Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Präsentiert wird ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts zur effektiven Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen.

Abstract

Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine membranöse Vesikel, die in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt und im ganzen Körper zirkuliert. Da sie verschiedene elterzellabgeleitete Biomoleküle wie DNA, mRNA, miRNA, Proteine und Lipide enthalten, sind ihre Anreicherung und Isolierung entscheidende Schritte für ihre Ausnutzung als potenzielle Biomarker für klinische Anwendungen. Herkömmliche Isolationsmethoden (z. B. Ultrazentrifugation) verursachen jedoch signifikante Verluste und Schäden an Mikrovesikeln und Exosomen. Diese Methoden erfordern auch mehrere sich wiederholende Schritte der Ultrazentrifugation, Desagung und Verschwendung von Reagenzien. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Origami-Papier-basierten Geräts (Exo-PAD), das für die effektive Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen auf einfache Weise entwickelt wurde. Das einzigartige Design des Exo-PAD, bestehend aus akkordeonartigen mehrfaltigen Schichten mit konvergenten Probenbereichen, ist in die Ionenkonzentrationspolarisationstechnik integriert und ermöglicht so eine fünffache Anreicherung der Mikrovesiken und Exosomen auf bestimmte Schichten. Darüber hinaus werden die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen durch einfaches Entfalten des Exo-PAD isoliert.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine Membranbläschen mit einer Größe von 0,2 x 1 m bzw. 30 bis 200 nm. Sie werden von mehreren verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5in die extrazelluläre Umgebung sezerniert. Sie enthalten elterliche Zellinformationen in Form von Teilmengen von DNA, mRNA, miRNA, Proteinen und Lipiden und zirkulieren im ganzen Körper über verschiedene Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Fruchtwasser und Speichel6,7,8,9. So können Techniken zur effizienten Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten umfangreiche Möglichkeiten in den Bereichen Diagnose, Prognose und Echtzeitüberwachung von Krankheiten sowie bei der Entwicklung neuer Therapeutika bieten.

Die herkömmliche Isolationsmethode für Mikrovesikeln und Exosomen auf Basis der Ultrazentrifugation ist jedoch extrem zeitaufwändig und verursacht einen erheblichen Verlust und eine Kontamination der Probe. Dies liegt daran, es beinhaltet mehrere umständliche Pipettier- und Ladeschritte und das Wegwerfen verschiedener Reagenzien mit wiederholter Ultrazentrifugation5,6,10,11,12. Darüber hinaus kann die hohe Scherspannung, die durch Ultrazentrifugation induziert wird (100.000 x g), die physikalische Lyse von Mikrovesikeln und Exosomen verursachen und zu schlechten Rückgewinnungsraten (5-23%)6,13,14führen. Daher muss eine hocheffiziente, unauffällige Isolationstechnik für Mikrovesikeln und Exosomen entwickelt werden, um Schäden und Verluste zu reduzieren und so höhere Rückgewinnungsraten zu erzielen.

Ein Origami-Papier-basiertes Gerät (Exo-PAD) wurde für eine einfachere, schonendere und hocheffiziente Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen6entwickelt. Das Design des Exo-PAD ist ein mehrfaches Papier mit seriell verbundenen Probenbereichen, die allmählich im Durchmesser abnehmen. Die Ionkonzentrationspolarisationstechnik (ICP), ein nano-elektrokinetisches Phänomen, das geladene Biomoleküle vorkonzentriert, wurde in dieses einzigartige Design integriert. Der Einsatz des Exo-PAD führte zu einer fünffachen Anreicherung der Mikrovesikeln und Exosomen in bestimmten Schichten und deren Isolierung durch einfaches Entfalten des Geräts. Dieser Artikel beschreibt die Exo-PAD im Detail, von der gesamten Gerätefertigung und -bedienung bis zur Analyse ihrer Verwendung, um die Methode zu veranschaulichen und repräsentative Ergebnisse zu zeigen6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Gerätefertigung

  1. Definieren Sie den Bereich, der auf Papier gedruckt werden soll, mit DerDruckersoftware (Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: Das Design hat 12 wachsgemusterte Schichten, in denen sich die Durchmesser der kreisförmigen Probenbereiche allmählich von 5 mm bis 2 mm verengen(Abbildung 1A).
  2. Drucken Sie hydrophobes Wachs auf den ausgewiesenen Bereichen auf beiden Seiten des Zellulosepapiers (Materialtabelle) mit einem kommerziellen Wachsdrucker (Materialtabelle) (Abbildung 1B).
  3. Das wachsbedruckte Papier in einen Laborofen für 80 s bei 120 °C stellen.
    HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es dem Wachs, die Innenseite des Papiers zu erreichen, indem es einen thermischen Rückfluss des bedruckten Wachses erreicht. Bei diesem Inkubationsprotokoll beträgt die Auflösung des Musters 2 mm. Achten Sie also darauf, keine Muster von weniger als 2 mm zu drucken. Andernfalls werden die Muster durch das Wachs blockiert.
  4. Schneiden Sie das wachsbedruckte Papier mit einem Fräser, um einzelne Geräte herzustellen (Abbildung 1C).
  5. Tropfen Sie 5 l und 2 l permselektive Membran (z. B. Nafion; Materialtabelle) auf die Stichprobenbereiche in der linken bzw. rechten Schicht(Abbildung 1D).
  6. Legen Sie die mit der permselektiven Membran beschichteten Schichten 30 min bei 70 °C auf eine Kochplatte, um das permselektive Membranlösungsmittel zu verdampfen.
  7. Versiegeln Sie die äußerste Oberfläche der beschichteten Schicht gegenüber der Pufferlösung mit druckempfindlichem Klebeband und hinterlassen Sie ein kleines Loch.
  8. Falten Sie das gedruckte Einzelgerät (z.B. Exo-PAD) entlang der weißen Linien hin und her.
    HINWEIS: Durch Falten des Geräts werden alle Probenbereiche konvergend verbunden (Abbildung 1E). Dieses konvergente Design fokussiert die elektrischen Feldleitungen, wenn die Spannung für ICP angewendet wird, wodurch eine intensivere Vorkonzentration der Mikrovesiken und Exosomen erreicht wird.

2. Anreicherung und räumliche Fokussierung von Mikrovesikeln und Exosomen durch Ionenkonzentrationspolarisation

  1. Laden Sie 15 l der Mikrovesikel- und Exosomenprobe (3 x 1011 Partikel/ml in 0,1x Phosphatgepufferte Saline [PBS] mit 0,05 % Tween 20) in die konvergenten Probenbereiche durch Pipetieren und warten Sie einige Sekunden, um eine vollständige Benetzung aller Probenbereiche sicherzustellen (Abbildung 1F).
  2. Legen Sie zwei Acrylkammern an beiden Enden des Exo-PAD und klemmen Sie den Exo-PAD sicher mit kleinen Bindeklammern, um eine Entfaltung zu verhindern (Abbildung 1G).
  3. Füllen Sie die Kammern mit 110 l 0,1x PBS und setzen Sie zwei Ag/AgCl-Elektroden ein (Abbildung 1H).
  4. 30 V auf die Elektroden für 20 min mit einem Strom-Spannungs-Quellenmesssystem (Materialtabelle )auftragen.
    HINWEIS: Die angelegte Spannung erzeugt das ICP-Phänomen und konzentriert damit die Mikrovesiken und Exosomen auf die Schichten 8 und 9 des Exo-PAD.

3. Isolierung der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen

  1. Trennen Sie den gefalteten Exo-PAD von den Acrylkammern und entfalten Sie das Gerät, um die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen von den anderen Schichten zu isolieren (Abbildung 1I).
  2. Die Probenbereiche in den Schichten 8 und 9, in denen die Mikrovesiken und Exosomen angereichert sind, für die nachgelagerte Analyse herausstechen (Abbildung 1J).

4. Rasterelektronenmikroskopische Analyse

  1. Fixieren Sie die angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen, indem Sie die gestanzten Bereiche in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium-Cakodylat-Puffer für 1 h und in 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcakodylat für 1 h eintauchen.
    VORSICHT: Osmiumtetroxid ist hochgiftig und gefährlich chemisch. Da Osmiumtetroxid in Kunststoffe eindringen kann, muss es in Glas gelagert werden. Jede Handhabung von Osmiumtetroxid muss in einer chemischen Rauchhaube mit doppelten Nitrilhandschuhen erfolgen.
  2. Dehydrieren Sie die festen Mikrovesikeln und Exosomen mit aufsteigenden Qualitäten von 200 nachgewiesenem Ethanol (d. h. 50 %, 70 %, 90 % und 100 %) für jeweils 30 min.
  3. Trocknen Sie die Probe chemisch, indem Sie sie 30 min lang in Hexamethyldisilazan in einen Trockenbaumittel eintauchen.
    VORSICHT: Hexamethyldisilazan ist eine brennbare und feuchtigkeitsempfindliche Chemikalie. Es muss in einem trockenen und gut belüfteten Bereich abseits von Zündquellen gelagert werden.
  4. Beschichten Sie die vollständig getrockneten Mikrovesiken und Exosomen mit Gold/Palladium (ca. 20 nm) über Sputtern und erfassen Sie Rasterelektronenmikroskopie (SEM)-Bilder.

5. Nanopartikel-Tracking-Analyse

  1. Stanzen Sie die Probenbereiche in den Schichten 6, 8 und 10 mit einem Biopsie-Punch nach 20 min Gerätebetrieb aus.
  2. Tauchen Sie jeden ausgestanzten Bereich in Pufferlösung ein (0,1x PBS mit 0,01% Tween 20).
  3. Wirbel für 10 min und Zentrifuge für 30 s bei 6.000 U/min, um die angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen wieder auszusetzen.
  4. Entfernen Sie die ausgestanzten Bereiche aus der Lösung und messen Sie die Konzentration von Mikrovesikeln und Exosomen mit einem Nanopartikel-Tracking-Analyse-Analyse-Instrument (NTA)(Tabelle der Materialien).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die Betriebszeit muss optimiert werden, um die maximale Rückgewinnungsausbeute der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen zu erreichen. Unzureichende Zeit erlaubt keine ausreichende Migration der Mikrovesiken und Exosomen, was die Anreicherung verringert, während übermäßige Zeit die räumliche Fokussierung verschlechtert und somit die Mikrovesiken und Exosomen dispergiert. So kann durch den Zeitoptimierungsschritt der maximale Präkonzentrationsfaktor von Mikrovesikeln und Exosomen und der endgültige Ort, an dem Mikrovesikeln und Exosomen am meisten angereichert sind, identifiziert werden. Um den endgültigen Standort der Mikrovesiken und Exosomen zu ermitteln, wurde die Zeitraffermigration von fluoreszierend markierten Mikrovesikeln und Exosomen mit einem Mikroskop beobachtet (Abbildung 2A) und die Fluoreszenzintensitäten in allen Probenbereichen wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert (Abbildung 2B). Vor dem Anreicherungsprozess(Abbildung 2A, 0 min) wurden Mikrovesiken und Exosomen in allen Probenbereichen mit einer allmählichen Abnahme der Intensität aufgrund der leichten Filterwirkung der Papiermatrix dispergiert(Abbildung 2B, 0 min). Nach 10 min Verarbeitung(Abbildung 2A, 10 min) migrierten Mikrovesikeln und Exosomen elektrokinetisch und auf Schicht 7 erschien ein sofortiger Vorkonzentrationsstecker. Die Weiterverarbeitung erreichte eine größere Vorkonzentration von Mikrovesikeln und Exosomen. Wenn die Prozesszeit 20 min erreichte, konzentrierten sich Mikrovesikeln und Exosomen stark auf die Schichten 8 und 9 (Abbildung 2A, 20 min) und wurden auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäten um das Fünffache angereichert(Abbildung 2B, 20 min).

Nach Abschluss des Vorkonzentrationsprozesses wurden die angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen durch Aufklappen des Geräts isoliert und der Probenbereich in Schicht 8 zur weiteren Analyse ausgestanzt. SEM-Bilder wurden erhalten, um die Integrität der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen zu untersuchen. Wie in den SEM-Bildern (Abbildung 3A) dargestellt, wurden nach dem Anreicherungsprozess deutlich mehr unbeschädigte Mikrovesikeln und Exosomen beobachtet. Anhand der erhaltenen SEM-Bilder wurde die Größenverteilung der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen analysiert (Abbildung 3B), wobei die Exosomen und Mikrovesikeln anhand eines Schwellendurchmessers von 200 nm unterschieden wurden. Mit anderen Worten, die Größe der Exosomen reichte von 95–195 nm mit einem mittleren Durchmesser von 134 nm und die der Mikrovesiken von 214–377 nm mit einem mittleren Durchmesser von 315 nm.

Anschließend wurde die tatsächliche Konzentration der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen auf den Probenbereichen in den Schichten 6, 8 und 10 durch NTA analysiert. Vor der Anreicherung betrug die Konzentration in Schicht 8 2,24 x 1011 Partikel/ml(Abbildung 3C, Schicht 8). Nach der Anreicherung betrug die Konzentration in Schicht 8 1,25 x 1012 Partikel/ml(Abbildung 3C, Schicht 8), was darauf hindeutet, dass die Mikrovesikeln und Exosomen um den Faktor 5,58 vorkonzentriert waren. Auf den anderen Schichten wurde keine spürbare Vorkonzentration beobachtet(Abbildung 3C, Schichten 6 und 10). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass das vorgeschlagene papierbasierte Gerät Mikrovesikel und Exosomen um etwa das Fünffache anreichern kann.

Die Isolationseffizienz des Geräts wurde wie folgt bewertet: Das Probenvolumen, das durch die Schichten 8 und 9 aufgenommen werden kann, beträgt aufgrund der Verengung des Exo-PAD von insgesamt 15 L Probenvolumen in 10 Schichten. Wenn wir von einem Idealfall ausgehen, in dem alle Mikrovesiken und Exosomen auf Schicht 8 und 9 vorkonzentriert sind und keine verloren gehen, dann sollte der ideale Vorkonzentrationsfaktor 6,8 (15 l/2,2 l = 6,8 ) betragen. Der durch NTA ermittelte experimentelle Präkonzentrationsfaktor (Abbildung 3c) betrug jedoch 5,58 USD, was bedeutet, dass ein Teil von 1,22 Mikrovesikeln und Exosomen durch Lyse oder unspezifische Bindung an die Papiermatrix verloren ging.
Equation 1
wobei 2,24 x 1012 Partikel/ml die Anfangskonzentration von Mikrovesikeln und Exosomen ist. Aus dieser Berechnung geht die erwartete Verlustrate des Exo-PAD um etwa 18% zurück; Daher beträgt die Isolationseffizienz etwa 82%. Dies ist eine deutliche Verbesserung im Vergleich zu den schlechten Erträgen der Ultrazentrifugation (5% –23%).

Figure 1
Abbildung 1: Insgesamt Exo-PAD-Verfahren, von der Montage bis zum Betrieb. (A) Software-Design zur Anleitung des Drucks von hydrophoberwachs auf Zellulosepapier. (B) Das wachsbedruckte Papier nach der Inkubation im Ofen für 80 s bei 120 °C. (C) Die einzelnen Geräte werden mit einem Fräser ausgeschnitten. (D) Permselektive Membranlösung wird auf die Probenbereiche in der linken und rechten Schicht abgeworfen und das Lösungsmittel wird auf einer Kochplatte bei 70 °C für 30 min verdampft. (E) Der gedruckte Exo-PAD wird entlang der weißen Linien hin und her gefaltet; alle Probenbereiche sind somit konvergend miteinander verbunden. (F) Im Probenbereich wird eine Mikrovesikle- und Exosomenprobe geladen. (G) Zwei Acrylkammern werden an den Enden des Geräts platziert und mit kleinen Binderclips gesichert. (H) Die Acrylkammern sind mit Pufferlösung gefüllt und zwei Ag/AgCl-Elektroden werden eingesetzt, um eine Spannung von 30 V anzuwenden. (I) Das Gerät wird aufgeklappt, um die vorkonzentrierten Mikrovesiken und Exosomen zu isolieren. (J) Die Probenbereiche in den Schichten 8 und 9 werden zur Analyse ausgestanzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Beobachtung fluoreszierend markierter Mikrovesikel und Exosomen während des Gerätebetriebs und der entsprechenden Fluoreszenzintensitäten. (A) Zeitrafferbeobachtung von Mikrovesikeln und Exosomen. Skalenstange = 5 mm. Mit 20 min Verarbeitung konzentrierten sich die Mikrovesiken und Exosomen stark auf die Schichten 8 und 9, wo sie (B) um das Fünffache angereichert wurden. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Analyse der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen. (A) SEM-Bilder, die die Integrität der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen zeigen. Nach der Vorkonzentration wurden viel mehr Mikrovesikle und Exosomen beobachtet6. Skalenbalken = 1 m. (B) Größenverteilung der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen. Die Exosomengrößen waren 95 bis 195 nm (mittlerer Durchmesser = 134 nm) und die Mikrovesikle-Größen waren 214 bis 377 nm (mittlerer Durchmesser = 315 nm). (C) Die tatsächliche Konzentration der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen, die mit NTA bewertet wurden. Nach der Anreicherung erhöhte sich die Konzentration von Mikrovesikeln und Exosomen um das Fünffache, was mit den Fluoreszenzergebnissen6übereinstimmt. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar (n = 3). Die Panels A und C werden mit Genehmigung von Kim et al.6reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Mikrovesikeln und Exosomen, die vorkonzentriert und auf Schicht 8 fokussiert sind, wurden von Rinderserumalbumin (BSA) getrennt, das in den Schichten 1–3 verblieb. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Obwohl der Exo-PAD erfolgreich zur Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen eingesetzt wurde, sollten mehrere kritische Punkte sorgfältig berücksichtigt werden: 1) die Inkubationszeit und -temperatur des Ofens während der Gerätevorbereitung, 2) Verarbeitungszeit, 3) Anwendung von Spannung mit unterschiedlichen Schichtzahlen und Probenflächendurchmessern und 4) Anwendbarkeit auf klinische Proben.

Die im Protokoll angegebene Inkubationszeit und -temperatur sind optimierte Bedingungen, um ein zuverlässiges Gerät herzustellen. Längere Inkubationszeiten oder eine höhere Temperatur können aufgrund des übermäßigen Rückflusses des bedruckten Wachses zu Verzerrungen des konvergenten Designs führen. Dies verhindert die Bildung fokussierter elektrischer Feldlinien und erhöht so die Migrationsresistenz während des elektrokinetischen Anreicherungsprozesses.

Die Bearbeitungszeit ist auch ein Faktor, der für eine maximale Anreicherung und Isolierung zu berücksichtigen ist. Eine Verarbeitungszeit von <20 min führt zu einer geringeren Vorkonzentration, da nicht genügend Zeit zur Möglichkeit der Migration von Mikrovesikle und Exosomen zur Folge hat. Andererseits verschlechtert eine Verarbeitungszeit von >20 min die Fokussiereffizienz und ermöglicht die Dispersion der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen. Nach diesem Test ist 20 min die beste Verarbeitungszeit, um eine maximale Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen zu erreichen.

