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Cancer Research

मिटोकन साइटोटॉक्सीसिटी के सटीक निर्धारण के लिए एक स्वचालित अंतर परमाणु स्टेनिंग परख

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61295
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of BioSciences, Rice University
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए एक तेजी से, उच्च थ्रूपुट, विश्वसनीय, सस्ती, और निष्पक्ष परख का वर्णन करता है। यह परख विशेष रूप से उपयोगी है जब कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान पहुंचा है, जो अन्य परखों में हस्तक्षेप करता है। परख दो परमाणु रंगों के साथ दाग कोशिकाओं की स्वचालित गिनती का उपयोग करता है-Hoechst ३४२ और प्रोपिडियम आयोडाइड ।

Abstract

ओंकोजेनिक परिवर्तन के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का योगदान व्यापक रुचि और सक्रिय अध्ययन का विषय है। चूंकि कैंसर चयापचय का क्षेत्र अधिक जटिल हो जाता है, इसलिए माइटोकॉन्ड्रिया को विभिन्न यौगिकों का उपयोग करके लक्षित करने का लक्ष्य जो माइटोकॉन्ड्रियल क्षति (तथाकथित माइटोकॉन) को दण्ड देते हैं, काफी लोकप्रिय हो रहा है। दुर्भाग्य से, कई मौजूदा साइटोटॉक्सीसिटी परख, जैसे टेट्राज़ोलियम साल्ट या रेसाज़ुरिन पर आधारित लोगों को अपने प्रदर्शन के लिए कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइमों की आवश्यकता होती है। माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करने वाले यौगिकों द्वारा दिए गए नुकसान अक्सर इन परख की सटीकता से समझौता करते हैं। यहां, हम दो फ्लोरोसेंट रंगों के साथ अंतर धुंधला के आधार पर एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिनमें से एक सेल-परमीट (Hoechst 33342) है और दूसरा है (प्रोपिडियम आयोडाइड)। धुंधला में अंतर रहने और मृत कोशिकाओं के साथ भेदभाव करने की अनुमति देता है । परख स्वचालित माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है, जो थ्रूपुट को बढ़ाता है और पूर्वाग्रह को कम करता है। यह 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट फैशन में उपयोग करने की अनुमति देता है, जिससे यह दवा खोज प्रयासों के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बन जाता है, खासकर जब प्रश्न में दवाओं में कुछ स्तर की माइटोटेक्सिकिटी होती है। महत्वपूर्ण बात, Hoechst द्वारा प्राप्त परिणाम/PI धुंधला परख में वृद्धि हुई निरंतरता दिखाने के लिए, दोनों trypan नीले बहिष्कार परिणामों के साथ और जैविक प्रतिकृति के बीच जब परख अंय तरीकों की तुलना में है ।

Introduction

प्रभावी कैंसर उपचार की पहचान करने के लिए पहला कदम एक मजबूत, निष्पक्ष साइटोटॉक्सिकिटी परख का चयन है जिसका उपयोग उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है। कम थ्रूपुट प्रयोगों के लिए एक आम विकल्प जीवित कोशिकाओं से ट्राइपैन ब्लू डाई का बहिष्कार है। यह विधि इष्ट है क्योंकि यह सेल अस्तित्व की मात्रा निर्धारित करने के लिए अपेक्षाकृत निष्पक्ष विधि की अनुमति देता है। ट्राइपैन ब्लू निष्क्रिय रूप से कोशिकाओं में फैलता है जिनकी झिल्ली से समझौता किया जाता है, लेकिन यह प्रभावी रूप से स्वस्थ कोशिकाओं में प्रवेश करने से अवरुद्ध हो जाता है1. जीवित कोशिकाओं और कुल कोशिकाओं का भागफल प्रतिशत व्यवहार्यता का प्रतिनिधित्व करता है, जो उपचार की प्रभावकारिता को इंगित करता है। ट्राइपैन ब्लू परख का सबसे महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि यह उच्च-थ्रूपुट पद्धतियों के लिए खराब अनुकूल है। इसमें अपेक्षाकृत कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात है और लंबे समय तक धुंधला होने के परिणामस्वरूप व्यवहार्य कोशिकाओं के धुंधला होने के कारण कलाकृतियों में प्रवेश हो सकता है। नतीजतन, ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन आमतौर पर होता है, लेकिन हमेशा2नहीं, मैनुअल गिनती में चला जाता है। यह इसे बहुत धीमा बनाता है और शोधकर्ता के व्यक्तिपरक निर्णय के कारण पूर्वाग्रह की मजबूत संभावना का परिचय देता है (जब तक कि चकाचौंध या स्वतंत्र गिनती का उपयोग नहीं किया जाता है, जो प्रयोगशाला थ्रूपुट को और कम करता है)। सामान्य तौर पर, इस परख का थ्रूपुट आधुनिक दवा खोज के लिए अपर्याप्त है।

व्यवहार्यता परख, जिसमें आम तौर पर बहुत अधिक थ्रूपुट होता है, शोधकर्ताओं को इस सीमा को दरकिनार करने की अनुमति देता है, लेकिन महत्वपूर्ण चेतावनी के साथ आते हैं (तालिका 1देखें)। ये तरीके आम तौर पर दो समूहों में आते हैं। एक समूह में कोलोरिमेट्रिक परख शामिल है जो सेलुलर रेडॉक्स एंजाइमों के कार्य पर आधारित है। बेरंग या गैर-फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट्स जीवंत उत्पादों में परिवर्तित हो जाते हैं जिन्हें स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। क्लासिक उदाहरणों में टेट्राज़ोलियम साल्ट (एमटीटी, डब्ल्यूएसटी-1, एक्सटीटी, आदि) और रेसाज़ुरिन शामिल हैं। इस श्रेणी में ल्यूमिनेसेंट परख भी शामिल है जो एटीपी स्तर का मूल्यांकन करने के लिए लूसिफ़ेरिन का उपयोग करता है। इस प्रकार के परख में अंतर्निहित सीमा है कि वे सेलुलर चयापचय को माप रहे हैं, जो सेलुलर व्यवहार्यता प्रति से नहीं है। कोशिकाओं के लिए प्रतिकूल परिस्थितियों में शांत होना काफी आम है, लेकिन फिर भी3,4, 5को विभाजित करने की क्षमता को बनाएरखतेहैं। उदाहरण के लिए, कैंसर स्टेम सेल अक्सर अपेक्षाकृत चयापचय रूपसे शांत6,7,8,9होते हैं, और इन तकनीकों का उपयोग करके परख करना मुश्किल होने की संभावना होती है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को नुकसान पहुंचाने वाले उपचारों की प्रभावशीलता, जैसे कि अधिकांश माइटोकॉन्सन, भी काफी अधिक अनुमान लगाए जाने की संभावना है।

एक वैकल्पिक पद्धति विभिन्न पदार्थों के रासायनिक गुणों का लाभ उठाती है जो उन्हें या तो पार करने या जैविक झिल्ली को पार करने की अनुमति नहीं देती है। इसका एक उदाहरण परमाणु दाग जैसे SYTOX या प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) हैं। इस श्रेणी में परख भी शामिल है जो अवधारणा में समान हैं, लेकिन कार्य में अलग हैं, जैसे लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) परख, जो सेलुलर नेक्रोसिस(चित्र 1,तालिका 1)के संकेतक के रूप में एलडीएच की रिहाई को बाहेती परिवेश में मापता है। ये परख चयापचय रूप से निष्क्रिय और मृत कोशिकाओं के बीच भेद करने में अधिक सक्षम हैं।

परख/डाई सेल डेथ के प्रकार (एस) का पता चला आवश्यक उपकरण मुख्य विशेषताएं
MTT, CKK-8, अलामार ब्लू (resazurin) एपोप्टोसिस/नेक्रोसिस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सस्ती, तेजी से; अंत बिंदु परख; एंजाइमों की गतिविधि पर निर्भर (एमटीटी के मामले में विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल) और सेल मृत्यु के तरीकों के बीच भेदभाव नहीं करता है1,10
एलडीएच रिलीज नेक्रोसिस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तेजी से, माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइमों की गतिविधि से स्वतंत्र; उच्च थ्रूपुट परीक्षणों के लिए महंगा; कॉम्प्रोमाइज्ड प्लाज्मा झिल्ली के साथ गल-पर्कीय कोशिकाओं का पता लगाता है11,12
ट्राइपन ब्लू (टीबी) एपोप्टोसिस/नेक्रोसिस सूक्ष्‍मदर्शी सेल-अभेद्य; सेल मृत्यु के तरीकों के बीच भेदभाव नहीं करता है; श्रमसतक और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है; अनुयायी कोशिकाओं के साथ उपयोग करना अधिक कठिन; उपयोगकर्ता के व्यक्तिपरक निर्णय से ग्रस्त है, लेकिन मानक सेल व्यवहार्यता माप विधि13 माना जाता है
एक्रिडीन नारंगी (एओ) एपोप्टोसिस/नेक्रोसिस/ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप अद्वितीय स्पेक्ट्रल गुणों के साथ एक न्यूक्लिक एसिड डाई, एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस/नेक्रोप्टोसिस14 के बीच अंतर कर सकता है
नेक्रोप्टोसिस
होचस्ट 33342, डीएपीआई एपोप्टोसिस फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या फ्लो साइटोमीटर सेल-पारमीबल; सेल मौत की निगरानी करने के लिए अपने दम पर अनुचित; सह-धुंधला के लिए उपयोगी; जल्दी एपोप्टोसिस में क्रोमेटिन संघनन और नाभिक विखंडन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; एपोप्टोसिस को नेक्रोसिस15,16 से अलग करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ जोड़ा जा सकता है
प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) स्वर्गीय एपोप्टोसिस/नेक्रोसिस फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या फ्लो साइटोमीटर सेल-अभेद्य इंटरकैलेटर; सेल डेथ17के दोनों लेट एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस मोड का पता लगाता है . विषाक्त और पारम करने योग्य लंबे समय के बाद18 इनक्यूबेशन बार

तालिका 1. साइटोटॉक्सिकिटी परख की सूची। साइटोटॉक्सिकिटी परख, जिनमें से कुछ का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था, जो उनकी प्रमुख विशेषताओं के संक्षिप्त विवरण के साथ सूचीबद्ध थे।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबॉलिज्म19, 20,21 , 22,23,24,25में बदल जाता है । उदाहरण के लिए, तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमियास (एएमएल) को उनकी ऊर्जा मांगों को पूरा करने के लिए अपने माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान, एमटीडीएनए सामग्री और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को अपरेग करने के लिए दिखाया गया है19,26,27। दूसरी ओर, कुछ ठोस ट्यूमर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, या बल्कि "मेटाबोलिक रीप्रोग्रामिंग" की विशेषता है, जैसे ऑक्सफोस में शामिल माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का डाउनरेगुलेशन या एमटीडीएनए सामग्री में कमी आई है, जो ट्यूमर इनवेसिवनेस, मेटास्टैटिक क्षमता और एकपॉपेटोसिस-उत्प्रेरण दवाओं के प्रतिरोध से जुड़ा हुआ है28,29। इसके अलावा, हाल ही में, विशेष कैंसर के लिए संभावित उपचारों के रूप में, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन (जिसे आमतौर पर माइटोकॉन्स30कहा जाता है) को प्रभावित करने वाले मशीनी विविध यौगिकों का उपयोग करने में रुचि बढ़ी है। ये दवाएं एटीपी संश्लेषण, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए, ऑक्सफोस और आरओएस उत्पादन के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रिया30, 31से जुड़े प्रो-एपोटोटिक और एंटी-एपोटोटिक प्रोटीन को लक्षित करती हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि इस दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण वायदा है19,32,33,34. हालांकि, कैंसर सेल जीव विज्ञान या माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग उपचारों में ये मेटाबॉलिक विचलन पारंपरिक व्यवहार्यता परख को काफी प्रभावित कर सकते हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल कार्यक्षमता पर आधारित हैं।

यहां, एक अंतर परमाणु धुंधला परख के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल वर्णित है । प्रोटोकॉल मिटोकान या अन्य यौगिकों के साथ उनके संयोजनों के साइटोटॉक्सिटी के तेज और सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। Hoechst 33342 एक सेल-पारमी परमाणु डाई है जो आसानी से कोशिका झिल्ली को पार कर डीएनए दाग देता है, जिससे कुल सेल काउंट प्राप्त होता है। पीआई के साथ सह-धुंधला करके, जो केवल मृत कोशिकाओं के नाभिक में प्रवेश करता है, जीवित रहने का अनुपात (केवल Hoechst) और मृत (दोनों के साथ दाग) कोशिकाओं को सही ढंग से निर्धारित किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल डाई एकाग्रता के अनुकूलन के लिए एक कदम जोड़कर प्रकाशित परख35 को परिष्कृत करता है (ऑर्थोगोनल ट्राइपैन ब्लू विधि के साथ क्रॉस-रेफरेंसिंग परिणाम द्वारा) और इमेजिंग से पहले प्लेट का अपकेंद्री। चूंकि कई सेल लाइनें अर्ध-अनुयायी या निलंबित होती हैं, इसलिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाता है जो छवि वाले होते हैं और दृढ़ता से सटीकता में सुधार करते हैं। परख के कई फायदे हैं, जिनमें यह धुंधला भी शामिल है कि मीडिया या धोने को हटाने की आवश्यकता नहीं है। डाई मिश्रण भी सस्ती है, तैयार करने में आसान है, और मल्टीचैनल/रोबोट पिपटिंग सिस्टम के साथ संगत है ।

कोशिकाओं को दाग देने के बाद, उन्हें स्वचालित माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया जाता है। इसमें छवियों का एक स्थायी रिकॉर्ड बनाने का अतिरिक्त लाभ है जिसे बाद में फिर से विश्लेषण किया जा सकता है और विशेष यौगिकों के प्रभावों को कैप्चर की गई छवियों के दृश्य निरीक्षण द्वारा फिर से मूल्यांकन किया जा सकता है। एक बार छवियां प्राप्त हो जाने के बाद, कोशिकाओं को या तो मैन्युअल रूप से या कई सॉफ्टवेयर पैकेजों में से किसी का उपयोग करके गिना जा सकता है, जिसमें मुफ्त (जैसे, इमेजजे, सेलप्रोफिलर, आदि) और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (जैसे, कायापलट, जेन5, आदि) शामिल हैं। स्वचालित सेल गिनती आम तौर पर बेहतर है क्योंकि ठीक से विकसित स्वचालित सेल गिनती पाइपलाइन मैनुअल गिनती की तुलना में अधिक सटीक और कम पक्षपातपूर्ण हैं। वे सेल मलबे या अघुलनशील परिसरों की भी अधिक प्रभावी ढंग से उपेक्षा करते हैं। इन पाइपलाइनों का विकास आम तौर पर सीधा होता है और उपयोग किए जाने वाले दागों की दक्षता से सरल होता है। आउटपुट मात्रात्मक है क्योंकि मृत कोशिकाओं की वास्तविक संख्या की गणना कुल सेल संख्या के संबंध में स्वचालित रूप से की जाती है, और विभिन्न थ्रेसहोल्ड को पहचान35की स्ट्रिंगेंसी को बढ़ाने या कम करने के लिए लागू किया जा सकता है। सुविधा के लिए, Gen5 v. 3.00 सॉफ्टवेयर संगत साइटेशन 5 सेल इमेजिंग मल्टी-मोड रीडर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती के लिए अनुकूलित पैरामीटर शामिल हैं।

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Protocol

1. साइटोटॉक्सिकिटी परख: सेटअप

  1. उपयुक्त मीडिया (सीरम-मुक्त या 1, 2.5, या 5% एफबीएस आरपीएमआई-1640) में वांछित सांद्रता पर ब्याज के यौगिकों के समाधान तैयार करें।
    1. एकल यौगिक (उदाहरण के लिए, प्रभावी खुराक निर्धारित करने के लिए) की साइटोटॉक्सिक्सिटी को मापने के लिए, 2x अंतिम एकाग्रता पर यौगिक तैयार करें।
    2. यौगिक संयोजनों की साइटोटॉक्सिक्सिटी को मापने के लिए, 4x अंतिम एकाग्रता पर यौगिक तैयार करें।
    3. सॉल्वेंट की समान मात्रा को उपयुक्त माध्यम के साथ मिलाकर सॉल्वेंट-केवल कंट्रोल तैयार करें। उदाहरण के लिए, यदि डीएमएसओ और मेथनॉल में भंग किए गए परीक्षण यौगिक, प्रत्येक विलायक के लिए सॉल्वेंट-केवल नियंत्रण बनाएं।
  2. संस्कृति पकवान या फ्लास्क से कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में ले लीजिए।
  3. सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोल को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में ट्रांसफर करें और 10 माइक्रोन 0.4% ट्राइपैन ब्लू के साथ दाग दें। प्रत्येक कोशिका स्रोत के लिए व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।
  4. 5 मिनट के लिए 200 ग्राम पर पैलेट सेल। एस्पिरेट या डिकेंट सुपरनेट।
  5. 3 * 10 5 कोशिकाओं/एमएल के सेल घनत्व पर परख-उपयुक्त मीडिया (सीरम-मुक्त या 1, 2.5,5% एफबीएस आरपीएमआई-1640) में सेल पेलेट को रिस्स्पेंड करें।
    नोट 1: 3 * 105 कोशिकाओं/एमएल का सेल घनत्व 15,000 कोशिकाओं/ सीडिंग घनत्व एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है और प्रयोग से पहले आदर्श रूप से पूर्व-परिभाषित किया जाना चाहिए। सीडिंग घनत्व को ध्यान में रखना चाहिए 1) सेल आकार - आमतौर पर बड़ी कोशिकाओं को कम घनत्व पर वरीयता दी जाती है; 2) उपचार अवधि - कोशिकाओं को आमतौर पर प्रयोगों के लिए कम घनत्व पर वरीयता दी जाती है जो लंबे समय तक चलेगी; और 3) सेल डिवीजन दर - विभाजन की उच्च दर वाली कोशिकाओं को कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त किया जाता है। अनुकूलित सीडिंग घनत्व के विशिष्ट उदाहरण: K562 कोशिकाएं, बड़ी, 24 घंटे की अवधि - 10,000 कोशिकाएं/ MOLM-13 कोशिकाओं, मध्यम आकार, 24 घंटे उपचार-15,000/अच्छी तरह से; MOLM-13 कोशिकाओं, ४८ घंटे उपचार-8,000/अच्छी तरह से; छोटे स्वस्थ परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी), 24 एच उपचार - 50,000/ प्राथमिक एएमएल कोशिकाएं, 24 घंटे उपचार - 15,000-20,000 /
    नोट 2: मीडिया में एफबीएस की उपस्थिति यौगिकों की गतिविधि को प्रभावित कर सकती है। एफबीएस की एकाग्रता को कम करने से परख परिणामों की व्याख्या करना आसान हो सकता है, लेकिन यह शारीरिक सटीकता को भी कम कर देता है।
  6. बीज 50 सेल निलंबन के चरण 1.5 से एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर.
  7. यौगिकों को इस प्रकार जोड़ें:
    1. एकल यौगिक परख के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से 2x यौगिक समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें। सॉल्वेंट-कंट्रोल कुओं के लिए, 2x एकाग्रता पर सॉल्वेंट युक्त टेस्ट मीडिया के 50 माइक्रोन जोड़ें।
    2. संयोजन परख के लिए, प्रत्येक परिसर (4x समाधान) में से प्रत्येक के 25 माइक्रोन जोड़ें। एकल यौगिक नियंत्रण कुओं के लिए, 4x यौगिक समाधान के 25 माइक्रोन और परीक्षण माध्यम के 25 माइक्रोन जोड़ें। सॉल्वेंट कंट्रोल कुओं के लिए, टेस्ट मीडियम या टेस्ट मीडियम के 50 माइक्रोन डालें जिसमें सॉल्वेंट हो।
      नोट 1: DMSO की अंतिम एकाग्रता 0.5% से अधिक नहीं होनी चाहिए।
      नोट 2: कम मात्रा के कारण प्रत्येक की दीवार को छूने वाले पिपेट के साथ यौगिकों वाले मीडिया को जोड़ने की सिफारिश की जाती है।
  8. कुओं की सामग्री के मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे प्लेट पर टैप करें।
  9. एक उचित समय के लिए एक आर्द्र 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें, उदाहरण के लिए, 24 घंटे।

2. साइटोटॉक्सिकिटी परख: होचस्ट 33342 और प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ धुंधला

  1. 10x धुंधला समाधान तैयार करें। इस समाधान के लिए प्रत्येक प्रयोग से पहले नए सिरे से तैयार करने की जरूरत है, यह संग्रहीत नहीं किया जा सकता है । अंतिम डाई सांद्रता प्रयोग से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए।
    1. ल्यूकेमिया सेल लाइनों और प्राथमिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के लिए, 10x धुंधला बफर के 1 ml 20 mM Hoechst ३४२ के 10 μL और ५० μL के 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड में बाँझ PBS (अंतिम सांद्रता: Hoechst ३३३४२ 20 μM, PI 5 μg/ml) शामिल हैं ।
    2. स्वस्थ पीबीएमसी के लिए, 10x स्टेनिंग बफर के 1 मिलियन μL में 20 m Hoechst 33342 के 10 μL और बाँझ पीबीएस में 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड के 10 माइक्रोन होते हैं (अंतिम सांद्रता: Hoechst 33342 20 M, PI 1 μg/mL)।
      नोट: प्रयोगों से पहले प्रोपिडियम आयोडाइड की अंतिम एकाग्रता निर्धारित की जानी चाहिए। कोशिकाओं को PI सांद्रता (1, २.५, 5 μg/mL) की एक श्रृंखला का उपयोग करके परीक्षण किया जाना चाहिए, और फिर Hoechst/PI-गणना व्यवहार्यता की तुलना ट्राइपैन ब्लू के माध्यम से मापी गई व्यवहार्यता के साथ की जानी चाहिए । ऊपर सूचीबद्ध पीआई सांद्रता को मीडिया-नियंत्रण कुओं में लक्ष्य सेल व्यवहार्यता (ल्यूकेमिया सेल लाइनों के लिए ~ 90% से ऊपर, स्वस्थ पीबीएमएमसी के लिए ~ 70% से ऊपर) के आधार पर चुना गया था।
      सावधानी: Hoechst 33342 और प्रोपिडियम आयोडाइड संभावित कैंसरजनक हैं। उन्हें संभालते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  2. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से 10x धुंधला बफर के 10 माइक्रोन जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि पिपेट टिप्स मीडिया को नहीं छूते हैं।
  3. धीरे-धीरे बुलबुले को मिलाने और साफ करने के लिए प्लेट पर टैप करें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दाग।
  4. प्लेट के नीचे सभी कोशिकाओं को लाने के लिए 4 मिनट के लिए 200 ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें। ध्यान से एक नम kimwipe के साथ थाली के नीचे पोंछ फाइबर और/
    नोट 1: प्लेट का अपकेंद्रित्र छवि में कब्जा करने के लिए सभी कोशिकाओं के लिए उच्चतम संभावना सुनिश्चित करता है । अक्सर मृत कोशिकाएं अलग और तैरना करेंगी, जो साइटोटॉक्सिकिटी के भ्रामक मूल्य प्रदान करती हैं। अपकेंद्रित्र इस प्रभाव को कम करता है।
    नोट 2: प्लेट को 15 मिनट के भीतर, आदर्श रूप से, अपकेंद्रित्र के बाद जितनी जल्दी हो सके इमेज किया जाना चाहिए। अपकेंद्रित्रता पीआई धुंधला की चयनशीलता को कम कर सकते हैं और कोशिकाओं को धीरे-धीरे प्रोपिडियम आयोडाइड अर्जित करने की अनुमति दे सकते हैं। मृत कोशिकाओं की कल्पना करके प्राप्त सटीकता में सुधार पीआई धुंधला में मामूली वृद्धि से अधिक है। अपकेंद्रित्र के 1 घंटे के भीतर इमेजिंग खत्म करने की सिफारिश की जाती है।

3. साइटोटॉक्सिकिटी परख: डेटा अधिग्रहण

  1. दोनों Hoechst ३४२ (उत्तेजन अधिकतम ३५० एनएम, उत्सर्जन अधिकतम ४६१ एनएम) और पीआई (उत्तेजन अधिकतम ४९३ एनएम, उत्सर्जन अधिकतम ६३६ एनएम) के लिए फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए स्वचालित माइक्रोस्कोप/प्लेट इमेजर के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें । दोनों चैनलों में प्रत्येक अच्छी तरह से छवियों के लिए छवियों को प्राप्त करें।
  2. सॉफ्टवेयर का उपयोग करना (जैसे सेलप्रोफिलर, मैटलैब http://cellprofiler.org/, इमेजजे, या जेन5 जैसे मालिकाना सॉफ्टवेयर पर आधारित एक मुफ्त छवि विश्लेषण स्टूडियो) प्रत्येक चैनल में प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं की गिनती करें।
    नोट: चूंकि हर कोशिका Hoechst ३३३४२ के साथ दाग होना चाहिए, और मृत कोशिकाओं PI के साथ दाग होना चाहिए, सभी के लिए मृत का अनुपात कोशिकाओं के अंश का प्रतिनिधित्व करता है कि मर रहे हैं । उदाहरण के लिए, यदि अनुपचारित नमूने में स्वचालित गिनती पीआई (मृत कोशिकाओं) और 2335 कोशिकाओं के साथ दाग 467 कोशिकाओं को दिखाती है, तो होचस्ट 33342 (कुल कोशिकाओं) के साथ सना हुआ है, तो अंश मृत 0.2 या 20% है। यह मूल्य तब एक समान रूप से संभाले गए नमूने की तुलना में होता है जहां उपचार का उपयोग किया जाता था।
  3. Cytation5 सेल इमेजिंग मल्टी-मोड रीडर और Gen5 v. 3.00 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके Hoechst/PI डेटा अधिग्रहण का विस्तृत विवरण:
    1. फ्लैट बॉटम, 96-वेल, जेनेरिक ब्लैक प्लास्टिक प्लेट्स में इमेज सेल्स के लिए साइटेशन5 मल्टीमोड प्लेट रीडर/इमेजर सेट करें।
    2. मानक DAPI और टेक्सास रेड फिल्टर सेट का उपयोग करने के लिए एक इमेजिंग प्रोटोकॉल निर्धारित करें। 4x आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करके अच्छी तरह से केंद्र में छवियां लें। कोई ऑफसेट (X/Y या Z) का उपयोग करें । निम्नलिखित इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करें: DAPI - एलईडी - 10, एकीकरण समय - 99, लाभ - 0; टेक्सास रेड - एलईडी - 8, एकीकरण समय - 950, लाभ - 18। DAPI सिग्नल का उपयोग कर ऑटोफोकसिंग करें; चैनलों के बीच ध्यान केंद्रित करने में कोई ऑफसेट नहीं होना चाहिए ।
    3. Gen5 सॉफ्टवेयर v 3.00 का उपयोग कर छवि विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं। सॉफ्टवेयर सेटिंग्स में, कोशिकाओं को उनके आकार में 5 और 25 माइक्रोन के बीच आकार के रूप में परिभाषित करें। प्राथमिक किनारे की वस्तुओं को बाहर करें और विशेष विकल्प "स्प्लिट टचिंग ऑब्जेक्ट्स" को चालू करके स्पर्श करने वाली वस्तुओं को विभाजित करें।  इसके बाद, पृष्ठभूमि (डार्क बैकग्राउंड घटाव) को हटाने के लिए छवि को संसाधित करें, एक परमाणु मुखौटा (दहलीज मूल्य DAPI और gt;= 6000 AU) लागू करें, और वस्तुओं की गिनती करें। पीआई धुंधला (दहलीज मूल्य टेक्सास रेड और जीटी;= 5000 AU) के आधार पर एक उप-जनसंख्या विश्लेषण करें, और वस्तुओं की गणना करें। सेल व्यवहार्यता % को (1-) के रूप में परिभाषित किया गया Equation 1 है।

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Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल को ओसीआई-एएमएल2 कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित किया गया है, जिन्हें एक प्रतिनिधि तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया सेल लाइन के रूप में लिया गया था। एएमएल बोन मैरो26में अविभेदित और गैर-कार्यात्मक हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के असामान्य प्रसार की विशेषता है। एएमएल लक्षित चिकित्सा में हाल की घटनाओं के बावजूद, देखभाल का मानक कई दशकों तक अपरिवर्तित रहा है, और इसमें प्रेरण चिकित्सा (आमतौर पर एंथ्रेसीक्लिन के तीन दिनों के शामिल होते हैं, उदाहरण के लिए, डौनोरुबिसिन, इदरुबिसिन, या एंथ्रेसेन्डेवन माइटोक्सेंथ्रोन, और साइटाराबिन के 7 दिन) समेकन के बाद (आमतौर पर सिटराबिन उपचार के दौर शामिल होते हैं)36.

चित्रा 1Aमें उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद, ओसीआई-AML2 कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता दी गई थी और माइटोकॉन्ड्रियल अनकूपलर कार्बोइल सायनाइड एम-क्लोरोफेनिल हाइड्राजोन (सीसीसीपी) या ग्लाइकोलिटिक अवरोधक 2-डिओक्सी-डी-ग्लूकोज (2-डीजी) के साथ सांद्रता की एक श्रृंखला में इलाज किया गया था। कोशिकाओं को सीरम मुक्त RPMI-१६४० मीडिया में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इलाज किया गया, और फिर व्यवहार्यता ट्राइपैन ब्लू (टीबी) बहिष्कार या चार व्यवहार्यता परख में से एक (Hoechst/PI अंतर परमाणु धुंधला, LDH रिलीज परख, MTT, या alamarBlue) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । Hoechst/PI के साथ दाग कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों चित्र 2 एमें दिखाया गया है । कई महत्वपूर्ण टिप्पणियां तुरंत की जा सकती हैं। सबसे पहले, कोशिकाओं की कुल संख्या (Hoechst धुंधला) काफी अधिक है और स्पष्ट रूप से मृत कोशिकाओं (पीआई धुंधला) की संख्या से अधिक है । इससे पता चलता है कि मीडिया की स्थिति सेल मौत की उच्च दरों को ट्रिगर नहीं कर रहे हैं । दूसरा, चूंकि केवल कोशिकाओं को Hoechst और PI दोनों के साथ लेबल किया जा रहा है मृत (विलय छवि में बैंगनी कोशिकाओं) के रूप में गिना जाता है, मलबे की गिनती की संभावना बहुत कम है । यह छवि ठीक से दाग कोशिकाओं का एक अच्छा उदाहरण दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1. प्रायोगिक समय रेखा और मौजूदा साइटोटॉक्सिकिटी की तुलना। (A)फ्लोचार्ट प्रायोगिक प्रक्रिया के लिए समय रेखा का सारांश, जैसे Hoechst/PI धुंधला । (ख)साइटोटॉक्सिकिटी की तुलना में यह कहते हैं, जिनमें से कुछ का इस्तेमाल इस अध्ययन में किया गया था । डाई अपवर्जन परख में अभेद्य परमाणु रंग शामिल होते हैं जो मृत कोशिकाओं को समझौता प्लाज्मा झिल्ली के साथ दाग देते हैं: टीबी - ट्राइपान ब्लू, पीआई - प्रोपिडियम आयोडाइड, एटबीआर - एथिडियम ब्रोमाइड, और SYTOX। परख का दूसरा समूह सेलुलर मेटाबोलिज्म पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, टेट्राज़ोलियम साल्ट एमटीटी, एक्सटी, और सीके-8 (डब्ल्यूएसटी-8), रेसाज़ुरिन-आधारित रिएजेंट अलामारब्लू आदि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। साइटोटॉक्सिकिटी के एक पैनल की तुलना ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन के साथ होती है। (A)टोटल (होचस्ट 33342) और डेड (प्रोपिडियम आयोडाइड, पीआई) ओसीआई-एएमएल2 कोशिकाओं के माध्यम से होचस्ट/पीआई धुंधला की प्रतिनिधि छवियां । (ख)सीसीसीपी(ऊपर)या 2-डीजी(नीचे)सांद्रता के ढाल के साथ उपचार के बाद विभिन्न तरीकों का उपयोग करते हुए ओसीआई-एएमएल2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन । ओसीआई-एएमएल2 को सेल व्यवहार्यता के निर्धारण से पहले 24 घंटे के लिए सीरम-मुक्त आरपीएमआई-1640 में सीसीसीपी या 2-डीजी के साथ इलाज किया गया था। दिखाया गया है मतलब है, त्रुटि सलाखों के बीच सेल व्यवहार्यता में SEM. C. अंतर का प्रतिनिधित्व(बी)बनाम ट्राइपैन ब्लू धुंधला (सटीक संख्या और औसत अंतर के लिए अनुपूरक तालिकाओं S1-2 देखें) में परखें । सितारे महत्वपूर्ण अंतर बनामसंकेत मिलता है । ट्राइपैन ब्लू धुंधला। ** पी एंड एलटी; 0.01, *** पी एंड एलटी; 0.001, एनएस - गैर-महत्वपूर्ण। समूह तुलना कई परिकल्पना परीक्षण के लिए सुधार के साथ टीपरीक्षण के माध्यम से किया गया था । तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जैसा कि हमने हाल ही में19रिपोर्ट की है, ल्यूकेमिया माइटोटोकिक उपचार के प्रति बहुत संवेदनशील हैं, जो इंगित करता है कि कोशिकाओं को पहले से ही अंतर्निहित माइटोकॉन्ड्रियल क्षति है। इस आधार पर, हमने भविष्यवाणी की थी कि एमटीटी और अलामारब्लू परख, जो माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम गतिविधि पर आधारित हैं, सेलुलर व्यवहार्यता को गलत तरीके से मापेंगे। जैसा कि अपेक्षित था, इन परख (विशेष रूप से आलमरब्लू) ने ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन की तुलना में काफी कम व्यवहार्यता दिखाई, चित्रा 2बी, सी, अनुपूरक तालिकाएं S1-S2देखें)। यह इस तथ्य के अनुरूप है कि एपोप्टोसिस या नेक्रोसिस को प्रेरित करने के लिए आवश्यक इन यौगिकों की खुराक माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन से समझौता करने के लिए आवश्यक लोगों की तुलना में अधिक है।

परीक्षण किए गए परख के बीच, Hoechst 33342 और पीआई के साथ दोहरी धुंधला टीबी धुंधला के साथ मजबूती, संवेदनशीलता, और स्थिरता का सबसे अच्छा संयोजन था, सीसीसीपी या 2-डीजी उपचार(अनुपूरक तालिकाओं S1-2)के बाद टीबी बहिष्कार विधि से सबसे छोटी औसत विचलन के साथ। दिलचस्प बात यह है कि सीसीसीपी (५० और १०० माइक्रोन) की उच्च खुराक पर Hoechst/PI या टीबी के साथ अनुमानित व्यवहार्यता कम खुराक(चित्रा 2B,शीर्ष) की तुलना में बढ़ गई थी । यह इसकी हाइड्रोफोबसिटी के कारण उच्च खुराक पर सीसीसीपी की वर्षा के कारण होने की संभावना है, इसकी प्रभावी एकाग्रता और कोशिकाओं पर प्रभाव को कम करने। सीसीसीपी की खुराक में वृद्धि से ओसीआई-एएमएल2 कोशिकाओं की Hoechst/PI-अनुमानित औसत व्यवहार्यता कम हो गई, हालांकि: 150 माइक्रोन पर 74%, 200 माइक्रोन पर 62%, 300 माइक्रोन पर 6%(डेटा नहीं दिखाया गया)।

Hoechst/PI परख अन्य माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग अणुओं के साथ उपचार के बाद सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण करने में भी प्रभावी था । इनमें रोटेनोन शामिल थे, एक जहर जो माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला37के कॉम्प्लेक्स I से समझौता करता है, और 3-ब्रोमोपाइरुवेट, एक ग्लाइकोलिटिक अवरोधक और एल्किलेटिंग एजेंट जो माइटोकॉन्ड्रियल पुनर्प्रापीकरण और माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म38 (चित्रा 3ए-डी, अनुपूरक तालिकाएं एस 3-4)को ख़राब करता है।

Figure 3
चित्र 3। ल्यूकेमिया कोशिकाओं में Hoechst/PI साइटोटॉक्सिकिटी परख का सत्यापन। (A,B)OCI-AML2 (एएमएल) कोशिकाओं को रोटेनोन(ए)या 3-ब्रोमोप्रुवेट, 3-बीपी(बी)सीरम-मुक्त आरपीएमआई-१६४० मीडिया में 24 घंटे के लिए विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया, तो व्यवहार्यता निर्धारित किया गया था । दिखाया SEM के साथ मतलब है ।(C, D)Hoechst/PI परख बनाम ट्राइपैन ब्लू धुंधला के बीच व्यवहार्यता अंतर की तुलना (ए-बीमें कोशिकाओं के लिए, मात्रा के लिए अनुपूरक तालिकाओं S3-4 देखें) । सितारे सांख्यिकीय महत्व बनाम ट्राइपैन ब्लू धुंधला संकेत देते हैं । ** पी एंड एलटी; 0.01, *** पी एंड एलटी; 0.001, एनएस - गैर-महत्वपूर्ण। समूह तुलना कई परिकल्पना परीक्षण के लिए सुधार के साथ टीपरीक्षण के माध्यम से किया गया था । ई.MOLM-13 (एएमएल), प्राथमिक एएमएल कोशिकाओं एक मरीज से अलग, MOLT-4 (सभी), और K562 (CML) कोशिकाओं सीरम में रोटेनोन की संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया गया-मुक्त RPMI-१६४० मीडिया के लिए 24 घंटे के लिए, व्यवहार्यता निर्धारण से पहले Hoechst/PI स्टेनिंग का उपयोग कर । दिखाया SEM के साथ मतलब है । तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Hoechst/PI साइटोटॉक्सिकिटी परख को ल्यूकेमिया सेल लाइनों के एक पैनल का उपयोग करके और अधिक मान्य किया गया था जो कई प्रकार के ल्यूकेमिया, साथ ही प्राथमिक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । इनमें एमएलएम-13 (एएमएल सेल लाइन), एक प्रतिनिधि रोगी नमूने से प्राप्त प्राथमिक एएमएल कोशिकाएं, एमओएलटी-4 (एक तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया सेल लाइन, ऑल), और K562 (एक क्रोनिक माइलोजेनस ल्यूकेमिया सेल लाइन, सीएमएल)(चित्रा 3ई, अनुपूरक चित्रा S1)शामिल थे। Hoechst/PI परख के परिणामों से पता चला है कि इन कोशिकाओं को रोटेनोन संवेदनशीलता में गहरा अंतर था, बहुत संवेदनशील (MOLT-4) से प्रतिरोधी (K562) कोशिकाओं को लेकर ।

परख की मजबूती प्रदर्शित करने के लिए, OCI-AML2 कोशिकाओं को 3-ब्रोमोप्वेट की एकाग्रता ढाल के साथ इलाज किया गया, जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है। सेल गिनती प्रत्येक एकाग्रता पर 6 कुओं के लिए एकत्र किए गए थे और दिखाया गया है(चित्रा 4A, B)। इन मामलों का उपयोग व्यवहार्यता की गणना करने के लिए किया गया था, और पता चला कि 4 कुओं के रूप में कुछ सही परख परिणाम(चित्रा 4C)पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त थे । परिणामस्वरूप खुराक-प्रतिक्रिया वक्र(चित्रा 4D) दिखायागया है।

Figure 4
चित्र 4. Hoechst/PI धुंधला की प्रजनन क्षमता। 3-ब्रोमोवायरुवेट (3-बीपी) की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के 24 घंटे के बाद OCI-AML2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता। (क)होचस्ट 33342 स्टेनिंग के माध्यम से गिने जाने वाली कोशिकाओं की कुल संख्या,(बी)प्रोपिडियम आयोडाइड स्टेनिंग के माध्यम से गिने जाने वाले मृत कोशिकाओं की संख्या। (C)व्यवहार्यता (%) (ए-बी)का उपयोग करके गणना की गई। (घ)प्रतिनिधि खुराक-प्रतिक्रिया ग्राफ। दिखाया SEM के साथ मतलब है । तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हालांकि परख अपेक्षाकृत मजबूत है, देखभाल अभी भी लिया जाना चाहिए । परख का अनुचित प्रदर्शन इसकी सटीकता से समझौता कर सकता है। समस्या निवारण उद्देश्यों(चित्र 5)के लिए कई समझौता किए गए परिणाम दिखाए जाते हैं। छवियों का पहला सेट PI के साथ अधिक धुंधला के परिणामों से पता चलता है, जो निम्नलिखित स्रोतों से उत्पन्न हो सकता है: बहुत अधिक एकाग्रता पर डाई का उपयोग करना, बहुत लंबे समय तक धुंधला करना, या लाल चैनल(चित्रा 5A)में बहुत अधिक एलईडी तीव्रता/एकीकरण समय का उपयोग करना। ये त्रुटियां मृत कोशिकाओं की कृत्रिम रूप से फुलाया संख्या उत्पन्न करेंगी। दूसरा मुद्दा अपकेंद्रित्र कदम की उपेक्षा से उठता है । अक्सर, मृत कोशिकाएं पकवान की सतह से अपना लगाव खोने लगती हैं। नतीजतन, उन्हें छवि अधिग्रहण के दौरान कम प्रतिनिधित्व दिया जाएगा, जो आम तौर पर कुएं केनीचे (चित्रा 5B)के पास होता है। अंत में, Hoechst चैनल में ओवरएक्सपोजर कृत्रिम रूप से कोशिकाओं के आकार का विस्तार करता है, जो प्रति अच्छी तरह से कुल गिनती को काफी कम करता है और परख शक्ति(चित्रा 5C)को सीमित करता है।

Figure 5
चित्रा 5। इष्टतम और उप-इष्टतम परख मापदंडों की तुलना। अनुकूलित मापदंडों (बाएं) या उप-इष्टतम मापदंडों (दाएं) के माध्यम से प्राप्त परिणामों की तुलना। (ए)स्वस्थ पीबीएमसी इमेजिंग से पहले 15 मिनट के लिए 1 μg/ml (बाएं) या 5 μg/ml (दाएं) पर प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ दाग थे । (ख)ओसीआई-AML2 कोशिकाओं के साथ लिया (बाएं) या बिना (दाएं) प्लेट अपकेंद्रित्र की छवियां । (ग)ओसीआई-AML2 कोशिकाओं की छवियां इष्टतम (बाएं) या अत्यधिक (दाएं) Hoechst चैनल के लिए एकीकरण समय के साथ अधिग्रहीत । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ट्राइपैन ब्लू विधि के साथ अंतर, %
सीसीसीपी, माइक्रोन Hoechst/PI एलडीएच परख एमटीटी आलमार ब्लू
3.1 -1.19 33.00 -31.05 -59.04
6.3 6.99 41.90 -11.03 -59.34
12.5 0.71 41.60 4.31 -52.52
25 30.73 66.33 -3.68 -51.85
50 47.38 50.71 -17.71 -60.27
100 13.81 17.12 -45.31 -67.25
औसत 10.40 41.75 -14.37 -59.19

अनुपूरक तालिका S1। सीसीसीपी उपचार के बाद ओसीआई-AML2 कोशिकाओं में परख के एक पैनल के लिए व्यवहार्यता मतभेद। सीसीसीपी की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के 24 घंटे के बाद व्यवहार्यता का आकलन किया गया था। परीक्षण परख के बीच औसत व्यवहार्यता अंतर (Hoechst/PI, LDH, MTT, या alamarBlue) और स्वचालित गिनती के साथ ट्राइपैन ब्लू धुंधला प्रत्येक दवा एकाग्रता पर व्यवहार्यता मतभेदों के आधार पर गणना की गई थी ।

ट्राइपैन ब्लू विधि के साथ अंतर, %
2-डीजी, एमएम Hoechst/PI एलडीएच परख एमटीटी आलमार ब्लू
3.1 16.16 20.77 5.82 -20.27
6.3 22.93 31.96 -11.13 -31.11
12.5 30.85 45.07 -34.27 -36.29
25 13.81 42.39 -55.79 -52.29
50 16.96 81.12 -29.38 -47.68
100 7.79 149.16 -19.37 -28.67
औसत 16.56 43.73 -24.38 -33.70

अनुपूरक तालिका S2। 2-डीजी उपचार के बाद OCI-AML2 कोशिकाओं में परख के एक पैनल के लिए व्यवहार्यता मतभेद । 2-डीजी की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के 24 घंटे के बाद व्यवहार्यता का आकलन किया गया था। परीक्षण परख के बीच औसत व्यवहार्यता अंतर (Hoechst/PI, LDH, MTT, या alamarBlue) और स्वचालित गिनती के साथ ट्राइपैन ब्लू धुंधला प्रत्येक दवा एकाग्रता पर व्यवहार्यता मतभेदों के आधार पर गणना की गई ।

रोटेनोन, माइक्रोन व्यवहार्यता अंतर, % (Hoechst/PI-trypan नीला)
10 4.45
25 7.61
50 17.70
100 7.74
150 56.38
200 16.57
औसत 12.15

अनुपूरक तालिका S3। रोटेनोन उपचार के बाद ओसीआई-एएमएल2 कोशिकाओं में Hoechst/PI और टीबी अपवर्जन विधि के बीच व्यवहार्यता अंतर । रोटेनोन की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के 24 घंटे के बाद व्यवहार्यता का आकलन किया गया था। Hoechst/PI और स्वचालित गिनती के साथ ट्राइपैन ब्लू धुंधला के बीच औसत व्यवहार्यता अंतर प्रत्येक दवा एकाग्रता पर व्यवहार्यता मतभेदों के आधार पर गणना की गई थी ।

3-बीपी, माइक्रोन व्यवहार्यता अंतर, % (Hoechst/PI-trypan नीला)
5 5.73
10 9.00
25 7.72
50 -1.90
100 -28.23
200 -20.77
एमएडियन 1.91

अनुपूरक तालिका एस 4। 3-ब्रोमोवाइरुवेट (3-बीपी) उपचार के बाद ओसीआई-एएमएल2 कोशिकाओं में Hoechst/PI और टीबी अपवर्जन विधि के बीच व्यवहार्यता अंतर । 3-बीपी की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के 24 एच के बाद व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया गया था । Hoechst/PI और स्वचालित गिनती के साथ ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग के बीच औसत व्यवहार्यता अंतर प्रत्येक दवा एकाग्रता पर व्यवहार्यता मतभेदों के आधार पर गणना की गई थी ।

अनुपूरक चित्रा S1। Hoechst/PI के साथ दाग कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियां, के साथ या सीरम में संकेत सांद्रता पर रोटेनोन उपचार के बिना मुक्त RPMI-१६४० मीडिया में 24 घंटे के लिए: ए-बी । एएमएल: एमएलएम-13 सेल लाइन(ए),और प्राथमिक एएमएल कोशिकाएं(बी)एक प्रतिनिधि रोगी नमूने से प्राप्त होती हैं। सी. सभी: MOLT-4 सेल लाइन। डी. सीएमएल: K562 सेल लाइन। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हालांकि Hoechst/PI साइटोटॉक्सिकिटी परख के लिए प्रोटोकॉल मजबूत है और तुलनात्मक रूप से कम हाथों की समय पर आवश्यकता है, वहां कई प्रयोगात्मक विवरण है कि सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि डीएमएसओ की एकाग्रता 0.5% (v/v) से नीचे बनी रहे। आम तौर पर इस बात पर सहमति होती है कि डीएमएसओ की कम खुराक के संपर्क में आने से कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और अनुलग्नक में काफी बदलाव आ सकता है और कोशिका चक्र प्रगति में काफी देरी हो सकती है39,40.

दूसरा, धुंधला उपचार के बाद जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। चूंकि कोई धोने के कदम नहीं हैं, इसलिए यौगिक कुओं में रहता है और कोशिकाओं पर नुकसान पहुंचाना जारी रख सकता है। पहले के प्रोटोकॉल35की तुलना में कोशिकाओं को केवल 15 मिनट के लिए दाग दिया गया था। यह संभावना को सीमित करता है कि व्यवहार्य कोशिकाओं को अनजाने में प्रोपिडियम आयोडाइड से सना जा सकता है। इस कारण से, हम चौंका देने वाला उपचार और धुंधला सुझाव है कि अगर दो से अधिक प्लेटों का इलाज किया जाएगा । यह प्लेटों के बीच इमेजिंग समय के लिए अनुमति देता है और प्रजनन क्षमता में सुधार करता है।

तीसरा, उचित डाई एकाग्रता सेल प्रकार पर निर्भर है। आर्थोगोनल संदर्भ के रूप में ट्राइपैन ब्लू धुंधला का उपयोग करके, अनुपचारित कोशिकाओं के साथ शुरुआत करते हुए अनुकूलित प्रोपिडियम आयोडाइड एकाग्रता को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करना महत्वपूर्ण है।

अंत में, दृश्य से तुरंत पहले अपकेंद्रित्र कदम भी महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल के आधार पर, 500-4000 कोशिकाओं की एक श्रृंखला दर्ज की जाती है (सीडिंग घनत्व के आधार पर)। यह 100-400 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से पहले35इस्तेमाल पर एक उल्लेखनीय सुधार है। कैंसर कोशिकाओं (विशेष रूप से प्राथमिक कोशिकाओं) की आबादी में भिन्नता को ध्यान में रखते हुए, विश्लेषण के लिए अधिक कोशिकाओं वाला महत्वपूर्ण है, और अधिक मजबूत डेटा विश्लेषण की अनुमति दे सकता है।

विधि की सापेक्ष सादगी के कारण, विभिन्न प्रकार के संशोधन आसानी से किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, कई अन्य सेल-इम्पेंट रंग कई विक्रेताओं से उपलब्ध हैं और उन्हें प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हालांकि इस प्रतिस्थापन का अपने आप में अपेक्षाकृत कम मूल्य है, रंगों की बढ़ी हुई पैलेट का मतलब है कि अधिक जटिल प्रयोग किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, तीसरे रंग के अलावा कोशिकाओं की उपआबादी के बीच अंतर अस्तित्व का आकलन करने की अनुमति देगा, जैसा कि आमतौर पर प्रवाह साइटोमेट्री के साथ किया जाता है।

प्रोटोकॉल का अधिक महत्वपूर्ण संशोधन सेल विज़ुअलाइज़ेशन को पूर्वगामी और इसके बजाय स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करना है। इस दृष्टिकोण में उपकरणों के लगभग सर्वव्यापी टुकड़े (माइक्रोप्लेट रीडर के साथ एक मानक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर) का उपयोग करने का लाभ है और डेटा प्राप्त करने का सबसे तेज़ तरीका है। हालांकि, यह विधि बहुत कम सटीक है। फ्लोरेसेंस तीव्रता सेल धुंधला का प्रतिनिधि है, लेकिन धुंधला तीव्रता में स्टोचस्टिक विविधताओं, अपेक्षाकृत छोटे नमूना क्षेत्र के साथ संयुक्त, महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता परिचय । जबकि आगे अनुकूलन (जैसे एक स्थिर, अतिरिक्त धोने के कदम, या नमूनों की एक बड़ी संख्या को शामिल करने के रूप में) इन समस्याओं का समाधान कर सकते हैं, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आम तौर पर एक बेहतर दृष्टिकोण है ।

अंत में, संशोधित Hoechst/PI प्रोटोकॉल एक तेज, सटीक, सस्ती, उच्च-थ्रूपुट साइटोटॉक्सिकिटी परख है जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन से स्वतंत्र है। इस परख में कुशलतापूर्वक यौगिकों या यौगिक संयोजनों की स्क्रीनिंग के लिए पर्याप्त उपयोगिता है जो माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एनवीके, कैंसर रिसर्च में एक CPRIT विद्वान, कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के अनुसंधान संस्थान (CPRIT) उनके उदार समर्थन के लिए धन्यवाद, CPRIT अनुदान RR150044. इस काम को वेल्च फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट सी-1 9 30 द्वारा और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा एनवीके को सम्मानित किया गया था। फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose/2-DG Chem-Impex 50-519-067
3-bromo-pyruvate Alfa Aesar 1113-59-3
96-Well plates Greiner Bio-One 655090 Black or clear flat-bottomed 96-well plates
Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)  Thermo Fisher A50101
Countess II automated cell counter Thermo Fisher
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek
Hoechst 33342 Thermo Fisher 62249 20 mM solution; final concentration 1:1,000
HyClone fetal bovine serum GE Healthcare #25-514
m-chlorophenylhydrazone/CCCP Sigma Aldrich C2759
PBS tablets Thermo Fisher BP2944100 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Gibco 10378016
Pierce LDH assay kit Thermo Fisher 50-103-5952
Propidium Iodide Thermo Fisher 50-596-072 Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs)
Rotenone Ark Pharm AK115691
RPMI-1640 Medium
With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture		 Sigma Aldrich R8758-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide ACROS Organics AC158990010
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Cell lines
K562 ATCC CCL-243 CML cell line
MOLM-13 ATCC AML cell line
MOLT-4 ATCC CRL-1582 ALL cell line
OCI-AML2 ATCC AML cell line

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References

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Pei, J., Panina, S. B., Kirienko, N. V. An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (159), e61295, doi:10.3791/61295 (2020).

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