Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61289
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Summary

Histon asetiltransferaz inhibitörleri (HATs, ayrıca lizin asetiltransferazolarak da bilinir), CBP/p300 gibi, kanser tedavisi için potansiyel tedavi vardır. Ancak, bu inhibitörleri doğrulamak için sıkı yöntemler gereklidir. Doğrulama için üç in vitro yöntem rekombinant asetiltransferazlar ile HAT tahlilleri dahil, hücre kültüründe histon asetilasyon için immünoblot, ve ChIP-qPCR.

Abstract

Lizin asetiltransferazlar (KATs) kromatin dinamiklerini ve gen ekspresyonunu düzenlemek için histones ve diğer proteinler üzerindeki lizin kalıntılarının asetilasyonını katalizler. CBP/p300 gibi KAT'lar, çeşitli kanserlerin tümörigenezindeki kritik rollerinden dolayı terapötik hedefler olarak yoğun bir araştırma altındadır. KAT'ların histon asetiltransferaz (HAT) fonksiyonunu hedefleyen yeni küçük molekül inhibitörlerinin geliştirilmesi zordur ve potansiyel inhibitörlerin özgüllüğünü ve gücünü doğrulayabilen sağlam tahliller gerektirir.

Bu makalede, yeni HAT inhibitörleri (HATi) için titiz in vitro doğrulama sağlayan üç yöntemden oluşan bir boru hattı özetlenmiştir. Bu yöntemler arasında test tüpü HAT testi, Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) testi ve Kromatin İmmünen-kantitatif PCR (ChIP-qPCR) sayılabilir. HAT testinde, rekombinant HAT'ler bir test tüpü reaksiyonunda histones ile kuluçkaya yatırılır, histon kuyruklarında spesifik lizin kalıntılarının asetilasyonuna izin verilir. Bu reaksiyon bir HATi ile engellenebilir ve bölgeye özgü histon asetilasının göreceli düzeyleri immünoblotting ile ölçülebilir. HAT satoyonunda tanımlanan inhibitörlerin hücresel ortamda doğrulanmaları gerekir.

ChHAI testi, histon deasetilaz inhibitörü (HDACi) tarafından indüklenen histones'un sağlam hiperasetilasyonunun zayıflatılan yeni HATi'yi taramak için immünolotlama kullanır. Histon asetilasyonunun bazal düzeylerini immünoblotting yoluyla tespit etmek zor olabilir, çünkü bir HDACi eklenmesi yararlıdır.

HAT ve ChHAI tahlilleri histon asetilasyonundaki küresel değişiklikleri ölçer, ancak spesifik genomik bölgelerde asetilasyon hakkında bilgi vermez. Bu nedenle, ChIP-qPCR gen düzenleyici elementlerde histon asetilasyon düzeyleri üzerinde HATi etkilerini araştırmak için kullanılır. Bu histon-DNA komplekslerinin selektif immünopresidasyon ve qPCR ile saflaştırılmış DNA analizi ile gerçekleştirilir. Birlikte, bu üç tahliller özgüllük, potens ve roman HATi eylem mekanizması dikkatli doğrulama için izin verir.

Introduction

Lizin asetiltransferazlar (KATs) hem histon hem de histon olmayan proteinler11,2,3,4lizin kalıntılarının asetilasyon katalaz. Son araştırmalar KATs ve asetiltransferaz fonksiyonu katı tümör büyümesini teşvik edebilir ortaya koymaktadır4,5,6,7,8,9. Örneğin, CREB bağlayıcı protein (CBP)/p300 kanser çok sayıda sinyal yollarını düzenleyen iki paralog KATsvardır 2,3. CBP/ p300 iyi histon asetiltransferaz karakterize var (HAT) fonksiyonu ve histon katalize 3 Lizin 27 asetilasyon (H3K27ac)2,4,5,10,11, aktif arttırıcılar için önemli bir belirteç, organizatör bölgeleri ve aktif gen transkripsiyon12,13,,14. CBP/p300, mitaşlar ve diğer transkripsiyon faktörlerinin asetilasyonu ile onkogenlerin transkripsiyonaktik tarafından katı tümörlerde pro-büyüme sinyal yolları için kritik ko-aktivatörler olarak hizmetvermektedir 4,9,15,16,17,18. Tümör ilerlemesindeki rollerinden dolayı, CBP/p300 ve diğer KAT'ler onkojenik fonksiyonlarını engelleyen yeni inhibitörlerin gelişimi için araştırma altındadır4,5,6,7,8,9,18,19,,20. A-485 ve GNE-049 CBP/p3004için güçlü ve spesifik inhibitörleri geliştirmek için iki başarılı girişimleri temsil,9. Ek inhibitörleri şu anda CBP/p300 ve diğer KATs için soruşturma altındadır.

Daha önce açıklanan KAT inhibitörlerinin (KATi) kalitesi sorgulanıyor, birçok inhibitör hedef etkileri ve kötü karakterizasyonu gösteren21. Bu nedenle, yeni ilaç adaylarının titiz karakterizasyonu ve doğrulanması yüksek kaliteli kimyasal probların geliştirilmesi için gereklidir. Burada özetlenen tarama için bir boru hattı oluşturan ve titizlikle potens ve yeni KATi özgüllüğü doğrulayan üç protokolleri, HAT fonksiyonu inhibe belirli bir odak ile (HATi) KATs. CBP/p300 ve inhibitörleri örnek olarak kullanılır, ancak bu protokoller HATfonksiyonu7 olan diğer KAT'lar için uyarlanabilir.

İlk protokol, kontrollü test tüpü reaksiyonunda saflaştırılmış rekombinant p300 ve histones kullanan in vitro histone asetilea (HAT) testidir. Bu testi gerçekleştirmek kolaydır, maliyet-etkindir, bileşikleri düşük iş ortamında taramak için kullanılabilir ve radyoaktif maddeler gerektirmez. Bu protokolde, rekombinant p300 kısa bir kuluçka döneminde histon kuyruklarında lizin asetilasyonunu katalizler ve histon asetilasyon düzeyleri standart immünoblotlama prosedürleri kullanılarak ölçülür. Enzimatik reaksiyon histon asetilasyonu azaltan bileşikleri taramak için CBP/p300 inhibitörlerinin varlığında veya yokluğunda gerçekleştirilebilir. Ayrıca, HAT tsay yeni bileşikler CBP / p300 için seçici olup olmadığını doğrulamak için pcaf gibi diğer saflaştırılmış KATs karşı faaliyetlerini değerlendirerek kullanılabilir. HAT tsay, basitliği, düşük maliyeti ve bir inhibitörün gücünü/seçiciliğini belirleme yeteneği nedeniyle yeni inhibitörleri araştırmak için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Nitekim, bu protokol genellikle bir in vitro ekran5,,10olarak literatürde kullanılır. Ancak, HAT testinde tanımlanan inhibitörler hücre kültüründe her zaman etkili değildir, çünkü bir test tüpü reaksiyonu yaşayan bir hücre sisteminden çok daha basittir. Bu nedenle, hücre kültürü deneylerinde inhibitörleri daha fazla karakterize etmek esastır22,23.

Boru hattındaki ikinci protokol Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) tetkiktir. Bu hücre bazlı test histon deasetilaz inhibitörleri kullanır (HDACi) bir HATi ile co-kuluçka önce kromatin histones hiperacetylate bir araç olarak24. Bazal histon asetilasyon hücre kültüründe düşük olabilir, zor asetilasyonu artırmak için bir HDACi eklenmesi olmadan immünoblotting yoluyla probe yapmak. ChHAI tsay amacı HDAC inhibisyonu neden histon asetilasyon artışı zayıflatmak yeni HATi belirlemektir. Bu testin avantajları düşük maliyet, göreceli performans kolaylığı ve test tüpü HAT testi daha fizyolojik alaka sağlar kültür, hücrelerin kullanımı içerir. HAT testindeki benzer şekilde, bu protokol veri toplama için standart immünoblotlama kullanır.

HAT ve ChHAI tahlilleri, küresel histon asetilasyonu inhibe etmek için yeni bileşiklerin potens hakkında veri sağlamak, ancak bu bileşiklerin belirli genomik bölgelerde modifikasyonları nasıl etkilediği hakkında fikir vermez. Bu nedenle son protokol olan Chromatin İmmünopan-nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ChIP-qPCR) genomun belirli bölgelerindeki DNA-protein etkileşimlerini araştıran bir hücre kültürü deneyidir. ChIP protokolünde, kromatin DNA-protein etkileşimlerini korumak için çapraz bağlanır. Kromatin daha sonra hücrelerden çıkarılır ve DNA-protein kompleksi ilgi proteini için selektif immünoprebata uğrar (örn. H3K27ac'a özgü bir antikor kullanılır). DNA daha sonra saflaştırılır ve qPCR kullanılarak analiz edilir. Örneğin, ChIP-qPCR yeni bir HATi'nin siklin D125gibi bireysel onkojenlerde histon asetiyonu aşağı yasedip düzenlemedığını belirlemek için kullanılabilir. ChIP-qPCR alanında kullanılan yaygın bir teknik olmakla birlikte,4,10,,26optimize etmek zor olabilir. Bu protokol, ChIP-qPCR yordamını gerçekleştirirken oluşabilecek olası tuzakları önlemek için ipuçları sağlar ve veriler üzerinde gerçekleştirilmesi gereken kalite kontrol denetimleri içerir.

Birlikte kullanıldığında, bu üç protokol leri sıkı karakterizasyonu ve roman HATi doğrulama sağlar. Ayrıca, bu yöntemler gerçekleştirmek kolay, nispeten ucuz ve küresel yanı sıra bölgesel histon asetilasyon veri sağlamak, çünkü birçok avantaj sunuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. In vitro HAT istif

  1. Arabellek hazırlığı
    NOT: Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakınız.
    1. 5x teşbi arabellek ve 6x Sodyum Dodecyl Sülfat (SDS) hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Aliquot SDS 1 mL aliquots içinde.
    2. 10x SDS jel çalışan tampon ve 10x TBST hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
    3. 1x transfer tamponu hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
      DİkKAT: Bu protokolde kullanılan tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin. SDS, DTT ve bromofenol mavisi toksiktir ve yutulmamalı, solunmamalı veya deriye veya gözlere maruz kalmamalıdır. Doğru işleme prosedürleri için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın. Lütfen tehlikeli kimyasallarla başa çıkmak için kimyasal bir duman başlığı kullanın.
  2. HAT tepkisi
    NOT: Anakardik asit bilinen bir p300 inhibitörü3'tur ve HAT analizinin yeni p300 inhibitörlerini nasıl tanımlayabileceğini göstermek için örnek olarak kullanılır. 1.2.1 adım şeması için Ek Protokol (Şematik 1)bölümüne bakın.
    1. 0,2 mL PCR tüpte aşağıdaki enzimatik reaksiyonu hazırlayın: 2 μL 5x teşrif arabellek, 1 μL saflaştırılmış p300 (0,19 μg/μL), 1 μL anakardik asit (HATi) veya DMSO kontrolü 1x teşrafa ile seyreltilmiş ve 2 μL otoklavd ddH2O. Pre-incubate karışımı 10 min sıcaklıkta bu karışımı. Daha sonra reaksiyona 3 μL 100 μM Asetil-CoA ve 1 μL saflaştırılmış H3.1 (0.2 g/μL) ekleyin.
    2. Tam reaksiyon karışımını 30 °C'de pcr termal döngüde 1 saat inkübedin.
    3. 6x SDS örnek tamponuna 1:10 oranında 2-mercaptoetanol ekleyin.
    4. PCR termal döngücüden numuneleri çıkarın ve reaksiyon karışımına 2 μL 6x SDS (2-mercaptoetanol eklendi) ekleyin.
      DİkKAT: 2-mercaptoetanol toksiktir ve kimyasal bir duman kaputu içinde kullanılmalıdır. Doğru kullanım için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın.
    5. Isı örnekleri 95 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika boyunca ve buz üzerinde soğutun. Numuneleri -20 veya -80 °C'de saklayın veya jel elektroforezi ve immünoblotlamayı aşağıda ayrıntılı olarak açıklanız.
  3. Jel elektroforez ve immünolot
    NOT: Jel elektroforezi ve immünoblotting için bu standart27 prosedür eğitimi 1.3.1-1.3.17 adlarının nasıl yapılacağına ilişkin ayrıntılı bilgi için bakın. Ek bilgi burada bulunabilir28,29,30,31,,32,33.
    1. Pipet 10 μL numuneler (adım 1.2.5.) bir 4-20% degrade poliakrilamid jel kuyuları içine. Pipet 5 μL protein merdiveni olarak kuyulardan birine moleküler ağırlık referansı olarak. Jel tankı kullanarak jeli 90 dk için 120 V'de çalıştırın.
    2. Jeli bir transfer tankı kullanarak 70 dk için 100 V'de polivinilidendiride (PVDF) membrana aktarın.
    3. Membranı transfer cihazından çıkarın ve plastik bir kapiçine yerleştirin. Konteynere 1x TBST (%5 süt içeren) ekleyerek membranı kesin ve oda sıcaklığında 1 saat hafifçe sallayın.
    4. 1x TBST adım 1.3.3 kaldırın. Membranı bir gecede seçilen bölgeye özgü asetil antikorları (örneğin, H3K18ac veya H3K27ac primer antikorlar 1x TBST'de %5 süt içeren 1:5.000 seyreltme) ilave edin.
    5. Birincil antikor solüsyonu çıkarın. Membranı oda sıcaklığında 1x TBST (süt yok) ile 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
    6. 1x TBST 1:20.000 ikincil antikor seyreltin (% 5 süt içeren) ve hafif sallayarak oda sıcaklığında 1 saat için membran kuluçka.
    7. İkincil antikor solüsyonu çıkarın. Membranı oda sıcaklığında 1x TBST (süt yok) ile 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
    8. Membrandan 1x TBST drenaj. HRP substrat peroksit çözeltisi ve HRP substrat luminol çözeltisini 1:1 oranında (her biri 1 mL) ve kombine çözeltinin 2 mL'sini membran yüzeyine karıştırın.
    9. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca membran ile çözelti kuluçka.
    10. Membrandan fazla kemilüminesan substratı kağıt havluya boşaltın ve membranı x-ray kaset tutucunun içine plastik şal içine yerleştirin.
    11. X-Ray film işleme adanmış karanlık bir odaya taşıyın. Filmi membranın üzerine yerleştirerek ve kaseti 30 s'ye kapatarak membranı bir x-Ray filmine maruz bırakın.
      NOT: Film ile membran arasındaki temas süresi deneysel olarak belirlenmelidir. Güçlü sinyaller kısa pozlama (saniye) ve zayıf sinyaller daha uzun pozlama gerekebilir gerekir.
    12. X-Ray filmini kasetten çıkarın ve bir x-ray film işlemcisi üzerinden çalıştırarak filmi işlayın. X-Ray filminin nasıl işlenir?
    13. Membranı plastik sargıdan çıkarın ve hafif sallayarak oda sıcaklığında 5 dk boyunca ddH2O ile yıkayın.
    14. Membranı 0,2 M NaOH ile 5 dakika oda sıcaklığında hafif çesitli titreyerek kuluçkaya yatırın.
    15. Membranı ddH2O ile 5 dk oda sıcaklığında hafif çesitli titreyerek yıkayın.
    16. Konteynere 1x TBST (%5 süt içeren) ekleyerek membranı kesin ve oda sıcaklığında 1 saat hafifçe sallayın.
    17. Bir sonraki birincil antikor seyreltmesini (örneğin, kullanılan ilk antikor H3K18ac ise H3K27ac için prob) ekleyin ve 4 °C'de bir gecede sallayın. Tüm antikor probları tamamlanana kadar 1.3.4-1.3.17 adımlarını tekrarlayın.

