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Biochemistry

पेपर-आधारित प्रीकंसेंट्रेशन और माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का अलगाव

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

प्रस्तुत किया गया एक प्रोटोकॉल है जो माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के प्रभावी संवर्धन और अलगाव के लिए एक कागज आधारित उपकरण बनाने के लिए है।

Abstract

माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स छोटे झिल्लीदार वेसिकल्स हैं जो बाहुलर वातावरण में जारी किए जाते हैं और पूरे शरीर में परिचालित होते हैं। क्योंकि उनमें डीएनए, एमआरएनए, मिरना, प्रोटीन और लिपिड जैसे विभिन्न पैतृक कोशिका-व्युत्पन्न जैव अणु होते हैं, उनके संवर्धन और अलगाव नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए संभावित बायोमार्कर के रूप में उनके शोषण के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। हालांकि, पारंपरिक अलगाव विधियों (जैसे, अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन) से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को महत्वपूर्ण नुकसान और नुकसान होता है। इन तरीकों के लिए अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन, लोडिंग और रिएजेंट्स को बर्बाद करने के कई दोहराव वाले कदमों की भी आवश्यकता होती है। यह लेख एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है जो एक ओरिगेमी-पेपर-आधारित डिवाइस (एक्सो-पैड) को सरल तरीके से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के प्रभावी संवर्धन और अलगाव के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक्सो-पैड का अनूठा डिजाइन, जिसमें अभिसरण नमूना क्षेत्रों के साथ अकॉर्डियन जैसी बहुमुल्ड परतें शामिल हैं, आयन एकाग्रता ध्रुवीकरण तकनीक के साथ एकीकृत है, जिससे विशिष्ट परतों पर माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के पांच गुना संवर्धन को सक्षम किया जाता है। इसके अलावा, समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को बस एक्सो-पैड का खुलासा करके अलग-थलग कर दिया जाता है।

Introduction

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माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम क्रमशः 0.2−1 माइक्रोन और 30−200 एनएम मापने वाले छोटे झिल्ली वेसिकल्स हैं। इन्हें कई अलग - अलग - अलग सेल प्रकार 1,,2, 3 ,4,,,5से बाहुलकर वातावरण में स्रावित कियाजाताहै .5 इनमें डीएनए, एमआरएनए, मिरना, प्रोटीन और लिपिड के सबसेट के रूप में माता-पिता की कोशिका जानकारी होती है, और सीरम, प्लाज्मा, मूत्र, सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ, एमनियोटिक द्रव, और,लार6,7,8,9जैसे शरीर के विभिन्न तरल पदार्थों के माध्यम से पूरे शरीर में प्रसारित होती है।,, इस प्रकार, जैविक तरल पदार्थों से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के कुशल अलगाव की तकनीक निदान, पूर्वानुमान और रोग की वास्तविक समय की निगरानी के साथ-साथ नए चिकित्सीय के विकास में व्यापक अवसर प्रदान कर सकती है।

हालांकि, अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के आधार पर माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के लिए पारंपरिक अलगाव विधि बेहद समय लेने वाली है और नमूने के महत्वपूर्ण नुकसान और संदूषण का कारण बनती है। इसका कारण यह है कि इसमें कई बोझिल पाइपिंग और लोडिंग कदम शामिल हैं और विभिन्न अभिकर्णों को बार - बार अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन 5 ,6,10,,11,,12से त्यागना शामिल है ।11 इसके अलावा, अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन (~ 100,000 x g)द्वारा प्रेरित उच्च कतरनी तनाव माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की शारीरिक रूप से लाइसिस का कारण बन सकता है, जिससे खराब वसूली दर (5−23%)6,13,,14हो सकती है।, इसलिए, क्षति और हानि को कम करने के लिए माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के लिए एक अत्यधिक कुशल, विनीत अलगाव तकनीक विकसित की जानी चाहिए, जिससे उच्च वसूली दर प्राप्त हो सके।

एक ओरिगामी-पेपर-आधारित डिवाइस (एक्सो-पैड) को माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स6के सरल, जेंटलर और अत्यधिक कुशल अलगाव के लिए विकसित किया गया था। एक्सो-पैड का डिजाइन धारावाहिक रूप से जुड़े नमूना क्षेत्रों के साथ एक बहुगुना कागज है जो धीरे-धीरे व्यास में कम होता है। आयन एकाग्रता ध्रुवीकरण (आईसीपी) तकनीक, जो एक नैनो-इलेक्ट्रोकाइनेटिक घटना है जो बायोमॉलिक्यूल्स का आरोप लगाने वाली पूर्वसंकेंद्रित है, इस अनूठे डिजाइन के साथ एकीकृत किया गया था। Exo-PAD का उपयोग करने के परिणामस्वरूप विशिष्ट परतों में माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का पांच गुना संवर्धन हुआ और बस डिवाइस का खुलासा करके उनके अलगाव । यह लेख एक्सो-पैड का विस्तार से वर्णन करता है, समग्र डिवाइस निर्माण और संचालन से लेकर इसके उपयोग के विश्लेषण तक, विधि को समझाने और प्रतिनिधि परिणाम6दिखाने के लिए।

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Protocol

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1. डिवाइस निर्माण

  1. प्रिंटर सॉफ्टवेयर(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके कागज पर मुद्रित किए जाने वाले क्षेत्र को परिभाषित करें।
    नोट: डिजाइन में 12 मोम-पैटर्न वाली परतें हैं जिनमें परिपत्र नमूना क्षेत्रों का व्यास धीरे-धीरे 5 मिमी से 2 मिमी(चित्रा 1A)तक संकीर्ण होता है।
  2. एक वाणिज्यिक मोम प्रिंटर (सामग्री की तालिका)(चित्रा 1 बी)का उपयोग करके सेल्यूलोज पेपर(सामग्री की तालिका)के दोनों किनारोंपर निर्धारित क्षेत्रों पर हाइड्रोफोबिक मोम प्रिंट करें।
  3. मोम मुद्रित कागज को 120 डिग्री सेल्सियस पर 80 एस के लिए प्रयोगशाला ओवन में रखें।
    नोट: यह कदम मुद्रित मोम के थर्मल रिफ्लो को प्राप्त करके मोम को कागज के अंदर तक पहुंचने की अनुमति देता है। इस इनक्यूबेशन प्रोटोकॉल के साथ, पैटर्न का संकल्प ~2 मिमी है। इस प्रकार, सावधान रहें कि 2 मिमी से कम के पैटर्न प्रिंट न करें। अन्यथा पैटर्न मोम द्वारा अवरुद्ध हो जाएगा।
  4. अलग-अलग डिवाइस(चित्रा 1C)बनाने के लिए एक कटर के साथ मोम मुद्रित कागज काटें।
  5. 5 माइक्रोन और 2 माइक्रोन की परमचयनात्मक झिल्ली (उदाहरण के लिए, नैफियन; सामग्री की तालिका) क्रमशः(चित्रा 1D)में सबसे अधिक और दक्षिणपंथी परतों में नमूना क्षेत्रों पर।
  6. परमचयनात्मक झिल्ली विलायक को वाष्पित करने के लिए 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर परमचयनात्मक झिल्ली के साथ लेपित परतों को रखें।
  7. एक छोटे से छेद को छोड़ते हुए, दबाव-संवेदनशील टेप के साथ बफर समाधान का सामना कर रहे लेपित परत की सबसे बाहरी सतह को सील करें।
  8. सफेद रेखाओं के साथ मुद्रित व्यक्तिगत डिवाइस (यानी, Exo-PAD) को आगे-पीछे मोड़ें।
    नोट: डिवाइस को मोड़कर, सभी नमूना क्षेत्र एकाग्र रूप से जुड़े हो जातेहैं (चित्रा 1E)। यह अभिसरण डिजाइन इलेक्ट्रिक फील्ड लाइनों को केंद्रित करता है जब वोल्टेज आईसीपी के लिए लागू किया जाता है, जो माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के अधिक गहन पूर्वसंवर्ती को प्राप्त करता है।

2. आयन एकाग्रता ध्रुवीकरण द्वारा माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का संवर्धन और स्थानिक ध्यान केंद्रित करना

  1. माइक्रोवेसिकल और एक्सोसोम नमूने के 15 माइक्रोन लोड (~ 3 x 1011 कणों/एमएल में 0.1x फॉस्फेट बफर खारा [पीबीएस] के साथ अभिसरण नमूना क्षेत्रों में 0.05% ट्वीन 20) पाइपिंग द्वारा और सभी नमूना क्षेत्रों(चित्रा 1F)की पूरी तरह गीला सुनिश्चित करने के लिए कुछ सेकंड इंतजार करें।
  2. Exo-PAD के दोनों सिरों पर दो ऐक्रेलिक कक्षों रखें और खुलासा(चित्रा 1G)को रोकने के लिए छोटे बांधने की मशीन क्लिप के साथ सुरक्षित रूप से Exo-पैड क्लैंप ।
  3. कक्षों को 0.1x पीबीएस के 110 माइक्रोन से भरें और दो एजी/एजीसीएल इलेक्ट्रोड(चित्रा 1H)डालें।
  4. वर्तमान-वोल्टेज स्रोत माप प्रणाली(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके 20 मिनट के लिए इलेक्ट्रोड पर 30 वी लागू करें।
    नोट: एप्लाइड वोल्टेज आईसीपी घटना उत्पन्न करता है और इसलिए एक्सो-पैड की परतों 8 और 9 पर माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को पूर्वसंेन्द्रित करता है।

3. समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का अलगाव

  1. एक्रेलिक कक्षों से मुड़ा हुआ एक्सो-पैड अलग करें और समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को अन्य परतों(चित्रा 1I)से अलग करने के लिए डिवाइस को प्रकट करें।
  2. 8 और 9 परतों में नमूना क्षेत्रों को पंच करें, जहां माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम समृद्ध होते हैं, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण(चित्रा 1J)के लिए।

4. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

  1. 1 एच के लिए 0.1 एम सोडियम कैकोडिल बफर में 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड में मुक्का मारा क्षेत्रों को विसर्जित करके समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को ठीक करें और 1 घंटे के लिए 0.1 एम सोडियम कैकोइडिल में 1% ऑस्मियम टेट्रोएक्साइड में।
    सावधानी: ऑस्मियम टेट्रोक्साइड अत्यधिक जहरीला और खतरनाक रसायन है। क्योंकि ऑस्मियम टेट्रोक्साइड प्लास्टिक में प्रवेश कर सकता है, इसे ग्लास में संग्रहीत किया जाना चाहिए। ऑस्मियम टेट्रोक्साइड की किसी भी हैंडलिंग को डबल नाइट्राइल दस्ताने के साथ रासायनिक धुएं हुड में किया जाना चाहिए।
  2. 200 प्रूफ इथेनॉल (यानी, 50%, 70%, 90%, और 100%) के आरोही ग्रेड के साथ फिक्स्ड माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को निर्जलित करें प्रत्येक के लिए 30 मिनट के लिए।
  3. रासायनिक रूप से 30 मिनट के लिए एक desiccator में हेक्सामेथिलडिसिलाज़न में विसर्जित करके नमूना सूख।
    सावधानी: हेक्सामेथिलडिसिलाज़न एक ज्वलनशील और नमी के प्रति संवेदनशील रसायन है। इसे इग्निशन स्रोतों से दूर सूखे और अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में संग्रहित किया जाना चाहिए।
  4. पूरी तरह से सूखे माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को सोने/पैलेडियम (~ 20 एनएम) के साथ स्पंदन के माध्यम से कोट करें और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवियों को कैप्चर करें।

5. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण

  1. 20 मिनट के डिवाइस ऑपरेशन के बाद बायोप्सी पंच का उपयोग करके 6, 8 और 10 परतों में नमूना क्षेत्रों को पंच करें।
  2. बफर समाधान (0.01% ट्वीन 20 के साथ 0.1x पीबीएस) में प्रत्येक छिद्रित क्षेत्र को विसर्जित करें।
  3. समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को फिर से खर्च करने के लिए 6,000 आरपीएम पर 30 एस के लिए भंवर और 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र।
  4. समाधान से छिद्रित क्षेत्रों को हटा दें और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) उपकरण (सामग्री की तालिका) द्वारा माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की एकाग्रताको मापें।

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Representative Results

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समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की अधिकतम वसूली उपज प्राप्त करने के लिए ऑपरेशन समय को अनुकूलित किया जाना चाहिए। अपर्याप्त समय माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के पर्याप्त प्रवास की अनुमति नहीं देता है, जो संवर्धन को कम करता है, जबकि अत्यधिक समय स्थानिक ध्यान केंद्रित करता है और इसलिए माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को फैलाता है। इस प्रकार, समय अनुकूलन चरण के माध्यम से, माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के अधिकतम पूर्वसंकेंद्रित कारक और अंतिम स्थान जहां माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम सबसे अधिक समृद्ध होते हैं, उनकी पहचान की जा सकती है। माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के अंतिम स्थान को खोजने के लिए, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के समय-चूक प्रवास को माइक्रोस्कोप(चित्रा 2 ए)के साथ देखा गया और सभी नमूना क्षेत्रों में फ्लोरेसेंस तीव्रता को इमेजजे सॉफ्टवेयर(चित्रा 2 बी)का उपयोग करके निर्धारित किया गया । संवर्धन प्रक्रिया(चित्रा 2 ए, 0मिनट) से पहले, पेपर मैट्रिक्स(चित्रा 2B,0 मिनट) की मामूली फ़िल्टरिंग कार्रवाई के कारण तीव्रता में क्रमिक कमी के साथ सभी नमूना क्षेत्रों में माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को फैलाया गया था। 10 मिनट की प्रोसेसिंग(चित्रा 2A,10 मिनट) के बाद, माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स इलेक्ट्रोकिंटिक रूप से माइग्रेट हो गए और एक त्वरित प्रीकंसेंट्रेशन प्लग लेयर 7 पर दिखाई दिया। इसके अलावा प्रसंस्करण ने माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का अधिक से अधिक पूर्वसंचालन हासिल किया। जब प्रक्रिया का समय 20 मिनट तक पहुंच गया, तो माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को दृढ़ता से परतों 8 और 9(चित्रा 2A, 20मिनट) पर केंद्रित किया गया था और फ्लोरेसेंस तीव्रता(चित्रा 2B, 20मिनट) के आधार पर पांच गुना समृद्ध किया गया था।

पूर्वसंक्रियागत प्रक्रिया को पूरा करने के बाद, समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को डिवाइस का खुलासा करके अलग किया गया था और परत 8 में नमूना क्षेत्र को आगे के विश्लेषण के लिए मुक्का मारा गया था। समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की अखंडता की जांच करने के लिए एसईएम छवियां प्राप्त की गई थीं। जैसा कि एसईएम छवियों(चित्रा 3 ए)में दिखाया गया है, संवर्धन प्रक्रिया के बाद काफी अधिक गैर-क्षतिग्रस्त माइक्रोसिकल्स और एक्सोसोम देखे गए थे। प्राप्त एसईएम छवियों का उपयोग करके, समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के आकार वितरण का विश्लेषण किया गया(चित्रा 3 B),जहां एक्सोसोम्स और माइक्रोवेसिकल्स को 200 एनएम के सीमा व्यास के आधार पर प्रतिष्ठित किया गया था। दूसरे शब्दों में, एक्सोसोम्स का आकार 95-195 एनएम से लेकर 134 एनएम के औसत व्यास और 214-377 एनएम से 315 एनएम के औसत व्यास के साथ माइक्रोवेसिकल्स का था।

इसके बाद, एनटीए द्वारा 6, 8 और 10 परतों में नमूना क्षेत्रों पर समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की वास्तविक एकाग्रता का विश्लेषण किया गया। संवर्धन से पहले, एकाग्रता ~ 2.24 x 1011 कणों /एमएल परत 8(चित्रा 3C,परत 8) में था। संवर्धन के बाद, एकाग्रता ~ 1.25 x 1012 कणों/एमएल परत 8(चित्रा 3 सी,परत 8) में थी, यह दर्शाता है कि माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम ~ 5.58 के कारक द्वारा पूर्वनिर्धारित थे। अन्य परतों(चित्रा 3C,परतों 6 और 10) पर ध्यान देने योग्य पूर्वसंक्रिया नहीं देखा गया था। एक साथ लिया, इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि प्रस्तावित कागज आधारित डिवाइस लगभग पांच गुना द्वारा microvesicles और exosomes समृद्ध कर सकते हैं ।

डिवाइस की अलगाव दक्षता का मूल्यांकन इस प्रकार किया गया था: नमूना मात्रा जिसे लेयर 8 और 9 द्वारा समायोजित किया जा सकता है, एक्सो-पैड के संकुचित डिजाइन के कारण 10 परतों में नमूना मात्रा के कुल 15 माइक्रोन में से ~ 2.2 माइक्रोन है। यदि हम एक आदर्श मामला मान लेते हैं जिसमें सभी माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स परत 8 और 9 पर पूर्वकेंद्रित होते हैं और कोई भी खो नहीं जाता है, तो आदर्श प्रीकॉन्स्ट्रेशन कारक ~ 6.8 (15 माइक्रोन/2.2 माइक्रोल = ~ 6.8) होना चाहिए। हालांकि, एनटीए(चित्रा 3सी)द्वारा प्राप्त प्रायोगिक पूर्वसंक्रिया कारक ~ 5.58 था, जिसका अर्थ है कि 1.22 माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम का एक हिस्सा लाइसिस या पेपर मैट्रिक्स के लिए गैर-विशिष्ट बाध्यकारी द्वारा खो गया था।
Equation 1
जहां 2.24 x 1012 कण/एमएल माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की प्रारंभिक सांद्रता है । इस गणना से, एक्सो-पैड की अपेक्षित हानि दर लगभग 18% है; इसलिए, अलगाव दक्षता लगभग 82% है। अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन (5%-23%) की खराब पैदावार की तुलना में यह एक महत्वपूर्ण सुधार है।

Figure 1
चित्रा 1: कुल मिलाकर Exo-पैड प्रक्रियाओं, विधानसभा से संचालन के लिए । (A)सेल्यूलोज पेपर पर हाइड्रोफोबिक वैक्स की छपाई का मार्गदर्शन करने के लिए सॉफ्टवेयर डिजाइन। (ख)80 एस के लिए ओवन में 120 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद मोम मुद्रित कागज। (ग)अलग-अलग उपकरणों को कटर का उपयोग करके काट दिया जाता है। (घ)परमचयनात्मक झिल्ली समाधान बाईं और दक्षिणपंथी परतों में नमूना क्षेत्रों पर गिरा दिया जाता है और सॉल्वेंट को 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर सुखाया जाता है।(ई)मुद्रित एक्सो-पैड को सफेद रेखाओं के साथ आगे-पीछे मोड़ा जाता है; इस प्रकार सभी नमूना क्षेत्र अभिसरण से जुड़े हुए हैं। (च)सैंपल एरिया में माइक्रोवेसिकल और एक्सोसोम सैंपल लोड किया जाता है। (जी)दो ऐक्रेलिक कक्षों डिवाइस के सिरों पर रखा जाता है और छोटे बांधने की मशीन क्लिप के साथ सुरक्षित । (ज)एक्रेलिक चैम्बर्स बफर सॉल्यूशन से भरे होते हैं और 30 वी (I) का वोल्टेज लगाने के लिए दो एजी/एजीसीएल इलेक्ट्रोड डाले जाते हैं ।(I)डिवाइस को प्रीकॉन्स्टेड माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को अलग करने के लिए सामने जाता है । (जम्मू)8 और 9 परतों में नमूना क्षेत्रों को विश्लेषण के लिए मुक्का मारा जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डिवाइस ऑपरेशन और इसी फ्लोरेसेंस तीव्रता के दौरान फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का अवलोकन। (ए)माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का समय-चूक अवलोकन। स्केल बार = 5 मिमी। प्रसंस्करण के 20 मिनट के साथ, माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम दृढ़ता से 8 और 9 परतों पर केंद्रित थे, जहां(बी)वे लगभग पांच गुना से समृद्ध थे। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं (n = 3). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का विश्लेषण। (क)समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की अखंडता को दर्शाने वाली एसईएम छवियां। पूर्वसंबंध के बाद, कई और माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम6देखे गए। स्केल बार = 1 माइक्रोन। (ख)समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का आकार वितरण। एक्सोसोम आकार 95−195 एनएम (मतलब व्यास = 134 एनएम) थे और माइक्रोवेसिकल आकार 214−377 एनएम (मतलब व्यास = 315 एनएम) थे। (ग)एनटीए का उपयोग करके मूल्यांकन किए गए समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की वास्तविक एकाग्रता । संवर्धन के बाद, माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की एकाग्रता पांच गुना बढ़ गई, जो फ्लोरेसेंस परिणामों के अनुरूप है6। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं (n = 3). पैनल और सी किम एट अल6से अनुमति के द्वारा पुन: पेश कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को पूर्वसंकेंद्रित और लेयर 8 पर केंद्रित गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) से अलग किया गया था, जो परतों में रहे 1-3 . कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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यद्यपि एक्सो-पैड का उपयोग माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के संवर्धन और अलगाव के लिए सफलतापूर्वक किया गया था, कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए: 1) डिवाइस तैयार करने के दौरान ओवन इनक्यूबेशन समय और तापमान, 2) प्रसंस्करण समय, 3) अलग-अलग परत संख्या और नमूना क्षेत्र व्यास के साथ वोल्टेज का आवेदन, और 4) नैदानिक नमूनों के लिए प्रयोज्यता।

प्रोटोकॉल में दिए गए इनक्यूबेशन समय और तापमान एक विश्वसनीय डिवाइस बनाने के लिए अनुकूलित स्थितियां हैं। अब इनक्यूबेशन बार या एक उच्च तापमान मुद्रित मोम के अत्यधिक पुनर्प्रवाह के कारण अभिसरण डिजाइन की विकृति का कारण बन सकता है। यह केंद्रित इलेक्ट्रिक फील्ड लाइनों के गठन को रोकेगा और इस प्रकार इलेक्ट्रोकाइनेटिक संवर्धन प्रक्रिया के दौरान माइग्रेशन प्रतिरोध को बढ़ाएगा।

प्रसंस्करण समय भी अधिकतम संवर्धन और अलगाव के लिए विचार करने के लिए एक कारक है। & 20 मिनट के प्रसंस्करण समय के परिणामस्वरूप कम पूर्वसंचालन होता है क्योंकि माइक्रोवेसिकल और एक्सोसोम माइग्रेशन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त समय नहीं है। दूसरी ओर, 20 मिनट का प्रसंस्करण समय फोकसिंग दक्षता को खराब करता है और समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के फैलाव की अनुमति देता है। इस परीक्षण के अनुसार, 20 मिनट माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के अधिकतम संवर्धन और अलगाव को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा प्रसंस्करण समय है।

लागू वोल्टेज पर विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है। इस प्रोटोकॉल में, परतों की संख्या और नमूना क्षेत्र व्यास को ध्यान में रखते हुए, 30 वी का उपयोग स्थिर पूर्वसंसेंट्रेशन और अलगाव को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। जब डिवाइस में आईसीपी घटना उत्पन्न होती है, तो ऑपरेशन शासन को लागू वोल्टेज के अनुसार तीन अलग-अलग क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: (1) ओमिक, (2) सीमित, और (3) ओवरलिमिटिंग क्षेत्र6,15,,16।, स्थिर पूर्वसंबंध और अलगाव के लिए, डिवाइस को सीमित क्षेत्र में संचालित किया जाना चाहिए, जहां आयन की कमी क्षेत्र उत्पन्न होता है और माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को स्थिर रूप से पूर्व-निर्धारित किया जाता है। इस प्रायोगिक सेटिंग में, ऑपरेटिंग वोल्टेज रेंज (5−40 वी) एक्सो-पैड के लिए सीमित क्षेत्र से मेल खाती है। यदि एप्लाइड वोल्टेज & 5 वी है, तो डिवाइस ओमिक क्षेत्र में संचालित होता है, जहां बिजली का करंट रैखिक रूप से बढ़ता है, यह दर्शाता है कि कोई आयन कमी क्षेत्र पूर्वसंकेंद्रितीकरण के लिए उत्पन्न नहीं होता है । हालांकि, यदि वोल्टेज >40 V है, तो आयन की कमी क्षेत्र मजबूत वोल्टेज-चालित इलेक्ट्रोकॉन्वक्शन द्वारा नष्ट हो जाता है, जो पूर्वसंरक्षण को अस्थिर करता है। इन कारकों को ध्यान में रखते हुए, यह निर्धारित किया गया था कि 30 वी 12 परतों और 2−5 मिमी के नमूना क्षेत्र व्यास वाले डिवाइस के लिए उपयोग करने के लिए इष्टतम वोल्टेज था। नमूना मात्रा को बड़ा करने के लिए परत संख्या या नमूना क्षेत्र व्यास बढ़ाया जा सकता है, लेकिन इन कारकों के साथ-साथ ऑपरेटिंग वोल्टेज को माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के स्थिर संवर्धन को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

प्रस्तावित एक्सो-पैड का उपयोग लार, मूत्र, सीरम और प्लाज्मा सहित विभिन्न नैदानिक नमूनों से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम को अलग करने के लिए किया जा सकता है। लार या मूत्र जैसे कम प्रोटीन वाले नमूनों के लिए, माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को बड़े बदलावों के बिना आसानी से अलग किया जा सकता है, क्योंकि इन नमूनों में प्रोटीन की एक छोटी मात्रा को कागज के लिए गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के माध्यम से फ़िल्टर किया जाएगा । सीमित क्षेत्र के भीतर डिवाइस का संचालन करते समय, केवल लागू वोल्टेज पर विचार करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि नमूनों की आयनिक ताकत अलग हो सकती है। प्रोटीन युक्त नमूनों, जैसे सीरम या प्लाज्मा के लिए, माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के पूर्वसंबंध और प्रचुर मात्रा में प्रोटीन से उनके अलगाव दोनों पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। हमारे हालिया प्रयोग से पता चलता है कि जब कार्बोनेट बफर का उपयोग किया जाता है तो प्रोटीन से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के पृथक्करण में काफी सुधार होता है, क्योंकि कार्बोनेट बफर के परिणामस्वरूप आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट के कारण माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स और प्रोटीन के बीच उच्च विद्युत आवेश अंतर होता है, जिसके परिणामस्वरूप बेहतर पृथक्करण दक्षता होती है। इस प्रयोग के लिए, माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के साथ प्रचुर मात्रा में प्रोटीन वाले पदार्थ को 50 मीटर कार्बोनेट(टेबल्स मैटर्स मैटर्स केबफर) में एक अलग फ्लोरोफोर (एक्स/एम: 590/617 एनएम) के साथ एक अलग फ्लोरोफोर (एक्स/एम: 590/617 एनएम) के साथ फिटसी (एक्स/एम: 490/520 एनएम) के साथ लेबल किए गए शुद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को मिलाकर नकल की गई थी । जैसा कि अनुपूरक चित्रा 1में दिखाया गया है, अधिकांश माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को परत 8 पर पूर्वकेंद्रित किया गया था, जैसा कि चित्रा 2 ए में था और उन्हें बीएसए से अलग किया गया था, जो 1-3 परतों में रहे । इस परिणाम से पता चलता है कि सीरम या प्लाज्मा नमूने से संवर्धन के लिए नमूने में कार्बोनेट बफर जोड़ने के लिए एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता होती है, और स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि एक्सो-पैड प्रचुर मात्रा में प्रोटीन से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को शुद्ध कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, ग्रांट एनआरएफ-2018R1D1A1A09084044 द्वारा समर्थित किया गया था। जे एच ली को 2019 में क्वांगवॉन विश्वविद्यालय के एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। Hyerin किम व्यापार, उद्योग और ऊर्जा मंत्रालय (MOTIE), कोरिया प्रौद्योगिकी संस्थान (KIAT) (नहीं) द्वारा संचालित के "उद्योग विशेषज्ञों के लिए योग्यता विकास कार्यक्रम" द्वारा समर्थित किया गया था । P0002397, वियरेबल स्मार्ट उपकरणों के औद्योगिक अभिसरण के लिए एचआरडी कार्यक्रम)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

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References

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पेपर-आधारित प्रीकंसेंट्रेशन और माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का अलगाव
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Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

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