Die angelegte Spannung ist ein weiterer wichtiger Faktor zu berücksichtigen. In diesem Protokoll wird unter Berücksichtigung der Anzahl der Schichten und der Probenflächendurchmesser 30 V verwendet, um eine stabile Vorkonzentration und Isolierung zu erreichen. Wenn ein ICP-Phänomen im Gerät erzeugt wird, kann das Betriebsregime in drei verschiedene Regionen nach der angelegten Spannung unterteilt werden: (1) ohmsche, (2) begrenzende und (3) überbegrenzende Bereiche6,15,16. Für eine stabile Vorkonzentration und Isolierung sollte das Gerät im Grenzbereich betrieben werden, wo eine Ionenabbauzone erzeugt wird und Mikrovesikeln und Exosomen stabil vorkonzentriert sind. In dieser experimentellen Einstellung entspricht der Betriebsspannungsbereich (5-40 V) dem Grenzbereich für den Exo-PAD. Wenn die angelegte Spannung <5 V ist, arbeitet das Gerät im ohmschen Bereich, wo der elektrische Strom linear ansteigt, was darauf hinweist, dass kein Ionenabbaubereich für die Vorkonzentration erzeugt wird. Wenn die Spannung jedoch >40 V beträgt, wird der Ionenerschöpfungsbereich durch starke spannungsgetriebene Elektrokonvektion zerstört, die die Vorkonzentration destabilisiert. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren wurde festgestellt, dass 30 V die optimale Spannung für ein Gerät mit 12 Schichten und einem Probenflächendurchmesser von 2 x 5 mm ist. Schichtnummern oder Probenflächendurchmesser können erhöht werden, um das Probenvolumen zu vergrößern, aber diese Faktoren sowie die Betriebsspannung sollten optimiert werden, um eine stabile Anreicherung von Mikrovesikeln und Exosomen zu erreichen.

Die vorgeschlagene Exo-PAD kann verwendet werden, um Mikrovesikel und Exosomen aus verschiedenen klinischen Proben zu isolieren, einschließlich Speichel, Urin, Serum und Plasma. Bei Proben mit weniger Protein, wie Speichel oder Urin, können Mikrovesiken und Exosomen ohne größere Veränderungen leicht isoliert werden, da eine kleine Menge Protein in diesen Proben durch unspezifische Bindung an das Papier herausgefiltert wird. Beim Betrieb des Gerätes innerhalb des Begrenzungsbereichs muss nur die angelegte Spannung berücksichtigt werden, da die Ionenstärke von Proben unterschiedlich sein kann. Bei proteinreichen Proben wie Serum oder Plasma sollten sowohl die Vorkonzentration von Mikrovesikeln und Exosomen als auch ihre Trennung von reichlich vorhandenen Proteinen sorgfältig überlegt werden. Unser jüngstes Experiment zeigt, dass die Trennung von Mikrovesikeln und Exosomen von Proteinen deutlich verbessert wird, wenn Karbonatpuffer verwendet werden, da karbonatischer Puffer aufgrund des isoelektrischen Punktes zu einer höheren elektrischen Ladungsdifferenz zwischen Mikrovesikeln und Exosomen und Proteinführt führt, was zu einer besseren Trenneffizienz führt. Für dieses Experiment wurde eine Substanz mit reichlich Proteinen, die mit Mikrovesikeln und Exosomen koexistieren, durch Mischen von gereinigten Mikrovesikeln und Exosomen, die mit FITC (Ex/Em: 490/520 nm) gekennzeichnet sind, mit BSA mit einem anderen Fluorophor (Ex/Em: 590/617 nm) in 50 mM Karbonatpuffer(Tabelle)nachgeahmt. Wie in Der Ergänzenden Abbildung 1dargestellt, waren die meisten Mikrovesiken und Exosomen auf Schicht 8 vorkonzentriert, wie in Abbildung 2A, und sie wurden von BSA getrennt, die in den Schichten 1-3 blieben. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Anreicherung aus einer Serum- oder Plasmaprobe einen zusätzlichen Schritt erfordert, der die Probe mit Einem Karbonatpuffer ergänzt, und zeigt deutlich, dass der Exo-PAD Mikrovesikeln und Exosomen von reichlich vorhandenen Proteinen reinigen kann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von der National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444 unterstützt. J. H. Lee wurde 2019 durch ein Forschungsstipendium der Kwangwoon University unterstützt. Hyerin Kim wurde vom "Competency Development Program for Industry Specialists" des koreanischen Ministeriums für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) unterstützt, das vom Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-Programm zur industriellen Konvergenz tragbarer Intelligenter Geräte).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14, (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17, (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21, (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34, (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19, (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11, (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39, (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18, (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91, (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16, (5), 925-931 (2016).
Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter