Summary
Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l'imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l'analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.
Abstract
Il protocollo qui sviluppato offre uno strumento per consentire il tracciamento informatico della divisione Escherichia coli e dei livelli fluorescenti per diverse ore. Il processo inizia attraverso lo screening per le colonie che sopravvivono su supporti minimi, supponendo che solo Escherichia coli che ospita il plasmide corretto sarà in grado di prosperare nelle condizioni specifiche. Poiché il processo di costruzione di grandi circuiti genetici, che richiedono l'assemblaggio di molte parti del DNA, è impegnativo, i componenti del circuito sono spesso distribuiti tra più plasmidi a diversi numeri di copia che richiedono l'uso di diversi antibiotici. Le mutazioni nel plasmide possono distruggere la trascrizione dei geni di resistenza agli antibiotici e interiettare con la gestione delle risorse nella cellula che porta alla necrosi. La colonia selezionata è impostata su una piastra di Petri con fondo di vetro e alcuni piani di messa a fuoco sono selezionati per il tracciamento della microscopia sia in campo luminoso che in domini fluorescenti. Il protocollo mantiene lo stato attivo dell'immagine per più di 12 ore in condizioni iniziali che non possono essere regolamentate, creando alcune difficoltà. Ad esempio, le cellule morte iniziano ad accumularsi nel campo di messa a fuoco delle lenti dopo alcune ore di imaging, il che causa l'accumulo di tossine e la sfocatura e il decadimento del segnale. L'esaurimento dei nutrienti introduce nuovi processi metabolici e ostacola la risposta desiderata del circuito. La temperatura dell'esperimento abbassa l'effettività di induttori e antibiotici, il che può danneggiare ulteriormente l'affidabilità del segnale. Il gel multimediale minimo si restringe e si asciuga e, di conseguenza, la messa a fuoco ottica cambia nel tempo. Abbiamo sviluppato questo metodo per superare queste sfide in Escherichia coli, simile ai lavori precedenti che sviluppano metodi analoghi per altri microrganismi. Inoltre, questo metodo offre un algoritmo per quantificare il rumore stocastico totale nelle celle inaltere e alterate, scoprendo che i risultati sono coerenti con le previsioni dell'analizzatore di flusso come mostrato da un coefficiente di variazione simile (CV).
Introduction
La biologia sintetica è un campo multidisciplinare emerso nell'ultimo decennio e mira a tradurre i principi di progettazione ingegneristica in progettazione biologicarazionale 1,2,3,nel tentativo di raggiungere l'integrazione e l'elaborazione multi-segnale nelle cellule viventi per comprendere la scienza dibase 4,5,applicazioni diagnostiche, terapeutiche ebiotecnologiche 6,7,8,9,10. La nostra capacità di quantificare la risposta input-output dei circuiti genetici sintetici è stata rivoluzionata dai recenti progressi nella tecnologia a cella singola, tra cui l'analizzatore di flusso e l'imaging di cellule vive utilizzando la microscopia automatica time-lapse11. Un analizzatore di flusso viene spesso utilizzato per misurare la risposta di questi circuiti allo statostazionario 1,12e la microscopia invertita viene utilizzata per misurare la risposta dinamica dei circuiti genetici sintetici a livello di una singola cella3. Ad esempio, uno dei primi lavori in biologia sintetica ha comportato la costruzione di reti di oscillatori genetici in cellule viventi utilizzando cicli di feedback negativi con un ritardodi 3. Successivamente, i circuiti genetici dell'oscillatore sono stati applicati per comprendere il controllo metabolico nell'ambiente dinamico delle celluleviventi 4. La microscopia automatica time-lapse è un metodo per caratterizzare tali circuiti. Ipotizziamo che le cellule ospiti, Escherichia coli, si sincronizzino quando formano micro colonie, consentendo la misurazione del segnale e il calcolo del rumore senza tracciare relazioni esatte madre-figlia.
Il rumore è un aspetto fondamentale e intrinseco dei sistemi biologici spesso derivanti da più fonti. Si consideri, ad esempio, le reazioni biochimiche che coinvolgono segnali che provengono dal trasporto di vettori casuali discreti come la diffusione delle proteine13. Questi segnali si propagano con fluttuazioni casuali14. Altre fonti di rumore sono la disponibilità di risorse, la divisione cellulare e le variazioni delle condizioni ambientali come temperatura, umidità e pressione. I segnali biologici che si propagano nei circuiti genetici sintetici hanno spesso un rapporto segnale/rumore molto basso (SNR), che disturba le prestazioni di tali circuiti. Pertanto, la progettazione di circuiti genetici rimane uno degli aspetti più impegnativi dell'ingegneriagenetica 15. Ad esempio, a differenza della maggior parte degli approcci che calcolano solo l'espressione genica media (misurata sull'intera popolazione cellulare), la varianza del segnale misurato è considerata al fine di progettare un comportamento prevedibile attraverso reti genichesintetiche 12. Come tale, i livelli di variabilità o rumore nell'espressione proteica svolgono un ruolo dominante nella progettazione e nelle prestazioni dei circuiti genetici analogici e digitali1,16,17.
Sono stati sviluppati molti approcci per quantificare la variabilità da cellula a cellula, tra cui in Escherichia coli3,7,18. Questi metodi sono spesso utilizzati per studiare l'attivazione genica e le vie metaboliche, tuttavia con minore attenzione allo studio della dinamica del rumore stocastico, come la misurazione e la districazione di specifiche fonti di rumore, in particolare per i circuiti genetici nelle cellule viventi dove questa è unasfida fondamentale 19,20,21. Diversi fattori, entrambi ereditati dal circuito stesso (intrinseco) e derivati dalle cellule ospiti (estrinsece), possono disturbare le prestazioni continue dei circuiti genetici. In questo documento, abbiamo sviluppato un protocollo che mira a quantificare il rumore totale nelle cellule di Escherichia coli, comprese le fonti di rumore intrinseche ed estrinsece6,22. Quantificando il rumore totale e quindi valutando l'SNR23, è possibile migliorare la progettazione dei circuiti genetici. Questo metodo può essere modificato per misurare separatamente le fonti di rumore indipendenti, monitorando diverse proteinefluorescenti 6,20. Per il protocollo qui descritto, manteniamo le condizioni ambientali ben controllate e misuriamo continuamente l'attività delle cellule senza l'influenza di fattori esterni. Misuriamo il segnale dalle proteine fluorescenti in singole cellule nel tempo e contemporaneamente le immaginiamo sotto un substrato di agarosio. Le immagini risultanti vengono analizzate utilizzando il MATLAB personalizzato del laboratorio.
Idealmente, la misurazione continua dell'attività in tempo reale delle proteine fluorescenti all'interno di una cellula produrrà dati accurati attraverso la crescita e la divisione delle cellule. Tuttavia, è difficile acquisire tali dati. Ciò è dovuto alla degradazione delle proteine fluorescenti, note come foto-sbiancamento7, quando sono esposte a radiazioni nel processo di eccitazione. Inoltre, le cellule di Escherichia coli sono sensibili anche per l'eccitazione, che potrebbe portare alla fototossicità7. Entrambi i problemi limitano la quantità di cornici che possono essere acquisite e il tempo tra le acquisizioni. Anche il substrato e i tipi medi (ad esempio il brodo di licogenia) che viene utilizzato per far crescere le cellule durante l'imaging hanno un ruolo critico. Si consiglia vivamente di utilizzare un mezzo minimo, che riduce al minimo lo sfondo non fluorescente ed estende il tempo di divisione cellulare.
Inoltre, il campione deve essere preparato considerando i seguenti requisiti (1) Il basso tasso di divisione cellulare consente esposizioni meno frequenti per l'imaging da vicino del ciclo di divisione e la riduzione della probabilità di fototossicità e fotoblesaching. Abbiamo impostato il tempo di acquisizione su circa la metà del tempo di mitosi previsto (2) La bassa densità cellulare all'inizio dell'esperimento consente una migliore uniformità e tracciabilità della divisione. La densità cellulare è influenzata dal rapporto di diluizione delle cellule di Escherichia coli, che è un parametro significativo per il successo di questo protocollo e deve essere determinato per ogni laboratorio. Per stabilire il rapporto, ogni nuovo ceppo o supporto di Escherichia coli utilizzato dovrebbe essere dotato di grafici del tasso di crescita(figura complementare 1). Un rapporto appropriato è stato raggiunto se le cellule possono crescere senza ulteriori scosse dopo una breve incubazione da una densità iniziale di circa600nm di OD = 0,1. Le cellule in questa fase si divideranno solo in base alla temperatura dell'ambiente (3) Restrizione del movimento cellulare: il movimento cellulare dipende fortemente dalla compattezza del substrato (tampone di agarosio). La compattezza del substrato dipende dalla quantità di agarosio totale e dal tempo di solidificazione del gel. I gel non possono essere lasciati solidificare durante la notte a temperatura ambiente, poiché l'Escherichia coli subirà la mitosi. Altri fattori che influenzano la stabilità del substrato includono la quantità di acqua nel campione e l'umidità. Ulteriori questioni sono discusse in dettaglio nei risultati rappresentativi. Questo protocollo fornisce molti dettagli e si sposta gradualmente da un passo all'altro. Il protocollo offre una lunga stabilità per gli esperimenti di imaging e fornisce uno strumento di elaborazione delle immagini di base.
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Protocol
1. Preparazione dei media e della cultura
- Preparare una soluzione stock di 1.000x carbenicillina (50 mg/mL) o antibiotico pertinente.
- . Pesare 0,5 g di carbenicillina. Aggiungere 10 mL di sterile H2O. Sciogliere completamente.
- Sterilizzare lo stock di carbenicillina attraverso un filtro siringa da 0,22 μm. Aliquota la soluzione antibiotica e conservare a -20 °C.
- Per preparare piatti di brodo di lisogenia (LB), mescolare 5 g di triptone, 5 g di NaCl, 2,5 g di estratto di lievito e 7,5 g di agar Bacto con 0,5 L di sterile H2O. Autoclave la soluzione a 121 °C per 20 min.
- Immergere parzialmente il gel-mix fuso in un bagno d'acqua a 50 °C. Aggiungere 1.000 μL di carbenicillina (50 mg/mL).
- Preparare le piastre di Petri in un ambiente sterile. Lasciare i piatti da impostare prima di conservarli in frigo.
- Per i mezzi minimi M9, preparare soluzioni di stock separate delle seguenti: 5 sali M9 (56,4 g/L), 2 M di glucosio e 2% di casaminoacidi senza biotina. Autoclavare le soluzioni a 121 °C per 20 min.
- Per preparare 5 piastre di Petri, mescolare 1125 mg di agar a bassa fusione e 400 mg di agar con 89,2 mL di mezzi minimi (1x M9). Aggiungere 10 ml di 2% di casaminoacidi (2% [vol/vol]) in un pallone Erlenmeyer da 250 mL.
NOTA: Assicurarsi di versare il supporto sulle labbra interne del pallone. - Microonde la soluzione in brevi raffiche da 3 a 4 secondi. Ripetere fino a quando la soluzione non è chiara.
NOTA: Assicurarsi di non raggiungere il punto di ebollizione. - Mettere il pallone Erlenmeyer da 250 mL in un bagno di acqua calda (60 °C) per mescolare ulteriormente per diffusione e lasciarlo raffreddare fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.
- Accendere la fiamma sulla panca che versa la piastra.
- Aggiungere rapidamente tutte le soluzioni nell'ordine seguente:
800 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol])
100 μL di tiammina (B1)
1100 μL di glucosio (2M)
100 μL di carbenicillina (50 mg/mL). - Ruotare il pallone Erlenmeyer per garantire una distribuzione uniforme di tutti gli ingredienti in tutto l'agar.
- Aprire un piatto alla volta accanto alla fiamma e iniziare a versare.
- Lasciare le piastre in panchina per qualche minuto fino alla solidificazione iniziale.
- Capovolgere le piastre per evitare che la condensa dell'acqua gocciola sul gel.
- Lasciare solidificare le piastre a temperatura ambiente per circa 2 ore.
- Una volta che le piastre si sono solidificate e asciugate, possono essere conservate a 4 °C per circa 3 mesi.
2. Costruzione di ceppi batterici e plasmidi
NOTA:Il circuito genetico contiene una parte; una proteina fluorescente verde (GFP) guidata da un promotore PtetO con conseguente espressione costitutiva. Tutti i plasmidi in questo lavoro sono stati costruiti utilizzando tecniche di clonazione molecolare di base e sono stati trasformati in Escherichia coli 10β, utilizzando un protocollo standard di shocktermico 24. Il costrutto finale è stato trasformato in ceppo di tipo selvatico Escherichia coli MG1655 per i test.
- Trasformare il plasmide desiderato in cellule Escherichia coli MG1655 con il protocollo standard di shock termico24.
- Far crescere le cellule trasformate su una piastra di agar LB durante la notte a 37 °C.
NOTA: È possibile mantenere le piastre di Petri dal passaggio 2.2 fino a 3 giorni per l'uso in microscopia. - Inoculare una singola colonia in 5 ml di brodo LB integrato con gli antibiotici pertinenti in un tubo di vetro.
- Far crescere le cellule a 37 °C con una velocità di scuotimento di 250 giri/min nell'incubatrice per 2 ore fino a quando il liquido non è torbido.
- Preparare 1 mL di soluzione di diluizione come segue:
892 μL di supporti minimi (1x M9)
8 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol])
100 μL di 2% di casaminoacidi (0,2% [wt/vol])
1 μL di tiammina (B1)
11 μL di glucosio (2 M)
1 μL di antibiotici pertinenti- Mescolare e girare verso il basso.
- Diluire la coltura cellulare (1:30) dal passo 2.4 in un tubo da 2 ml aggiungendo 30 μL di crescita di Escherichia coli a 1000 μL di soluzione di diluizione (fase 2.5).
- Incubare il tubo per 1 h con scuotimento (250 giri/min) a 37 °C.
- Crescere 40 μL - 60 μL su piastre M9 preparate nella fase 1.10. Incubare la piastra a 37 °C durante la notte.
NOTA: La densità ottica (OD600nm)per la placcatura deve essere di circa 0,1. - Posizionare fino a tre piastre inferiori in vetro da 35 mm sulla panca.
NOTA: Assicurarsi che il vetro della piastra abbia lo spessore corretto per le lenti al microscopio utilizzate. - Preparare la coltura per la semina su piastre di gel, ripetere i passaggi da 2.3 a 2.6 per le colonie da piastre preparate a misure al microscopio passo 2.9.
- Preparare la seguente soluzione per realizzare tre lastre al microscopio.
- Preriscaldare il bagno d'acqua a 60 °C.
- Mescolare 112,5 mg di agar a bassa fusione e 40 mg di agar con 8,92 ml di mezzi minimi (1x M9) e aggiungere 1 ml di 2% di casaminoacidi (0,2% [vol/vol]) in un pallone Erlenmeyer da 25 ml.
NOTA: Assicurarsi di versare il supporto sulle labbra interne del pallone.
- Microonde la soluzione in brevi raffiche da 2 a 3 secondi. Ripetere fino a quando la soluzione non è chiara.
NOTA: Assicurarsi di non raggiungere il punto di ebollizione. - Mettere il pallone Erlenmeyer da 25 mL in un bagno d'acqua calda (60 °C) per mescolare ulteriormente per diffusione e lasciarlo raffreddare sul banco fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.
3. Preparazione di tamponi di agarosio
- Panca pulita con 70% di etanolo. Allungare il nastro sulla panca pulita. Assicurarsi che il nastro sia liscio e livellato.
- Preparare due coverlips: uno sul nastro e un secondo nelle vicinanze. Preparare una coverlid.
- Rimuovere il pallone (preparato al passaggio 2.14) dal bagno d'acqua, pulire l'esterno del pallone e lasciarlo raffreddare fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 °C.
- Per realizzare la soluzione gel, mescolare rapidamente tutte le soluzioni nel seguente ordine:
80 μL di glicerolo al 50% (0,4% [vol/vol])
1 mL di 2% di casaminoacidi (0,2% [wt/vol])
10 μL di tiammina (B1)
110 μL di glucosio (2 M)
10 μL di antibiotici pertinenti. - Versare 1,5 mL di gel sul coperchio e coprirlo con il secondo pezzo facendo un "sandwich".
- Riportare l'Erlenmeyer al bagno di acqua calda. Coprire il panino con il coperchio e impostare il timer per 20 minuti.
- Allo stesso tempo, incubare il tubo dal passaggio 2.11 per 1 h a 37 °C con scuotimento (250 giri/min)
- Dopo 20 minuti capovolgere il panino (passo 3.5), coprirlo e lasciare riposare per 1 h.
NOTA: Per risultati migliori lasciare riposare il "sandwich" a 4 °C per tutta la durata del passaggio 3.8. - Seme Escherichia coli coltura dal passo 3.7 pipettando il campione sul piatto da 35 mm.
NOTA: Pipettare 6 μL di cellule come piccole gocce separate dà i migliori risultati. - Lasciare asciugare le gocce, per almeno 15 minuti e fino a 30 minuti.
- Esporre il gel solidificato del sandwich dal passaggio 3.8 facendo scorrere via il coverslip.
- Tagliare il sandwich in piccoli cuscinetti singoli con punzone o punta in biopsia.
- Appoggiarlo delicatamente sul campione (fase 3.9). Lasciare il piatto per 20 minuti in panchina.
4. Preparazione del campione per l'imaging di microscopia
- Rimuovere il pallone dal bagno d'acqua dal passaggio 3.6. Pulire l'esterno del pallone e lasciare raffreddare a temperatura ambiente (25 °C).
NOTA: Rimuovere il pallone al passaggio 4.1 circa 3 minuti prima della fine del timer. - Versare costantemente 3 mL del gel sul perimetro della piastra con un movimento circolare. Lasciare solidificare per qualche minuto.
- Sigillare le piastre con nastro adesivo e perforare diversi fori con ago da 25 G. Capovolgere tutti i piatti per evitare che la condensa dell'acqua gocciola sul gel.
- Incubare tutti i piatti a 4 °C per 30 min per consentire la piena solidificazione prevenendo la mitosi cellulare.
NOTA: Lasciare campioni a 4 °C per misurazioni successive, non più di un giorno. - Avviare il microscopio per istruzioni del produttore.
- Trova la messa a fuoco iniziale usando l'obiettivo di amplificazione più basso e attiva il sistema di messa a fuoco automatica (AFS).
- Utilizzare l'olio se necessario, annegare l'obiettivo con olio e diffonderlo con attenzione spostando la piastra con un controller della piattaforma (non manualmente) e AFS può essere nuovamente inserito.
- Utilizzate la sezione trasversale relativa in direzione Z, seguendo il suggerimento di default per le sezioni trasversali del passo Z.
NOTA: Abbiamo scattato immagini a campo luminoso ogni 5 minuti e immagini fluorescenti ogni 20 minuti. A volte la messa a fuoco deve essere regolata durante i primi 30 minuti. Il preriscaldamento della scatola dell'incubatore di microscopio e dell'olio, mentre la refrigerazione del campione tende a contribuire a ridurre la perdita iniziale di messa a fuoco.
5. Analisi dei dati
NOTA: Per elaborare i dati della microscopia, abbiamo progettato un software basato su computer in MATLAB. Questo software facilita l'identificazione dei confini cellulari da immagini tiff a campo luminoso e segmenti e ordina le celle per area. L'output di questa analisi delle immagini può essere utilizzato come maschera su immagini tiff fluorescenti per derivare i livelli di intensità cellulare e annullare artefatti nel dominio fluorescente come l'alone cellulare a causa dei limiti di risoluzione del microscopio. Il software sviluppato è stato ispirato da operesimili 7,25,26,27,28,29,30 e fornisce una soluzione elegante su misura per il laboratorio.
- Definire innanzitutto i seguenti parametri in main_code.m.
- Definire la cartella delle immagini di acquisizione.
- Definisci il periodo di tempo dell'immagine- passo del tempo del canale del campo luminoso in pochi minuti.
- Definire la frequenza GFP - tasso di acquisizione delle immagini GFP.
- Definire la risoluzione del microscopio (cioè quanti pixel sono uguali a 1 μm).
- Definire l'intervallo del contenitore dell'istogramma - intervallo di area delle celle.
NOTA: Il processo di classificazione dei dati in base all'area cellulare è simile ai principi di gating nell'analisi dei dati della citometria del flusso. Le porte sono posizionate attorno a popolazioni di cellule con caratteristiche comuni, di solito sparse in avanti e sparse lateralmente, per isolare e quantificare queste popolazioni di interesse. La microscopia consente di gate, indagare e quantificare diversi gruppi cellulari. - Definire il kernel di convoluzione (3,3): questo parametro rileva i limiti delle celle mediante soglia globale (count_cells.m).
NOTA: questa configurazione è necessaria solo quando si modifica il laboratorio o il microscopio. Il software richiede che il canale di campo luminoso di ingresso sia etichettato con l'indice c1, canale di fluorescenza etichettato come c2.
- Eseguire main_code.m, che eseguirà automaticamente tutti gli altri script (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Il programma segmenta automaticamente le immagini dei campi luminosi (vedere figura complementare 2-4).
- Combina l'immagine di segmentazione con l'immagine fluorescente (GFP) per estrarre il livello di intensità per cella.
- Calcola il grafico della quantità di cellule per tempo e adatta in base alla crescita esponenziale.
- Calcolare la deviazione media e standard (STD) per ogni intervallo di area della cella.
- Calcolare il rapporto segnale/rumore (SNR) per ogni intervallo di area cellulare.
- Tracciare e adattare la distribuzione della quantità di cellule per intensità.
- Calcolare il coefficiente di varianza (CV) e confrontarlo con i dati dell'analizzatore di flusso.
NOTA: il software fornirà come output le immagini di segmentazione finali per la regolazione conv_kernel in una nuova cartella "cartella/Segmentata". Il software darà come output i grafici in una nuova cartella "yourfolder/Graphs.
- Per confrontare tra gli esperimenti, utilizzare compare_experiments.m.
- Definire le directory per i grafici salvati e l'indirizzo per la directory \CompareResult.
- Eseguire il file.
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Representative Results
Il software analizza le immagini del dominio di campo luminoso che sono bianche e nere. L'Escherichia coli sarà simile a forme oblunghe nere su uno sfondo bianco troppo bianco e la gamma dinamica di luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro (Figura 1). Nelle immagini fluorescenti le cellule possono avere un piccolo alone, ma le singole cellule con forme oblunghe possono ancora essere risolte. Un evento di mitosi deve essere rilevato per la prima volta dopo 30 minuti. La messa a fuoco al microscopio dovrebbe rimanere stabile nel tempo e sebbene le cellule possano muoversi lentamente durante quei 30 minuti, è improbabile che lascino il campo visivo. Tale esperimento sarà considerato buono e può essere visualizzato nella figura 2. Le celle potrebbero essere difficili da rilevare nel dominio dei campi luminosi a basso ingrandimento. Si consiglia di stabilire la distanza media di messa a fuoco con un plasmide ad alto numero di copia (HCN), in quanto è facile notare a basso ingrandimento. Impostare la distanza media misurando in anticipo un plasmide a basso numero di copie (LCN) all'ingrandimento elevato. Questa distanza di messa a fuoco dipende principalmente dalle piastre, dal sistema di microscopia e dall'olio, e non dallo spessore del gel o del ceppo di Escherichia coli.
Quando si adatta questo protocollo ad altri laboratori, possono sorgere i seguenti problemi (1) Le piastre Escherichia coli (campioni) preparate con un rapporto di diluizione errato possono mostrare un numero immutabile di cellule(Figura 3 e Figura 4) (2)I campioni preparati senza sigillare la piastra possono mostrare un eccessivo restringimento. Questo può essere osservato come deriva delle cellule (Figura 3) o causare una perdita di messa a fuoco (Figura 5) (3) Alcuni campioni possono mostrare celle "fisse" a lento spostamento (in nero) su uno sfondo di celle di nuoto (in bianco). Ciò è probabilmente dovuto a un campione umido e di solito si stabilizza poiché l'acqua in eccesso viene assorbita dal gel (Supplementary Video 1) (4) Campioni che non mostrano cellule dopo pochi minuti di riscaldamento potrebbero essere stati preparati in modo errato, probabilmente a causa di: (I) Gel è stato versato mentre era ancora troppo caldo, (II) il cappuccio protettivo è stato dimenticato, (III) il supporto minimo manca di un ingrediente, (IV) densità cellulare errata e (V) gel è stato sigillato troppo strettamente. È importante forare i fori per consentire lo scambio di gas a scapito del restringimento del gel (Figura 5) e (VI) le cellule possono anche indentare il gel alla ricerca di nutrienti, impilando uno sopra l'altro, compromettendo il monostrato cellulare impedendo efficacemente il rilevamento delle cellule e la misurazione di un segnale fluorescente affidabile (Figura complementare 5).
Abbiamo misurato tre circuiti in questo lavoro. In primo luogo, un promotore costitutivo che regola la GFP mostrato nella figura 6. In secondo luogo, un promotore costitutivo che regola la superpiega GFP31 (sfGFP) mostrata nella figura 7. Un tag di degradazione ssrA (AAV) è stato aggiunto a sfGFP per ridurne la durata a minuti5. Il terzo circuito si basa su un circuito di feedbackpositivo 1ed è indotto da acil-omoserina-lattone (AHL). Il promotoreP luxR regola sfGFP e LuxR, un fattore di trascrizione che si lega con AHL per attivare PluxR come mostrato nella figura 8. La figura 9 presenta la dinamica della crescita cellulare (numeri di cellulare rispetto al tempo), la figura 10 mostra la dinamica del segnale misurato (fluorescenza media rispetto al tempo) e la figura 11 mostra la dinamica del rumore totale valutato (deviazione standard (STD) rispetto al tempo).
L'SNR (o CV) è ampiamente utilizzato nella progettazione di circuiti elettronici analogici per esprimere la precisione e l'affidabilità delcircuito 32. Cv si riferisce alla distribuzione del segnale tra singole celle e consente il confronto tra metodi e diverse apparecchiature come microscopi e analizzatori di flusso. Il calcolo dell'SNR dalle immagini al microscopio ci consente di confrontare i circuiti nel tempo, le cellule segmentate vengono misurate allo stesso tempo fornendo una misura per la risoluzione specifica del rumore rispetto al segnale, o un intervallo di rumore per un tempo specifico e una concentrazione di induttori. Ciò può indicare se le celle del rivelatore saranno in grado di risolvere l'esatta risposta del segnale alla concentrazione dell'induttore. In questo lavoro, il CV è stato calcolato considerando tutti gli artefatti segmentati che sono celle, indipendentemente dalla progressione cellulare nel ciclo di divisione. L'SNR è stato calcolato per un intervallo di aree cellulari specifico nel tempo, e poi è stato calcolato in media per tre esperimenti ripetuti. Né il segnale acquisito né l'STD sono affidabili da soli, in quanto sono specifici dell'esperimento e delle attrezzature utilizzate. Il segnale viene misurato con unità arbitrarie che dipendono dal guadagno preimpostato dell'apparecchiatura, dal rilevatore fotografico e dal tempo di esposizione. I dati presentati nella figura 10 suggeriscono che lo stadio delle celle nel ciclo di divisione non influisce sul livello di rumore, poiché diversi intervalli di area (punti nel ciclo di divisione) mostrano la stessa tendenza. Questa osservazione potrebbe supportare l'affermazione che il monitoraggio delle relazioni esatta madre - figlia può essere evitato per misurare il rumore e questo potrebbe migliorare l'SNR per il metodo presentato. Non è stata osservata alcuna variazione sostanziale della SNR tra la FPG e la sfGFP, come mostrato nella figura 12. Calcoliamo l'SNR (SNR= media/ STD) e lo presentiamo nella figura 12 e nella figura 13.
Abbiamo quindi calcolato la varianza e il CV in base alle seguenti equazioni31
1.1
1.2
Dove λ è il tempo di piegatura delle proteine, T è il tempo di divisione cellulare, θ e μ sono il numero di plasmidi prima e dopo la divisione, la copia plasmidenumero 31. Usando le equazioni di cui sopra (1.1 e 1.2) possiamo adattare i dati dal segnale dell'analizzatore di flusso per la distribuzione gamma.
Quindi abbiamo confrontato tra il CV, che viene misurato e calcolato dall'analizzatore di flusso (Figura 14) e dal protocollo (Figura 15).
Figura 1: Immagine di esposizione ai campi luminosi (a) Acquisizione stabilizzata in campo luminoso (b) Immagine di segmentazione, solo le celle colorate entrano nella mappa di luminosità dei calcoli (c) Pixel dell'acquisizione, picco è il rumore di fondo. La soglia da essa segmenta solo Escherichia coli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Questo esperimento mostra buone cellule sane che dividono e reagiscono dopo 120 minuti. Le immagini sono state acquisite successivamente a intervalli di 20 minuti. Le colonie sono a fuoco, il gel è stabile tra i campionamenti. Le colonie dividono e producono segnali forti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti di un rapporto di diluizione errato e di un restringimento del gel sull'immagine fluorescente. Le immagini sono state acquisiteaintervalli di 20 minuti ( a ) Escherichia coli individuale cerchiata in rosso (b) La stessa cella va alla deriva a destra del campo visivo (e) La cella va oltre. Le cellule inoltre non dividono o cambiano posizione, probabilmente a causa di un basso rapporto di diluizione e di un restringimento del gel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: In questo esperimento non è stata rilevata alcuna attività e quasi nessuna cellule era presente. I possibili motivi sono che il gel è troppo caldo, l'essiccazione del campione è troppo aggressiva o non ha un cappuccio protettivo ( a ) Immagini fluorescenti scattate a 40minuti ( b) Immagini fluorescenti scattatea60 minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Perdita di messa a fuoco e fotobleaching. Le immagini successive da ( a ) a (d) sono state acquisite a intervalli di tempo di 15 minuti utilizzando il sistema di messaafuoco automatica. Vedi video complementare 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6:Mappa plasmide del Pteto che regola la GFP. Senza il repressore TetR,il promotore P tetO funge da promotore costitutivo. Il circuito è clonato su plasmidi a basso numero di copie. Questo plasmide funge da base per la misurazione SNR per qualsiasi circuito modificato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7:Mappa plasmide del Pteto che regola sfGFP. Sf GFP è fuso con un tag di degradazione AAV. Il circuito è clonato su plasmidi a basso numero di copie. Il sfGFP-AAV è una variante più robusta di GFP, mentre il tag AAV lo rende suscettibile alla degradazione dalle proteasi delle pulizie dell'Escherichia coli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Mappa plasmide del circuito di feedback positivo. Il circuito è indotto da un induttore AHL, che lega il fattore di trascrizione LuxR. Il promotoreP luxR, regolato dal complesso AHL-LuxR, attiva la produzione di LuxR e sfGFP-AAV. Il circuito è clonato su plasmidi a basso numero di copie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Dinamicadella crescita del ceppo Escherichia coli MG1655 in mezzi minimi comprende (a) PtetO-GFP, una crescita esponenziale di circa 35 minuti. Le immagini di questo esperimento sono mostrate nella figura 2 (b) PtetO-sfGFP, crescita esponenziale di circa 35 minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Livello di intensità fluorescente, normalizzato per pixel e acquisito a intervalli di 20 minuti.
Le celle vengono cestinate in base all'area, al fine di ridurre al minimo gli artefatti. Le cellule sono divise per la loro area in un quadrato micrometrico (a) Pteto-GFP la prima ripetizione per intensità a210 minuti è 0,004 a.u (b) PtetO-sfCircuito GFP prima ripetizione per intensità a 210 minuti è 0,022 a.u (c) Segnale misurato del circuito Pteto-GFP (d) Segnale misurato di PtetO-circuito sfGFP. Tutti i dati sperimentali rappresentano la media di tre esperimenti. Il software può ordinare l'area delle celle in gruppi diversi (a) e (b) mostrare grafici per quattro intervalli di aree di celle che rappresentano il ciclo di divisione. La prima area di 14 micrometri rappresenta le cellule dopo la divisione, poiché molto probabilmente le cellule dopo la divisione saranno le più piccole. La seconda area di 21 μm rappresenta le cellule prima della divisione. La terza e la quarta area rappresentano le cellule in divisione in quanto l'area totale viene moltiplicata per due (29 e 36 μm) per considerare le cellule che hanno impiegato più tempo per dividersi. Le aree sono state scelte valutando manualmente i dati guardando le immagini di microscopia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11:Deviazione standard (STD) delle intensità di fluorescenza a singola cella per: ( a ) PtetO-GFP la prima ripetizione per stda210 minuti è 0,001865 a.u (b) PtetO-sfCircuito GFP prima ripetizione per STD a 210 minuti è 0.01477 a.u (c) STD del circuito Pteto-GFP (d) STD del circuito PtetO-sfGFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12:SNR delle intensità di fluorescenza a cella singola. Calcoliamo che il circuito SNR=Mean/STD ( a ) PtetO-GFP prima ripetizione per SNRa210 minuti è 1.309 a.u (b) PtetO-sfGFP circuit prima ripetizione per SNR a 210 minuti è 1.29 a.u (c) Tre ripetizioni della misurazione GFP (d) Tre ripetizioni della misurazione sfGFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13:SNR delle intensità di fluorescenza a singola cella (a)PluxR-sfCircuito GFP SNR per la risposta di saturazione ad AHL (b) PluxR-sfGFP circuit SNR per la risposta a metà tempo ad AHL. L'SNR del circuito regolato AHL a retroazione positiva è superiore a SNR per il circuito costitutivo sfGFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 14: Istogrammi dei circuiti genetici basati sull'analizzatore di flusso: dati sperimentali (blu) e dati del modello stocastico (rosso). L'asse x rappresenta unità di fluorescenza arbitrarie dalla citometria del flusso, e l'asse y rappresenta la frequenza delle cellule che producono il corrispondente livello di fluorescenza. I dati sono stati misurati utilizzando un analizzatore di flusso dopo tre ore. La fluorescenza della GFP è stata quantificata per eccitazione ad una lunghezza d'onda di 484 nm ed emissione ad una lunghezza d'onda di 510 nm. Le tensioni del filtro PE-TexasRed sono state utilizzate su un campionatore ad alta velocità effettiva per misurare i livelli di espressione GFP. Le tensioni dell'analizzatore di flusso sono state regolate utilizzando il software in modo che i livelli massimi e minimi di espressione potessero essere misurati con le stesse impostazioni di tensione. Pertanto, tensioni coerenti sono state utilizzate in ogni intero esperimento. Le stesse tensioni sono state utilizzate per successive ripetizioni dello stesso esperimento. Il montaggio è stato effettuato utilizzando la distribuzione gamma31. Questo metodo presuppone che il segnale dipenda principalmente dalla distribuzione casuale dei plasmidi (a) Misurazione del clone Pteto-GFPsul numero di copie basso plasmide. CV sperimentale=0,46, Modello CV=0,32 (b) Misurazione del Pteto-sfGFP-AAV clonata su plasmide a basso numero di copie. CV sperimentale=0,86, Modello CV=0,44. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 15: Istogrammi dei circuiti genetici basati sul microscopio: dati sperimentali (linee tratteggiate) e dati del modello stocastico (linee solide). L'asse x rappresenta unità di fluorescenza arbitrarie dal microscopio invertito e l'asse y rappresenta la frequenza delle cellule che producono il corrispondente livello di fluorescenza. Il montaggio è stato effettuato utilizzando la distribuzione gamma MATLAB31,32 ( a ) Misurazione del clone PtetO-GFPsunumero di copie basso plasmid (b) Misurazione di PtetO-sfGFP-AAV clonata su numero di copia basso. Il confronto mostra che il nostro protocollo ottiene valori CV simili a quello dell'esperimento dell'analizzatore di flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1: Quattro rapporti di diluizione, tra 1:500 e 1:20, per il ceppo MG1655. Il grafico mostra che se la densità iniziale è alta, i nutrienti LB sono abbondanti con conseguente divisione più rapida delle cellule. Per una diluizione di 1:500, la densità cellulare rimase costante. Per una diluizione 1:100, la densità cellulare aumentò lentamente. Per una diluizione 1:50, la densità cellulare è aumentata a velocità di divisione moderata senza ritardi significativi nell'incubazione di 250 giri/min. Per una diluizione 1:20, la densità cellulare ha raggiunto rapidamente la saturazione. Abbiamo scelto un rapporto di diluizione di 1:30, consentendo una breve incubazione per raggiungere una crescita esponenziale e un intervallo di divisione sostanziale per raggiungere un'elevata saturazione a velocità di divisione moderata. Clicca qui per scaricare questa cifra
Figura complementare 2: Elaborazione di immagini a campo luminoso. (a) Immagini di intensità dei dati grezzi dal canale dei campi luminosi dal sistema al microscopio. (b) Modifica del miglioramento del contrasto dell'immagine per migliorare la separazione degli oggetti cella dallo sfondo. (c) Riconoscimento dei limiti delle celle basato sul filtro di convoluzione33 e sulla soglia globale basata sulla binarizzazione34. (d) Morfologica35 operazioni di chiusura e riempimento per identificare i confini delle colonie cellulari. Clicca qui per scaricare questa cifra
Figura complementare 3: Sfondo colonia cellulare\segmentazione in primo piano. Per ridurre al minimo l'impatto del rumore cerchiamo di identificare i confini della colonia cellulare ed estrarli dal rumore del gel. (a) Operazione di binarizzazione delle immagini sul miglioramento del contrasto basata sulla soglia adattiva per rilevare gli oggetti cella36. (b) Multipiattamento matriciale delle matrici presentato a S2d e S3a filtrando con successo la maggior parte dei rumori e differenziando il rumore gel dalle cellule. Alcuni limiti non sono completamente risolti. (c) Identificazione dei confini cellulari mediante un algoritmo spartiacque37 basato sulla trasformazione della distanza38. (d) Multipiattamento matriciale delle matrici presentate a S3b e S3c che risoluto con successo singole cellule. Clicca qui per scaricare questa cifra
Figura complementare 4: Segmentazione a cella singola. (a) Prodotto segmentato dell'immagine del campo luminoso. L'ulteriore pulizia è preformata in base alla gating e alla forma dell'area cellulare, scartando le bolle rotonde. bimmaginidel segnale di fluorescenza acquisite al microscopio. (c) Multipiattamento matriciale delle matrici presentate a S4a e S4b che estraggono con successo il segnale di singole cellule. Clicca qui per scaricare questa cifra
Figura complementare 5: Perdita di monostrato. (a) Immagine di campo luminoso di uno strato cellulare a 840 minuti (14 ore) di Pteto che regola il circuito GFP mostrato nella figura 2 dell'articolo come un buon esperimento. Sul lato destro della microscopia è possibile rilevare la perdita di immagine del monostrato. (b) Immagine di segmentazione del software. A causa della perdita di cellule monostrato sono frammentate e verranno pulite in base alla gating dell'area. (c) Immagine a fluorescenza che mostra che sul lato destro dell'immagine non è possibile risolvere alcuna voce e un basso segnale di cellule sul lato sinistro dell'immagine a causa della perdita di monostrato. (d) Immagine di segmentazione combinata con l'immagine a fluorescenza. Clicca qui per scaricare questa cifra
Video supplementare 1. Clicca qui per scaricare questo video
Video supplementare 2. Clicca qui per scaricare questo video
Video supplementare 3. Clicca qui per scaricare questo video
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Discussion
In questo lavoro, abbiamo sviluppato un protocollo che consente il tracciamento computerico delle cellule vive di Escherichia coli, seguendo livelli di divisione e fluorescenti per un periodo di ore. Questo protocollo ci permette di quantificare le dinamiche stocastiche dei circuiti genetici in Escherichia coli misurando il CV e l'SNR in tempo reale. In questo protocollo, abbiamo confrontato i comportamenti stocastica di due circuiti diversi come mostrato nella Figura 10. È stato dimostrato che i plasmidi con un basso numero di copie sono più inclini agli effetti stocastica e meno influenzati dalla divisione cellulare. Il primo circuito ha espresso in modo costitutivo GFP (Figura 10a) e il secondo circuito espresso in modo costitutivo sfGFP fuso con un tag di degradazione ssrA (Figura 10b). Al fine di quantificare il comportamento stocastico delle proteine fluorescenti, abbiamo anche registrato le immagini dei campi luminosi. I risultati mostrano che l'espressione di GFP, in particolare alla sua maturazione39, è la fonte di rumore dominante. Il modello periodico di comportamento dei denti della sega osservato nella figura 10a può essere spiegato dal processo casuale di divisione cellulare e dalla scala di lunga durata della maturazione della GFP (~ 50 minuti). Al contrario, il segnale sfGFP del secondo circuito è stato stabilizzato durante la misurazione, perché il tempo di maturazione molto breve della sfGFP (~ 6 minuti). Abbiamo sviluppato una formula semplice che descrive il livello di GFP in entrambi i circuiti quando consideriamo solo il processo di divisione cellulare e il tempo di maturazione GFP. In un dato momento, t, assumiamo che ci siano x numeri di copia di proteine e μ numeri di copia dei plasmidi. Il numero di copia proteica può essere descritto da:
1.3
1.4
Quando si considerano solo gli eventi di divisione; 
dopo la maturazione proteica e così per i plasmidi specifici otteniamo:
Per la GFP ( 
): 1.5
Per sfGFP ( 
):1.6
Quindi, la serie sviluppata di sfGFP:
1.7
Nel caso in cui 
, otteniamo 
. Questo risultato può essere spiegato come segue. Quando x è piccolo, i livellidi SF GFP aumentano di una piccola quantità. Quando x è grande, sfGFP viene degradato a uno stato stazionario. Allo stesso modo, per il circuito della GFP, ogni cellula contiene circa 10 unità di GFP, ma poiché il tempo di maturazione per la GFP è più lungo della mitosi, si osservano modelli degradanti dei denti a sega di intensità di fluorescenza. Nel modello, abbiamo supposto che la replicazione del plasmide sia abbastanza veloce da garantire che la distribuzione plasmide rimanga costante prima e dopo la divisione. Il tag di degradazione ssrA spesso riduce il tempo di emimanazione della proteina da ore ameno di un'ora 5 e porta a uno stato stazionare veloce. Abbiamo dimostrato che il metodo fornisce anche una distribuzione simile a quella misurata con un analizzatore di flusso di popolazione elevato e che il CV di questa distribuzione è uguale o inferiore al CV dell'analizzatore di flusso.
Mentre diversi metodi3,7,18 sono stati sviluppati per l'imaging di cellule vive, il metodo qui presentato è su misura per Escherichia coli. Questo batterio richiede un supporto speciale e un approccio leggermente diverso. Il protocollo ha le seguenti caratteristiche importanti: (1) Stabilire un rapporto di diluizione specifico per i batteri e il ceppo all'inizio della crescita esponenziale piuttosto che nella fase centrale (crescita esponenziale senza tremare) (2) Escherichia coli si divide meglio a 37 °C, ma a 37 °C il gel multimediale minimo perde rapidamente acqua che porta a restringimento e instabilità. Il protocollo qui supera questa sfida (3) Applichiamo prima il campione di batteri e poi lo sigillamo con gel liquido. Poiché il campione è intrappolato tra il fondo di vetro e il gel, abbiamo bisogno di un gel che (I) consenta lo scambio di gas per evitare di tagliare le sacche d'aria, (II) rimanga liquido a basse temperature in quanto Escherichia coli è sensibile al calore e (III) assicura che il campione non venga miscelato all'interno del gel liquido. Il gel rimane liquido a 37 °C, tuttavia, si consiglia l'uso di un cappuccio protettivo sopra il campione per evitare un eccessivo calore e la miscelazione del campione all'interno del gel (4) Questo approccio richiede apparecchiature semplici e generiche (5) I campioni possono essere misurati direttamente senza preriscaldamento, quindi non vi è perdita di eventi di divisione (6) Il protocollo, che include le fasi wet-lab e il software automatizzato personalizzato, può essere utilizzato per studiare il comportamento stocastico dei circuiti genetici come la quantificazione della SNR e del CV dei segnali del circuito. Abbiamo confrontato il metodo della microscopia con i risultati dell'analizzatore di flusso al fine di convalidare l'uso di piccole popolazioni di cellule e stabilire una linea di base per il confronto secondo CV (7) Il software ci consente di rilevare le cellule sul monostrato senza l'intervento umano e analizzare il rumore totale. Strumenti software come ImageJ18 o Schnitzcells richiedono l'identificazione manuale delle celle e sono difficili da modificare.
Quando si imagingno continuamente colonie di cellule viventi, progettare l'esperimento considerando diversi parametri fisici complessi, come lo stress cellulare e la tossicità, il tasso di esaurimento delle risorse, la necrosi e il tempo di degradazione di induttori e sostanze chimiche. Il protocollo consente una misurazione affidabile fino a cinque ore. I nostri esperimenti suggeriscono che Escherichia coli si sincronizzi quando si divide in colonie micro monostrato (Supplementary Video 3). Supponiamo che il gel sia uniforme in termini di risorse e tenacità, che le cellule abbiano un comportamento simile e che il campo di illuminazione sia leggermente più grande dal campo visivo. Pertanto, ogni cella dovrebbe produrre lo stesso segnale e gli stessi dati statistici, che possono essere raccolti come abbiamo mostrato confrontando cv ottenuto in questo modo con la misurazione con un analizzatore di flusso. Al fine di misurare il rumore a condizioni iniziali costanti per periodi di tempo più lunghi, prenderemo in considerazione l'uso di chip microfluidici in futuro. Ulteriori vantaggi di un tale dispositivo sono il mantenimento di posizioni fisse delle celle e la messa a fuocostabile 10. Tuttavia, la progettazione, la fabbricazione di chip microfluidici e l'adescamento per esperimenti richiedono formazione, attrezzature specifiche (fatte su misura a volte) e tempo. Per questo motivo, è utile utilizzare la microscopia time lapse come mostrato in questo protocollo per acquisire una comprensione generale del circuito.
Il protocollo proposto e il software sviluppato consentono misurazioni riproducibili, da cui è semplice ricavare grafici. Consente inoltre di testare e confrontare il rumore totale e può essere modificato per misurare il rumore intrinseco ed estrinseco. Il metodo si basa su materiali generici o facili da ordinare, software apertamente condivisi e facili da usare e non richiede una formazione specifica. Abbiamo dimostrato che la popolazione misurata per microscopia è abbastanza grande da ottenere dati significativi confrontando il cv del metodo con quello ottenuto con un analizzatore di flusso. Pertanto, possiamo stabilire con successo una linea di base SNR utilizzando questo protocollo e confrontarla con circuiti genetici più complessi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Sig. Gil Gelbert (Facoltà di Ingegneria Elettrica, Technion) per aver assistervi con il codice MATLAB. Ringraziamo il Dr. Ximing Li (Facoltà di Ingegneria bio-medica, Technion) per aver assistenza nella correzione di questo articolo. Questa ricerca è stata parzialmente supportata dalla Neubauer Family Foundation e dal Ministero della Scienza israeliano, sovvenzione 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
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