2. ChHAI teşp

  1. In vitro ilaç tedavileri ve asetitli histones analizi
    NOT: A-485 güçlü ve iyi karakterize p300 HATi2,4 . Bu inhibitör, hücre kültüründeki etkinliği ve özgüllüğü nedeniyle kalan tahlillerde kullanılacaktır. MS-275 (Entinostat)24 histon asetilasyon düzeylerini belirgin bir şekilde artıran ve standart immünoblotlama ile asetilasyon problarının daha kolay saptanmasını kolaylaştırmak için kullanılan bir HDACi'dir. Bkz. Ek Protokol (Şematik 2) 2.1. adımda kullanılan ilaç seyreltmelerinin şeması için.
    1. Tohum 100.000 MCF-7 hücreleri 12 iyi plaka ve hücrelerin hücre kültürü orta 1 mL içinde% 80-90 biraraya büyümeye izin verir. Aşağıdaki deneysel tasarım için kuyuları işaretleyin: iyi 1: DMSO kontrolü (referans noktası); iyi 2: A-485 (3 μM); iyi 3: A-485 (10 μM); iyi 4: MS-275 (3 μM); iyi 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); iyi 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      NOT: MCF-7 hücrelerinin kültüre atımı için tam DMEM ortamı kullanın ve hücrelerin %5 CO2ile 37 °C'de büyümesine izin verin. Komple DMEM tarifi için Tablo 1'e bakın.
    2. Tohumlamadan sonra 24 saat, pipet 4 mL tam DMEM media steril 15 mL konik tüp. Pipet 2 μL MS-275 (DMSO'da 6 mM) ile 4 mL orta son konsantrasyon için 3 μM MS-275.
    3. Pipet 2 μL DMSO ile 4 mL orta ayrı steril 15 mL konik tüp.
      DMSO'nun doğru şekilde işlenmesi için lütfen güvenlik veri sayfasını kontrol edin. Bazı eldiven tipleri DMSO kullanımı için derecelendirilmez.
    4. Hücre kültürünü her kuyuya orta (adım 2.1.2) halinde 3 μM MS-275 kuyularından 4-6 ve pipet 1 mL'den aspire edin. Kullanılmayan seyreltilmiş MS-275 atın.
    5. Hücre kültürünü her kuyuya seyreltilmiş DMSO'nun 1-3 ve pipet 1 mL'sinden (adım 2.1.3) aspire edin. Kullanılmayan seyreltilmiş DMSO atın.
    6. MS-275'e maruz kalan hücrelerde asetitli histones birikimine izin vermek için hücreleri kuvöze ve kuluçkaya yatırın 4 saat (kuyu lar 4-6).
      NOT: MS-275 bir HDACi ve histon hiperasetilasyon neden olur24. Bu 4 saat ön kuluçka MS-275 a-485 eklenmesinden önce hiperasetilasyon indüklemek için izin vermek için gereklidir, hangi histon asetilasyon azaltır2,4.
    7. MS-275 ile 4 saat kuluçkadan sonra, aşağıdaki seyreltmeleri ayrı steril 1,5 mL tüplerde pipetleme ile hazırlayın: 1.0 μL DMSO ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL A-485 (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL A-485 (20 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL MS-275 (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL A-485 (6 mM) ve 0,5 μL MS-275 (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL A-485 (20 mM) ve 0,5 μL MS-275 (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam.
    8. Hücre kültürünün ortasını kuyulardan 1-6 ve pipet 1 mL seyreltme 1'den 1'e, seyreltme 2'den 1'e, seyreltme 3'ten iyi ye 3'e, seyreltme 4'ten iyiye 4, seyreltme 5'ten iyi 5'e ve seyreltme 6'dan iyi 6'ya aspire edin.
      NOT: Genel bir kural, hücresel toksisite ve çoğalma değişikliklerini önlemek için hücre kültüründe %0,1 DMSO içeriğini geçmemek ve dmso (çözücü) içeriğini deneysel gruplar arasında dengelemektir.
    9. Hücreleri 20 saat boyunca kuvöze ve kültüre geri döndürün.
    10. 20 saat sonra hücre kültürünü 1-6 kuyudan aspire edin.
    11. 1-6 kuyuya 1 mL PBS boru tutarak hücreleri yıkayın. PBS'yi aspire edin.
    12. 1-6 kuyularına 100 μL 1x pasif lisis tamponu ekleyin (tablo 1'ebakınız). Hücrelerin dondurulması-çözülmesi ve pilisi için hücre kültür plakası (pasif lisis tamponunda örneklerle) bir gecede −80 °C'de saklayın.
      DİkKAT: Tampon yapmadan önce lütfen tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin. CDTA ciddi göz hasarı ve tahrişe neden olabilir.
    13. 10 dakika boyunca hafif sallayarak oda sıcaklığında eritme örnekleri. Örnekleri 1,5 mL'lik tüpleri ayırın ve hemen buza yerleştirin.
    14. Her numunenin protein konsantrasyonu ölçün. Protein konsantrasyonu birkaç köklü protokoller kullanılarak belirlenebilir34.
    15. Protein konsantrasyonu 1-6 (eşit hacimde) 1x pasif lisis tamponu kullanarak seyreltmek için, gerektiğinde protein konsantrasyonu dengeleyin.
    16. 6x SDS örnek tampon 1:10 oranında 2-mercaptoethanol ekleyin.
    17. 1-6 numunelere 2-mercaptoetanollü 6x SDS numune tamponu ekleyin ve 1x SDS numune tamponunun son konsantrasyonuna ekleyin.
    18. Isı örnekleri 95 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika boyunca ve buz üzerinde soğutun. Numuneler -20 °C veya -80 °C'de 2.1.19 adıma kadar saklanabilir.
    19. Pipet, %4-20 degrade liakrilamid jelde kuyulara 1-6 numune için 30 μg protein içeren bir hacimdir. Protokol 1'de açıklanan protokole göre immünolotlama işlemini gerçekleştirin.

3. ChIP-qPCR

NOT: Aşağıdaki protokol p300 inhibitörleri için örnek olarak açıklanmıştır.

  1. Arabellek hazırlığı
    NOT: Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakınız. ChIP protokolünün genel adımları (örn. tampon tarifleri, yıkama süreleri ve santrifüj süreleri) aşağıdaki modifiye edilip, üreticinin ticari olarak kullanılabilen bir kitin tavsiyelerinden (bkz. Malzeme Tablosu)veliteratürden 35,36.
    1. ChIP seyreltme tamponu, çekirdek şişme tamponu, düşük tuz yıkama tamponu, yüksek tuz yıkama tamponu, LiCl yıkama tamponu ve TE tamponunu hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
    2. Hazırlamak SDS lysis tampon, 10x glisin tampon ve ChIP elüsasyon tampon. Oda sıcaklığında saklayın.
      DİkKAT: Doğru kullanım sağlamak için tampon yapmadan önce lütfen tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin.
  2. İlaç tedavisi
    NOT: 3.2. adımda kullanılan ilaç seyreltmelerinin şeması için Ek Protokol (Şematik 3)bölümüne bakınız.
    1. İki 15 cm kültür tabaklarında TOHUM MCF-7 hücreleri ve tam DMEM orta 12 mL% 90 biraraya hücreleri büyümek. Aşağıdaki deneysel tasarım için yemekleri işaretleyin: Çanak 1: DMSO kontrolü (referans noktası); Çanak 2: A-485 (3 μm).
      NOT: MCF-7 hücrelerinin kültüre atımı için komple DMEM ortamı kullanın ve %5 CO2ile 37 °C'de büyüyün. Komple DMEM tarifi için Tablo 1'e bakın.
    2. Steril 15 mL konik boruda, pipet 12 mL DMEM media ve pipet 6 μL DMSO. İyi bir şekilde karıştırın.
    3. Ayrı bir steril 15 mL konik tüpte, 3 μM A-485'lik son konsantrasyonu elde etmek için 12 mL DMEM ortam ve 6 μL A-485 (DMSO'da 6 mM) pipet. İyi bir şekilde karıştırın.
    4. Çanak 1 ve 2'den medyayı aspire edin.
    5. DMEM'deki seyreltilmiş DMSO'nun 12 mL'sini (adım 3.2.2.) Çanak 1'e ekleyin.
    6. DMEM'deki 3 μM A-485'in 12 mL'sini (adım 3.2.3.) Çanak 2'ye ekleyin.
    7. Hücre kültürü yemeklerini 24 saat boyunca kuvöze ve kuluçkaya yatırın.
  3. Hücre fiksasyonu
    1. Pipet 330 μL (mL başına 27,5 μL) tam ortama % 37 formaldehit ve yavaşça karıştırmak için plaka girdap.
      DİkKAT: Formaldehit toksiktir. Doğru işleme prosedürleri için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
    3. Pipet 2 mL 10x glisin plaka ve karıştırmak için girdap.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
    5. Kuluçkadan sonra, buz üzerine tabakyerleştirin ve proteaz inhibitörü kokteyl bir aliquot çözültün.
    6. Adım 3.1'de hazırlanan tamponları kullanarak hem DMSO hem de A-485 numuneleri için aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
      1. Proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesi ile 2 mL PBS
      2. Proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesi ile 1 mL çekirdek şişme tamponu
      3. Proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesi ile 0,5 mL SDS lysis tampon
    7. Hücre kültürü tabaklarından medyayı aspire edin ve hücreleri 15 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
    8. Pilette 2 mL PBS proteaz inhibitörü kokteyli (adım 3.3.6.1) ile hücre kültürü yemekleri. Hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak çözeltiye kaldırın.
    9. Hücre süspansiyonuna mikrosantrifüj tüpü aktarın. Gerekirse ek PBS ile kalan hücreleri toplayın.
    10. Hücreleri peletlemek için 5 dakika boyunca 4 °C'de 800 x g'de dönme tüpleri.
    11. Proteaz inhibitörü kokteyli (adım 3.3.6.2) ile çekirdeklerin şişme tamponunun süpernatant ve pipet 1 mL'sini pelete aspire edin. Pelet işarj edin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
    12. Tüpleri 2.700 x g 4 °C'de 5 dk ve pelet çekirdekleri için santrifüj edin.
    13. SDS lysis tamponunun süpernatant ve pipet0.5 mL'ini proteaz inhibitörü kokteyli (adım 3.3.6.3) ile pelete aspire edin. Pelet işarj edin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
    14. Kromatin örneklerini -80 °C'de 3.4.1 adıma kadar saklayın veya hemen 3.4 adıma geçin.
  4. DNA sonication
    1. DMSO örneğinden (adım 3.3.14) 130 μL kromatini bir pipet (her biri 130 μL) kullanarak iki DNA sonication tüpüne aktarın.
    2. A-485 örneğinden (adım 3.3.14) 130 μL kromatini pipet (her biri 130 μL) kullanarak iki DNA sonication tüpüne aktarın.
    3. Aşağıdaki sonicator ayarlarını kullanarak DNA'yı kabaca 150-200 baz çifti parçalarına sonikle bakın: 175'lik Peak Incident Power (W), %10'luk Görev Faktörü, Patlama başına 200 Döngü ve 430's tedavi süresi.
      NOT: Sonication ayarları modelleri arasında farklılık gösterebilir ve ayarları farklı hücre hatları için uygun parça boyutu elde etmek için ayarlanması gerekebilir.
    4. Sonication sonra buz üzerinde örnekleri tutun.
    5. Sonicated kromatini 1,5 mL'lik bir tüpe pipet ve santrifüj kullanarak 10.000 x g'de 4 °C'de 10 dk için pelet enkazına aktarın.
    6. Pipet supernatant (sonicated kromatin içerir) yeni bir tüp ve enkaz atın. Sonicated kromatin -80 °C'de saklanabilir.
  5. Kromatin immünopresipite (ChIP)
    NOT: Adım 3.5'teki IP gruplarının şeması için Ek Protokol (Şematik 3)bölümüne bakın.
    1. Adım 3.4.6'dan DMSO ve A-485 örnekleri için sonicated kromatin protein içeriğini ölçün. Protein içeriği köklü protokoller kullanılarak ölçülebilir34.
      NOT: Basitlik için bu protokol protein içeriğinin eşit olduğunu varsayacak ve 100 μL sonicated kromatin kullanılacaktır. Aksi takdirde, protein içeriği eşit hacimde tüm numuneler arasında dengelenebilir gerekir.
    2. Pipet 100 μL DMSO sonicated kromatin iki 1,5 mL tüpler (100 μL her). Toplam hacmi 500 μL'ye kadar çıkarmak için her tüpe ChIP seyreltme tamponunun (1:1.000 seyreltme içeren) pipet 400 μL'si.
    3. Pipet 100 μL A-485 sonicated kromatin iki 1,5 mL tüpler (100 μL her). Pipette 400 μL ChIP seyreltme tamponu (proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1000 seyreltilmesini içeren) her tüpe toplam hacmi 500°L'ye kadar getirin. Çözeltinin 5 μL'ini tüplerden çıkarın ve -20 °C'de A-485 Girişi olarak saklayın.
    4. Bir pipet kullanarak, DMSO ve A-485 örnekleri için ilgili tüplere immünopresipitasyon (IP) antikor (örn. spesifik olmayan IgG kontrolü veya H3K27ac spesifik antikor) ekleyin: IGG antikorlu IP #1 DMSO kromatini (5-10 μg); IP #2 H3K27ac antikorlu DMSO kromatin (5-10 μg); IP #3 IgG antikorlu A-485 kromatin (5-10 μg); IP #4 H3K27ac antikorlu A-485 kromatin (5-10 μg).
    5. Her tüpe 20 μL protein ekleyin Bir manyetik boncuk ekleyin. Boncukların tekrar askıya alındıklarının iyi bir şekilde askıya alınmasından emin olun.
    6. Numuneleri bir gecede 4 °C'de döndürün.
    7. Pelet protein Manyetik ayırıcı kullanarak manyetik boncuklar ve supernatant kaldırın. Boncukları rahatsız etmeyin.
    8. Boncukları 500 μL ile 1 mL arasında düşük tuz yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
    9. Boncukları 500 μL ile 1 mL arasında yüksek tuz yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
    10. Boncukları 500 μL ile 1 mL arasında LiCl yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
    11. Boncukları 500 μL ile 1 mL TE tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın. Adım 3.5.14 kadar TE tampon boncuk tutun.
    12. Giriş örneklerini (adım 3.5.2 ve 3.5.3)'den) dondurucudan çıkarın ve buzda tutun.
    13. Proteinaz K'nin bir aliquot'unu erit.
    14. Manyetik ayırıcı kullanarak boncukları peletve boncuklardan TE tamponu çıkarın (adım 3.5.11).
    15. Giriş örnekleri de dahil olmak üzere her numuneye 100 μL ChIP elüsyon tamponu + 1 μL Proteinaz K ekleyin. Bir termocycler kullanarak 2 saat için 62 °C'de sallayarak inküter örnekleri.
    16. 2 saat sonra, ısı örnekleri 95 °C için 10 dakika bir termocycler kullanarak.
    17. Örnekleri oda sıcaklığına kadar soğutun.
    18. Manyetik ayırıcı kullanarak pelet manyetik boncuklar ve transfer supernatant (ilgi DNA içerir) yeni bir 1.5 mL tüp.
    19. Standart bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA'yı arındırın.
    20. Saflaştırılmış DNA -20 °C'de saklanabilir ve standart qPCR protokollerinde şablon olarak kullanılabilir. QPCR çalıştırmak için üretici protokollerini izleyin.
  6. ChIP-qPCR veri analizi
    NOT: ChIP-qPCR sonuçlarını analiz etmek için iki yaygın yöntem IgG antikor ve% 1 Giriş yöntemi üzerinde kat zenginleştirme vardır. Her iki analiz yöntemleri için mükemmel bir şablon hızlı bir şekilde her IP antikor / faiz hedef37için kat zenginleştirme hesaplamak için ticari bir kaynak tarafından sağlanmaktadır.
    1. Kat zenginleştirme ve % Girişi hesaplamak için, analiz şablonundaki ilgili bölgeye her bir antikor (spesifik olmayan IgG, IP H3K27ac antikor ve %1 Giriş) için elde edilen qPCR verilerinden ΔCt değerlerini kopyalayıp yapıştırın ve Kat Zenginleştirme ve Verim % Girdiotomatik olarak doldurulacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro histon asetiltransferaz (HAT) tsuraj ı, p300 HAT aktivitesini histon substrata doğru inhibe eden bileşikleriçin prob için kullanılabilir. Şekil 1A, HAT tsurciçin deneysel bir şema sağlar. Anakardik asit, bilinen BIR HATi3,38, 12.5-100 μM arasında bir konsantrasyon aralığında bu titretinde kullanılmıştır. 100 μM'de, anakardik asit histon 3, Lizinler 9 ve 18'de histon asetilasyonunu katalize eder (Şekil 1B, şerit 5 şerit 1' e karşı). Düşük ilaç dozları büyük ölçüde p300 HAT aktivitesini inhibe olmayabilir çünkü bir konsantrasyon aralığı bu teşriyi kullanılmıştır(Şekil 1B, lanes 2-4 karşı şerit 1). Lane 6'da reaksiyona asetil-CoA eklenmedi ve p300 kataliz ve rekombinant H3.1'de histon asetilasyonunun bazal düzeyleri için negatif kontrol görevi görüyor (Şekil 1B). p300 ve H3.1 protein düzeyleri yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır (Şekil 1B). Bu immünoblot sonuçları ImageJ39 (Şekil 1C)kullanılarak ölçüldü. Kat değişimleri, her numunenin bant yoğunluğu ile her asetilasyon probu için DMSO kontrolünün bant yoğunluğu ile karşılaştırılarak hesaplanmıştır. 100 μM'de anakardik asit için nicelik, DMSO kontrolüne karşı H3K18ac ve H3K9ac'ta güçlü bir azalma gösterir ve Şekil 1B'dekigörsel sonuçları doğrular.

Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) kontrolünde HDACi, bir HATi24ile eş kuluçkadan önce kromatindeki histones'u hiperasetiletmek için bir araç olarak kullanılır , örneğin p300 inhibitörü A-4852,4. Bu tetkikin amacı HDACi tarafından indüklenen histon hiperasetilasyonu zayıflatmak için HATi etkinliğini belirlemektir. Şekil 2A, ChHAI tsurciçin deneysel bir şema sağlar. Bu töhlükte, Histon 3'te HDACi MS-275 ile MCF-7 hücrelerinin tedavisi, birkaç lizin kalıntısı üzerinde(Şekil 2B, şerit 4 şerit 1' e karşı). H3K18ac ve H3K27ac bazal düzeyleri düşüktü, ChHAI tsurel bir HDACi eklemenin faydalarını gösteren(Şekil 2B, şeritler 1-3). MS-275 ile A-485 eklenmesi H3K18 ve H3K27 artan histon asetilasyon zayıflatır, ancak H3K9(Şekil 2B, şeritler 4-6) zayıflatır. Daha da önemlisi, H3K9ac hücre kültürü2p300 tarafından düzenlenir değildir , Bu deneyde A-485 özgüllüğünü gösteren. Bu immünoblot sonuçları Şekil 2C'deölçüldü. Kat değişimleri, her numunenin bant yoğunluğuile her asetilasyon probu için tek başına MS-275 'in (Lane 4) bant yoğunluğuile karşılaştırılarak hesaplandı. H3K18ac ve H3K27ac bazal düzeyleri tespit edilmediği için 1-3 şerit sayısallaştırılmadı.

Kromatin İmmünopan-kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ChIP-qPCR), genomun belirli bölgelerindeki DNA-protein etkileşimlerini araştıran bir hücre kültürü deneyidir. Onkogen ekspresyonunu kontrol eden gen düzenleyici elemanlarda HATi'nin etkilerini araştırmak için kullanılabilir25. Şekil 3A, ChIP-qPCR protokolü için deneysel bir şema sağlar. 24 saat boyunca 3 μM A-485 ile tedavi edilen MCF-7 hücreleri H3K27ac'ta zenginleştirilmiş histon-DNA komplekslerinin immünopresidibatasyon yoluyla ChIP-qPCR'ye tabi tutuldu (Şekil 3). Saflaştırılmış DNA Cyclin D1 promotör dizisi için analiz edildi. ChIP-qPCR astarlar genomdaki belirli bir DNA dizisine karşı tasarlanmıştır ve çökelmiş DNA'nın göreceli miktarını tespit etmek için kullanılır. Çökelmiş DNA miktarı, araştırılan genomik bölgede ilgi proteininin bolluğunu yansıtır. Nitekim, DMSO örneğinde, IgG kontrol antikortarafından çökeltilen DNA, Siklin D1 promotörü için qPCR reaksiyonundaki H3K27ac antikordan daha yüksek bir Ct değeri üretir (Şekil 3B). Bu non-spesifik IgG kontrolü Siklin D1 organizatörü h3K27ac spesifik antikor daha az DNA-protein kompleksleri çöktürülmüş olduğunu gösterir. Bu non-spesifik IgG kontrolü(Şekil 3B)üzerinde H3K27ac 632,73 kat zenginleştirme anlamına gelir.

Bu kat zenginleştirme, H3K27ac spesifik antikor başarıyla immünoppresipitated asetillated histones ve H3K27ac Cyclin D1 organizatörü zenginleştirilmiş olduğunu kanıt sağlar. H3K27ac antikor kalitesini nitedikten sonra DMSO ve A-485 tedavi edilen gruplar arasında karşılaştırma yapılabilir. Şekil 3C'degösterildiği gibi, A-485 % Giriş yöntemi (n=2 temsili sonucu) kullanarak DMSO kontrolü ne karşı Cyclin D1 organizatörü nde H3K27ac zenginleştirme azaltır. Daha da önemlisi, A-485 önemli ölçüde hücre kültürü2H3K27ac azaltmak için bilinmektedir,4.

ChIP-qPCR ham %Girdi değerleri, deneysel eğilimin tekrarlanabilir olmasına rağmen bağımsız biyolojik kopyalar arasında son derece değişken olabilir. Bu nedenle, kontrol ve ilaç tedavisi10arasındaki tekrarlanabilir oranı göstermek için DMSO kontrolünün normalleştirilmiş bir yüzdesi olarak veri sunmak yararlı olabilir. Örneğin, Şekil 3D'deA-485, Cyclin D1 organizatöründeki H3K27ac doluluk oranını önemli ölçüde düşürebilir (n=2). İstatistiksel analiz, Öğrencinin t-testine (*P < 0.05) dayanmaktadır.

Figure 1
Şekil 1: Anakardik asit, HAT analizinde p300 enzimatik aktivitesini inhibe eder. (A) HAT suresinin enzimatik reaksiyonu gösteren şematik diyagramı. (B) Anakardik asit p300 enzimatik aktivitesini güçlü bir şekilde inhibe etti ve H3K18 ve H3K9'da 100 μM 'de (şerit 5) DMSO kontrol tedavisine karşı histon asetilasını dindüşürdü (şerit 1). Lane 6 reaksiyona Asetil-CoA yoksun ve histon asetilasyon için olumsuz bir kontrol olarak görev yaptı. (C) (B) immünoblot sonuçları sayısallaştırılmıştır. Kat değişimleri, her numunenin bant yoğunluğu ile her asetilasyon probu için DMSO kontrolünün bant yoğunluğu ile karşılaştırılarak hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: p300 inhibitörü A-485 ChHAI satografyasında histon hiperasetiliyi güçlü bir şekilde zayıflatır. (A) ChHAI tsurcunun şematik diyagramı. (B) MCF-7 hücrelerinde, HDAC inhibitörü MS-275 H3K18, K27 ve K9'da (şerit 4) DMSO kontrolüne (şerit 1) karşı güçlü bir şekilde histon asetilasyonu nasibini yükseltmiştir. Ms-275 ile bilinen bir p300 HAT inhibitörü olan A-485'in eklenmesi H3K18 ve K27'de histon asetilasyondaki artışı zayıflatmış, ancak H3K9'da (şerit 5-6 şeritli 4) zayıflatmamak. (C) (B) immünoblot sonuçları sayısallaştırılmıştır. Kat değişimleri, her numunenin bant yoğunluğuile her asetilasyon probu için tek başına MS-275 'in (Lane 4) bant yoğunluğuile karşılaştırılarak hesaplandı. H3K18ac ve H3K27ac bazal düzeyleri tespit edilmediği için 1-3 şerit sayısallaştırılmadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: p300 inhibitörü A-485, ChIP-qPCR ile ölçülen Siklin D1 promotöründe H3K27ac düzeylerini düşürür. (A) ChIP-qPCR protokolünün şematik diyagramı. (B) IgG ve H3K27ac immünopresiyağışları için Siklin D1 promotörü için temsili qPCR Ct değerleri. IgG kontrolü daha yüksek bir Ct değerine sahipti, bu da H3K27ac antikorun spesifik olmayan IgG antikorüzerinde H3K27ac için başarıyla zenginleştirilmiş olduğunu gösteriyordu. (C) A-485 (3 μM) tedavi 24 h downregulated H3K27ac için Cyclin D1 organizatörü MCF-7 hücrelerinde DMSO kontrol tedavisi ile karşılaştırıldığında (n= 2 temsilcisi sonucu). (D) İki bağımsız ChIP deneyinden elde edilen %Giriş, DMSO kontrolünün bir yüzdesi olarak DMSO kontrolüne normalleştirildi. MCF-7 hücrelerinde A-485 ile tedavi önemli ölçüde cyclin D1 organizatörü h3K27ac doluluk düzenler. İstatistiksel analiz, Öğrencinin t-testine (*P < 0.05) dayanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Arabellek Tarifi
10X Glisin tamponu Çözünmüş kadar PBS ile glisin 18.74 g ve 200 ml PBS ekleyin.
10X Çalışan Arabellek 250 mM Tris, 1.9 M glisin, %1 SDS
Tris baz 30.0 g, glisin 144.0 g ve H2O 1000 ml SDS 10.0 g çözünür. Arabelleğe ait pH 8.3 olmalıdır ve pH ayarı gerekmez. Çalışan tamponu oda sıcaklığında saklayın ve kullanmadan önce 1X'e kadar seyreltin.
10X TBST Tris baz 2.42 g, NaCl 8g, 2 ml 50% Tween 20, 1 litre ddH2O ekleyin
%5 sütlü 1X TBST 1X TBST yaklaşık 100 ml başına 5g toz süt
5X Tsay arabelleği: 500 mM HEPES, pH 7.5, %0.4 Triton X-100
5X Pasif lisis tampon dDH2O'da 125 mM Tris, pH 7.8, 10 mM 1,2-CDTA, 10 mM DTT, 5 mg/ml BSA, %5 (vol/vol) Triton X-100 ve %50 (vol/vol) gliserol içeren sulu stok yapın.
6X Sodyum Dodecyl Sülfat (SDS) 0.375 M Tris pH 6.8, 6 ml gliserol, 1.2 g SDS, 0.93 g 1.4-dithiothreitol (DTT), 6 mg bromofenol mavisi, 10 ml su ekleyin.
ChIP seyreltme tamponu %0.01 SDS, %1.1 Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 167 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl
ChIP Elution Tampon Otoklavlı ddH2O%1 SDS (w/v) ve 0,1 M NaHCO3
MCF-7 Hücreleri için Komple DMEM: Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile takviye 10% sığır buzağı serum (BCS), penisilin (10 adet / ml), ve streptomisin (10 mg / ml)
Yüksek tuz yıkama tamponu %0.1 SDS, %1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl.
LiCl yıkama tamponu 0.25 M LiCl, %1 NP-40, %1 sodyum deoksikolat, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0.
Düşük tuz yıkama tamponu %0.1 SDS, %1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl.
Çekirdek şişme tampon 5 mM BORUlar pH 8.0, 85 mM KCl, %0.5 NP-40
SDS lysis arabellek %1 SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8.0
TE tamponu 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA.
Transfer arabelleği 25 mM Tris, 190 mM glisin, %20 metanol ve pH'ı kontrol edin ve gerekirse pH 8.3'e ayarlayın.

Tablo 1: Tamponların ve kullanılan çözümün tarifleri.

Ek dosyalar: Protokoller 1-3 için ek deneysel şemalar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lizin asetiltransferazlar (KATs) histon kuyrukları ve transkripsiyon faktörleri gen transkripsiyondüzenlemekiçin çeşitli lizin kalıntıları asetit 2,3. Son yirmi yılda yapılan çalışmalar, CBP/p300, PCAF ve GCN5 gibi KAT'ların onkojenik transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girdiği ve çeşitli solid tümör tiplerinde tümör büyümesini artırmaya yardımcı olduğunu ortaya koymuştur4,5,9,,15,16,17,,18. Tümör büyümesini teşvik onların ortaya çıkan rolü nedeniyle, KATs kanser tedavisinde yeni hedefler olarak araştırılmaktadır. Yeni KAT inhibitörleri (KATi) klinikte kullanmak için hareket etmeden önce potens, seçicilik ve güvenlik açısından dikkatli ve titizlikle test edilmelidir. Son kanıtlar, daha önce açıklanan KATi bileşiklerinin hedef etkileri kapalı sergive kötü kimyasal problar21olarak bilimsel literatürde kullanılmadan önce kötü karakterize olduğunu göstermiştir. Bu nedenle KATi karakterizasyonu için sıkı yöntemler gereklidir. Burada açıklanan üç protokolleri karakterize ve KATs histone asetiltransferaz (HAT) fonksiyonu hedefleyen yeni inhibitörleri doğrulamak için kullanılabilir: bir in vitro HAT tsay, ChHAI tsay, ve ChIP-qPCR. Bu protokoller CBP/p300 ve inhibitörlerini örnek olarak kullanır, ancak bu yöntemler diğer KAT'lerin araştırılmasında gelecekteki uygulamalara kolayca uyarlanabilir.

HAT testi basit ve bir test tüpünde HAT işlevini inhibe potens için bileşikleri ekrana uygun maliyetli bir yoldur. Saflaştırılmış HATs (ya rekombinant4,10 veya immünoppresipitated40) bu test test edilebilir, ancak rekombinant CBP / p300 bu protokolde bir örnek olarak kullanılır. CBP/p300, asetil grubundan hedef substrat3'tekilizin kalıntısına asetil grubu aktaran enzimatik bir HAT etki alanına sahiptir. En karakterize CBP/p300 histon hedefleri Histone 3 Lizin 18 ve 27 (Sırasıyla H3K18 ve H3K27)2,3,10,11. HAT tsay'ında saflaştırılmış p300 HAT etki alanı asetil-coa ve Histon 3.1 ile bir substrat olarak kuluçkaya yatırılır. Kuluçka döneminde p300, H3K18 ve H3K27 dahil olmak üzere birçok H3.1 kalıntısında asetilasi katalize edecektir. Bu kalıntılar üzerinde asetilasyon göreceli bolluk immünoblotting ile ölçülebilir. Bu test tüpü reaksiyonu p300'e bağlanan ve HAT aktivitesini (HATi) engelleyen yeni bileşikleri taramak için kullanılabilir. Örneğin, anakardik asit, bilinen bir HATi38, güçlü dmso kontrolü ile karşılaştırıldığında hem H3K18 ve H3K9 histon asetilasyon düzenler(Şekil 1B, şerit 5 karşı şerit 1). Deneysel reaksiyonlara Asetil-CoA(Şekil 1B, Lanes 1-5) veya histon asetilasyonun p300 kataleksi oluşmaz(Şekil 1B, Lane 6) eklemek kritik öneme sahip. Asetil-CoA yokluğu da p300 kataliz için negatif kontrol olarak kullanılabilir ve rekombinant H3.1 histon asetilasyon bazal düzeyleri için.

HAT tonu yaparken, her reaksiyonun aynı miktarda p300, H3.1 ve Asetil-CoA aldığından emin olmak önemlidir. İmmünoblottaki H3.1 ve p300 seviyeleri jel için yükleme kontrolleri olarak hizmet vermektedir. Bu teşp için, yere özgü histon asetil antikorları veya pan-asetil antikor immünoblot için kullanılabilir. İmmünoblot kalitesini iyileştirmek için optimize ederken, immünolotlama için doğrulanmış antikorlar kullanmak ve başlangıçta antikor seyreltme için üreticinin tavsiyelerini takip etmek çok önemlidir. Protokol bölümünde kullanılan antikor seyreltmeleri referans amaçlıdır ve seyreltmeler ilk deneylerin sonuçlarına göre değiştirilebilir (örneğin, sinyal çok güçlüyse antikor daha da seyreltilebilir). Sadeliği nedeniyle, HAT tsay yeni inhibitörleri tarama için mükemmel bir başlangıç deneyidir. Ancak, HAT tsay dezavantajları vardır. HAT testi ile ilgili önemli bir endişe, bir test tüpünde etkili bileşiklerin yaşayan bir sistemde etkisiz kanıtlayabileceğidir. Hücre kültüründe bileşik etkinliği hücresel geçirgenlik sorunları, hücresel metabolizma ve bileşik stabilite ile değiştirilebilir, çünkü bu bir sorundur. Buna ek olarak, KATs, özellikle CBP / p300, hücre,kültürü3,41,42kendi KAT aktivitesini düzenleyen birçok protein-protein etkileşimleri var.42 Bu nedenle, hücre kültürü deneyleri20,23HAT analizinde tanımlanan inhibitörleri daha fazla karakterize etmek esastır.

Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) analizi boru hattındaki ikinci protokoldür ve hücre kültüründe yeni inhibitörlerin etkilerini doğrulamak için yararlıdır. Bu sataş hdac inhibitörleri kullanır (HDACi)24 hücrelerde histon hiperasetiltion indüklemek için bazal asetilasyon bir immünoblot üzerinde tespit etmek için çok düşük olabilir çünkü. Tercih edilen hücre hatları bir HATi eklenmesinden önce asetitli kromatin birikimi için izin vermek için bir HDACi ile önceden inkübe edilir. HDACi ve HATi'nin birlikte inkübünden sonra hücreler lysed ve belirli histon asetilasyon bölgeleri için standart immünoblotlama prosedürlerine tabi tutulur. Bu çalışmanın amacı HDACi tarafından indüklenen histon hiperasetilasyonu zayıflatmak için yeni HATi etkinliğini belirlemektir. HDACi'ye maruz kalan hücreler, DMSO çözücüse maruz kalan hücrelerden anlamlı olarak histon asetilasi düzeylerine sahip olmalıdır(Şekil 2B, şerit 4 karşı şerit 1). HDACi ile birlikte HATi eklenmesi tek başına HDACi tedavisiile karşılaştırıldığında immünoblot sinyalini azaltmak için bekleniyor(Şekil 2B, lanes 5-6 karşı şerit 4). Histon asetilasının bazal düzeyleri(Şekil 2B, Lanes 1-3) saptanması zordur ve bu protokole HDACi eklemenin önemini vurgular. MS-275 (Entinostat) örnek olarak kullanılır ancak diğer HDACi24,43kullanılabilir. MS-275 sınıf I HDACs karşı değişken inhibitör konsantrasyonları rapor ve genellikle düşük mikromolar konsantrasyonları nanomolar ile HDAC1 ve HDAC3 inhibe, sırasıyla43,44. Ms-275 konsantrasyonları geniş bir yelpazede literatürde kullanılır45,46,47, ama 3 μM tedavi MCF-7 hücrelerinde histon asetilasyon sağlam ve tekrarlanabilir bir artış sağlar. Bu nedenle, farklı bir hücre hattı kullanırken ChHAI testi için en uygun konsantrasyonu belirlemek için hdaci ve HATi konsantrasyonları geniş bir yelpazede bir başlangıç ekranı gerçekleştirmek için yararlı olabilir.

HAT tahsinine benzer şekilde, immünoblot protokolünün uygun antikorlar, optimum antikor seyreltmeleri ve dikkatle kontrol edilen numune yüklemesi yoluyla kaliteli sonuçlar elde etmek için optimize edilmesi gerekebilir. Dikkatle kontrol edilen numune yüklemesi bu protokolün başarısı için gereklidir ve tüm numunelerin protein içeriğini dengelerek ve eşit hacimli numuneleri immünoblot jelinin kuyularına borulama yoluyla elde edilebilir. Bir pan-asetil antikor bu protokolde sondalama için kullanılabilir. Ancak, KATs bazı histon lizin kalıntıları için özgüllük var ve HATi hücre kültürü1tüm histon asetilasyon siteleri etkilemez çünkü siteye özgü asetil antikorları ile takviye edilmelidir,2,4,,5,10,11. HAT ve ChHAI tahlillerinde histon asetilasyonunu azaltmada etkili olan inhibitörler ileri değerlendirme için güçlü adaylardır. Daha da önemlisi, HAT ve ChHAI tahlilleri sadece histon asetilasyonküresel değişiklikler hakkında veri sağlayan sınırlama var. Bu sınırlama genomun belirli bölgelerinde yeni HATi etkilerini karakterize etmek için ihtiyaç yaratır.

Kromatin İmmünopan-kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ChIP-qPCR) boru hattının son protokolüdür ve genomun belirli bölgelerindeki DNA-protein etkileşimlerini değerlendirir. Bu testte H3K27ac'ta zenginleştirilmiş genomik bölgeler immünoprebat (IP) ile saflaştırılır ve qPCR'de DNA astarları kullanılarak analiz edilir. Bu teknik, HATi'nin gen destekleyicileri ve arttırıcılarda histon modifikasyonlarını nasıl etkilediğine dair mekanik bir içgörü sağlar. ChIP-qPCR sağlam bir tekniktir ve tüm genom diziliminden (örneğin, ChIP-seq) daha az maliyetlidir, ancak sonucu etkileyen birçok adım nedeniyle optimize etmek zor olabilir. Doğru optimize etmek için en zor adım adım 3.5, immünopresipitasyon. Bu adımı optimize etmek zordur, çünkü eğer 3.5.20'deki saflaştırılmış DNA son derece seyreltilmişse qPCR reaksiyonunda kötü sonuçlara neden olabilir (örn. hedef gen dizisinin amplifikasyonu ve çok yüksek ΔCt değerleri). IP adımının başarısı, protein hedefinin bolluğu ve IP antikorunun kalitesi gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. IP adımının başarısını doğrulamak için IP H3K27ac antikorunun ip ikontrolünden karşı kalitesini doğrulamak çok önemlidir. Örneğin, Şekil 3B'de,H3K27ac spesifik antikor, spesifik olmayan IgG kontrolü üzerinde 632,73 kat zenginleştirme görüntüler. Bu H3K27ac antikor yüksek kaliteli olduğunu ve H3K27ac Cyclin D1 organizatörü zenginleştirilmiş olduğunu gösterir. IP antikordoğrulaması yapıldıktan sonra, DMSO ve A-485 tedavi edilen gruplar arasında karşılaştırma yapılabilir. Şekil 3C'degösterildiği gibi, A-485 % Giriş yöntemi (n=2 temsili sonucu) kullanarak DMSO kontrolü ne karşı Cyclin D1 organizatörü nde H3K27ac zenginleştirme azaltır. IP antikordüşük kaliteli olduğunu kanıtlıyorsa ve ilk deneylerde kat zenginleştirme göstermiyorsa, adım 3.2.1'deki hücre sayılarını artırmayı deneyin. Daha yüksek hücre sayıları, lysat'ın toplam protein içeriğini artırarak zayıf antikor kalitesini telafi etmeye yardımcı olabilir ve IP reaksiyonuna daha fazla protein eklenmesini sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması ya da açıklama yapmaları gerekmez.

Acknowledgments

Bu çalışma James ve Esther King Biyomedikal Araştırma Programı (6JK03 ve 20K07) ve Bankhead-Coley Kanser Araştırma Programı (4BF02 ve 6BC03), Florida Sağlık Bakanlığı, Florida Meme Kanseri Vakfı ve UF Sağlık Kanser Merkezi hibe tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, dr Zachary Osking ve Dr Andrea Lin yayın sürecinde destek için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Tags

Kanser Araştırmaları Sayı 162 lizin asetiltransferazlar KATlar CBP/p300 histon asetiltransferaz inhibitörleri tarama yöntemleri histon asetilasyon epigenetik kanser gen regülasyonu
Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for… More

Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter