Summary
Presentato è un protocollo per fabbricare un dispositivo cartaceo per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi.
Abstract
I microvescoli e gli esosomi sono piccole vesciche membranose rilasciate nell'ambiente extracellulare e circolate in tutto il corpo. Poiché contengono varie biomolecole derivate dalle cellule parentali come DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, il loro arricchimento e isolamento sono passaggi critici per il loro sfruttamento come potenziali biomarcatori per applicazioni cliniche. Tuttavia, i metodi di isolamento convenzionali (ad esempio, l'ultracentrifuga) causano perdite e danni significativi ai microvescicoli e agli esosomi. Questi metodi richiedono anche più passaggi ripetitivi di ultracentrifugazione, carico e sprechezza dei reagenti. Questo articolo descrive un metodo dettagliato per fabbricare un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) progettato per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi in modo semplice. Il design unico dell'Exo-PAD, costituito da strati multipiegati a fisarmonica con aree campione convergenti, è integrato con la tecnica di polarizzazione della concentrazione degli ioni, consentendo così l'arricchimento di cinque volte dei microvigli e degli esosomi su strati specifici. Inoltre, i microvescicoli arricchiti e gli esosomi sono isolati semplicemente dispiegando l'Exo-PAD.
Introduction
I microvescicoli e gli esosomi sono piccole vesciche a membrana che misurano rispettivamente 0,2 m e 30-200 nm. Essi sono secreti nell'ambiente extracellulare da diversi tipi di cellule1,2,3,4,5. Essi contengono informazioni sulle cellule parentali sotto forma di sottoinsiemi di DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, e circolano in tutto il corpo attraverso vari fluidi corporei come siero, plasma, urina, liquido cerebrospinale, liquido amniotico, e saliva6,7,8,9. Pertanto, le tecniche per un isolamento efficiente dei microviscoli e degli esosomi dai fluidi biologici possono fornire ampie opportunità nei campi della diagnosi, della prognosi e del monitoraggio in tempo reale della malattia, nonché nello sviluppo di nuove terapie.
Tuttavia, il metodo di isolamento convenzionale per microvicoli ed esosomi a base di ultracentrifugazione è estremamente dispendioso in termini di tempo e causa una significativa perdita e contaminazione del campione. Questo perché comporta diverse fasi ingombranti di pipettaggio e caricamento e lo scarto di vari reagenti con ultracentrifugazione ripetuta5,6,10,11,12.12 Inoltre, l'elevata sollecitazione di taglio indotta dall'ultracentrifugazione (100.000 x g)può causare il lisi fisico di microvessicoli ed esosomi, producendo bassi tassi di recupero (5-23%)6,13,14. Pertanto, è necessario sviluppare una tecnica di isolamento altamente efficiente e discreta per microvicoli ed esosomi per ridurre i danni e le perdite, ottenendo così tassi di recupero più elevati.
È stato sviluppato un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) per un isolamento più semplice, più delicato ed altamente efficiente di microvescicoli ed esosomi6. Il design dell'Exo-PAD è una carta multipiegata con aree campione collegate in serie che diminuiscono gradualmente di diametro. La tecnica di polarizzazione della concentrazione di ioni (ICP), che è un fenomeno nano-elettrocinetico che preconcentra le biomolecole cariche, è stata integrata con questo design unico. L'utilizzo dell'Exo-PAD ha portato a un arricchimento quintuplicato dei microvessicoli e degli esosomi in strati specifici e al loro isolamento semplicemente aprendo il dispositivo. In questo articolo viene descritto in dettaglio Exo-PAD, dalla fabbricazione e il funzionamento complessivo del dispositivo all'analisi del relativo utilizzo, per illustrare il metodo e mostrare risultati rappresentativi6.
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Protocol
1. Fabbricazione del dispositivo
- Definire la regione da stampare su carta utilizzando il software della stampante (Table of Materials).
NOTA: Il disegno ha 12 strati con motivi di cera in cui i diametri delle aree campione circolari si restringono gradualmente da 5 a 2 mm (Figura 1A). - Stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa (Tabella dei materiali) utilizzando una stampante di cera commerciale ( Tabella deimateriali) (Figura 1B).
- Mettere la carta stampata in cera in un forno da laboratorio per 80 s a 120 gradi centigradi.
NOTA: Questo passaggio consente alla cera di raggiungere l'interno della carta ottenendo un riflusso termico della cera stampata. Con questo protocollo di incubazione, la risoluzione del modello è di 2 mm. Quindi, fare attenzione a non stampare modelli di meno di 2 mm. Altrimenti i modelli saranno bloccati dalla cera. - Tagliare la carta stampata in cera con una fresa per creare singoli dispositivi (Figura 1C).
- Cadere 5 l e 2 l di membrana permselective (ad es. Nafion; Tabella dei materiali) sulle aree di esempio nei livelli più a sinistra e più a destra, rispettivamente (Figura 1D).
- Posizionare gli strati rivestiti con la membrana permselective su una piastra calda a 70 gradi centigradi per 30 min per far evaporare il solvente a membrana permselettiva.
- Sigillare la superficie più esterna dello strato rivestito rivolto verso la soluzione tampone con nastro sensibile alla pressione, lasciando un piccolo foro.
- Piegare il singolo dispositivo stampato (ad esempio, Exo-PAD) avanti e indietro lungo le linee bianche.
NOTA: piegando il dispositivo, tutte le aree campione diventano convergentmente connesse (Figura 1E). Questo design convergente focalizza le linee di campo elettrico quando la tensione viene applicata per ICP, ottenendo una preconcentrazione più intensiva dei microfonie e degli esosomi.
2. Arricchimento e messa a fuoco spaziale di microvescicoli ed esosomi mediante polarizzazione della concentrazione iostico
- Caricare 15 L del seme di microvessicolo ed exosoma (3 x 1011 particelle/mL in 0,1x fosfato tamponata salina [PBS] con 0,05% Tween 20) nelle aree campione convergenti mediante pipettaggio e attendere alcuni secondi per garantire la bagnatura completa di tutte le aree campione (Figura 1F).
- Posizionare due camere acriliche ad entrambe le estremità dell'Exo-PAD e bloccare l'Exo-PAD in modo sicuro con piccole clip legante per evitare lo svolgimento (Figura 1G).
- Riempire le camere con 110 xL di 0,1x PBS e inserire due elettrodi Ag/AgCl (Figura 1H).
- Applicare 30 V agli elettrodi per 20 min utilizzando un sistema di misurazione della sorgente di corrente-tensione (Tabella dei materiali).
NOTA: La tensione applicata genera il fenomeno ICP e quindi preconcentra i microfonie e gli esosomi sugli strati 8 e 9 dell'Exo-PAD.
3. Isolamento dei microvessicoli e degli esosomi arricchiti
- Separare l'Exo-PAD piegato dalle camere acriliche e aprire il dispositivo per isolare i microvescicoli e gli esosomi arricchiti dagli altri strati (Figura 1I).
- Estrarre le aree campione nei livelli 8 e 9, in cui vengono arricchiti i microvicoli e gli esosomi, per l'analisi a valle (Figura 1J).
4. Analisi della microscopia elettronica a scansione
- Fissare i microvescicoli e gli esosomi arricchiti immergendo le aree perforate in glutaraldeide 2,5% in buffer di cacodilate di sodio da 0,1 M per 1 h e nell'1% di tetrossido di osmio in cacodilate di sodio da 0,1 M per 1 h.
AVVISO: il tetrossido di Osmio è una sostanza chimica altamente velenosa e pericolosa. Poiché il tetrossido di osmio può penetrare nella plastica, deve essere conservato nel vetro. Qualsiasi trattamento di tetrossido di osmio deve essere eseguito in una cappa di fumi chimici con guanti a doppio nitrile. - Disidratare i microvescoli fissi e gli esosomi con gradi ascendenti di 200 etanolo di prova (ad esempio, 50%, 70%, 90% e 100%) per 30 min ciascuno.
- Asciugare chimicamente il campione immergendolo in hexamethyldisilazane in un desiccatore per 30 min.
AVVISO: l'hexamethyldisilazane è una sostanza chimica infiammabile e sensibile all'umidità. Deve essere conservato in un'area asciutta e ben ventilata lontana da fonti di accensione. - Rivestire i microvescicoli e gli esosomi completamente essiccati con oro/palladio (20 nm) attraverso immagini di microscopia elettronica a scansione (SEM).
5. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle
- Estrarre le aree campione nei livelli 6, 8 e 10 utilizzando un punzone di biopsia dopo 20 min di funzionamento del dispositivo.
- Immergi ogni area perforata in una soluzione buffer (0,1x PBS con 0,01% Tween 20).
- Vortice per 10 min e centrifuga per 30 s a 6.000 rpm per rimettere in sospensione i microvessi e gli esosomi arricchiti.
- Rimuovere le aree perforate dalla soluzione e misurare la concentrazione di microvissicoli ed esosomi da parte di uno strumento di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) (Tabella dei materiali).
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Representative Results
Il tempo di funzionamento deve essere ottimizzato per ottenere il massimo rendimento di recupero dei microvessicoli arricchiti e degli esosomi. Tempo insufficiente non consente una sufficiente migrazione dei microvicoli e degli esosomi, che diminuisce l'arricchimento, mentre il tempo eccessivo deteriora la messa a fuoco spaziale e quindi disperde i migameni e gli esosomi. Così, attraverso la fase di ottimizzazione del tempo, è possibile identificare il massimo fattore di preconcentrazione di microvissicoli ed esosomi e la posizione finale in cui i microvigli e gli esosomi sono più arricchiti. Per trovare la posizione finale dei microvessicoli e degli esosomi, è stata osservata la migrazione time-lapse di microvessicoliFigure 2Aed esosomi etichettati fluorescentmente conl'etichettaturaJ ( Figura 2B ). Prima del processo di arricchimento (Figura 2A, 0 min), i microvessicoli e gli esosomi venivano dispersi in tutte le aree campione con una graduale diminuzione dell'intensità a causa della leggera azione di filtraggio della matrice di carta (Figura 2B, 0 min). Dopo 10 min di elaborazione (Figura 2A, 10 min), microvessicoli ed esosomi migrati elettrocinicamente e una spina di preconcentrazione istantanea apparso sul livello 7. Un'ulteriore elaborazione ha raggiunto una maggiore preconcentrazione di microvissicoli ed esosomi. Quando il tempo del processo ha raggiunto i 20 minuti, i microvescicoli e gli esosomi erano fortemente concentrati sugli strati 8 e 9(Figura 2A, 20 min) e arricchiti cinque volte, in base alle intensità di fluorescenza (Figura 2B, 20 min).
Dopo aver completato il processo di preconcentrazione, i microvescicoli e gli esosomi arricchiti sono stati isolati aprendo il dispositivo e l'area campione nello strato 8 è stata perforata per ulteriori analisi. Sono state ottenute immagini SEM per studiare l'integrità dei microvescicoli e degli esosomi arricchiti. Come mostrato nelle immagini SEM (Figura 3A), sono stati osservati microvesicoli ed esosomi significativamente più non danneggiati dopo il processo di arricchimento. Utilizzando le immagini SEM ottenute, è stata analizzata la distribuzione delle dimensioni dei microvescicoli e degli esosomi arricchiti (Figura 3B), dove gli esosomi e i microvescicoli erano distinti in base a un diametro di soglia di 200 nm. In altre parole, la dimensione degli esosomi variava da 95 a 195 nm con un diametro medio di 134 nm e quella dei microvicoli da 214 a 377 nm con un diametro medio di 315 nm.
Successivamente, l'effettiva concentrazione dei microvessicoli arricchiti e degli esosomi sulle aree campione negli strati 6, 8 e 10 è stata analizzata da NTA. Prima dell'arricchimento, la concentrazione era di 2,24 x 1011 particelle/mL nello strato 8(Figura 3C, strato 8). Dopo l'arricchimento, la concentrazione è stata di 1,25 x10 12 particelle/mL nello strato 8(Figura 3C, strato 8), indicando che i microfonie e gli esosomi erano preconcentrati da un fattore di 5,58 dollari. Notevoli preconcentrazioni non sono state osservate negli altri livelli (Figura 3C, strati 6 e 10). Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che il dispositivo cartaceo proposto può arricchire i microvessicoli e gli esosomi di circa cinque volte.
L'efficienza di isolamento del dispositivo è stata valutata come segue: il volume del campione che può essere adattato dallo strato 8 e 9 è di 2,2 dollari su un totale di 15 - L di volume del campione in 10 strati a causa del design di restringimento dell'Exo-PAD. Se assumiamo un caso ideale in cui tutti i microvescicoli e gli esosomi sono preconcentrati sullo strato 8 e 9 e nessuno viene perso, allora il fattore di preconcentrazione ideale dovrebbe essere di 6,8 dollari (15 .L/L/2.2L - 6,8). Tuttavia, il fattore sperimentale di preconcentrazione ottenuto da NTA (Figura 3c) è stato di 5,58 dollari, il che significa che una porzione di 1,22 microvicoli ed esosomi sono stati persi dal lisi o dall'associazione non specifica alla matrice di carta.
dove 2,24 x 1012 particelle/mL è la concentrazione iniziale di microvicoli ed esosomi. Da questo calcolo, il tasso di perdita previsto dell'Exo-PAD è di circa il 18%; quindi, l'efficienza di isolamento è di circa l'82%. Si tratta di un miglioramento significativo rispetto alle scarse rese di ultracentrifugazione (5-23%).
Figura 1: Procedure Exo-PAD complessive, dall'assemblaggio al funzionamento. (A) Progettazione software per guidare la stampa di cera idrofobica su carta cellulosa. (B) La carta stampata in cera dopo l'incubazione in forno per 80 s a 120 gradi centigradi. (C) I singoli dispositivi vengono tagliati utilizzando una fresa. (D) La soluzione di membrana perselettiva viene rilasciata sulle aree campione negli strati più a sinistra e più a destra e il solvente viene evaporato su una piastra calda a 70 gradi centigradi per 30 min. ( (E) L'Exo-PAD stampato viene ripiegato avanti e indietro lungo le linee bianche; tutte le aree campione sono quindi convergentemente connesse. (F) Nell'area del campione viene caricato un campione di microvessicolo ed esosoma. (G) Due camere acriliche sono posizionate alle estremità del dispositivo e fissate con piccole clip legante. (H) Le camere acriliche sono riempite con soluzione tampone e vengono inseriti due elettrodi Ag/AgCl per applicare una tensione di 30 V. (I) Il dispositivo viene spiegato per isolare i microvescicoli preconcentrati e gli esosomi. (J) Le aree campione nei layer 8 e 9 vengono perforate per l'analisi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Osservazione di microscopi e esomici fluorescenti durante il funzionamento del dispositivo e delle corrispondenti intensità di fluorescenza. (A) Osservazione time-lapse di microvessicoli ed esosomi. Barra della scala: 5 mm. Con 20 min di lavorazione, i microvescicoli e gli esosomi erano fortemente concentrati sui livelli 8 e 9, dove (B) sono stati arricchiti di circa cinque volte. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n - 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi dei microvessicoli e degli esosomi arricchiti. (A) Immagini SEM che mostrano l'integrità dei microvescicoli e degli esosomi arricchiti. Dopo la preconcentrazione, sono stati osservati molti più microvessicoli ed esosomi6. Barra della scala: 1 m. (B) Distribuzione delle dimensioni dei microvescicoli e degli esosomi arricchiti. Le dimensioni degli esosomi erano di 95,195 nm (diametro medio 134 nm) e le dimensioni dei microvicoli erano di 214-377 nm (diametro medio: 315 nm). (C) L'effettiva concentrazione dei microvessicoli e degli esosomi arricchiti è stata valutata mediante NTA. Dopo l'arricchimento, la concentrazione di microvescicoli ed esosomi è quintuplicata, che è coerente con i risultati di fluorescenza6. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n - 3). I pannelli A e C sono riprodotti per autorizzazione di Kim et al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementary Figura 1: Microvescoli ed esosomi preconcentrati e concentrati sul livello 8 sono stati separati dall'albumina del siero bovino (BSA), che è rimasto nei livelli 1–3. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Anche se l'Exo-PAD è stato utilizzato con successo per l'arricchimento e l'isolamento di microvicoli ed esosomi, diversi punti critici devono essere attentamente considerati: 1) il tempo di incubazione del forno e la temperatura durante la preparazione del dispositivo, 2) tempo di elaborazione, 3) applicazione di tensione con diversi numeri di strato e diametri di area campione, e 4) l'applicabilità ai campioni clinici.
Il tempo di incubazione e la temperatura indicati nel protocollo sono condizioni ottimizzate per fabbricare un dispositivo affidabile. Tempi di incubazione più lunghi o una temperatura più elevata possono causare distorsioni del disegno convergente a causa dell'eccessivo riflusso della cera stampata. Ciò impedirà la formazione di linee di campo elettrico focalizzate e quindi aumenterà la resistenza alla migrazione durante il processo di arricchimento elettrocinetico.
Il tempo di elaborazione è anche un fattore da considerare per il massimo arricchimento e isolamento. Un tempo di elaborazione di <20 min determina una minore preconcentrazione perché non è sufficiente per consentire la migrazione di microviscicoli ed esosome. D'altra parte, un tempo di elaborazione di >20 min deteriora l'efficienza di messa a fuoco e consente la dispersione dei microfoniti arricchiti e degli esosomi. Secondo questo test, 20 min è il miglior tempo di lavorazione per ottenere il massimo arricchimento e isolamento di microvescicoli ed esosomi.
La tensione applicata è un altro fattore importante da considerare. In questo protocollo, considerando il numero di strati e i diametri dell'area campione, 30 V viene utilizzato per ottenere preconcentrazione e isolamento stabili. Quando un fenomeno ICP viene generato nel dispositivo, il regime di funzionamento può essere suddiviso in tre aree distinte in base alla tensione applicata: (1) ohmic, (2) limitando le regioni6,15,16. Per la preconcentrazione e l'isolamento stabili, il dispositivo deve essere azionato nella regione limitante, dove viene generata una zona di esaurimento degli ioni e i microfonie e gli esosomi sono stabilmente preconcentrati. In questa impostazione sperimentale, l'intervallo di tensione operativa (5-40 V) corrisponde alla regione limitante per l'Exo-PAD. Se la tensione applicata è <5 V, il dispositivo opera nell'area ohmica, dove la corrente elettrica aumenta linearmente, a indicare che non viene generata alcuna regione di esaurimento degli ioni per la preconcentrazione. Tuttavia, se la tensione è >40 V, la regione di esaurimento degli ioni viene distrutta da una forte elettroconvezione guidata dalla tensione, che destabilizza la preconcentrazione. Considerando questi fattori, è stato determinato che 30 V era la tensione ottimale da utilizzare per un dispositivo con 12 strati e un diametro dell'area del campione di 2-5 mm. I numeri di strato o i diametri dell'area del campione possono essere aumentati per ingrandire il volume del campione, ma questi fattori, così come la tensione di funzionamento, dovrebbero essere ottimizzati per ottenere un arricchimento stabile di microvescicoli ed esosomi.
Il proposto Exo-PAD può essere utilizzato per isolare microvescicoli ed esosomi da vari campioni clinici, tra cui saliva, urina, siero e plasma. Per i campioni con meno proteine, come saliva o urina, i mivescoli e gli esosomi possono essere facilmente isolati senza grandi cambiamenti, perché una piccola quantità di proteine in questi campioni verrà filtrata attraverso un legame non specifico alla carta. Quando si utilizza il dispositivo all'interno della regione limitante, è necessario considerare solo la tensione applicata, perché la forza ionica dei campioni può essere diversa. Per i campioni ricchi di proteine, come il siero o il plasma, sia la preconcentrazione di microvescicoli ed esosomi e la loro separazione da proteine abbondanti devono essere attentamente considerate. Il nostro recente esperimento mostra che la separazione dei microvescicoli e degli esosomi dalle proteine è notevolmente migliorata quando si utilizza il buffer di carbonato, perché il buffer di carbonato comporta una maggiore differenza di carica elettrica tra microvicoloe ed esosomi e proteine a causa del punto isoelettrico, con conseguente migliore efficienza di separazione. Per questo esperimento, una sostanza con abbondanti proteine coesistenti con microvessicoli ed esosomi è stata mimickata mescolando microvessicoli purificati ed esosomi etichettati con FITC (Ex/Em: 490/520 nm) con BSA etichettatoTable of Materialscon un diverso fluoroforo (Ex/Em: 590/617 nm) in 50 m. Come mostrato nella Figura supplementare 1, la maggior parte dei microvicoli e degli esosomi erano preconcentrati sullo strato 8, come nella Figura 2A e sono stati separati dalla BSA, che rimaneva nello strato 1-3. Questo risultato suggerisce che l'arricchimento da un siero o un campione di plasma richiede un ulteriore passo nell'aggiunta del tampone di carbonato al campione, e dimostra chiaramente che l'Exo-PAD può purificare i microvescicoli e gli esosomi dalle proteine abbondanti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee è stato sostenuto da una borsa di ricerca della Kwangwoon University nel 2019. Hyerin Kim è stata sostenuta dal "Programma di sviluppo delle competenze per gli specialisti dell'industria" del Ministero coreano del commercio, dell'industria e dell'energia (MOTIE), gestito dal Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (n. P0002397, programma HRD per la convergenza industriale di dispositivi intelligenti indossabili).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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