusive Input-proverna. Inkubera prover med skakning vid 62 °C i 2 h med hjälp av en termocyklare.
    16. Efter 2 h, värmeprover till 95 °C i 10 min med hjälp av en termocyklare.
    17. Kyl in proverna till rumstemperatur.
    18. Pellet magnetiska pärlor med hjälp av en magnetisk separator och överföra supernatant (innehåller DNA av intresse) till en ny 1,5 mL rör.
    19. Rena DNA:t med hjälp av en pcr-rensedats av standard.
    20. Det renade DNA kan lagras vid -20 °C och kan användas som mallar i standardprotokoll för QPCR. Följ tillverkarprotokoll för körning av qPCR.
  6. Analys av ChIP-qPCR-data
    OBS: Två vanliga metoder för att analysera ChIP-qPCR resultat är vik anrikning över IgG antikroppen och 1% Input metoden. En utmärkt mall för båda analysmetoderna tillhandahålls av en kommersiell källa kan användas för att snabbt beräkna vikanrikning för varje IP-antikropp/mål av ränta37.
    1. För att beräkna falsberikning och % Input kopierar och klistrar du in ΔCt-värdena från de qPCR-data som erhållits för varje antikropp (icke-specifik IgG, IP H3K27ac-antikroppen, och 1% Input) i motsvarande region i analysmallen och Fold Enrichment and Yield % Input kommer automatiskt att fylla i.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro-histonacetyltransferas (HAT) analys kan användas för att sondera för föreningar som hämmar p300 HAT aktivitet mot ett histonsubstrat. Bild 1A ger ett experimentellt schema för HAT-analysen. Anakarsyra, en känd HATi3,38, utnyttjades i denna analys i ett koncentrationsintervall från 12,5-100 μM. Vid 100 μM, anakardisyra downregulates p300 katalyseras histon acetylation vid Histone 3, Lysin 9 och 18 mot kontrollen DMSO behandling (Figur 1B, lane 5 versus lane 1). En koncentrationsintervall utnyttjades i denna analys eftersom lägre läkemedel doser inte kan kraftigt hämma p300 HAT aktivitet (Figur 1B, körfält 2-4 kontra körfält 1). I Lane 6 lades ingen Acetyl-CoA till i reaktionen och fungerar som en negativ kontroll för p300 katalys och för basala nivåer av histonacetylation på rekombinant H3.1 (Figur 1B). P300 och H3.1 proteinnivåer utnyttjades som lastningskontroller (Figur 1B). Dessa immunblotresultat kvantifierades med hjälp av ImageJ39 (Figur 1C). Fold förändringar beräknades genom att jämföra bandet intensiteten av varje prov till bandet intensiteten av DMSO kontroll för varje acetylation sond. Kvantifiering för anakarsyra vid 100 μM visar potent reduktion av H3K18ac och H3K9ac jämfört med DMSO-kontrollen, vilket bekräftar de visuella resultaten i figur 1B.

I Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analys, HDACi används som ett verktyg för att hyperacetylate histoner i kromatin före co-inkubation med en HATi24, såsom p300-hämmare A-4852,4. Syftet med denna analys är att fastställa effekten av HATi för att dämpa hitonhyperacetyation som framkallas av HDACi. Bild 2A ger ett experimentellt schema för ChHAI-analysen. I denna analys, behandling av MCF-7 celler med HDACi MS-275 starkt upregulated acetylation på Histone 3, på flera lysin rester (Figur 2B, lane 4 kontra körfält 1). De basala nivåerna av H3K18ac och H3K27ac var låga, visar fördelarna med att lägga till en HDACi i ChHAI-analysen (Figur 2B, körfält 1-3). Tillsatsen av A-485 med MS-275 dämpar den ökade histonacetylationen vid H3K18 och H3K27, men inte H3K9 (Figur 2B, körfält 4-6). Viktigt är H3K9ac inte regleras av p300 i cellkultur2, som visar specificiteten hos A-485 i detta experiment. Dessa immunblotresultat kvantifierades i figur 2C. Fold förändringar beräknades genom att jämföra bandet intensiteten av varje prov till bandet intensitet ms-275 ensam (Lane 4) för varje acetylation sond. Körfält 1-3 kvantifierades inte eftersom H3K18ac och H3K27ac basala nivåer inte upptäcktes.

Chromatin Immunoprecipitation-kvantitativ Polymeras Chain Reaction (ChIP-qPCR) är ett cellodlingsexperiment som undersöker DNA-protein interaktioner vid specifika regioner i arvsmassan. Det kan användas för att undersöka effekterna av HATi vid genreglerande element som styr onkogen uttryck25. Bild 3A ger ett experimentellt schema för ChIP-qPCR-protokollet. MCF-7-celler som behandlades med 3 μM A-485 i 24 timmar utsattes för ChIP-qPCR genom immunoprecipitation av hiton-DNA-komplex berikade i H3K27ac (Figur 3). Den renade DNA analyserades för Cyclin D1 promotorn sekvensen. ChIP-qPCR-primers är utformade mot en specifik DNA-sekvens i arvsmassan och används för att upptäcka den relativa mängden utfällt DNA. Mängden utfällt DNA återspeglar överflödet av det protein av intresse som finns i den genomiska regionen som är under utredning. I DMSO-provet ger dna-fälls ut av IgG-kontrollantikroppen faktiskt ett högre Ct-värde än H3K27ac-antikroppen i qPCR-reaktionen för cyklin D1-promotorn (Figur 3B). Detta indikerar att den icke-specifika IgG-kontrollen fällde ut mindre DNA-proteinkomplex än den specifika antikroppen H3K27ac vid cyklin D1-promotorn. Detta innebär en 632,73 fals anrikning av H3K27ac över den icke-specifika IgG-kontrollen (Figur 3B).

Denna vik anrikning ger bevis för att H3K27ac specifika antikropp framgångsrikt immunoprecipitated acetylerade histoner och att H3K27ac är berikad vid Cyclin D1 promotorn. Efter att ha validerat kvaliteten på H3K27ac-antikroppen kan en jämförelse göras mellan de behandlade DMSO- och A-485-behandlade grupperna. Som framgår av figur 3C, A-485 minskar H3K27ac anrikning vid Cyclin D1 promotorn kontra DMSO-kontrollen med %Input metoden (representativt resultat av n =2). Viktigt är A-485 känt för att avsevärt minska H3K27ac i cellkultur2,4.

ChIP-qPCR rå %Input-värden kan vara mycket varierande mellan oberoende biologiska replikat, trots att den experimentella trenden är reproducerbar. Därför kan det vara bra att presentera data som en normaliserad procent av DMSO kontroll för att visa det reproducerbara förhållandet mellan kontroll och läkemedelsbehandling10. I figur 3D, nedreglerar A-485 till exempel avsevärt H3K27ac-beläggningen hos cyklin D1-promotorn (n=2). Statistisk analys baserades på Studentens t-test (*P < 0,05).

Figure 1
Figur 1: Anakaryrsyra hämmar p300 enzymatisk aktivitet i en HAT-analys. (A) Ett schematiskt diagram över HAT-analysen, som skildrar den enzymatiska reaktionen. (B) Anakarsyra hämmade potent p300 enzymatisk aktivitet och nedreglerad histonacetylation vid H3K18 och H3K9 vid 100 μM (körfält 5) kontra DMSO-kontrollbehandlingen (körfält 1). Lane 6 saknar Acetyl-CoA i reaktionen och fungerade som en negativ kontroll för histonacetylation. (C) Immunblotresultaten i (B) kvantifierades. Fold förändringar beräknades genom att jämföra bandet intensiteten av varje prov till bandet intensiteten av DMSO kontroll för varje acetylation sond. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: p300-hämmare A-485 dämpar potent hitonhyperacetylation i ChHAI-analysen. (A) Ett schematiskt diagram över ChHAI-analysen. (B) I MCF-7-celler, HDAC-hämmare MS-275 potent upregulated histonacetylation vid H3K18, K27 och K9 (lane 4) mot DMSO-kontrollen (lane 1). Tillägget av A-485, en känd p300 HAT-hämmare, med MS-275 försvagade ökningen av histonacetylation vid H3K18 och K27, men inte H3K9 (körfält 5-6 kontra lane 4). (C) Immunblotresultaten i (B) kvantifierades. Fold förändringar beräknades genom att jämföra bandet intensiteten av varje prov till bandet intensitet ms-275 ensam (Lane 4) för varje acetylation sond. Körfält 1-3 kvantifierades inte eftersom H3K18ac och H3K27ac basala nivåer inte upptäcktes. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: p300-hämmare A-485 minskar H3K27ac-nivåerna vid Cyklin D1-promotorn mätt med ChIP-qPCR. (A) Ett schematiskt diagram över ChIP-qPCR-protokollet. (B) Representativa qPCR Ct-värden för cyklin D1-promotorn för immunutjämningarna IgG och H3K27ac. IgG-kontrollen hade ett högre Ct-värde, vilket indikerar att H3K27ac-antikroppen framgångsrikt anrikat för H3K27ac över den icke-specifika IgG-antikroppen. (C) Behandling med A-485 (3 μM) för 24 h nedreglerad H3K27ac vid cyklin D1-promotorn i jämförelse med DMSO-kontrollbehandlingen i MCF-7-celler (representativt resultat av n=2). (D) %Inputen från två oberoende ChIP-experiment normaliserades till DMSO-kontrollen i procent av DMSO-kontrollen. Behandling med A-485 i MCF-7 celler minskar avsevärt H3K27ac beläggning vid Cyclin D1 promotorn. Statistisk analys baserades på Studentens t-test (*P < 0,05). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Buffert Recept
10X Glyinbuffert 18,74 g glycin med PBS tills löst och tillsätt PBS till 200 ml.
10X löpande buffert 250 mM Tris, 1,9 M glycin, 1% SDS
Lös 30,0 g Tris bas, 144,0 g glycin, och 10,0 g SDS i 1000 ml H2O. Buffertens pH-värde bör vara 8,3 och ingen pH-justering krävs. Förvara löpbufferten i rumstemperatur och späd till 1X före användning.
10X TBST 2,42 g Tris bas, 8g av NaCl, 2 ml 50% Tween 20, lägg ddH2O till 1 liter
1X TBST med 5% mjölk 5g mjölkpulver per cirka 100 ml 1X TBST
5X Analysbuffert: 500 mM HEPES, pH 7,5, 0,4 % Triton X-100
5X Passiv lysbuffert göra ett vattenhaltigt lager som innehåller 125 mM Tris, pH 7.8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg/ml BSA, 5% (vol/vol) Triton X-100 och 50% (vol/vol) glycerol i ddH2O.
6X Natrium Dodecyl Sulfat (SDS) 0,375 M Tris pH 6,8, 6 ml glycerol, 1,2 g SDS, 0,93 g 1,4-dithiothreitol (DTT), 6 mg bromophenol blå, tillsätt vatten till 10 ml.
ChIP-utspädningsbuffert 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl
ChIP Elueringsbuffert 1% SDS (w/v) och 0,1 M NaHCO3 i autoklaverad ddH2O
Komplett DMEM för MCF-7 Celler: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% bovint kalvserum (BCS), penicillin (10 enheter/ml), och streptomycin (10 mg/ml)
Hög salttvättbuffert 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl.
LiCl tvättbuffert 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxicholat, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0.
Låg salttvättbuffert 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl.
Nuclei svullnad buffert 5 mM rör pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40
SDS-lysbuffert 1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,0
TE-buffert 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA.
Överföringsbuffert 25 mM Tris, 190 mM glycin, 20% metanol och kontrollera pH och justera till pH 8,3 om det behövs.

Tabell 1: Recept av de buffertar och den lösning som används.

Kompletterande filer: Kompletterande experimentella scheman för protokoll 1-3. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lysinacetyltransferaser (KATs) acetylerar flera lysinrester på histonstjärtar och transkriptionsfaktorer för att reglera gentranskription2,3. Arbete under de senaste två decennierna har visat att KATs, såsom CBP/p300, PCAF och GCN5, interagera med onkogena transkriptionsfaktorer och bidra till att driva tumörtillväxt i flera solida tumörtyper4,5,9,15,16,17,18. På grund av deras framväxande roll i att främja tumörtillväxt, KATs utreds som nya mål i cancerbehandling. Nya KAT-hämmare (KATi) måste noggrant och noggrant testas för styrka, selektivitet och säkerhet innan de flyttar för att använda på kliniken. Nya rön har visat att tidigare beskrivna KATi föreningar uppvisar utanför måleffekter och var dåligt kännetecknas innan de används i stor utsträckning i den vetenskapliga litteraturen som kemiska sonder21. Därför behövs rigorösa metoder för KATi-karakterisering. Beskrivs här är tre protokoll som kan användas tillsammans för att karakterisera och validera nya hämmare inriktning hiton acetyltransferas (HAT) funktion av KATs: en in vitro HAT-analys, den ChHAI analys, och ChIP-qPCR. Dessa protokoll använder CBP/p300 och deras hämmare som exempel, men dessa metoder kan enkelt anpassas för framtida tillämpning vid undersökning av andra KATs.

HAT-analysen är enkel och ett kostnadseffektivt sätt att skärmföreningar för potens i att hämma HAT-funktion i ett provrör. Renat HATs (antingen rekombinanta4,10 eller immunoprecipitated40) kan testas i denna analys, men rekombinant CBP/p300 används som exempel i detta protokoll. CBP/p300 har en enzymatisk HAT-domän som överför en acetylgrupp från Acetyl-CoA till en lysinrester på ett målsubstrat3. De mest karaktäriserade CBP/p300-histonmålen är Histone 3 Lysin 18 och 27 (H3K18 respektive H3K27)2,3,10,11. I HAT-analysen inkuberas den renade p300 HAT-domänen med Acetyl-CoA och Histone 3.1 som substrat. Under inkubationstiden kommer p300 att katalysera acetylation på flera H3.1-rester inklusive H3K18 och H3K27. Den relativa överflödet av acetylation på dessa rester kan mätas via immunoblotting. Denna provrörsreaktion kan användas för att screena för nya föreningar som binder till p300 och hämmar dess HAT-aktivitet (HATi). Till exempel, anakarsyra, en känd HATi38, potent nedreglerar histonacetylation vid både H3K18 och H3K9 i jämförelse med DMSO-kontrollen (Figur 1B, lane 5 mot körfält 1). Det är av avgörande betydelse att lägga acetyl-CoA till de experimentella reaktionerna (Figur 1B, Lanes 1-5) eller p300 katalys av histonacetylation kommer inte att inträffa (Figur 1B, Lane 6). Frånvaron av Acetyl-CoA kan också användas som en negativ kontroll för p300 katalys och för basala nivåer av histonacetylation på rekombinant H3.1.

När MAN utför HAT-analysen är det viktigt att säkerställa att varje reaktion får samma mängd p300, H3.1 och Acetyl-CoA. H3.1- och p300-nivåerna i immunoblot-halten fungerar som lastningskontroller för gelen. För denna analys kan platsspecifika hitonacetylantikroppar eller en pan-acetyl-antikropp användas för immunoblottering. Vid optimering för att förbättra immunoblotkvaliteten är det avgörande att använda validerade antikroppar för immunoblotting och att initialt följa tillverkarens rekommendationer för antikroppsutspädning. De antikroppsutspädningar som används i avsnittet Protocol är som referens och spädningarna kan ändras utifrån resultaten från inledande experiment (t.ex. om signalen är för stark kan antikroppen spädas ytterligare). På grund av sin enkelhet är HAT-analysen ett utmärkt startexperiment för screening av nya hämmare. Dock har HAT-analysen nackdelar. Ett stort bekymmer med HAT-analysen är att föreningar som är effektiva i ett provrör kan visa sig vara ineffektiva i ett levande system. Detta är en fråga eftersom sammansatt effekt i cellodling kan ändras av cellulära permeabilitet frågor, cellulär metabolism, och sammansatta stabilitet. Dessutom har KATs, specifikt CBP/p300, många protein-protein interaktioner som reglerar deras KAT aktivitet i cellodling3,41,42. Därför är det viktigt att ytterligare karakterisera hämmare som identifieras i HAT-analysen i cellodlingsexperiment20,23.

Den Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analys är det andra protokollet i pipelinen och är användbart för att validera effekterna av nya hämmare i cellodling. Denna analys utnyttjar HDAC-hämmare (HDACi)24 för att inducera hitonhyperacetylation i celler eftersom basal acetylering kan vara för låg för att upptäcka på en immunoblot. De cellinjer val är förinkuberade med en HDACi att möjliggöra ansamling av acetylerat kromatin före tillsats av en HATi. Efter co-inkubering av HDACi och HATi, cellerna är lysed och utsätts för standard immunoblotting förfaranden för specifika histon acetylation platser. Syftet med denna analys är att bestämma effekten av romanen HATi för förmildrande histon hyperacetylation inducerad av HDACi. Celler som exponeras för HDACi bör ha betydligt högre nivåer av histonacetylation än celler som exponeras för DMSO-lösningsmedlet (Figur 2B, lane 4 mot körfält 1). Tillägg av HATi tillsammans med HDACi förväntas minska immunoblot signalen i jämförelse med HDACi behandling ensam (Figur 2B, körfält 5-6 kontra körfält 4). Basala nivåer av histonacetylation (Figur 2B, Lanes 1-3) är svåra att upptäcka och belyser vikten av att lägga till en HDACi i detta protokoll. MS-275 (Entinostat) används som exempel men andra HDACi kan användas24,43. MS-275 har variabel rapporterade hämmande koncentrationer kontra klass I HDACs och i allmänhet hämmar HDAC1 och HDAC3 med nanomolar till låga mikromolarkoncentrationer, respektive43,44. Ett brett spektrum av MS-275 koncentrationer används ilitteraturen 45,46,47, men en 3 μM behandling ger en robust och reproducerbar ökning av histonacetylation i MCF-7 celler. Därför kan det vara fördelaktigt att utföra en inledande skärm med ett brett spektrum av HDACi och HATi koncentrationer för att bestämma den optimala koncentrationen för ChHAI-analysen när du använder en annan cellinje.

I likhet med HAT-analysen kan immunblotprotokollet behöva optimeras för att erhålla kvalitetsresultat genom användning av lämpliga antikroppar, optimala antikroppspädningar och noggrant kontrollerad provbelastning. Noggrant kontrollerad provbelastning är avgörande för att detta protokoll ska lyckas och kan uppnås genom att proteininnehållet i alla prover och genom pipettering av lika stora provvolymer kan uppnås i immunblotgelens brunnar. En pan-acetyl-antikropp kan användas för probing i detta protokoll. Det bör dock kompletteras med platsspecifika acetylantikroppar eftersom KATs har specificitet för vissa histonlysinrester och HATi påverkar inte alla histonacetylationsställen icellodlingen 1,2,4,5,10,11. Hämmare som är potenta på att minska histonacetylation i både HAT och ChHAI analyser är starka kandidater för ytterligare utvärdering. Viktigt, HAT och ChHAI analyser har begränsningen att endast tillhandahålla data om globala förändringar i histon acetylering. Denna begränsning skapar behovet av att karakterisera effekterna av romanen HATi vid specifika regioner i arvsmassan.

Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) är det slutliga protokollet i pipelinen och utvärderar DNA-protein interaktioner vid specifika regioner i arvsmassan. I denna analys renas genomiska regioner berikade i H3K27ac genom immunoprecipitation (IP) och analyseras med hjälp av DNA-primers i qPCR. Denna teknik ger mekanistisk inblick i hur HATi påverkar histonmodifieringar hos genpromotorer och förstärkare. ChIP-qPCR är en robust teknik och är mindre kostsam än hel-genomsekvensering (t.ex. ChIP-seq), men det kan vara svårt att optimera på grund av många steg som påverkar resultatet. Det svåraste steget att korrekt optimera är steg 3.5, den immunoprecipitation. Detta steg är svårt att optimera eftersom om den renade DNA i steg 3.5.20 är mycket utspädd det kan orsaka dåliga resultat i qPCR reaktionen (t.ex. ingen förstärkning av målet gensekvens och mycket höga ΔCt värden). IP-stegets framgång är beroende av flera faktorer, såsom proteinmålets överflöd av intresse och IP-antikroppens kvalitet. Det är avgörande att validera kvaliteten på IP H3K27ac-antikroppen kontra IgG-kontrollen för att verifiera ip-stegets framgång. I figur 3Bvisar exempelvis den specifika antikroppen H3K27ac 632,73-faldig anrikning över den icke-specifika IgG-kontrollen. Detta indikerar att H3K27ac-antikroppen är hög kvalitet och att H3K27ac är berikad vid cyklin D1-promotorn. Efter validering av IP-antikroppen kan en jämförelse göras mellan de behandlade grupperna DMSO och A-485. Som framgår av figur 3C, A-485 minskar H3K27ac anrikning vid Cyclin D1 promotorn kontra DMSO-kontrollen med %Input metoden (representativt resultat av n =2). Om IP-antikroppen visar sig vara låg kvalitet och inte visar vikberikning i inledande experiment, försök öka celltalen i steg 3.2.1. Högre celltal kan bidra till att kompensera för dålig antikroppskvalitet genom att öka den totala proteinhalten i lysate och kommer att tillåta mer protein som ska läggas till IP-reaktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter eller upplysningar att göra.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av bidrag från James och Esther King Biomedical Research Program (6JK03 och 20K07), och Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 och 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, och UF Health Cancer Center. Dessutom vill vi tacka Dr Zachary Osking och Dr Andrea Lin för deras stöd under publiceringsprocessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Tags

Cancerforskning lysinacetyltransferaser KATs CBP/p300 hitonacetyltransfashämmare screeningmetoder histonacetylation epigenetik cancer genreglering
Analyser för validering av Histone Acetyltransferas hämmare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for… More

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter