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Biochemistry

微量和外显子的纸基预集中和分离

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

提供是一种制造纸基装置的协议,用于有效丰富和分离微囊和外显体。

Abstract

微囊和外体是小膜囊泡释放到细胞外环境,并在整个身体中循环。由于它们含有各种亲细胞衍生生物分子,如DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质,因此它们的浓缩和分离是它们作为临床应用的潜在生物标志物被开发的关键步骤。然而,传统的分离方法(例如,超离心)对微囊和外显体造成重大损失和损害。这些方法还需要多个重复步骤的超离心,加载和浪费试剂。本文介绍了一种详细的方法,以制造一个折纸为基础的设备(Exo-PAD),旨在有效地丰富和隔离微囊和外体在简单的方式。Exo-PAD 的独特设计由手风琴样多层和收敛样品区组成,与离子浓度极化技术集成,从而使特定层的微囊和外显体具有五倍的富集。此外,通过展开 Exo-PAD,分离出富集的微囊和外显子。

Introduction

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微囊和外显体是小膜囊泡,分别测量0.2±1μm和30±200nm。它们被,几个不同的细胞类型,1、2、3、4、53,分分泌入细胞,外环境2它们含有DNA、mRNA、miRNA、蛋白质和脂质子集形式的亲细胞信息,通过各种体液(如血清、血浆、尿液、脑脊液、羊水以及唾液,,6、7、8、9)7在体内循环68因此,从生物液体中有效分离微囊和外体的技术可以在疾病的诊断、预后和实时监测以及开发新疗法方面提供广泛的机会。

然而,传统的基于超离心的微囊和外体分离方法非常耗时,并导致样品的显著损失和污染。这是因为它涉及几个繁琐的移液和装载步骤和丢弃各种试剂与重复的超离心5,6,10,11,12。6,10,11,125此外,超离心引起的高剪切应力(±100,000 x g)可导致微囊和外显子的物理解损伤,产生不良的回收率(5~23%)6、13、14。6,13,14因此,必须开发一种高效、不显眼的微囊和外体隔离技术,以减少损伤和损失,从而实现更高的回收率。

一种以折纸为基础的装置(Exo-PAD)被开发用于简单、温和、高效分离微囊和外显体6。Exo-PAD 的设计是一种多面纸,具有连续连接的样品区域,直径逐渐减小。离子浓度极化(ICP)技术是一种纳米电动力学现象,预浓缩带电生物分子,并融入这一独特的设计。使用 Exo-PAD 可使特定层中的微囊和外体富集五倍,并且只需展开设备即可进行隔离。本文详细介绍了Exo-PAD,从整体器件的制造和操作到分析其使用,以说明该方法并展示具有代表性的结果6。

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Protocol

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1. 设备制造

  1. 使用打印机软件(材料表)定义要在纸张上打印区域
    注:该设计有12个蜡纹层,其中圆形样品区域的直径逐渐从5毫米缩小到2毫米(图1A)。
  2. 使用商业蜡印机(材料表)在纤维素纸(材料表)两侧的指定区域上打印疏水蜡图1B)。
  3. 将蜡印纸在 120 °C 下放入实验室烤箱中 80 度。
    注:此步骤通过实现印刷蜡的热回流,使蜡到达纸张内部。有了此孵育协议,该模式的分辨率为 ±2 mm。因此,注意不要打印小于2毫米的图案,否则图案将被蜡封杀。
  4. 用切割机切割蜡印纸,以制造单个设备(图1C)。
  5. 滴 5 μL 和 2 μL 的渗透膜(例如,纳菲翁;材料表)分别到最左侧和最右侧图层中的采样区域(图 1D)。
  6. 将涂有渗透膜的层在70°C的热板上放置30分钟,以蒸发渗透膜溶剂。
  7. 用压敏胶带密封涂层层最外层,面对缓冲液,留下一个小孔。
  8. 沿白线来回折叠打印的单个设备(即 Exo-PAD)。
    注:通过折叠设备,所有采样区域都变得收敛连接(图1E)。这种收敛设计在将电压应用于ICP时聚焦电场线,实现微囊和外显体更密集的预集中。

2. 通过离子浓度极化对微囊和外体进行丰富和空间聚焦

  1. 通过移液在收敛样品区域中加载 15 μL 的微囊和外显组样品(±3 x 1011颗粒/mL,在 0.1 倍磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 中,用 0.05% Tween 20)在收敛样品区域中,并等待几秒钟,以确保所有样品区域完全湿润(图 1F)。
  2. 将两个丙烯酸腔室放在 Exo-PAD 的两端,用小粘结夹牢固地夹紧夹住 Exo-PAD,以防止展开(图 1G)。
  3. 用 110 μL 的 0.1x PBS 填充腔室,并插入两个 Ag/AgCl 电极(图 1H)。
  4. 使用电流电压源测量系统(材料表)对电极应用 30 V 20分钟
    注:施加的电压产生ICP现象,因此预集中的微囊和外显子在8层和9层的Exo-PAD。

3. 分离富集的微囊和外体

  1. 将折叠的 Exo-PAD 与丙烯酸室分离,并展开设备,将富集的微囊和外显体与其他层分离(图1I)。
  2. 冲出第8层和9层的样品区域,其中对微囊和外体进行丰富的分析,用于下游分析(图1J)。

4. 扫描电子显微镜分析

  1. 修复富集的微囊和外显体,将冲孔区域浸入 2.5% 的谷胱甘肽中,在 0.1 M 卡沙丁酸钠缓冲液中煮 1 小时,在 0.1 M 卡沙丁酸钠中浸入 1% 的四氧化二氮中 1.
    注意:三氧化硅是剧毒和危险的化学品。因为三氧化硅可以穿透塑料,所以必须储存在玻璃中。任何对三氧化钛的处理都必须在化学烟气罩中,并配有双硝酸盐手套。
  2. 用200个证明乙醇(即50%、70%、90%和100%)的提升等级对固定微囊和外体进行脱水每人30分钟。
  3. 将样品浸入六甲基二甲苯干燥器中,在干燥器中浸30分钟,对样品进行化学干燥。
    注意:六甲基二甲苯是一种易燃和对水分敏感的化学物质。它必须存放在干燥通风良好的区域,远离点火源。
  4. 通过溅射和捕获扫描电子显微镜 (SEM) 图像,用金/铂(±20 nm)将完全干燥的微囊和外显体涂上金/铂(±20 nm)。

5. 纳米粒子跟踪分析

  1. 在设备操作 20 分钟后,使用活检冲头,在 6、8 和 10 层中冲出样品区域。
  2. 将每个冲孔区域浸入缓冲液中(0.1 倍 PBS,带 0.01% Tween 20)。
  3. 漩涡10分钟,在6,000转/分时离心30秒,以重新暂停富集的微囊和外显体。
  4. 从溶液中去除冲孔区域,通过纳米粒子跟踪分析 (NTA) 仪器(材料表)测量微囊和外显子的浓度

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Representative Results

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必须优化操作时间,以实现富集的微囊和外显体的最大回收率。时间不足不允许足够的微囊和外体迁移,从而减少富集,而过多的时间会恶化空间聚焦,从而分散微囊和外体。因此,通过时间优化步骤,可以确定微囊和外体的最大预集中系数以及微囊和外体最丰富的最终位置。为了找到微量和外显子的最终位置,用显微镜观察了荧光标记微量微量和外显子的延时迁移(图2A),并使用 ImageJ 软件量化了所有样本区域的荧光强度(图2B)。在富集过程(图2A,0分钟)之前,由于纸基的轻微过滤作用,微囊和外体分散在所有样品区域,强度逐渐降低(图2B,0分钟)。经过10分钟的处理(图2A,10分钟),微囊和外体通过电皮迁移,第7层出现即时预集中塞。进一步加工实现了微囊和外显体更大的预集中。当过程时间达到20分钟时,微囊和外体强烈聚焦在8层和9层(图2A,20分钟),并基于荧光强度(图2B,20分钟)丰富5倍。

在完成预集中过程后,通过展开装置分离富集的微囊和外体,并冲出第8层的样品区域进行进一步分析。获得SEM图像,以调查富集的微囊和外显体的完整性。如SEM图像(图3A)所示,在富集过程后观察到的未损坏的微囊和外显体明显更多。利用获得的SEM图像,分析了富集微囊和外显体的大小分布(图3B),其中外显体和微囊根据阈值直径200nm进行区分。换句话说,外显体的大小范围从95-195纳米,平均直径为134纳米,而微囊的大小为214-377纳米,平均直径为315纳米。

随后,NTA分析了6层、8层和10层样品区富集微囊和外显子的实际浓度。富集前,第8层浓度为±2.24 x10 11颗粒/mL(图3C,第8层)。富集后,第8层浓度为±1.25 x10 12颗粒/mL(图3C,第8层),表明微囊和外体以±5.58倍的因子预浓缩。在其他层上未观察到明显的预集中(图3C,第6层和10层)。综合起来,这些结果表明,拟议的纸基装置可以丰富微囊和外显子约五倍。

器件的隔离效率评估如下:由于 Exo-PAD 的设计变窄,可由第 8 层和 9 层容纳的样品体积在 10 层中总共 15 μL 的 15 μL 中为 ±2.2 μL。如果我们假设一个理想情况下,所有微囊和外体都预先集中在第 8 层和 9 层,没有丢失,那么理想的预集中系数应为 ±6.8 (15 μL/2.2 μL + 6.8)。然而,NTA获得的实验预集中因子(图3c)为+5.58,这意味着1.22微囊和外显体的一部分因与纸基质的解或非特异性结合而丢失。
Equation 1
其中2.24 x10 12颗粒/mL是微囊和外显体的初始浓度。从这个计算中,外向PAD的预期损失率约为18%;因此,隔离效率约为82%。与超离心率低(5%~23%)相比,这是一个显著的改善。

Figure 1
图 1:从组装到操作的总体 Exo-PAD 过程。A) 软件设计,指导纤维素纸上疏水蜡的印刷。(B) 蜡印纸在120°C的烤箱中孵育80度。(C) 单个设备使用切割机切割。(D) 将永久选择性膜溶液丢弃在最左侧和右侧层的样品区域,溶剂在70°C的热板上蒸发30分钟。因此,所有采样区域都收敛连接。(F) 样品区加载微囊和外显体样品.(G) 两个丙烯酸腔室被放置在设备的末端,用小粘结夹固定。(H) 丙烯酸腔室充满缓冲液,并插入两个Ag/AgCl电极,施加30 V的电压(I)装置被展开,以分离预集中的微囊和外体。(J) 第 8 层和 9 层的样品区域被冲出来进行分析。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:在设备操作过程中观察荧光标记的微囊和外显体以及相应的荧光强度。A) 微囊和外显子的延时观察。比例线 = 5 毫米。在20分钟的加工中,微囊和外体强烈聚焦在8层和9层,其中(B)它们被丰富了大约5倍。误差柱表示标准偏差 (n = 3)。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:富集微囊和外显体分析。A) 显示富集微囊和外显体完整性的SEM图像。经过预集中,更多的微囊和外体被观察到6。比例线 = 1 μm。(B) 富集微囊和外显子的大小分布。外显体尺寸为 95×195 nm(平均直径 = 134 nm),微囊尺寸为 214×377 nm(平均直径 = 315 nm)。(C) 使用NTA评估的富集微量和外体的实际浓度。富集后,微囊和外显子的浓度增加了五倍,这与荧光结果6一致。误差柱表示标准偏差 (n = 3)。面板A和CKim等人许可复制请单击此处查看此图的较大版本。

补充图1:微量 and 和外体预先集中并集中在第8层,与留在第1层~3层的牛血清白蛋白(BSA)分离。请点击这里下载此文件。

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Discussion

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虽然 Exo-PAD 已成功用于显微和外显子的富集和分离,但应仔细考虑几个关键点:1) 设备制备期间的烤箱孵化时间和温度,2) 处理时间,3) 施加不同层数和样品面积直径的电压,以及 4) 适用于临床样品。

协议给出的孵化时间和温度是制造可靠器件的优化条件。由于印刷蜡的回流过多,较长的孵育时间或较高的温度可能会导致收敛设计失真。这将防止聚焦电场线路的形成,从而增加电动力学富集过程中的迁移阻力。

处理时间也是最大浓缩和隔离考虑的一个因素。<20 分钟的处理时间会导致预集中减少,因为没有足够的时间允许微囊和外体迁移。另一方面,20 分钟的处理时间会降低对焦效率,并允许富集的微囊和外显子的分散。根据这项测试,20分钟是实现最大富集和分离微囊和外体的最佳处理时间。

施加的电压是另一个需要考虑的重要因素。在此协议中,考虑到层数和样品面积直径,30 V 用于实现稳定的预集中和隔离。当器件中产生ICP现象时,根据施加的电压可分为三个不同的区域:(1)欧姆,(2)限制,(3)超限区域6、15、16。,166,为了稳定的预集中和隔离,该装置应在限制区域操作,在那里产生离子消耗区,并稳定地预集中微囊和外体。在此实验设置中,工作电压范围 (5~40 V) 对应于 Exo-PAD 的限制区域。如果施加的电压为 <5 V,则器件在欧姆区域工作,其中电流线性增加,表示未生成离子损耗区域进行预集中。但是,如果电压为 >40 V,离子损耗区域被强电压驱动的电解破坏,从而破坏预集中。考虑到这些因素,确定30 V是12层、样品面积直径为2~5毫米的器件的最佳电压。可以增加层数或样品面积直径,以扩大样品体积,但这些因素以及工作电压应得到优化,以实现微囊和外显体的稳定富集。

建议的 Exo-PAD 可用于从各种临床样本(包括唾液、尿液、血清和血浆)中分离微囊和外体。对于蛋白质较少的样品,如唾液或尿液,微囊和外体可以容易分离,而不会有重大变化,因为这些样品中的少量蛋白质会通过非特异性结合来过滤掉。在限制区域内操作器件时,只需考虑施加的电压,因为样品的离子强度可能不同。对于富含蛋白质的样品,如血清或血浆,应仔细考虑微囊和外显体的预集中及其与丰富蛋白质的分离。我们最近的实验表明,使用碳酸盐缓冲液时,微囊和外体与蛋白质的分离显著改善,因为碳酸盐缓冲液由于等电点导致微囊和外体与蛋白质之间的电荷差异更高,从而产生更好的分离效率。在本次实验中,通过将标有 FITC(Ex/Em: 490/520 nm)的纯化微囊和外体与 50 mM 碳酸盐缓冲液中标有不同氟磷(Ex/Em: 590/617 nm)的 BSA(Ex/Em: 590/617 nm)混合,Table of Materials模拟了含有丰富蛋白质的物质。在 50mM 碳酸盐缓冲液中,将 BSA 标记为不同的荧光(Ex/Em: 590/617 nm)。如补充图1所示,大多数微囊和外体被预集中在第8层,如图2A所示,它们与BSA分离,BSA停留在第1层~3层。这一结果表明,从血清或血浆样品中浓缩需要额外一步,在样品中添加碳酸盐缓冲液,并清楚地表明Exo-PAD可以从丰富的蛋白质中净化微囊和外显子。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了韩国国家研究基金会资助,授予NRF-2018R1D1A1A09084044。2019年,J.H.Lee得到了光格永大学的研究资助。金海林得到了韩国贸易、工业和能源部(MOTIE)的"工业专家能力发展计划"的支持,该方案由韩国技术促进研究所(KIAT)运营。P0002397,可穿戴智能设备工业融合人力资源开发计划)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

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Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

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