Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Papirbaseret forkoncentration og isolering af mikrovekler og exosoler

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret er en protokol til at fremstille en papir-baseret enhed til effektiv berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer.

Abstract

Microvesicles og exosomer er små membranøse vesikler frigivet til det ekstracellulære miljø og cirkulerede i hele kroppen. Fordi de indeholder forskellige forældrecellebaserede biomolekyler såsom DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, er deres berigelse og isolation afgørende skridt for deres udnyttelse som potentielle biomarkører til kliniske anvendelser. Konventionelle isolationsmetoder (f.eks. ultracentrifugation) forårsager imidlertid betydelige tab og skader på mikrovekler og exosomer. Disse metoder kræver også flere gentagne trin i ultracentrifugation, lastning og spilde af reagenser. Denne artikel beskriver en detaljeret metode til at fremstille en origami-papir-baseret enhed (Exo-PAD) designet til effektiv berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer på en enkel måde. Exo-PAD's unikke design, der består af harmonikalignende flerfoldede lag med konvergerende prøveområder, er integreret med ionkoncentrationspolariseringsteknikken, hvilket muliggør femdoblet berigelse af mikrovekler og exosomer på specifikke lag. Desuden er de berigede mikrovekler og exosomer isoleret ved blot at udfolde Exo-PAD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikrovekler og exosomer er små membran vesikler, der måler henholdsvis 0,2−1 μm og 30−200 nm. De udskilles i det ekstracellulære miljø af flere forskellige celletyper1,,2,,3,,4,,5. De indeholder forældrecelle oplysninger i form af undergrupper af DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, og cirkulerer i hele kroppen via forskellige kropsvæsker såsom serum, plasma, urin, cerebrospinalvæske, fostervand, og spyt6,7,8,9. Således kan teknikker til effektiv isolering af mikrovekler og exosomer fra biologiske væsker give omfattende muligheder inden for diagnose, prognose, og real-time overvågning af sygdom, samt i udviklingen af nye terapeutiske.

Den konventionelle isolationsmetode for mikrovesiler og exosomer baseret på ultracentrifugation er imidlertid yderst tidskrævende og medfører betydelige tab og kontaminering af prøven. Dette skyldes , at det indebærer flere besværlige pipetterings- og lastningstrin og udsmid af forskellige reagenser med gentagen ultracentrifugation5,6,10,11,12. Desuden kan den høje forskydningsbelastning forårsaget af ultracentrifugation (~100.000 x g) forårsage fysisk lysis af mikrovende stoffer og exosomer, hvilket giver dårlige restitutionsrater (5−23 %)6,13,14. Derfor skal der udvikles en yderst effektiv, diskret isolationsteknik til mikrovende stoffer og exosomer for at reducere skader og tab og derved opnå højere restitutionsrater.

En origami-papir-baseret enhed (Exo-PAD) blev udviklet til enklere, blidere, og meget effektiv isolering af mikrovekler og exosomer6. Udformningen af Exo-PAD er et flerfoldet papir med serielt forbundne prøveområder, der gradvist falder i diameter. Ionkoncentrationspolariseringsteknikken (ICP), som er et nanoelektrokinetisk fænomen, der prækoncentrerer ladede biomolekyler, blev integreret med dette unikke design. Brug af Exo-PAD resulterede i femdoblet berigelse af mikrovekler og exosomer i specifikke lag og deres isolation ved blot at folde enheden ud. Denne artikel beskriver Exo-PAD i detaljer, fra den samlede enhed fabrikation og drift til analyse af dens anvendelse, for at illustrere metoden og vise repræsentative resultater6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling af udstyr

  1. Definer det område, der skal udskrives på papir, ved hjælp af printersoftware (Materialetabel).
    BEMÆRK: Designet har 12 voksmønstrede lag, hvor diametrene af de cirkulære prøveområder gradvist indsnævres fra 5 mm til 2 mm (figur 1A).
  2. Udskriv hydrofobvoks på de udpegede områder på begge sider af cellulosepapiret (Materialetabellen) ved hjælp af et kommercielt voksprinter (Materialetabel) (Figur 1B).
  3. Det vokstrykte papir placeres i en laboratorieovn i 80 s ved 120 °C.
    BEMÆRK: Dette trin gør det muligt for voks at nå indersiden af papiret ved at opnå en termisk reflow af den trykte voks. Med denne inkubationsprotokol er mønsterets opløsning ~2 mm. Således skal du passe på ikke at udskrive mønstre på mindre end 2 mm. Ellers mønstre vil blive blokeret af voks.
  4. Skær vokstrykt papir med en fræser for at lave individuelle enheder( Figur 1C).
  5. Dråbe 5 μL og 2 μL permselektive membran (f.eks. Tabel over materialer) prøveområderne i henholdsvis lagene længst til venstre og længst til højre ( figur1D).
  6. Lagene, der er belagt med den permsektiv membran, placeres på en varmeplade ved 70 °C i 30 minutter for at fordampe det permselektive membranopløsningsmiddel.
  7. Forsegle den yderste overflade af det belagte lag mod bufferløsningen med trykfølsomt tape, så der efterlades et lille hul.
  8. Fold den trykte individuelle enhed (dvs. Exo-PAD) frem og tilbage langs de hvide linjer.
    BEMÆRK: Ved at folde enheden bliver alle prøveområder konvergerende forbundet (Figur 1E). Dette konvergerende design fokuserer de elektriske feltlinjer, når spændingen anvendes til ICP, opnå mere intensiv prækoncentration af mikrovekler og exosomer.

2. Berigelse og rumlig fokusering af mikrovesicles og exosomer ved ionkoncentration polarisering

  1. 15 μL af mikrovesikel- og exosomprøven (~3 x 1011 partikler/ml i 0,1x fosfatbufferet saltvand [PBS] med 0,05% Tween 20) i de konvergerende prøveområder ved at pipettere og vente et par sekunder for at sikre fuldstændig befugtning af alle prøveområder (Figur 1F).
  2. Placer to akrylkamre i begge ender af Exo-PAD og klem Exo-PAD sikkert med små bindemiddelclips for at forhindre udfoldning (Figur 1G).
  3. Kamrene fyldes med 110 μL 0,1 x PBS, og der indsættes to Ag/AgCl-elektroder (figur 1H).
  4. Påfør 30 V på elektroderne i 20 min ved hjælp af et strømspændingskildemålesystem (Materialetabel).
    BEMÆRK: Den anvendte spænding genererer ICP-fænomenet og preconcentrates mikrovesker og exosomer på lag 8 og 9 i Exo-PAD.

3. Isolering af de berigede mikrovekler og exosomer

  1. Adskil den foldede Exo-PAD fra akrylkamrene og fold enheden ud for at isolere de berigede mikrovende stoffer og exosomer fra de andre lag (Figur 1I).
  2. Udstans prøveområderne i lag 8 og 9, hvor mikrovesker og exosomer beriges, til downstream-analyse (Figur 1J).

4. Scanning elektron mikroskopi analyse

  1. De berigede mikrovesikler og exosomer blev tilsat ved nedsænkning af de udstansede områder i 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M natrium cacodylasatbuffer i 1 time og i 1% osmium tetroxid i 0,1 M natrium cacodhyat for 1 time.
    FORSIGTIG: Osmium tetroxid er meget giftigt og farligt kemikalie. Fordi osmium tetroxid kan trænge ind plast, skal det opbevares i glas. Enhver håndtering af osmium tetroxid skal udføres i en kemisk røghætte med dobbelte nitrilhandsker.
  2. Dehydrere de faste mikrovekler og exosomer med stigende kvaliteter på 200 bevis ethanol (dvs. 50%, 70%, 90% og 100%) i 30 min hver.
  3. Prøven tørres kemisk ved at nedsænke den i hexamethyldisilazane i en eksikator i 30 min.
    FORSIGTIG: Hexamethyldisilazane er et brandfarligt og fugtfølsomt kemikalie. Det skal opbevares i et tørt og godt ventileret område væk fra antændelseskilder.
  4. Coat de helt tørrede mikrovesikler og exosomer med guld / palladium (~ 20 nm) via sputtering og fange scanning elektron mikroskopi (SEM) billeder.

5. Analyse af sporing af nanopartikel

  1. Punch ud prøven områder i lag 6, 8 og 10 ved hjælp af en biopsi punch efter 20 min enhed drift.
  2. Forsænk hvert udstanset område i bufferopløsning (0,1 x PBS med 0,01 % Tween 20).
  3. Vortex i 10 min og centrifuge i 30 s ved 6.000 rpm at resuspendre de berigede mikrovende stoffer og exosomer.
  4. Fjern de udstansede områder fra opløsningen, og mål koncentrationen af mikrovekler og exosomer ved hjælp af et NTA-instrument (Nanopartiicle tracking analysis) (Table of Materials).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Driftstiden skal optimeres for at opnå det maksimale genvindingsudbytte af de berigede mikrovekler og exosomer. Utilstrækkelig tid tillader ikke tilstrækkelig migration af mikrovekler og exosomer, hvilket reducerer berigelsen, mens overdreven tid forr formindsker den rumlige fokusering og dermed spreder mikrovepik og exosomer. Således kan den maksimale prækoncentrationsfaktor for mikrovesiler og exosomer og den endelige placering, hvor mikrovende stoffer og exosomer er mest berigede, identificeres gennem tidsoptimeringstrinnet. For at finde mikroveklernes og exosomers endelige placering blev der observeret tidsforskudt migration af fluorescerende mærkede mikrovekler og exosomer med et mikroskop (figur 2A), og fluorescensintensiteten i alle prøveområder blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ-software (Figur 2B). Før berigningsprocessen(figur 2A, 0 min), blev mikrovekler og exosomer spredt i alle prøveområder med et gradvist fald i intensiteten på grund af papirmatrixens lille filtreringseffekt (figur 2B, 0 min). Efter 10 min behandling(Figur 2A,10 min), mikrovestik og exosomer migreret elektrokinetisk og en øjeblikkelig prækoncentration stik dukkede op på lag 7. Yderligere forarbejdning opnået større prækoncentration af mikrovekler og exosomer. Når processen tid nåede 20 min, mikrovekler og exosomer var stærkt fokuseret på lag 8 og 9(Figur 2A,20 min) og beriget femdoblet, baseret på fluorescens intensitet(Figur 2B, 20 min).

Efter at have afsluttet prækoncentrationsprocessen blev de berigede mikrovekler og exosomer isoleret ved at folde enheden ud, og prøveområdet i lag 8 blev udstanset til yderligere analyse. SEM-billeder blev opnået for at undersøge integriteten af de berigede mikrovekler og exosomer. Som vist i SEM-billederne (figur 3A), blev der observeret betydeligt flere ikke-beskadigede mikrovende stoffer og exosomer efter berigelsesprocessen. Ved hjælp af de opnåede SEM-billeder blev størrelsesfordelingen af de berigede mikrovende stoffer og exosomer analyseret (figur 3B), hvor exosomer og mikroveksler blev skelnet baseret på en tærskeldiameter på 200 nm. Med andre ord varierede størrelsen af exosomer fra 95-195 nm med en gennemsnitlig diameter på 134 nm og størrelsen af mikrobåndene fra 214-377 nm med en gennemsnitlig diameter på 315 nm.

Efterfølgende blev den faktiske koncentration af de berigede mikrovekler og exosomer på prøveområderne i lag 6, 8 og 10 analyseret af NTA. Før tilsætning var koncentrationen ~2,24 x 1011 partikler/ml i lag 8 (figur 3C, lag 8). Efter tilsætning var koncentrationen ~1,25 x 1012 partikler/ml i lag 8 (figur 3C, lag 8), hvilket indikerer, at mikrovesikler og exosomer var prækoncentreret af en faktor på ~5,58. Mærkbar prækoncentration blev ikke observeret på de andre lag (figur 3C, lag 6 og 10). Samlet set viser disse resultater, at den foreslåede papirbaserede anordning kan berige mikrovekler og exosomer med ca. femdoblede.

Enhedens isolationseffektivitet blev evalueret som følger: Prøvevolumen, der kan rummes af lag 8 og 9, er ~2,2 μL ud af i alt 15 μL prøvevolumen i 10 lag på grund af Exo-PAD'ens indsnævringsdesign. Hvis vi antager et ideelt tilfælde, hvor alle mikrovestikkerne og exosomer er prækoncentreret på lag 8 og 9, og ingen går tabt, så bør den ideelle prækoncentrationsfaktor være ~ 6,8 (15 μL/2,2 μL = ~6,8). Den eksperimentelle prækoncentrationsfaktor, der blev opnået ved NTA (figur 3c), var imidlertid ~5,58, hvilket betyder, at en del af 1,22 mikroveksler og exosomer gik tabt ved lysis eller uspecifikke bindinger til papirmatrixen.
Equation 1
hvor 2,24 x 1012 partikler/ml er den oprindelige koncentration af mikrovekler og exosomer. Ud fra denne beregning er exo-PAD'ens forventede tab ca. 18 %. Isolationseffektiviteten er således ca. 82 %. Dette er en betydelig forbedring i forhold til de dårlige udbytter af ultracentrifugation (5%-23%).

Figure 1
Figur 1: Overordnede Exo-PAD-procedurer, fra samling til drift. (A) Software design til at guide trykning af hydrofob voks på cellulose papir. (B) Det vokstrykte papir efter inkubation i en ovn i 80 s ved 120 °C. (C) De enkelte enheder skæres ud ved hjælp af en fræser. DD) Permsektiv membranopløsning tabes på prøveområderne i lagene længst til venstre og til højre, og opløsningsmidlet fordampes på en kogeplade ved 70 °C i 30 min. (E) Den trykte Exo-PAD foldes frem og tilbage langs de hvide linjer. alle prøveområder er således konvergerende forbundet. FF) Der i prøveområdet indlæses en mikroslægt og en exosomprøve. (G) To akrylkamre anbringes for enderne af anordningen og fastgøres med små bindemiddelclips. (H) Akrylkamrene fyldes med bufferopløsning, og to Ag/AgCl-elektroder indsættes for at anvende en spænding på 30 V. (I) Anordningen udfoldes for at isolere de prækoncentrerede mikroveksler og exosomer. (J) Prøveområderne i lag 8 og 9 udstanses til analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Observation af fluorescerende mærkede mikroveksler og exosomer under udstyrets drift og tilsvarende fluorescensintensiteter. (A) Time-lapse observation af mikrovekler og exosomer. Skalabjælke = 5 mm. Med 20 min forarbejdning var mikroveklerne og exosomer stærkt fokuseret på lag 8 og 9, hvor (B) blev de beriget med ca. femdoblet. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Analyse af de berigede mikrovende stoffer og exosomer. (A) SEM-billeder, der viser integriteten af de berigede mikrovende stoffer og exosomer. Efter prækoncentration blev der observeret mange flere mikrovekler og exosomer6. Skalabar = 1 μm. BB) Størrelsesfordeling af de berigede mikrovekler og exosomer. Exosomstørrelserne var 95−195 nm (middeldiameter = 134 nm) og mikrovesikelstørrelser var 214−377 nm (middeldiameter = 315 nm). CC) Den faktiske koncentration af de berigede mikrovende stoffer og exosomer, der er vurderet ved hjælp af NTA. Efter tilsætningen femdoblede koncentrationen af mikrovekler og exosomer, hvilket er i overensstemmelse med fluorescensresultater6. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse (n = 3). Panel A og C gengives med tilladelse fra Kim et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Microvesicles og exosomes præconcentreret og fokuseret på lag 8 blev adskilt fra kvæg serum albumin (BSA), som opholdt sig i lag 1-3. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Selv om Exo-PAD blev anvendt med succes til berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer, bør flere kritiske punkter nøje overvejes: 1) ovnens inkubationstid og -temperatur under enhedens tilberedning, 2) behandlingstid, 3) påføring af spænding med varierende lagtal og prøveområdediametre og 4) anvendelighed på kliniske prøver.

Inkubationstiden og -temperaturen i protokollen er optimerede betingelser for at fremstille en pålidelig enhed. Længere inkubationstider eller en højere temperatur kan forårsage forvrængning af det konvergerende design på grund af den store genudgang af den trykte voks. Dette vil forhindre dannelsen af fokuserede elektriske feltlinjer og dermed øge migrationsmodstanden under den elektrokinetiske berigelsesproces.

Behandlingstiden er også en faktor, der skal tages i højde for maksimal berigelse og isolering. En behandlingstid på <20 min resulterer i mindre prækoncentration, fordi der ikke er tilstrækkelig tid til at tillade mikrovesikel og exosommigration. På den anden side, en behandlingstid på > 20 min forredder fokusering effektivitet og tillader spredning af de berigede mikrovekler og exosomer. Ifølge denne test, 20 min er den bedste behandlingstid for at opnå maksimal berigelse og isolering af mikrovesicles og exosomer.

Den anvendte spænding er en anden vigtig faktor at overveje. I denne protokol anvendes 30 V i betragtning af antallet af lag og prøvearealdiametrene til at opnå stabil prækoncentration og isolering. Når der genereres et ICP-fænomen i enheden, kan driftsordningen opdeles i tre forskellige regioner i henhold til den anvendte spænding: (1) ohmic, (2) begrænsning og (3) overlimiterenderegion 6,15,16. Ved stabil prækoncentration og isolering bør anordningen anvendes i det begrænsende område, hvor der dannes en ionudtømningszone, og mikrovekler og exosomer er stabilt prækoncentreret. I denne eksperimentelle indstilling svarer driftsspændingsområdet (5−40 V) til det begrænsende område for Exo-PAD. Hvis den anvendte spænding er <5 V, fungerer enheden i det ohmiske område, hvor den elektriske strøm stiger lineært, hvilket indikerer, at der ikke genereres nogen ionudtømningsregion til førkoncentration. Men hvis spændingen er >40 V, ødelægges ionudtømningsområdet af stærk spændingsdrevet elektrokonvektion, som destabiliserer prækoncentrationen. I betragtning af disse faktorer blev det fastslået, at 30 V var den optimale spænding til brug for en enhed med 12 lag og en prøveområdediameter på 2−5 mm. Lagnumre eller prøvearealdiametre kan øges for at forstørre prøvevolumen, men disse faktorer samt driftsspændingen bør optimeres for at opnå stabil berigelse af mikrovekler og exosomer.

Den foreslåede Exo-PAD kan bruges til at isolere mikrovekler og exosomer fra forskellige kliniske prøver, herunder spyt, urin, serum og plasma. For prøver med mindre protein, såsom spyt eller urin, kan mikrovekler og exosomer let isoleres uden større ændringer, fordi en lille mængde protein i disse prøver vil blive filtreret ud gennem uspecifikke binding til papiret. Når du betjener enheden inden for det begrænsende område, er det kun den anvendte spænding, der skal tages i betragtning, da prøvernes ionstyrke kan være anderledes. For proteinrige prøver, såsom serum eller plasma, bør både prækoncentrationen af mikrovende stoffer og exosomer og deres adskillelse fra rigelige proteiner overvejes nøje. Vores seneste eksperiment viser, at adskillelsen af mikrovekler og exosomer fra proteiner forbedres betydeligt, når der anvendes karbonatbuffer, fordi karbonatbufferen resulterer i en højere elektrisk ladningsforskel mellem mikrovekler og exosomer og protein på grund af det isoelektriske punkt, hvilket resulterer i bedre separationseffektivitet. Til dette eksperiment blev et stof med rigelige proteiner, der eksisterer side om side med mikroveksler og exosomer, efterlignet ved at blande rensede mikroveksler og exosomer mærket med FITC (Ex/Em: 490/520 nm) med BSA mærket med en anden fluorofore (Ex/Em: 590/617 nm) i 50 mM carbonatbuffer (Materialetabel). Som vist i supplerende figur 1var de fleste mikrovekler og exosomer prækoncentreret på lag 8, som i figur 2A, og de blev adskilt fra BSA, som forblev i lag 1-3. Dette resultat tyder på, at berigelse fra et serum eller en plasmaprøve kræver et ekstra trin tilsætning af karbonatbuffer til prøven og viser tydeligt, at Exo-PAD kan rense mikrovekler og exosomer fra rigelige proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee blev støttet af et forskningstilskud fra Kwangwoon University i 2019. Hyerin Kim blev støttet af "Kompetenceudviklingsprogram for branchespecialister" fra det koreanske ministerium for handel, industri og energi (MOTIE), der drives af Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-program for industriel konvergens af bærbare smart-enheder).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14, (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17, (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21, (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34, (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19, (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11, (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39, (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18, (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91, (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16, (5), 925-931 (2016).
Papirbaseret forkoncentration og isolering af mikrovekler og exosoler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter