Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Papirbasert preconcentration og isolering av mikrovesicles og exosomer

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Presentert er en protokoll for å fremstille en papirbasert enhet for effektiv berikelse og isolering av mikroveskler og eksosomer.

Abstract

Mikrokjøretøy og eksosomer er små membranøse vesikler som frigjøres til det ekstracellulære miljøet og sirkuleres i hele kroppen. Fordi de inneholder ulike foreldrecelleavledede biomolekyler som DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, er deres berikelse og isolasjon kritiske skritt for deres utnyttelse som potensielle biomarkører for kliniske applikasjoner. Konvensjonelle isolasjonsmetoder (f.eks. ultracentrifugation) forårsaker imidlertid betydelig tap og skade på mikroveskler og eksosomer. Disse metodene krever også flere repeterende trinn av ultracentrifugation, lasting, og sløse av reagenser. Denne artikkelen beskriver en detaljert metode for å fremstille en origami-papirbasert enhet (Exo-PAD) designet for effektiv berikelse og isolering av mikroveskler og eksosomer på en enkel måte. Den unike utformingen av Exo-PAD, som består av trekkspilllignende flerfoldede lag med konvergerende prøveområder, er integrert med ionkonsentrasjonspolariseringsteknikken, og muliggjør dermed femdoblet berikelse av mikrovesiklene og eksosomene på bestemte lag. I tillegg isoleres de berikede mikrovesiklene og eksosomene ved ganske enkelt å utfolde Exo-PAD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikrokjøretøy og eksosomer er små membran vesikler som måler henholdsvis 0,2-1 μm og 30-200 nm. De utskilles i det ekstracellulære miljøet av flere forskjellige celletyper1,,2,,3,,4,5. De inneholder foreldrecelleinformasjon i form av undergrupper av DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, og sirkulerer i hele kroppen via ulike kroppsvæsker som serum, plasma, urin, cerebrospinalvæske, fostervann og spytt6,7,8,9. Dermed kan teknikker for effektiv isolering av mikrovesikler og eksosomer fra biologiske væsker gi omfattende muligheter innen diagnose, prognose og sanntidsovervåking av sykdom, samt i utviklingen av nye terapeutiske midler.

Den konvensjonelle isolasjonsmetoden for mikroveskler og eksosomer basert på ultracentrifugering er imidlertid ekstremt tidkrevende og forårsaker betydelig tap og forurensning av prøven. Dette er fordi det innebærer flere tungvint pipettering og lasting trinn og kassering av ulike reagenser med gjentatt ultracentrifugation5,6,10,11,12. Videre kan det høye skjærstresset forårsaket av ultracentrifugation (~ 100.000 x g)forårsake fysisk lysis av mikroveskler og eksosomer, noe som gir dårlig utvinning (5-23%)6,13,14. Derfor må en svært effektiv, diskret isolasjonsteknikk for mikroveskler og eksosomer utvikles for å redusere skade og tap, og dermed oppnå høyere utvinningsgrad.

En origami-papirbasert enhet (Exo-PAD) ble utviklet for enklere, mildere og svært effektiv isolering av mikroveskler og eksosomer6. Utformingen av Exo-PAD er et papir med flerefold med seriellede prøveområder som gradvis reduseres i diameter. Ionkonsentrasjonspolariseringsteknikken (ICP), som er et nanoelektrokinetisk fenomen som prekonstruerer ladede biomolekyler, ble integrert med denne unike designen. Bruk av Exo-PAD resulterte i femdoble berikelse av mikrovesiklene og eksosomene i bestemte lag og deres isolasjon ved ganske enkelt å utfolde enheten. Denne artikkelen beskriver Exo-PAD i detalj, fra den generelle enheten fabrikasjon og drift til analyse av bruken, for å illustrere metoden og vise representative resultater6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Enhetsfabrikasjon

  1. Definer området som skal skrives ut på papir ved hjelp av skriverprogramvare (Tabell over materialer).
    MERK: Designet har 12 voksmønstrede lag der diameterene på de sirkulære prøveområdene gradvis smalner fra 5 mm til 2 mm (Figur 1A).
  2. Skriv ut hydrofob voks på de angitte områdene på begge sider av cellulosepapiret (Tabell over materialer) ved hjelp av en kommersiell voksskriver ( Tabell overmaterialer) (Figur 1B).
  3. Plasser det vokstrykte papiret i en laboratorieovn i 80 s ved 120 °C.
    MERK: Dette trinnet gjør at voksen kan nå innsiden av papiret ved å oppnå en termisk reflow av den trykte voks. Med denne inkubasjonsprotokollen er oppløsningen på mønsteret ~ 2 mm. Vær derfor forsiktig så du ikke skriver ut mønstre på mindre enn 2 mm. Ellers vil mønstrene bli blokkert av voksen.
  4. Klipp det vokstrykte papiret med en kutter for å lage individuelle enheter (Figur 1C).
  5. Slipp 5 μL og 2 μL permselective membran (f.eks. Tabell over materialer) på prøveområdene i henholdsvis venstre og høyre (Figur 1D).
  6. Plasser lagene belagt med permselective membran på en kokeplate ved 70 °C i 30 min for å fordampe det permselective membranløsningsmiddelet.
  7. Forsegle den ytterste overflaten av det belagte laget mot bufferløsningen med trykkfølsom tape, og etterlater et lite hull.
  8. Brett den utskrevne individuelle enheten (dvs. Exo-PAD) frem og tilbake langs de hvite linjene.
    MERK: Ved å brette enheten blir alle prøveområder konvergerende tilkoblet (Figur 1E). Denne konvergerende designen fokuserer de elektriske feltlinjene når spenningen brukes for ICP, og oppnår mer intensiv preconcentration av mikrovesicles og eksosomer.

2. Berikelse og romlig fokusering av mikroveskler og eksosomer ved ionkonsentrasjonspolarisering

  1. Last 15 μL av mikrovesklemmen og eksosomprøven (~ 3 x 1011 partikler/ml i 0,1x fosfatbufret saltvann [PBS] med 0,05 % Tween 20) i de konvergerende prøveområdene ved pipettering og vent noen sekunder for å sikre fullstendig fukting av alle prøveområder (Figur 1F).
  2. Plasser to akrylkamre i begge ender av Exo-PAD og klem Exo-PAD godt fast med små bindemiddelklips for å hindre utfoldelse (Figur 1G).
  3. Fyll kamrene med 110 μL 0,1x PBS og sett inn to Ag/AgCl-elektroder (figur 1H).
  4. Påfør 30 V på elektrodene i 20 min ved hjelp av et strømspenningskildemålingssystem (Tabell over materialer).
    MERK: Den påførte spenningen genererer ICP-fenomenet og prekonstruerer dermed mikrovesiklene og eksosomene på lag 8 og 9 av Exo-PAD.

3. Isolering av berikede mikroveskler og eksosomer

  1. Skill den brettede Exo-PAD fra akrylkamrene og brett ut enheten for å isolere de berikede mikrovesiklene og eksosomene fra de andre lagene (figur 1I).
  2. Slå ut prøveområdene i lag 8 og 9, hvor mikrovesiklene og eksosomene er beriket, for nedstrøms analyse (Figur 1J).

4. Skanning av elektronmikroskopianalyse

  1. Fiks de berikede mikrovesiklene og eksosomene ved å senke de stansede områdene i 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumkaktylatbuffer i 1 t og i 1 % osmiumtetroxide i 0,1 M natriumkaktylat i 1 timer.
    FORSIKTIG: Osmium tetroxide er svært giftig og farlig kjemisk. Fordi osmium tetroxide kan trenge inn i plast, må den lagres i glass. Enhver håndtering av osmiumtetroxid må utføres i en kjemisk røykhette med doble nitrilhansker.
  2. Dehydrere de faste mikrovesikler og eksosomer med stigende karakterer på 200 bevis etanol (dvs. 50%, 70%, 90%, og 100%) i 30 min hver.
  3. Kjemisk tørk prøven ved å senke den i heksamyldisilazan i en tørkesor i 30 min.
    FORSIKTIG: Heksamyldisilazan er et brannfarlig og fuktighetsfølsomt kjemikalie. Den må oppbevares i et tørt og godt ventilert område vekk fra tenningskilder.
  4. Coat de helt tørkede mikrovesiklene og eksosomene med gull / palladium (~ 20 nm) via sputtering og fange skanning elektron mikroskopi (SEM) bilder.

5. Nanopartikkel sporing analyse

  1. Slå ut prøveområdene i lag 6, 8 og 10 ved hjelp av en biopsistans etter 20 min enhetsdrift.
  2. Senk hvert utsende område i bufferløsning (0,1 x PBS med 0,01 % Tween 20).
  3. Vortex i 10 min og sentrifuge for 30 s ved 6000 rpm for å resuspepend de berikede mikroveskler og eksosomer.
  4. Fjern de utstansede områdene fra løsningen og mål konsentrasjonen av mikroveskler og eksosomer ved et nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) instrument (Tabell over materialer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Driftstiden må optimaliseres for å oppnå maksimal utvinningsutbytte av de berikede mikrovesiklene og eksosomene. Utilstrekkelig tid tillater ikke tilstrekkelig migrering av mikrovesiklene og eksosomene, noe som reduserer berikelsen, mens overdreven tid forverrer den romlige fokuseringen og sprer dermed mikrovesiklene og eksosomene. Dermed, gjennom tiden optimalisering trinn, maksimal preconcentration faktor av mikrovesicles og eksosomer og den endelige plasseringen der mikrovesicles og eksosomer er mest beriket kan identifiseres. For å finne den endelige plasseringen av mikrovesikler og eksosomer, ble tidsforløpsmigrasjon av fluorescerende merkede mikroveskler og eksosomer observert med et mikroskop (Figur 2A) og fluorescensintensiteten i alle prøveområder ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ-programvare (Figur 2B). Før berikelsesprosessen (Figur 2A, 0 min), ble mikroveskler og eksosomer dispergert i alle prøveområder med en gradvis reduksjon i intensiteten på grunn av den lille filtreringsvirkningen til papirmatrisen (Figur 2B, 0 min). Etter 10 min behandling (Figur 2A, 10 min), migrerte mikrovesikler og eksosomer elektrokinetisk og en umiddelbar preconcentration plugg på lag 7. Videre behandling oppnådde større preconcentration av mikrovesicles og eksosomer. Når prosessen nådde 20 min, var mikroveskler og eksosomer sterkt fokusert på lag 8 og 9 (Figur 2A,20 min) og beriket femdoblet, basert på fluorescensintensiteten (figur 2B, 20 min).

Etter å ha fullført preconcentration prosessen, beriket mikrovesicles og eksosomer ble isolert ved å utfolde enheten og prøveområdet i lag 8 ble slått ut for videre analyse. SEM-bilder ble innhentet for å undersøke integriteten til de berikede mikrovesiklene og eksosomene. Som vist i SEM-bildene (Figur 3A),ble signifikant flere ikke-jordede mikroveskler og eksosomer observert etter berikelsesprosessen. Ved hjelp av de oppnådde SEM-bildene ble størrelsesfordelingen av de berikede mikrovesiklene og eksosomene analysert (Figur 3B), hvor eksosomene og mikrovesiklene ble preget basert på en terskeldiameter på 200 nm. Med andre ord, størrelsen på eksosomer varierte fra 95-195 nm med en gjennomsnittlig diameter på 134 nm og mikrovesiklene fra 214-377 nm med en gjennomsnittlig diameter på 315 nm.

Deretter ble den faktiske konsentrasjonen av berikede mikroveskler og eksosomer på prøveområdene i lag 6, 8 og 10 analysert av NTA. Før berikelse var konsentrasjonen ~2,24 x 1011 partikler/ml i lag 8 (Figur 3C, lag 8). Etter berikelse var konsentrasjonen ~1,25 x 1012 partikler/ml i lag 8 (Figur 3C, lag 8), noe som indikerer at mikrovesikler og eksosomer ble forhåndskonsentrert med en faktor på ~ 5,58. Merkbar preconcentration ble ikke observert på de andre lagene (Figur 3C, lag 6 og 10). Samlet viser disse resultatene at den foreslåtte papirbaserte enheten kan berike mikroveskler og eksosomer med omtrent femdoblet.

Isolasjonseffektiviteten til enheten ble evaluert som følger: Prøvevolumet som kan innkvarteres med lag 8 og 9 er ~ 2,2 μL av totalt 15 μL prøvevolum i 10 lag på grunn av innsnevring av Exo-PAD. Hvis vi antar et ideelt tilfelle der alle mikrovesikler og eksosomer er forhåndskonsentrert på lag 8 og 9 og ingen går tapt, bør den ideelle preconcentration faktor være ~ 6,8 (15 μL / 2,2 μL = ~ 6,8). Den eksperimentelle preconcentration-faktoren oppnådd av NTA (Figur 3c) var imidlertid ~ 5,58, noe som betyr at en del av 1,22 mikroveskler og eksosomer gikk tapt av lysis eller uspesifikk binding til papirmatrisen.
Equation 1
der 2,24 x 1012 partikler/ml er den første konsentrasjonen av mikroveskler og eksosomer. Fra denne beregningen er den forventede tapshastigheten til Exo-PAD ca. 18%; dermed er isolasjonseffektiviteten ca 82%. Dette er en betydelig forbedring sammenlignet med de dårlige utbyttene av ultracentrifugation (5%-23%).

Figure 1
Figur 1: Generelle Exo-PAD prosedyrer, fra montering til drift. (A)Programvaredesign for å veilede utskrift av hydrofob voks på cellulosepapir. (B) Det vokstrykte papiret etter inkubasjon i en ovn i 80 s ved 120 °C. (C) De enkelte enhetene kuttes ut med en kutter. (D) Permselective membranoppløsning slippes på prøveområdene i venstre og høyre lag og løsningsmidlet fordampes på en kokeplate ved 70 °C i 30 min. ( E ) DentrykteExo-PAD brettes frem og tilbake langs de hvite linjene; alle prøveområder er dermed konvergerende forbundet. (F) En mikroveskel og eksosom prøve er lastet i prøveområdet. (G) To akrylkamre er plassert i endene av enheten og sikret med små bindemiddelklemmer. (H) Akrylkamrene er fylt med bufferløsning og to Ag/AgCl-elektroder settes inn for å påføre en spenning på 30 V. (I) Apparatet er utfoldet for å isolere de forhåndskonsentrerte mikrovesiklene og eksosomene. Utvalgsområdenei lag 8 og 9 er slått ut for analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Observasjon av fluorescerende merkede mikroveskler og eksosomer under enhetsdrift og tilsvarende fluorescensintensiteter. (A)Tidsforløp observasjon av mikroveskler og eksosomer. Skala bar = 5 mm. Med 20 min behandling var mikrovesiklene og eksosomene sterkt fokusert på lag 8 og 9, hvor (B) de ble beriket med omtrent femdoblet. Feilfelt representerer standardavvik (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Analyse av berikede mikroveskler og eksosomer. (A)SEM-bilder som viser integriteten til de berikede mikrovesiklene og eksosomene. Etter preconcentration ble mange flere mikrovesicles og eksosomer observert6. Skala bar = 1 μm. (B) Størrelsesfordeling av berikede mikroveskler og eksosomer. Eksosomstørrelsene var 95–195 nm (gjennomsnittlig diameter = 134 nm) og mikroveskelstørrelser var 214–377 nm (gjennomsnittlig diameter = 315 nm). (C) Den faktiske konsentrasjonen av berikede mikroveskler og eksosomer som evalueres ved hjelp av NTA. Etter berikelse økte konsentrasjonen av mikroveskler og eksosomer femdoblet, noe som er i samsvar med fluorescensresultater6. Feilfelt representerer standardavvik (n = 3). Panel A A og C reproduseres med tillatelse fra Kim et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: Mikrovesikler og eksosomer forhåndskonsentrert og fokusert på lag 8 ble skilt fra storfe serum albumin (BSA), som bodde i lag 1-3. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Selv om Exo-PAD ble brukt med hell for berikelse og isolering av mikroveskler og eksosomer, bør flere kritiske punkter vurderes nøye: 1) ovnsinkubasjonstiden og temperaturen under fremstillingen av enheten, 2) behandlingstid, 3) påføring av spenning med varierende lagtall og prøveområdediametere, og 4) anvendelighet til kliniske prøver.

Inkubasjonstiden og temperaturen som er gitt i protokollen er optimaliserte forhold for å fremstille en pålitelig enhet. Lengre inkubasjonstider eller høyere temperatur kan føre til forvrengning av konvergent design på grunn av overdreven reflow av den trykte voks. Dette vil forhindre dannelsen av fokuserte elektriske feltlinjer og dermed øke migrasjonsmotstanden under den elektrokinetiske berikelsesprosessen.

Behandlingstid er også en faktor å vurdere for maksimal berikelse og isolasjon. En behandlingstid på <20 min resulterer i mindre preconcentration fordi det ikke er tilstrekkelig tid til å tillate mikrovesicle og eksosom migrasjon. På den annen side forverrer en behandlingstid på > 20 min fokuseffektiviteten og tillater spredning av de berikede mikrovesiklene og eksosomene. Ifølge denne testen er 20 min den beste behandlingstiden for å oppnå maksimal berikelse og isolering av mikroveskler og eksosomer.

Den påførte spenningen er en annen viktig faktor å vurdere. I denne protokollen, med tanke på antall lag og prøveområdet diametre, brukes 30 V til å oppnå stabil preconcentration og isolasjon. Når et ICP-fenomen genereres i enheten, kan operasjonsregimet deles inn i tre forskjellige regioner i henhold til den påførte spenningen: (1) ohmisk, (2) begrense, og (3) overlimiting regioner6,15,16. For stabil preconcentration og isolasjon, bør enheten betjenes i det begrensende området, hvor en ioneuttømmingssone genereres og mikroveskler og eksosomer er stabilt forhåndskonsentrert. I denne eksperimentelle innstillingen tilsvarer driftsspenningsområdet (5–40 V) det begrensende området for Exo-PAD. Hvis den påførte spenningen er <5 V, opererer enheten i ohmisk region, der den elektriske strømmen øker lineært, noe som indikerer at det genereres ingen uttømmingsområde for forhåndsbehandling. Men hvis spenningen er > 40 V, blir isjonsuttømmingsområdet ødelagt av sterk spenningsdrevet elektrokonveksjon, som destabiliserer forkonsentrasjonen. Tatt i betraktning disse faktorene, ble det fastslått at 30 V var den optimale spenningen å bruke for en enhet med 12 lag og et prøveområde diameter på 2-5 mm. Lagtall eller prøveområdediametre kan økes for å forstørre prøvevolumet, men disse faktorene, samt driftsspenningen, bør optimaliseres for å oppnå stabil berikelse av mikrovesicles og exosomes.

Den foreslåtte Exo-PAD kan brukes til å isolere mikrovesikler og eksosomer fra ulike kliniske prøver, inkludert spytt, urin, serum og plasma. For prøver med mindre protein, som spytt eller urin, kan mikroveskler og eksosomer lett isoleres uten store endringer, fordi en liten mengde protein i disse prøvene vil bli filtrert ut gjennom uspesifikk binding til papiret. Når du bruker enheten innenfor det begrensende området, må bare den anvendte spenningen vurderes, fordi den ioniske styrken til prøvene kan være forskjellig. For proteinrike prøver, som serum eller plasma, bør både prekonsentrasjonen av mikroveskler og eksosomer og deres separasjon fra rikelig proteiner vurderes nøye. Vårt siste eksperiment viser at separasjon av mikroveskler og eksosomer fra proteiner er betydelig forbedret når karbonatbufferen brukes, fordi karbonatbufferen resulterer i en høyere elektrisk ladeforskjell mellom mikroveskler og eksosomer og protein på grunn av isoelektrisk punkt, noe som resulterer i bedre separasjonseffektivitet. For dette eksperimentet ble et stoff med rikelig proteiner som sameksisterer med mikrovesikler og eksosomer etterlignet ved å blande rensede mikroveskler og eksosomer merket med FITC (Ex/Em: 490/520 nm) med BSA merket med en annen ophfluorore (Ex/Em: 590/617 nm) i 50 mM karbonatbuffer (Tabell over materialer). Som vist i tilleggstall 1ble de fleste mikroveskler og eksosomer forhåndskonsentrert på lag 8, som i figur 2A og de ble skilt fra BSA, som bodde i lag 1-3. Dette resultatet tyder på at berikelse fra en serum- eller plasmaprøve krever en ekstra trinn som legger til karbonatbuffer til prøven, og viser tydelig at Exo-PAD kan rense mikroveskler og eksosomer fra rikelige proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee ble støttet av et forskningsstipend fra Kwangwoon University i 2019. Hyerin Kim ble støttet av "Competency Development Program for Industry Specialists" av det koreanske handels-, industri- og energidepartementet (MOTIE), drevet av Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-program for industriell konvergens av bærbare smarte enheter).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14, (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17, (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21, (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34, (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19, (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11, (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39, (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18, (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91, (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16, (5), 925-931 (2016).
Papirbasert preconcentration og isolering av mikrovesicles og exosomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter