Summary
Apresentado é um protocolo para fabricar um dispositivo baseado em papel para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis.
Abstract
Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas membranous liberadas para o ambiente extracelular e circuladas por todo o corpo. Por conterem várias biomoléculas derivadas de células parentais, como DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, seu enriquecimento e isolamento são passos críticos para sua exploração como potenciais biomarcadores para aplicações clínicas. No entanto, métodos convencionais de isolamento (por exemplo, ultracentrifugação) causam perdas e danos significativos a microvesculas e exosóis. Esses métodos também requerem múltiplas etapas repetitivas de ultracentrifugação, carregamento e desolação de reagentes. Este artigo descreve um método detalhado para fabricar um dispositivo baseado em papel origami (Exo-PAD) projetado para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis de forma simples. O design único do Exo-PAD, composto por camadas multi-dobradas semelhantes a acordeões com áreas de amostra convergentes, é integrado à técnica de polarização da concentração de íons, permitindo assim o enriquecimento de cinco vezes dos microvesículos e exosóis em camadas específicas. Além disso, os microvesículos enriquecidos e exosóis são isolados simplesmente desdobrando o Exo-PAD.
Introduction
Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas de membrana medindo 0,2−1 μm e 30-200 nm, respectivamente. Eles são secretados no ambiente extracelular por vários tipos diferentes de células1,,2,,3,,4,5. Eles contêm informações de células parentais na forma de subconjuntos de DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, e circulam por todo o corpo através de vários fluidos corporais, como soro, plasma, urina, fluido cefalorraquidiano, fluido amniótico e saliva6,,7,,8,,9. Assim, técnicas de isolamento eficiente de microvesículos e exosóis de fluidos biológicos podem proporcionar amplas oportunidades nas áreas do diagnóstico, prognóstico e monitoramento em tempo real da doença, bem como no desenvolvimento de novas terapêuticas.
No entanto, o método de isolamento convencional para microvesículos e exosóis baseados na ultracentrifugação é extremamente demorado e causa perda e contaminação significativas da amostra. Isso porque envolve várias etapas de tubulação e carregamento e descarte de vários reagentes com ultracentrifugação repetida5,6,,10,,11,12. Além disso, o alto estresse de corte induzido pela ultracentrifugação (~100.000 x g) pode causar a lise física de microvesículos e exosóis, gerando baixas taxas de recuperação (5-23%)6,13,14. Portanto, uma técnica de isolamento altamente eficiente e discreta para microvesculas e exosóis deve ser desenvolvida para reduzir danos e perdas, alcançando assim taxas de recuperação mais elevadas.
Um dispositivo à base de papel origami (Exo-PAD) foi desenvolvido para um isolamento mais simples, suave e altamente eficiente de microvesículos e exosóis6. O design do Exo-PAD é um papel multi-dobrado com áreas de amostra conectadas em série que gradualmente diminuem de diâmetro. A técnica de polarização da concentração de íons (ICP), que é um fenômeno nano-eletrocinético que pré-concentra biomoléculas carregadas, foi integrada a este design único. O uso do Exo-PAD resultou em enriquecimento cinco vezes maior dos microvesículos e exosóis em camadas específicas e seu isolamento simplesmente desdobrando o dispositivo. Este artigo descreve o Exo-PAD em detalhes, desde a fabricação e operação geral do dispositivo até a análise de seu uso, para ilustrar o método e mostrar resultados representativos6.
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Protocol
1. Fabricação de dispositivos
- Defina a região a ser impressa em papel usando software de impressora(Tabela de Materiais).
NOTA: O desenho possui 12 camadas padrão de cera nas quais os diâmetros das áreas de amostra circular gradualmente diminuem de 5 mm a 2 mm(Figura 1A). - Imprima cera hidrofóbica nas regiões designadas em ambos os lados do papel de celulose(Tabela de Materiais)utilizando uma impressora de cera comercial(Tabela de Materiais)(Figura 1B).
- Coloque o papel impresso em cera em um forno de laboratório para 80 s a 120 °C.
NOTA: Esta etapa permite que a cera atinja o interior do papel, obtendo um refluxo térmico da cera impressa. Com este protocolo de incubação, a resolução do padrão é ~2 mm. Assim, tenha cuidado para não imprimir padrões inferiores a 2 mm. Caso contrário, os padrões serão bloqueados pela cera. - Corte o papel impresso em cera com um cortador para fazer dispositivos individuais(Figura 1C).
- Queda de 5 μL e 2 μL de membrana permeselétrica (por exemplo, Nafion; Tabela de Materiais) sobre as áreas amostrais nas camadas mais à esquerda e à direita, respectivamente (Figura 1D).
- Coloque as camadas revestidas com a membrana permseleção em uma placa quente a 70 °C por 30 minutos para evaporar o solvente de membrana permseletiva.
- Sele a superfície mais externa da camada revestida voltada para a solução tampão com fita sensível à pressão, deixando um pequeno orifício.
- Dobre o dispositivo individual impresso (ou seja, Exo-PAD) para frente e para trás ao longo das linhas brancas.
NOTA: Ao dobrar o dispositivo, todas as áreas de amostra tornam-se convergentemente conectadas(Figura 1E). Este projeto convergente concentra as linhas de campo elétrico quando a tensão é aplicada para ICP, alcançando uma pré-concentração mais intensiva dos microvesculos e exosóis.
2. Enriquecimento e foco espacial de microvesículos e exosóis pela polarização da concentração de íons
- Carregar 15 μL da amostra de microvesculas e exosóculos (~3 x 1011 partículas/mL em 0,1x salina tamponada de fosfato [PBS] com 0,05% Tween 20) nas áreas convergentes da amostra por pipetação e esperar alguns segundos para garantir a motação completa de todas as áreas amostrais(Figura 1F).
- Coloque duas câmaras de acrílico em ambas as extremidades do Exo-PAD e aperte o Exo-PAD com segurança com pequenos clipes de aglutinante para evitar desdobramentos(Figura 1G).
- Encha as câmaras com 110 μL de PBS 0,1x e insira dois eletrodos Ag/AgCl(Figura 1H).
- Aplique 30 V nos eletrodos por 20 min utilizando um sistema de medição de fonte de tensão corrente(Tabela de Materiais).
NOTA: A tensão aplicada gera o fenômeno ICP e, portanto, pré-concentra os microvesculos e exosóis nas camadas 8 e 9 do Exo-PAD.
3. Isolamento dos microvesículos enriquecidos e exosóis
- Separe o Exo-PAD dobrado das câmaras acrílicas e desdobre o dispositivo para isolar os microvesculas enriquecidas e exosóis das outras camadas(Figura 1I).
- Esmurra as áreas amostrais nas camadas 8 e 9, onde os microvesículos e exosóis são enriquecidos, para análise a jusante(Figura 1J).
4. Análise de microscopia eletrônica de varredura
- Fixar os microvesículos enriquecidos e exosóculos imergindo as áreas perfuradas em 2,5% glutaraldeído em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio por 1h e em 1% de tetroxida de ósmio em 0,1 M de cacodilato de sódio por 1 h.
ATENÇÃO: O tetroxida de ósmio é químico altamente venenoso e perigoso. Como o tetroxida de ósmio pode penetrar plásticos, ele deve ser armazenado em vidro. Qualquer manuseio de tetroxida de ósmio deve ser realizado em um capô de fumaça química com luvas de nitrito duplo. - Desidratar os microvesculos fixos e exosóis com notas ascendentes de 200 etanol de prova (ou seja, 50%, 70%, 90% e 100%) por 30 min cada.
- Seque quimicamente a amostra imergindo-a em hexametiletiladisilazane em um desiccador por 30 minutos.
ATENÇÃO: Hexametiletiladisilazane é um produto químico inflamável e sensível à umidade. Deve ser armazenado em uma área seca e bem ventilada longe das fontes de ignição. - Cubra os microvesículos completamente secos e exosóis com ouro/paládio (~20 nm) através de imagens de microscopia eletrônica de varredura (SEM).
5. Análise de rastreamento de nanopartículas
- Esmurre as áreas amostrais nas camadas 6, 8 e 10 usando um soco de biópsia após 20 minutos de operação do dispositivo.
- Mergulhe cada área perfurada em solução tampão (0,1x PBS com 0,01% Tween 20).
- Vórtice por 10 min e centrífuga por 30 s a 6.000 rpm para resuspensar os microvesículos enriquecidos e exosóis.
- Remova as áreas perfuradas da solução e meça a concentração de microvesculas e exosóis por um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)(Tabela de Materiais).
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Representative Results
O tempo de operação deve ser otimizado para alcançar o rendimento máximo de recuperação dos microvesículos enriquecidos e exosóis. O tempo insuficiente não permite migração suficiente dos microvesículos e exosóis, o que diminui o enriquecimento, enquanto o tempo excessivo deteriora o foco espacial e, portanto, dispersa os microvesículos e exosóis. Assim, através da etapa de otimização do tempo, pode ser identificado o fator máximo de pré-concentração de microvesículos e exosóis e o local final onde microvesículos e exosóis são mais enriquecidos. Para encontrar a localização final dos microvesculos e exosóis, a migração de lapso de tempo de microvesculas e exosomos rotulados fluorescente foi observada com um microscópio (Figura 2A) e as intensidades de fluorescência em todas as áreas amostrais foram quantificadas por meio do software ImageJ(Figura 2B). Antes do processo de enriquecimento (Figura 2A, 0 min), microvesículos e exossomos foram dispersados em todas as áreas amostrais com uma diminuição gradual da intensidade devido à ligeira ação de filtragem da matriz de papel(Figura 2B, 0 min). Após 10 minutos de processamento (Figura 2A, 10 min), microvesículos e exosóis migraram eletrokinetticamente e um plugue de pré-concentração instantâneo apareceu na camada 7. O processamento adicional alcançou maior pré-concentração de microvesículos e exosóis. Quando o tempo de processo chegou a 20 min, microvesículos e exosóis foram fortemente focados nas camadas 8 e 9 (Figura 2A, 20 min) e enriqueceram cinco vezes, com base nas intensidades de fluorescência(Figura 2B, 20 min).
Após a conclusão do processo de pré-concentração, os microvesculas enriquecidos e os exossomos foram isolados pelo desdobramento do dispositivo e a área da amostra na camada 8 foi perfurada para análise posterior. Foram obtidas imagens sem para investigar a integridade dos microvesculos enriquecidos e exosóis. Como mostrado nas imagens SEM (Figura 3A),foram observados microvesículos e exosóis significativamente mais não danificados após o processo de enriquecimento. Utilizando-se as imagens SEM obtidas, analisou-se a distribuição de tamanho dos microvesculas e exosóis enriquecidos(Figura 3B),onde os exosóis e microvesculas foram distinguidos com base em um diâmetro limiar de 200 nm. Em outras palavras, o tamanho dos exossomos variou de 95 a 195 nm com diâmetro médio de 134 nm e o dos microvesculas de 214-377 nm com diâmetro médio de 315 nm.
Posteriormente, a concentração real dos microvesículos enriquecidos e exosóis nas áreas amostrais nas camadas 6, 8 e 10 foi analisada pela NTA. Antes do enriquecimento, a concentração era ~2,24 x 1011 partículas/mL na camada 8(Figura 3C, camada 8). Após o enriquecimento, a concentração foi ~1,25 x 1012 partículas/mL na camada 8(Figura 3C, camada 8), indicando que os microvesculas e exosóis foram pré-cocentrados por um fator de ~5,58. A pré-concentração perceptível não foi observada nas outras camadas(Figura 3C, camadas 6 e 10). Juntos, esses resultados demonstram que o dispositivo proposto à base de papel pode enriquecer microvesculas e exosóis em aproximadamente cinco vezes.
A eficiência de isolamento do dispositivo foi avaliada da seguinte forma: O volume amostral que pode ser acomodado pela camada 8 e 9 é ~2,2 μL de um total de 15 μL de volume amostral em 10 camadas devido ao projeto de estreitamento do Exo-PAD. Se assumirmos um caso ideal em que todos os microvesículos e exosóis são pré-concentrados nas camadas 8 e 9 e nenhum é perdido, então o fator de pré-concentração ideal deve ser ~6,8 (15 μL/2,2 μL = ~6,8). No entanto, o fator de pré-concentração experimental obtido pela NTA (Figura 3c) foi ~5,58, o que significa que uma porção de 1,22 microvesculas e exosóis foram perdidos por lise ou vinculação inespecífica à matriz de papel.
onde 2,24 x 1012 partículas/mL é a concentração inicial de microvesculas e exosóis. A partir deste cálculo, a taxa de perda esperada do Exo-PAD é de cerca de 18%; portanto, a eficiência de isolamento é de cerca de 82%. Trata-se de uma melhora significativa em relação aos fracos rendimentos da ultracentrifugação (5%-23%).
Figura 1: Procedimentos globais exo-PAD, desde a montagem até a operação. (A) Projeto de software para orientar a impressão de cera hidrofóbica em papel de celulose. (B) O papel impresso em cera após a incubação em forno por 80 s a 120 °C. (C) Os dispositivos individuais são cortados usando um cortador. (D) Solução de membrana permselétrica é lançada nas áreas de amostra nas camadas mais à esquerda e à direita e o solvente é evaporado em uma placa de aquecimento a 70 °C por 30 min. (E) O Exo-PAD impresso é dobrado para frente e para trás ao longo das linhas brancas; todas as áreas amostrais estão, portanto, convergentemente conectadas. (F) Uma amostra de microvesculas e exosóculos é carregada na área da amostra. (G) Duas câmaras de acrílico são colocadas nas extremidades do dispositivo e fixadas com pequenos clipes de aglutinante. (H) As câmaras de acrílico são preenchidas com solução tampão e dois eletrodos Ag/AgCl são inseridos para aplicar uma tensão de 30 V. (I) O dispositivo é desdobrado para isolar os microvesculas e exosóculos pré-cocentrados. (J) As áreas amostrais nas camadas 8 e 9 são perfuradas para análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Observação de microvesculas e exosóis fluorescentes durante a operação do dispositivo e intensidades correspondentes de fluorescência. (A) Observação de lapso de tempo de microvesículos e exosóis. Barra de escala = 5 mm. Com 20 minutos de processamento, as microvesculas e exosóis foram fortemente focados nas camadas 8 e 9, onde (B) foram enriquecidos por aproximadamente cinco vezes. As barras de erro representam desvio padrão (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise dos microvesículos enriquecidos e exosóis. (A) Imagens SEM mostrando a integridade dos microvesculos enriquecidos e exosóis. Após a pré-concentração, muitos mais microvesículos e exosóis foram observados6. Barra de escala = 1 μm. (B) Distribuição de tamanho dos microvesículos enriquecidos e exosóis. Os tamanhos exossomos foram de 95-195 nm (diâmetro médio = 134 nm) e os tamanhos de microvesculas foram de 214-377 nm (diâmetro médio = 315 nm). (C) A concentração real dos microvesículos enriquecidos e exosóis avaliados utilizando-se NTA. Após o enriquecimento, a concentração de microvesículos e exosóis aumentou cinco vezes, o que é consistente com os resultados da fluorescência6. As barras de erro representam desvio padrão (n = 3). Os painéis A e C são reproduzidos por permissão de Kim et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Microvesículos e exosóis pré-concentrados e focados na camada 8 foram separados da albumina de soro bovino (BSA), que ficou nas camadas 1-3. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Embora o Exo-PAD tenha sido utilizado com sucesso para o enriquecimento e isolamento de microvesculas e exosóis, vários pontos críticos devem ser cuidadosamente considerados: 1) o tempo de incubação do forno e a temperatura durante a preparação do dispositivo, 2) tempo de processamento, 3) aplicação de tensão com números de camadas variados e diâmetros da área da amostra, e 4) aplicabilidade às amostras clínicas.
O tempo de incubação e a temperatura dado no protocolo são condições otimizadas para fabricar um dispositivo confiável. Tempos de incubação mais longos ou uma temperatura mais alta podem causar distorção do desenho convergente devido ao fluxo excessivo da cera impressa. Isso impedirá a formação de linhas de campo elétricos focalizando e, assim, aumentará a resistência migratória durante o processo de enriquecimento eletrocinético.
O tempo de processamento também é um fator a considerar para o máximo enriquecimento e isolamento. Um tempo de processamento de <20 min resulta em menos pré-concentração porque não há tempo suficiente para permitir a migração de microvesculos e exósmos. Por outro lado, um tempo de processamento de >20 min deteriora a eficiência de foco e permite a dispersão dos microvesículos enriquecidos e exosóis. De acordo com este teste, 20 min é o melhor tempo de processamento para alcançar o máximo de enriquecimento e isolamento de microvesículos e exosóis.
A tensão aplicada é outro fator importante a considerar. Neste protocolo, considerando o número de camadas e os diâmetros da área da amostra, 30 V é usado para alcançar a pré-concentração e o isolamento estáveis. Quando um fenômeno ICP é gerado no dispositivo, o regime de operação pode ser dividido em três regiões distintas de acordo com a tensão aplicada: (1) ohmic, (2) limitante e (3) regiões de superlimitação6,,15,,16. Para pré-concentração e isolamento estáveis, o dispositivo deve ser operado na região limitante, onde uma zona de esgotamento de íons é gerada e microvesculas e exosóis são pré-cocentrados. Nesta configuração experimental, a faixa de tensão de operação (5-40 V) corresponde à região limitante para o Exo-PAD. Se a tensão aplicada for <5 V, o dispositivo opera na região ómia, onde a corrente elétrica aumenta linearmente, indicando que nenhuma região de esgotamento de íons é gerada para pré-concentração. No entanto, se a tensão é >40 V, a região de esgotamento do íon é destruída por uma forte eletroconvecção movida por tensão, que desestabiliza a pré-concentração. Considerando esses fatores, foi determinado que 30 V era a tensão ideal para usar para um dispositivo com 12 camadas e diâmetro de área amostral de 2-5 mm. Números de camadas ou diâmetros da área da amostra podem ser aumentados para ampliar o volume amostral, mas esses fatores, bem como a tensão operacional, devem ser otimizados para alcançar o enriquecimento estável de microvesculos e exosóis.
O Exo-PAD proposto pode ser usado para isolar microvesculas e exosóis de várias amostras clínicas, incluindo saliva, urina, soro e plasma. Para amostras com menos proteína, como saliva ou urina, microvesculas e exosóis podem ser facilmente isolados sem grandes alterações, pois uma pequena quantidade de proteína nessas amostras será filtrada através de ligação inespecífica ao papel. Ao operar o dispositivo dentro da região limitante, apenas a tensão aplicada precisa ser considerada, pois a resistência iônica das amostras pode ser diferente. Para amostras ricas em proteínas, como soro ou plasma, tanto a pré-concentração de microvesículas e exosóis quanto sua separação de proteínas abundantes devem ser cuidadosamente consideradas. Nosso experimento recente mostra que a separação de microvesículos e exosóis de proteínas é significativamente melhorada quando o tampão de carbonato é usado, porque o tampão de carbonato resulta em uma maior diferença de carga elétrica entre microvesículos e exosóis e proteínas devido ao ponto isoelétrico, resultando em uma melhor eficiência de separação. Para este experimento, uma substância com proteínas abundantes que coexistiram com microvesículos e exosóis foi imitada pela mistura de microvesculos purificados e exosóculos rotulados com FITC (Ex/Em: 490/520 nm) com BSA rotulado com um fluorohore diferente (Ex/Em: 590/617 nm) em 50 mMate tampão de carbono(Tabela de Materiais). Como mostrado na Figura Suplementar 1, a maioria dos microvesículos e exosóis foram pré-cocentrados na camada 8, como na Figura 2A e foram separados da BSA, que ficou nas camadas 1-3. Este resultado sugere que o enriquecimento de uma amostra de soro ou plasma requer um passo adicional adicionando tampão de carbonato à amostra, e demonstra claramente que o Exo-PAD pode purificar microvesculas e exosóis de proteínas abundantes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Universidade Kwangwoon em 2019. Hyerin Kim foi apoiada pelo "Programa de Desenvolvimento de Competências para Especialistas da Indústria" do Ministério do Comércio, Indústria e Energia da Coreia (MOTIE), operado pelo Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para Convergência Industrial de Dispositivos Inteligentes Vestíveis).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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