Summary
Présenté est un protocole pour fabriquer un dispositif à base de papier pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes.
Abstract
Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membraneuses libérées dans l’environnement extracellulaire et distribuées dans tout le corps. Étant donné qu’ils contiennent diverses biomolécules d’origine cellulaire parentale telles que l’ADN, l’ARNm, le miARN, les protéines et les lipides, leur enrichissement et leur isolement sont des étapes essentielles pour leur exploitation en tant que biomarqueurs potentiels pour les applications cliniques. Toutefois, les méthodes d’isolement conventionnelles (p. ex., l’ultracentrifugation) causent des pertes et des dommages importants aux microvesicules et aux exosomes. Ces méthodes nécessitent également de multiples étapes répétitives d’ultracentrifugation, de chargement et de gaspillage de réactifs. Cet article décrit une méthode détaillée pour fabriquer un dispositif à base de papier origami (Exo-PAD) conçu pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes d’une manière simple. La conception unique de l’Exo-PAD, composée de couches multiples en forme d’accordéon avec des zones d’échantillonnage convergentes, est intégrée à la technique de polarisation de la concentration des ions, permettant ainsi un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes sur des couches spécifiques. En outre, les microvesicules enrichies et les exosomes sont isolés en déployant simplement l’Exo-PAD.
Introduction
Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membranaires mesurant respectivement 0,2−1 μm et 30−200 nm. Ils sont sécrétés dans l’environnement extracellulaire par plusieurs types de cellules différents1,2,3,4,5. Ils contiennent des informations relatives aux cellules parentales sous forme de sous-ensembles d’ADN, d’ARNm, de miARN, de protéines et de lipides, et circulent dans tout le corps via divers fluides corporels tels que le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, le liquide amniotique et la salive6,,7,8,9. Ainsi, les techniques d’isolement efficace des microvesicules et des exosomes des fluides biologiques peuvent fournir de vastes possibilités dans les domaines du diagnostic, du pronostic et de la surveillance en temps réel de la maladie, ainsi que dans le développement de nouvelles thérapies.
Cependant, la méthode d’isolement conventionnelle pour les microvesicules et les exosomes basée sur l’ultracentrifugation prend énormément de temps et entraîne une perte et une contamination importantes de l’échantillon. C’est parce qu’il implique plusieurs étapes lourdes de pipetage et de chargement et le rejet de divers réactifs avec ultracentrifugation répétée5,6,10,11,12. En outre, le stress de cisaillement élevé induit par l’ultracentrifugation (~100 000 x g)peut causer la lyse physique des microvesicules et des exosomes, ce qui donne de faibles taux de récupération (5−23%)6,13,14. Par conséquent, une technique d’isolement discrète et très efficace pour les microvesicules et les exosomes doit être développée pour réduire les dommages et les pertes, atteignant ainsi des taux de récupération plus élevés.
Un dispositif origami-papier (Exo-PAD) a été développé pour un isolement plus simple, plus doux et très efficace des microvesicules et des exosomes6. La conception de l’Exo-PAD est un papier multifréqué avec des zones d’échantillonnage reliées en série qui diminuent progressivement de diamètre. La technique de polarisation de la concentration des ions (ICP), qui est un phénomène nano-électrocinétique qui préconcentre les biomolécules chargées par les préconcentrés, a été intégrée à cette conception unique. L’utilisation de l’Exo-PAD a entraîné un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes dans des couches spécifiques et leur isolement en déroulant simplement l’appareil. Cet article décrit l’Exo-PAD en détail, de la fabrication et de l’exploitation globales de l’appareil à l’analyse de son utilisation, pour illustrer la méthode et afficher des résultats représentatifs6.
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Protocol
1. Fabrication d’appareils
- Définir la région à imprimer sur papier à l’aide d’un logicield’imprimante( Table des matériaux ).
REMARQUE : La conception comporte 12 couches à motifs de cire dans lesquelles les diamètres des zones d’échantillonnage circulaires se rétrécissent progressivement de 5 mm à 2 mm (figure 1A). - Imprimer de la cire hydrophobe sur les régions désignées des deux côtés du papier cellulosique ( Tableau des matériaux) àl’aide d’uneimprimante de cire commerciale (Tableau des matériaux) ( Figure1B).
- Placer le papier imprimé ciré dans un four de laboratoire pendant 80 s à 120 °C.
REMARQUE : Cette étape permet à la cire d’atteindre l’intérieur du papier en réalisant un réflow thermique de la cire imprimée. Avec ce protocole d’incubation, la résolution du motif est de ~2 mm. Ainsi, veillez à ne pas imprimer des motifs de moins de 2 mm. Sinon, les motifs seront bloqués par la cire. - Couper le papier imprimé ciré à l’aide d’un coupeur pour fabriquer des appareils individuels (figure 1C).
- Baisse de 5 μL et de 2 μL de membrane permsélective (p. ex., Nafion; Tableau des matériaux) sur les zones d’échantillonnage dans les couches les plus à gauche et à droite, respectivement (figure 1D).
- Placez les couches recouvertes de la membrane permsélective sur une plaque chauffante à 70 °C pendant 30 min pour évaporer le solvant de membrane permsélective.
- Sceller la surface la plus externe de la couche enduite face à la solution tampon avec du ruban sensible à la pression, laissant un petit trou.
- Pliez l’appareil individuel imprimé (c.-à-d. Exo-PAD) d’avant en arrière le long des lignes blanches.
REMARQUE : En pliant l’appareil, toutes les zones d’échantillonnage deviennent convergentes (figure 1E). Cette conception convergente concentre les lignes de champ électrique lorsque la tension est appliquée pour ICP, réalisant une préconcentration plus intensive des microvesicules et des exosomes.
2. Enrichissement et focalisation spatiale des microvesicules et des exosomes par polarisation de la concentration d’ions
- Chargez 15 μL de l’échantillon de microvesicle et d’exosome (~3 x 1011 particules/mL en 0,1x de phosphate tamponné saline [PBS] avec 0,05% Tween 20) dans les zones d’échantillonnage convergentes en pipeting et attendre quelques secondes pour assurer le mouillage complet de toutes les zones d’échantillonnage (Figure 1F).
- Placez deux chambres acryliques aux deux extrémités de l’Exo-PAD et serrez l’Exo-PAD en toute sécurité avec de petits pinces à reliure pour éviter le déploiement (Figure 1G).
- Remplissez les chambres de 110 μL de 0,1 x PBS et insérez deux électrodes Ag/AgCl (Figure 1H).
- Appliquer 30 V sur les électrodes pendant 20 min à l’aide d’un système de mesure de la source de tension de courant (Table des matériaux).
REMARQUE : La tension appliquée génère le phénomène ICP et préconcentre donc les microvesicles et les exosomes sur les couches 8 et 9 de l’Exo-PAD.
3. Isolation des microvesicules et exosomes enrichis
- Séparez l’Exo-PAD plié des chambres acryliques et dépliez l’appareil pour isoler les microvesicules enrichies et les exosomes des autres couches (Figure 1I).
- Éperner les zones d’échantillonnage dans les couches 8 et 9, où les microvesicules et les exosomes sont enrichis, pour l’analyse en aval (Figure 1J).
4. Analyse de microscopie électronique à balayage
- Fixer les microvesicules enrichies et les exosomes en immergeant les zones perforées dans 2,5% de glutaraldéhyde dans 0,1 M tampon de cacodylate de sodium pour 1 h et dans 1% de tétroxide d’osmium dans 0,1 M de cacodylate de sodium pendant 1 h.
ATTENTION : Le tétroxide d’osmium est un produit chimique hautement toxique et dangereux. Parce que le tétroxide d’osmium peut pénétrer dans les plastiques, il doit être stocké dans le verre. Toute manipulation de tétroxide d’osmium doit être effectuée dans un capot de fumée chimique avec des gants de nitrule double. - Déshydrater les microvesicules fixes et les exosomes avec des teneurs ascendantes de 200 éthanols de preuve (c.-à-d. 50%, 70%, 90%, et 100%) pendant 30 min chacun.
- Sécher chimiquement l’échantillon en l’immergeant dans l’hexaméthyldisilazane dans un desiccateur pendant 30 min.
ATTENTION : Hexaméthyldisilazane est un produit chimique inflammable et sensible à l’humidité. Il doit être stocké dans une zone sèche et bien aérée, à l’écart des sources d’inflammation. - Enrober les microvesicules et les exosomes complètement séchés d’or/palladium (~20 nm) par pulvérisation et capture de microscopie électronique à balayage (SEM).
5. Analyse de suivi des nanoparticules
- Poinçonnez les zones d’échantillon dans les couches 6, 8 et 10 à l’aide d’un poinçon de biopsie après 20 min d’opération de l’appareil.
- Plongez chaque zone perforée dans une solution tampon (0,1 x PBS avec 0,01% Tween 20).
- Vortex pendant 10 min et centrifugeuse de 30 s à 6 000 tr/min pour réutiliser les microvesicules enrichies et les exosomes.
- Retirer les zones perforées de la solution et mesurer la concentration de microvesicules et d’exosomes par un instrument d’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)(Tableau des matériaux).
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Representative Results
Le temps d’opération doit être optimisé pour atteindre le rendement maximal de récupération des microvesicles enrichis et des exosomes. Le temps insuffisant ne permet pas une migration suffisante des microvesicules et des exosomes, ce qui diminue l’enrichissement, alors que le temps excessif détériore la focalisation spatiale et disperse donc les microvesicules et les exosomes. Ainsi, grâce à l’étape d’optimisation du temps, le facteur maximum de préconcentration des microvesicules et des exosomes et l’emplacement final où les microvesicules et les exosomes sont les plus enrichis peuvent être identifiés. Pour trouver l’emplacement final des microvesicules et des exosomes, la migration en time-lapse des microvesicules et des exosomes fluorescents a été observée au microscope (figure 2A)et les intensités de fluorescence dans toutes les zones d’échantillonnage ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ (Figure 2B). Avant le processus d’enrichissement(figure 2A, 0 min), les microvesicules et les exosomes étaient dispersés dans toutes les zones d’échantillonnage avec une diminution progressive de l’intensité en raison de la légère action de filtrage de la matrice de papier (figure 2B, 0 min). Après 10 min de traitement(figure 2A, 10 min), microvesicles et exosomes ont migré électrokinetiquement et un bouchon instantané de préconcentration est apparu sur la couche 7. Un traitement ultérieur a permis d’obtenir une plus grande préconcentration des microvesicules et des exosomes. Lorsque le temps de processus a atteint 20 min, les microvesicules et les exosomes étaient fortement concentrés sur les couches 8 et 9(figure 2A, 20 min) et enrichis cinq fois, en fonction des intensités de fluorescence (figure 2B, 20 min).
Après avoir terminé le processus de préconcentration, les microvesicules enrichies et les exosomes ont été isolés en dépluant l’appareil et la zone de l’échantillon dans la couche 8 a été perforée pour une analyse plus approfondie. Des images sem ont été obtenues pour étudier l’intégrité des microvesicules enrichies et des exosomes. Comme indiqué dans les images sem (figure 3A), beaucoup plus de microvesicles et d’exosomes non-damamed ont été observés après le processus d’enrichissement. À l’aide des images SEM obtenues, la répartition de la taille des microvesicules enrichies et des exosomes a été analysée (figure 3B), où les exosomes et microvesicules ont été distingués sur la base d’un diamètre seuil de 200 nm. En d’autres termes, la taille des exosomes variait de 95 à 195 nm avec un diamètre moyen de 134 nm et celle des microvesicles de 214 à 377 nm avec un diamètre moyen de 315 nm.
Par la suite, la concentration réelle des microvesicules enrichies et des exosomes sur les zones d’échantillonnage dans les couches 6, 8 et 10 a été analysée par l’ANT. Avant l’enrichissement, la concentration était de ~2,24 x 1011 particules/mL dans la couche 8 (figure 3C, couche 8). Après l’enrichissement, la concentration était d’environ 1,25 x10 12 particules/mL dans la couche8 (figure 3C, couche 8), ce qui indique que les microvesicules et les exosomes ont été préconcentrés par un facteur d’environ 5,58. La préconcentration notable n’a pas été observée sur les autres couches (figure 3C, couches 6 et 10). Pris ensemble, ces résultats démontrent que le dispositif à base de papier proposé peut enrichir les microvesicules et les exosomes d’environ cinq fois.
L’efficacité d’isolement de l’appareil a été évaluée comme suit : Le volume de l’échantillon qui peut être pris en charge par les couches 8 et 9 est de ~2,2 μL sur un total de 15 μL de volume d’échantillon en 10 couches en raison de la conception de rétrécissement de l’Exo-PAD. Si nous supposons un cas idéal dans lequel toutes les microvesicules et les exosomes sont préconcentrés sur les couches 8 et 9 et aucun n’est perdu, alors le facteur idéal de préconcentration devrait être ~6,8 (15 μL/2,2 μL = ~6,8). Toutefois, le facteur expérimental de préconcentration obtenu par l’ANT (figure 3c)était de ~5,58, ce qui signifie qu’une partie de 1,22 microvesicles et exosomes ont été perdus par l’lyse ou la liaison non spécifique à la matrice de papier.
où 2,24 x 1012 particules/mL est la concentration initiale de microvesicules et d’exosomes. À partir de ce calcul, le taux de perte prévu de l’Exo-PAD est d’environ 18 %; par conséquent, l’efficacité de l’isolement est d’environ 82 %. Il s’agit d’une amélioration significative par rapport aux faibles rendements de l’ultracentrifugation (5%–23%).
Figure 1 : Procédures globales d’exo-PAD, de l’assemblage au fonctionnement. (A) Conception logicielle pour guider l’impression de cire hydrophobe sur du papier cellulosique. (B) Papier imprimé ciré après incubation dans un four de 80 s à 120 °C. (C) Les appareils individuels sont découpés à l’aide d’un cutter. (D) La solution membranaire permsélective est déposée sur les zones d’échantillonnage dans les couches les plus à gauche et les couches les plus à droite et le solvant est évaporé sur une plaque chauffante à 70 °C pendant 30 min. (E) L’Exo-PAD imprimé est plié d’avant en arrière le long des lignes blanches; toutes les zones d’échantillonnage sont ainsi reliées de manière convergente. (F) Un échantillon de microvesicle et d’exosome est chargé dans la zone de l’échantillon. (G) Deux chambres acryliques sont placées aux extrémités de l’appareil et fixées avec de petits pincements de liant. (H) Les chambres acryliques sont remplies de solution tampon et deux électrodes Ag/AgCl sont insérées pour appliquer une tension de 30 V. (I) Le dispositif est déplié pour isoler les microvesicules et les exosomes préconcentrés. (J) Les zones d’échantillonnage des couches 8 et 9 sont perforées pour analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Observation de microvesicules et d’exosomes étiquetés fluorescents pendant le fonctionnement de l’appareil et intensités de fluorescence correspondantes. (A) Observation en time-lapse des microvesicules et des exosomes. Barre d’échelle = 5 mm. Avec 20 min de traitement, les microvesicules et les exosomes étaient fortement concentrés sur les couches 8 et 9, où (B) ils ont été enrichis d’environ cinq fois. Les barres d’erreur représentent l’écart type (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse des microvesicules et des exosomes enrichis. (A) Images SEM montrant l’intégrité des microvesicules enrichies et des exosomes. Après la préconcentration, beaucoup plus de microvesicules et d’exosomes ont été observés6. Barre d’échelle = 1 μm. (B) Répartition de la taille des microvesicules et exosomes enrichis. Les tailles d’exosome étaient de 95−195 nm (diamètre moyen = 134 nm) et les tailles de microvesicles étaient 214−377 nm (diamètre moyen = 315 nm). (C) La concentration réelle des microvesicules enrichies et des exosomes évaluées à l’aide de l’ANT. Après l’enrichissement, la concentration de microvesicules et d’exosomes a quintuplé, ce qui est compatible avec les résultats de fluorescence6. Les barres d’erreur représentent l’écart type (n = 3). Les panneaux A et C sont reproduits avec la permission de Kim et coll.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Les microvesicles et les exosomes préconcentrés et concentrés sur la couche 8 ont été séparés de l’albumine de sérum bovin (BSA), qui est restée dans les couches 1–3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Bien que l’Exo-PAD ait été utilisé avec succès pour l’enrichissement et l’isolement des microvesicules et des exosomes, plusieurs points critiques doivent être soigneusement examinés : 1) le temps et la température d’incubation du four pendant la préparation de l’appareil, 2) le temps de traitement, 3) l’application de la tension avec des nombres de couches variables et les diamètres de la surface d’échantillonnage, et 4) l’applicabilité aux échantillons cliniques.
Le temps et la température d’incubation donnés dans le protocole sont des conditions optimisées pour fabriquer un dispositif fiable. Des temps d’incubation plus longs ou une température plus élevée peuvent entraîner une distorsion de la conception convergente en raison du réaflux excessif de la cire imprimée. Cela permettra d’éviter la formation de lignes de champ électriques ciblées et ainsi augmenter la résistance à la migration pendant le processus d’enrichissement électrocinétique.
Le temps de traitement est également un facteur à prendre en compte pour un enrichissement et un isolement maximums. Un temps de traitement de <20 min entraîne moins de préconcentration parce qu’il n’y a pas suffisamment de temps pour permettre la migration des microvesicles et des exosomes. D’autre part, un temps de traitement de >20 min détériore l’efficacité de mise au point et permet la dispersion des microvesicules enrichies et des exosomes. Selon ce test, 20 min est le meilleur temps de traitement pour atteindre l’enrichissement maximum et l’isolement des microvesicules et des exosomes.
La tension appliquée est un autre facteur important à considérer. Dans ce protocole, compte tenu du nombre de couches et des diamètres de la surface de l’échantillon, 30 V est utilisé pour atteindre une préconcentration et un isolement stables. Lorsqu’un phénomène ICP est généré dans l’appareil, le régime d’exploitation peut être divisé en trois régions distinctes selon la tension appliquée : (1) ohmic, (2) limitative, et (3) surlimitation des régions6,15,16. Pour une préconcentration et un isolement stables, le dispositif doit être utilisé dans la région limitante, où une zone d’épuisement des ions est générée et où les microvesicles et les exosomes sont bien préconcentrés. Dans ce paramètre expérimental, la plage de tension de fonctionnement (5−40 V) correspond à la région limitante de l’Exo-PAD. Si la tension appliquée est <5 V, l’appareil fonctionne dans la région ohmique, où le courant électrique augmente linéairement, ce qui indique qu’aucune région d’épuisement des ions n’est générée pour la préconcentration. Toutefois, si la tension est de >40 V, la région d’épuisement des ions est détruite par une forte électroconvection à tension, ce qui déstabilise la préconcentration. Compte tenu de ces facteurs, il a été déterminé que 30 V étaient la tension optimale à utiliser pour un dispositif de 12 couches et un diamètre de surface d’échantillon de 2 à 5 mm. Les nombres de couches ou de surface d’échantillonnage peuvent être augmentés pour augmenter le volume de l’échantillon, mais ces facteurs, ainsi que la tension de fonctionnement, devraient être optimisés pour obtenir un enrichissement stable des microvesicules et des exosomes.
L’Exo-PAD proposé peut être utilisé pour isoler les microvesicules et les exosomes de divers échantillons cliniques, y compris la salive, l’urine, le sérum et le plasma. Pour les échantillons avec moins de protéines, comme la salive ou l’urine, les microvesicules et les exosomes peuvent être facilement isolés sans changements majeurs, car une petite quantité de protéines dans ces échantillons sera filtrée par liaison non spécifique au papier. Lors de l’utilisation de l’appareil dans la région limitante, seule la tension appliquée doit être prise en compte, car la résistance ionique des échantillons peut être différente. Pour les échantillons riches en protéines, tels que le sérum ou le plasma, la préconcentration des microvesicules et des exosomes et leur séparation des protéines abondantes doivent être soigneusement étudiées. Notre expérience récente montre que la séparation des microvesicules et des exosomes des protéines est significativement améliorée lorsque le tampon carbonate est utilisé, parce que la mémoire tampon de carbonate entraîne une plus grande différence de charge électrique entre les microvesicules et les exosomes et les protéines dues au point isoélectrique, résultant en une meilleure efficacité de séparation. Pour cette expérience, une substance aux protéines abondantes coexistant avec des microvesicules et des exosomes a été imitée en mélangeant des microvesicules purifiées et des exosomes étiquetés avec fitc (Ex/Em: 490/520 nm) avec BSA étiqueté avec un fluorophore différent (Ex/Em: 590/617 nm) dans 50 mM tampon carbonate (Table des matériaux). Comme le montre la figure supplémentaire 1, la plupart des microvesicules et des exosomes ont été préconcentrés sur la couche 8, comme à la figure 2A et ils ont été séparés de la BSA, qui est restée dans les couches 1–3. Ce résultat suggère que l’enrichissement à partir d’un échantillon de sérum ou de plasma nécessite une étape supplémentaire en ajoutant tampon de carbonate à l’échantillon, et démontre clairement que l’Exo-PAD peut purifier les microvesicules et les exosomes à partir de protéines abondantes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee a reçu le soutien d’une subvention de recherche de l’Université Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim a reçu l’appui du « Programme de développement des compétences pour les spécialistes de l’industrie » du Ministère coréen du commerce, de l’industrie et de l’énergie (MOTIE), géré par le Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programme drh pour la convergence industrielle des appareils intelligents portables).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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