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Biochemistry

マイクロベシクルとエキソソームのペーパーベースの事前濃縮と分離

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

提示は、マイクロベシクルおよびエキソソームの効果的な濃縮および分離のための紙ベースのデバイスを製造するためのプロトコルです。

Abstract

マイクロベシクルおよびエキソソームは、細胞外環境に放出され、全身に循環する小さな膜小胞である。DNA、mRNA、miRNA、タンパク質、脂質などの様々な親の細胞由来生体分子が含まれているため、その濃縮と単離は、臨床応用の潜在的なバイオマーカーとしての活用に不可欠なステップです。しかしながら、従来の分離法(例えば、超遠心分離)は、微小胞およびエキソソームに重大な損失および損傷を引き起こす。これらの方法では、試薬の超遠心、荷重、および無駄の複数の繰り返しステップが必要です。本稿では、マイクロベシクルとエキソソームの効果的な濃縮と分離を簡単に行えるように設計された折り紙ベースのデバイス(Exo-PAD)を製造するための詳細な方法について説明します。収束したサンプル領域を持つアコーディオンのような多折層からなるExo-PADのユニークなデザインは、イオン濃度偏光技術と統合され、それによって特定の層上の微小胞およびエキソソームの5倍の濃縮を可能にする。さらに、濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームは、単にExo-PADを展開することによって分離されます。

Introduction

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マイクロベシクルとエキソソームはそれぞれ0.2-1 μmと30-200 nmの小膜小胞です。それらは、いくつかの異なる,細胞タイプ1、2、3、4、52,3,によって細胞外環境に分泌される。145それらはDNA、mRNA、miRNA、タンパク質、および脂質のサブセットの形態の親の細胞情報を含み、血清、血漿、尿、脳脊髄液、羊水、唾液66、7、8、97,8,9のような様々な体液を介して全身を循環する。このように、生物学的流体からの微小胞およびエキソソームを効率的に単離する技術は、疾患の診断、予後、およびリアルタイムモニタリングの分野において、ならびに新しい治療薬の開発において広範な機会を提供することができる。

しかし、超遠心分離に基づくミクロベシクルおよびエキソソームの従来の分離法は非常に時間がかかり、サンプルの著しい損失および汚染を引き起こす。これは、超遠心,,,55、6、10、11、126を繰り返した様々な試薬の、いくつかの面倒なピペットとローディングステップと廃棄を伴うからです。101112また、超遠心分離(〜100,000 x g)によって引き起こされる高剪断応力は、微小胞およびエキソソームの物理的なリシスを引き起こし、回復率が低い(5−23%)6、13、14を生じる。6,13,14そのため、損傷や損失を低減するために、マイクロベシクルおよびエキソソームの非常に効率的で目立たない分離技術を開発し、より高い回収率を達成する必要があります。

折り紙ベースのデバイス (Exo-PAD) は、マイクロベシクルとエキソソームの分離を簡単に、より穏やかで、高効率に開発しましたExo-PADの設計は、直径が徐々に減少する連続的に接続されたサンプル領域を有する多重折紙である。このユニークな設計と統合された、電位分子を事前濃縮するナノ電気運動現象であるイオン濃度偏光(ICP)技術。Exo-PADを使用すると、特定の層の微小胞とエキソソームの5倍の濃縮と、単にデバイスを展開するだけで分離しました。この記事では、Exo-PAD について詳細に説明し、デバイスの全体的な製造と操作からその使用の分析まで、その方法を説明し、代表的な結果6を示します。

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Protocol

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1. デバイスの製造

  1. プリンタソフトウェアを使用して用紙に印刷する領域を定義します ([資料一覧] )。
    注:設計には12のワックスパターンの層があり、円形サンプル領域の直径は5mmから2mmに徐々に狭くなります(図1A)。
  2. セルロース紙の両面の指定領域に疎水性ワックスを印刷し、市販ワックスプリンタ(材料表)を使用して(図1B)。
  3. ワックスプリント紙を120°Cの80sの実験用オーブンに入れます。
    注:このステップは、印刷されたワックスの熱リフローを達成することによって、ワックスが紙の内側に到達することを可能にします。このインキュベーションプロトコルでは、パターンの分解能は〜2mmです。したがって、2mm未満のパターンを印刷しないように注意してください。
  4. ワックスプリントの紙をカッターで切って、個々のデバイスを作ります(図1C)。
  5. 5 μL および 2 μL の透過性膜(例えば、ナフィオン;資料一覧)それぞれ、左端と右端のレイヤーのサンプル領域に(図1D)
  6. パーミセレクティブ膜でコーティングした層をホットプレートの上に70°Cで30分間置き、透過膜溶媒を蒸発させます。
  7. 緩衝液に面したコーティングされた層の最表面を感圧テープで密封し、小さな穴を残します。
  8. 印刷した個々のデバイス(Exo-PAD)を白い線に沿って前後に折り畳みます。
    メモ:デバイスを折りたたむと、すべてのサンプル領域が収束接続されます(図1E)。この収束設計は、電圧がICPに印加される際に電界線に焦点を当て、マイクロベシクルおよびエキソソームのより集中的な事前集積を達成する。

イオン濃度分極による微小胞とエキソソームの濃縮と空間的焦点化

  1. ミクロベシクルおよびエキソソームサンプルの15 μL(0.1x11リン酸緩衝生理食塩水[PBS]0.1x 0.05%Tween 20)の15μLを、ピペット処理によって収束サンプル領域に負荷し、数秒待ってすべてのサンプル領域を完全に濡らします(図1F)。
  2. Exo-PADの両端に2つのアクリルチャンバーを置き、展開を防ぐために小さなバインダークリップでExo-PADをしっかりとクランプします(図1G)。
  3. チャンバに0.1x PBSの110 μLを充填し、Ag/AgCl電極を2個挿入します(図1H)。
  4. 電流電圧源測定システム(材料表)を使用して、電極に30Vを20分間塗布します。
    注:印加電圧はICP現象を発生させ、Exo-PADの8および9の層にマイクロベシクルとエキソソームを事前に濃縮します。

3. 濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームの分離

  1. 折りたたまれたExo-PADをアクリルチャンバーから分離し、デバイスを展開して濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームを他の層から分離する(図1I)。
  2. 下流解析のために、マイクロベシクルとエキソソームが豊富に含まれるレイヤー8と9のサンプル領域をパンチアウトします(図1J)。

4. 走査型電子顕微鏡解析

  1. 0.1 Mのカコチル酸ナトリウムバッファーに2.5%のグルタルアルデヒド、1.1 Mのカコチル酸ナトリウムで1%の四酸化オスミウムに1時間浸漬することにより、濃縮されたミクロ胞およびエキソソームを固定します。
    注意:四酸化オスミウムは非常に有毒で有害な化学物質です。四酸化オスミウムはプラスチックに浸透することができるので、ガラスに保管する必要があります。四酸化オスミウムの任意の取り扱いは、二重ニトリル手袋と化学ヒュームフードで行われなければなりません。
  2. 200個の証拠エタノール(すなわち、50%、70%、90%、および100%)の上昇グレードで固定マイクロベシクルおよびエキソソームを脱水するそれぞれ30分間。
  3. ヘキサメチルジシルラザンに30分間乾燥剤を浸してサンプルを化学的に乾燥させます。
    注意:ヘキサメチルジシルラザンは可燃性で湿気に敏感な化学物質です。それは点火源から離れて乾燥し、換気の良い区域に貯えられる必要がある。
  4. 完全に乾燥したマイクロベシクルとエキソソームを金/パラジウム(〜20nm)で植え付け、スパッタリングを介して、走査型電子顕微鏡(SEM)画像をキャプチャします。

5. ナノ粒子追跡解析

  1. デバイス操作の20分後に生検パンチを使用して、サンプル領域をレイヤー6、8、および10でパンチアウトします。
  2. 各パンチアウト領域をバッファ溶液(0.01%Tween 20で0.1x PBS)に浸します。
  3. 渦は10分間、遠心分離機は6,000rpmで30s、濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームを再中断する。
  4. 溶液からパンチアウト領域を取り除き、ナノ粒子追跡解析(NTA)機器(材料表)によってマイクロベシクルおよびエキソソームの濃度を測定する。

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Representative Results

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濃縮されたマイクロベシクルおよびエキソソームの最大の回収率を達成するために、操作時間を最適化する必要があります。時間が不十分なため、微小胞やエキソソームの十分な移動が可能で、富化が低下するのに対し、過度の時間は空間的な集着を悪化させ、したがって微小胞およびエキソソームを分散させる。したがって、時間最適化ステップを通じて、マイクロベシクルとエキソソームの最大事前集積因子と、マイクロベシクルとエキソソームが最も豊かにされる最終位置を同定することができる。マイクロベシクルおよびエキソソームの最終的な位置を見つけるために、蛍光標識されたマイクロベシクルおよびエキソソームのタイムラプス移動を顕微鏡で観察し(図2A)、全てのサンプル領域の蛍光強度をImageJソフトウェアを用いて定量した(図2B)。濃縮処理(図2A、0分)の前に、マイクロベシクルおよびエキソソームは、紙マトリックスのわずかなフィルタリング作用のために強度が徐々に減少して、すべてのサンプル領域に分散した(図2B、0分)。10分の処理(図2A、10分)の後、マイクロベシクルおよびエキソソームは電気的に移動し、即刻の事前濃縮プラグが層7に現れた。さらなる処理は、マイクロベシクルおよびエキソソームのより大きな事前濃縮を達成した。プロセス時間が20分に達すると、マイクロベシクルとエキソソームは、層8と9(図2A、20分)に強く焦点を当て、蛍光強度(図2B、20分)に基づいて5倍に濃縮した。

事前濃縮プロセスを完了した後、濃縮されたマイクロベシクルおよびエキソソームを装置を展開して単離し、さらに分析のために層8のサンプル領域をパンチアウトした。濃縮されたマイクロベシクルおよびエキソソームの完全性を調べるSEM画像を得た。SEM画像(図3A)に示すように、濃縮プロセス後に、損傷を受けていない微小胞およびエキソソームが有意に多く観察された。得られたSEM画像を用いて、濃縮されたマイクロベシクルおよびエキソソームのサイズ分布を分析し(図3B)、エキソソームとマイクロベシクルを200nmの閾値直径に基づいて区別した。つまりエキソソームの大きさは、平均直径134nmの95~195nm、平均直径315nmの214~377nmのマイクロベシクルの大きさでした。

続いて、6、8、および10の層内のサンプル領域上の濃縮された微小胞およびエキソソームの実際の濃度をNTAで分析した。濃縮前、濃度は層8中〜2.24 x10 11個の粒子/mLであった(図3C、層8)。濃縮後、濃度は層8(図3C、層8)において12個の粒子/mL〜1.12個の濃度であったが、マイクロベシクルおよびエキソソームは〜5.58の係数で予濃縮されたことを示す。他の層には顕著な事前濃度は認められなかった(図3C、層6および10)。これらの結果をまとめると、提案された紙ベースのデバイスがマイクロベシクルとエキソソームを約5倍に濃縮できることを実証した。

装置の絶縁効率は以下のように評価した:Exo-PADの設計が狭まるため、層8と9で収容できるサンプル容積は、10層のサンプル体積の合計15μLから〜2μL〜2μLである。マイクロベシクルとエキソソームのすべてがレイヤ8と9に事前濃縮され、何も失われず、理想的な場合は、理想的な事前濃縮係数は~6.8(15 μL/2.2 μL = ~6.8)にする必要があります。しかしながら、NTA(図3c)によって得られた実験的事前濃縮因子は〜5.58であり、これは1.22マイクロベシクルおよびエキソソームの一部が、紙マトリックスへのリシスまたは非特異的結合によって失われたことを意味する。
Equation 1
ここで2.24 x 1012粒子/mLは、マイクロベシクルおよびエキソソームの初期濃度である。この計算から、Exo-PADの予想損失率は約18%である。したがって、絶縁効率は約82%です。これは、超遠心率の低い収率(5%-23%)に比べて大幅に改善されています。

Figure 1
図1:アセンブリから操作まで、全体的なExo-PAD手順。(A) セルロース紙に疎水性ワックスの印刷を導くソフトウェア設計。(B)120°Cで80sのオーブンでインキュベーション後のワックスプリント紙。B(C)個々の装置はカッターを使って切り取られます。(D) 選択性膜溶液は、一番左と右端の層のサンプル領域に落とされ、溶媒はホットプレート上で30分間蒸発する(E)印刷されたExo-PADは白線に沿って前後に折り畳まれる。したがって、すべてのサンプル領域は収束的に接続されます。(F)マイクロベシクルとエキソソームサンプルがサンプル領域に積載される。(G)2つのアクリルチャンバーは、デバイスの端に配置され、小さなバインダークリップで固定されています。(H)アクリルチャンバは、バッファー溶液で満たされ、2つのAg /AgCl電極は、30 Vの電圧を印加するために挿入されます。(J) レイヤー 8 と 9 のサンプル領域は、解析用にパンチアウトされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:デバイス操作中の蛍光標識されたマイクロベシクルおよびエキソソームの観察と、それに対応する蛍光強度(A)マイクロベシクルおよびエキソソームのタイムラプス観察。スケールバー= 5 mm20分の処理で、マイクロベシクルとエキソソームは層8と9に強く焦点を当て、そこで(B)約5倍の濃縮を行った。誤差範囲は標準偏差(n = 3)を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:濃縮された微小胞およびエキソソームの分析。(A) 濃縮されたマイクロベシクルおよびエキソソームの完全性を示すSEM画像。事前濃縮後、さらに多くのミクロベシクルおよびエキソソームが6に観察された。スケールバー = 1 μm(B) 濃縮されたマイクロベシクルおよびエキソソームのサイズ分布。エキソソームサイズは95-195nm(平均直径= 134nm)、マイクロベシクルサイズは214-377nm(平均直径= 315nm)であった。(C) NTAを用いて評価した濃縮マイクロベシクルおよびエキソソームの実際の濃度。濃縮後、マイクロベシクルおよびエキソソームの濃度は5倍に増加し、これは蛍光結果6と一致する。誤差範囲は標準偏差(n = 3)を表します。パネルACは、Kim et al.6の許可により再現されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:マイクロベシクルエキソソームは、あらかじめ濃縮され、層8に焦点を当てたが、層1〜3に留まった牛血清アルブミン(BSA)から分離された

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Discussion

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Exo-PADはマイクロベシクルおよびエキソソームの濃縮および分離のために正常に使用されましたが、いくつかの重要な点を慎重に検討する必要があります:1)デバイス調製中のオーブンインキュベーション時間と温度、2)処理時間、3)様々な層数とサンプル面積径の電圧の適用、および4)臨床サンプルへの適用性。

プロトコルで与えられたインキュベーション時間と温度は、信頼性の高いデバイスを製造するために最適化された条件です。より長いインキュベーション時間または高温は、プリントされたワックスの過度のリフローのために収束設計の歪みを引き起こす可能性があります。これにより、電界線の形成を防ぎ、エレクトロキネティックエンリッチメントプロセス中の移動抵抗を増加させます。

処理時間は、最大の濃縮と分離を考慮する要素でもあります。<20 分の処理時間は、マイクロベシクルおよびエキソソーム移行を可能にする十分な時間がないため、事前濃度が低下します。一方、処理時間が20分の場合、焦点の効率が低下し、濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームの分散が可能になります。このテストによると、20分は、マイクロベシクルとエキソソームの最大濃縮と分離を達成するための最良の処理時間です。

印加電圧は、考慮すべきもう一つの重要な要素です。このプロトコルでは、層数およびサンプル面積径を考慮すると、安定した事前集中および分離を達成するために30Vが使用される。装置内でICP現象が発生する場合、動作レジームは、(1)オーミック、(2)制限、および(3)過大領域66、15、1615,の電圧に応じて3つの異なる領域に分けることができる。16安定した事前集中および分離のために、装置はイオン枯渇地帯が発生し、マイクロベシクルおよびエキソソームが安定に濃縮される制限領域で作動されるべきである。この実験的設定では、動作電圧範囲(5−40 V)はExo-PADの制限領域に対応します。印加電圧が<5Vの場合、電流が直線的に増加するオーミック領域で動作し、イオン枯渇領域が事前集中のために生成されなくなることを示します。ただし、電圧が>40Vの場合、イオン枯渇領域は、強い電圧駆動電気の結び付きによって破壊され、事前の集中を不安定にします。これらの要因を考慮すると、30Vが12層のデバイスに最適な電圧であり、サンプル面積直径が2〜5mmのサンプル面積を大きくしてサンプル体積を大きくすることができるが、これらの要因は、マイクロシクルおよびエキソソームの安定した濃縮を達成するために、動作電圧と同様に最適化されるべきである。

提案されたExo-PADは、唾液、尿、血清、および血漿を含む様々な臨床サンプルから微小胞およびエキソソームを分離するために使用することができる。唾液や尿などのタンパク質が少ないサンプルの場合、これらのサンプル中の少量のタンパク質が紙に非特異的に結合して除外されるため、マイクロベシクルおよびエキソソームは大きな変化なしに容易に単離することができます。制限領域内でデバイスを動作させる場合、サンプルのイオン強度が異なるため、印加電圧のみを考慮する必要があります。血清や血漿などのタンパク質が豊富なサンプルの場合、マイクロベシクルとエキソソームの事前濃縮と豊富なタンパク質からの分離の両方を慎重に検討する必要があります。我々の最近の実験では、炭酸塩緩衝液を使用すると、タンパク質からの微小胞とエキソソームの分離が有意に改善され、炭酸塩緩衝液は等電点による微小胞とエキソソームおよびタンパク質の間でより高い電荷差をもたらし、より良い分離効率をもたらすことを示している。この実験では、微小胞およびエキソソームと共存するタンパク質が豊富な物質を、精製されたミクロベシクルとFITC(Ex/Em:490/520 nm)で標識されたエキソソームと、異なるフッ素酸胞(Ex/Em:590/617 nm)で標識したBSAを50mの炭酸塩バッファー()に混合して模倣した。補助図 1に示すように、図2Aのように、ほとんどのマイクロベシクルおよびエキソソームは、レイヤ 8 にあらかじめ濃縮されており、BSA から分離され、それらは 1 ~ 3 に留まっていました。この結果は、血清または血漿サンプルからの濃縮は、試料に炭酸塩バッファーを追加する必要があることを示唆し、Exo-PADが豊富なタンパク質からマイクロベシクルおよびエキソソームを精製できることを明確に示しています。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、韓国国立研究財団、グラントNRF-2018R1D1A1A09084044によって支援されました。J.H.リーは、2019年に光明大学からの研究助成金によって支援されました。キム・ヒエリンは、韓国産業振興機構(KIAT)が運営する韓国産業エネルギー省の「産業専門家コンピテンシー開発プログラム」の支援を受けました(No.P0002397、ウェアラブルスマートデバイスの産業コンバージェンスのためのHRDプログラム)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

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Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

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