Summary
Protokol, hücresel canlılığı verimli bir şekilde belirlemek için hızlı, yüksek verimli, güvenilir, ucuz ve tarafsız bir testi tanımlar. Bu tahlil özellikle hücrelerin mitokondrisi hasar gördüğünde yararlıdır, bu da diğer tahlilleri bozar. Hoechst 33342 ve propidium iyodür - Tsay iki nükleer boya ile boyanmış hücrelerin otomatik sayma kullanır.
Abstract
Mitokondrinin onkojenik dönüşüme katkısı geniş ilgi ve aktif bir çalışma konusudur. Kanser metabolizması alanı daha karmaşık hale geldikçe, mitokondri hasar (sözde mitokanlar) inflict çeşitli bileşikler kullanarak mitokondri hedefleme hedefi oldukça popüler hale gelmektedir. Ne yazık ki, tetrazolyum tuzları veya resazurin dayalı olanlar gibi birçok mevcut sitotoksisite tahlilleri performansları için fonksiyonel mitokondriyal enzimler gerektirir. Mitokondriyi hedef alan bileşiklerin verdiği hasar genellikle bu tahlillerin doğruluğunu tehlikeye attırıyor. Burada, biri hücre permeant (Hoechst 33342) diğeri (propidium iyodür) olmayan iki floresan boyaile diferansiyel boyama ya da reisial boyama dayalı değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Boyama farkı yaşayan ve ölü hücrelerin ayrımcılığa uğramasını sağlar. Tahlil, otomatik mikroskopi ve görüntü analizine açıktır, bu da iş bilgililiği artırır ve önyargıyı azaltır. Bu aynı zamanda 96-iyi plakalar kullanarak yüksek iş yapma moda kullanılacak töz sağlar, uyuşturucu keşif çabaları için uygun bir seçenek yapma, özellikle söz konusu ilaçlar ın mitotoksisite bazı düzeyde var. Daha da önemlisi, Hoechst/PI boyama tahtına göre elde edilen sonuçlar, hem trypan mavisi dışlama sonuçlarıyla hem de tahkikat diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında biyolojik kopyalar arasında artan tutarlılık göstermektedir.
Introduction
Etkili kanser tedavilerini belirlemek için ilk adım, tedavinin etkisini incelemek için kullanılabilecek sağlam, tarafsız sitotoksisite tetkik seçimidir. Düşük iş elde deneyleri için ortak bir seçim canlı hücrelerden trypan mavi boya dışlanmasıdır. Hücre sağkalım ölçmek için nispeten tarafsız bir yöntem sağlar, çünkü bu yöntem tercih edilir. trypan mavi pasif olan membranlar tehlikeye hücrelere yayılır, ancak etkili sağlıklı hücrelere girmesini engellenir1. Canlı hücrelerin ve toplam hücrelerin bölümü tedavinin etkinliğini gösteren yüzde canlılığı temsil eder. Trypan mavi sataştının en önemli dezavantajı, yüksek iş elde yöntemleri için uygun olmadığıdır. Nispeten düşük sinyal-gürültü oranına sahiptir ve uzun süreli boyama canlı hücrelerin boyanması nedeniyle eserlere neden olabilir. Sonuç olarak, trypan mavi dışlama genellikle, ama her zaman değil2, manuel sayma için küme. Bu çok yavaş yapar ve araştırmacının öznel yargı nedeniyle önyargı güçlü bir olasılık ortaya çıkarır (kör edici veya bağımsız sayımlar kullanılmadığı sürece, hangi daha fazla laboratuvar iş büyümesini azaltmak). Genel olarak, bu tayın elde edilmesi modern uyuşturucu keşfi için yeterli değildir.
Genellikle çok daha yüksek bir iş bilgili canlılık denemeleri, araştırmacıların bu sınırlamayı atlatmasına izin verir, ancak önemli uyarılarla birlikte gelir (bkz. Tablo 1). Bu yöntemler genellikle iki gruba ayrılır. Bir grup hücresel redoks enzimlerinin işlevine dayalı kolorimetrik tahliller oluşur. Renksiz veya floresan olmayan yüzeyler, spektrofotometre kullanılarak ölçülebilen canlı ürünlere dönüştürülür. Klasik örnekler tetrazolyum tuzları (MTT, WST-1, XTT, vb) ve resazurin içerir. Bu kategori de ATP düzeyini değerlendirmek için luciferin kullanan Parlak tahliller içerir. Bu tip tahliller hücre metabolizmasını ölçtükleri için altta yatan bir sınırlamaya sahiptir, ki bu da tek başına hücresel canlılık değildir. Bu olumsuz koşullar altında quiescent olmak hücreleri için oldukça yaygındır, ama yine de3bölmek için yeteneğini korumak,4,5. Örneğin, kanser kök hücreleri genellikle nispeten metabolik quiescent6,7,8,9, ve bu teknikleri kullanarak tsay zor olması muhtemeldir. Mitokondriyal fonksiyona zarar veren tedavilerin etkinliği, çoğu mitokan gibi, aynı zamanda önemli ölçüde abartılmış olması muhtemeldir.
Alternatif bir metodoloji, biyolojik membranları geçmelerini ya da geçmemelerini sağlayan çeşitli maddelerin kimyasal özelliklerinden yararlanır. Bir örnek SYTOX veya propidium iyodür (PI) gibi nükleer lekeler vardır. Bu kategori de kavram olarak benzer ama işlevi farklı tahliller içerir, laktat dehidrogenaz gibi (LDH) tahlil, hücresel nekroz bir göstergesi olarak hücre dışı ortama LDH salınımını ölçer(Şekil 1, Tablo 1). Bu tahliller metabolik olarak inaktif ve ölü hücreleri ayırt etme yeteneğine sahiptir.
| Assay/boya | Hücre ölümünün türü(ler) tespit | Gerekli ekipmanlar | Temel özellikler |
| MTT, CKK-8, Alamar Mavisi (resazurin) | Apoptosis/Nekroz | Spektrofotometre | Ucuz, hızlı; uç nokta tsası; enzimlerin aktivitesine bağlıdır (MTT durumunda münhasıran mitokondriyal) ve hücre ölüm modları arasında ayrım yapmaz1,10 |
| LDH sürümü | Nekroz | Spektrofotometre | Hızlı, mitokondriyal enzimlerin aktivitesinden bağımsız; yüksek iş ortası testleri için pahalı; kompromized plazma membranı ile nekrotik hücreleri algılar11,12 |
| Trypan Mavi (TB) | Apoptosis/Nekroz | Mikroskop | Hücre impermeant; hücre ölüm modları arasında ayrım yapmaz; zahmetli ve yüksek iş gücü taraması için uygun olmayan; yapışık hücrelerle kullanımı daha zordur; kullanıcının öznel yargıyatkın, ancak standart hücre canlılık ölçüm yöntemi13 olarak kabul edilir |
| Acridine portakal (AO) | Apoptosis/Nekroz/ | Floresan mikroskobu | Benzersiz spektral özelliklere sahip bir nükleik asit boyası, apopoz ve nekroz/nekroz arasında ayrım yapabilir14 |
| Necroptosis | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptozis | Floresan mikroskobu veya akış sitometresi | Hücre geçirilebilir; hücre ölümünü izlemek için kendi başına uygunsuz; ortak boyama için yararlıdır; erken apoptozda kromatin yoğuşması ve çekirdek parçalanmasını değerlendirmek için kullanılabilir; nekroz dan apoptoz ayırt etmek için propidium iyodür ile eşleştirilmiş olabilir15,16 |
| Propidium İyodür (PI) | Geç apoptoz/Nekroz | Floresan mikroskobu veya akış sitometresi | Hücre imperkastinin interkalatör; hücre ölümü hem geç apoptoz ve nekroz modları algılar17. Uzun kuluçka sürelerinde toksik ve geçirbilebilir18 |
Tablo 1. Sitotoksisite tahlillerinin listesi. Sitotoksisite tahlilleri, bazıları bu çalışmada kullanılan, onların temel özellikleri kısa açıklaması ile birlikte listelenmiştir.
Son çalışmalar, mitokondriyal metabolizmabazı kanserlerde19,20,21,22,23,24,25değişmiş olduğunu göstermiştir. Örneğin, akut miyeloid lösemiler (AML) onların mitokondriyal kitle, mtDNA içeriği ve mitokondriyal solunum enerji taleplerini karşılamak için upregulate gösterilmiştir19,26,27. Öte yandan, bazı katı tümörler mitokondriyal disfonksiyon ile karakterizedir, daha doğrusu "metabolik yeniden programlama", OXPHOS dahil mitokondriyal proteinlerin downregülasyonu veya azalmış mtDNA içeriği gibi, tümör invazivliği ile ilişkili olmuştur, metastatik potansiyel ve apoptoz indükleyici ilaçlara direnç28,29. Ayrıca, son zamanlarda, mitokondriyal fonksiyonu etkileyen mekanistik çeşitli bileşikler kullanarak artan bir ilgi olmuştur (genellikle mitokanlar denir30), belirli kanserler için potansiyel tedaviler olarak. Bu ilaçlar atp sentezi hedef, mitokondriyal DNA, OXPHOS, ve ROS üretimi, yanı sıra mitokondri ile ilişkili pro-apoptotic ve anti-apoptotik proteinler30,31. Çeşitli çalışmalar bu yaklaşımın önemli bir söz olduğunu göstermiştir19,32,33,34. Ancak, kanser hücre biyolojisi veya mitokondri hedefleme tedavilerde bu metabolik sapmalar önemli ölçüde mitokondriyal işlevselliğe dayalı geleneksel canlılık tahlilleri etkileyebilir.
Burada diferansiyel nükleer boyama testini için optimize edilmiş bir protokol tanımlanmıştır. Protokol mitokanların sitotoksisitesinin veya diğer bileşiklerle kombinasyonlarının hızlı ve doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar. Hoechst 33342, dna lekelemek için hücre zarlarını kolayca geçen ve toplam hücre sayısının elde edilmesine olanak tanıyan hücre içi bir nükleer boyadır. Sadece ölü hücrelerin çekirdeklerine giren PI ile birlikte boyanarak, canlıların (yalnızca Hoechst) ve ölü (her ikisiyle de lekelenmiş) hücrelerin oranı doğru bir şekilde belirlenebilir. Bu protokol, boya konsantrasyonunun optimizasyonu için bir adım ekleyerek (ortogonal trippan mavi yöntemi ile çapraz referans sonuçları ile) ve görüntüleme den önce plakanın santrifüjü ile yayınlanan tahkikat35'i geliştirir. Birçok hücre hattı yarı yapışık veya askıya alındığından, santrifüj görüntülenmiş hücrelerin oranını artırır ve doğruluğu güçlü bir şekilde artırır. Tama, boyama nın ortam veya yıkamayı gerektirmediği de dahil olmak üzere çeşitli avantajları vardır. Boya karışımı da ucuz, hazırlanması kolay ve çok kanallı /robotik boru lama sistemleri ile uyumludur.
Hücreler lekelendikten sonra otomatik bir mikroskopla görüntülenirler. Bu, daha sonra yeniden analiz edilebilen görüntülerin kalıcı bir kaydını oluşturma avantajına sahiptir ve belirli bileşiklerin etkileri yakalanan görüntülerin görsel incelemesi ile yeniden değerlendirilebilir. Görüntüler elde edildikten sonra hücreler, hem ücretsiz (örn. ImageJ, CellProfiler, vb.) hem de ticari yazılımlar (örn. Metamorf, Gen5, vb.) dahil olmak üzere çeşitli yazılım paketlerinden herhangi biri kullanılarak elle veya herhangi bir yazılım paketi kullanılarak sayılabilir. Düzgün geliştirilmiş otomatik hücre sayma boru hatları manuel sayımlara göre daha doğru ve daha az önyargılı olduğundan otomatik hücre sayma genellikle tercih edilir. Ayrıca hücre enkazını veya çözünmez kompleksleri daha etkili bir şekilde göz ardı ederler. Bu boru hatlarının geliştirilmesi genellikle basittir ve kullanılan lekelerin verimliliği ile basitleştirilir. Ölü hücrelerin gerçek sayısı toplam hücre sayısına göre otomatik olarak hesaplandığı ve algılamanın sıkılığını artırmak veya azaltmak için farklı eşikler uygulanabileceğinden çıktı niceldir35. Kolaylık sağlamak için, Gen5 v. 3.00 yazılım uyumlu Cytation 5 Hücre Görüntüleme Multi-Mode Reader kullanarak hücreleri saymak için optimize edilmiş parametreler dahildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sitotoksisite Tsay: Kurulum
- Uygun ortamda istenilen konsantrasyonlarda (serumsuz veya 1, 2,5 veya %5 FBS RPMI-1640) ilgi bileşiklerinin çözümlerini hazırlayın.
- Tek bir bileşiğin sitotoksisitesini ölçmek için (örn. etkili dozları belirlemek için), bileşikleri 2x son konsantrasyonda hazırlayın.
- Bileşik kombinasyonların sitotoksisitesini ölçmek için, bileşikleri 4x son konsantrasyonda hazırlayın.
- Aynı miktarda çözücüile uygun ortama karıştırılarak yalnızca çözücü kontrollerini hazırlayın. Örneğin, DMSO ve metanolde çözünmüş bileşikleri test ediyorsanız, her çözücü için yalnızca çözücü kontrolü yapın.
- 15 mL konik tüp içine kültür çanak veya şişe hücreleri toplamak.
- 10 μL hücre süspansiyonu mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve %10 0,4 trypan mavisi ile leke. Her hücre kaynağı için canlı ve canlı olmayan hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.
- Pelet hücreleri 200 g 5 dk. Aspire veya decant supernatant.
- 3*105 hücre/mL hücre yoğunluğunda taht-ı muhatap ortamlarda hücre peletini (serumsuz veya 1, 2,5, %5 FBS RPMI-1640) yeniden askıya alın.
NOT 1: 3*105 hücre/mL hücre yoğunluğu 15.000 hücre/kuyu tohumlama yoğunluğu sağlar. Tohumlama yoğunluğu önemli bir parametredir ve ideal olarak deneyden önce önceden tanımlanmış olmalıdır. Tohumlama yoğunluğu dikkate almalıdır 1) hücre büyüklüğü - genellikle büyük hücreler daha düşük bir yoğunlukta tohumlu; 2) tedavi süresi - hücreler genellikle daha uzun sürecek deneyler için daha düşük bir yoğunlukta tohumlu; ve 3) hücre bölünme hızı – bölünme oranı daha yüksek olan hücreler daha düşük yoğunlukta tohumlanır. Optimize edilmiş tohumlama yoğunluklarına özel örnekler: K562 hücreleri, daha büyük, 24 saat süre – 10.000 hücre/kuyu; MOLM-13 hücreleri, orta boy, 24 saat tedavi – 15.000/well; MOLM-13 hücreleri, 48 h tedavi – 8.000/well; küçük sağlıklı periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs), 24 saat tedavi – 50,000/well; primer AML hücreleri, 24 saat tedavi – 15.000-20.000/well.
NOT 2: Medyada FBS varlığı bileşiklerin etkinliğini etkileyebilir. FBS konsantrasyonunun azaltılması taht sonuçlarını yorumlamayı kolaylaştırabilir, ancak aynı zamanda fizyolojik doğruluğu da azaltır. - Çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyulu bir plakanın her kuyunun içine adım 1,5'ten 50°L hücre süspansiyonu yerleştirin.
- Aşağıdaki gibi bileşikler ekleyin:
- Tek bileşik tahliller için, her kuyuya 50 μL 2x bileşik çözelti ekleyin. Solvent kontrollü kuyular için, çözücüiçeren 50 μL'lik test ortamını 2 x konsantrasyonda ekleyin.
- Kombinasyon tahlilleri için, her bir kuyuya her bir bileşiğin (4x çözeltisi) 25°L'sini ekleyin. Tek bileşik kontrol kuyuları için 25 μL 4x bileşik çözeltisi ve 25 μL test ortamı ekleyin. Solvent kontrollü kuyular için, çözücü içeren 50 μL test ortamı veya test ortamı ekleyin.
NOT 1: DMSO'nun son konsantrasyonu %0.5'i geçmemelidir.
NOT 2: Düşük hacimnedeniyle her kuyunun duvarına dokunan pipetile bileşikleri içeren ortamların eklenmesi önerilir.
- Kuyuların içeriğinin karıştırılmasını sağlamak için plakaya hafifçe dokunun.
- 37 °C'de, nemlendirilmiş %5 CO2 atmosferinde uygun bir süre için 24 saat kuluçkaya yatırın.
2. Sitotoksisite Tsay: Hoechst 33342 ve propidium Iodide ile boyama
- 10x boyama çözeltisi hazırlayın. Bu çözüm her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır, depolanamaz. Son boya konsantrasyonları deneyden önce belirlenmelidir.
- Lösemi hücre hatları ve primer lösemi hücreleri için 1 mL 10x boyama tamponu 10 μL 20 mM Hoechst 33342 ve 50 μL 1 mg/mL propidium iyodür içerir steril PBS (son konsantrasyonlar: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
- Sağlıklı PBMC'ler için 1 mL 1mL 10 μL 20 mM Hoechst 33342 ve steril PBS'de 1mg/mL propidium iyodür (son konsantrasyonlar: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL) içerir.
NOT: Proidium iyodürünün son konsantrasyonu deneylerden önce belirlenmelidir. Hücreler çeşitli PI konsantrasyonları (1, 2,5, 5 g/mL) kullanılarak test edilmeli ve daha sonra Hoechst/PI hesaplanan canlılık trypan mavisi ile ölçülen canlılıkla karşılaştırılmalıdır. Yukarıda listelenen PI konsantrasyonları medya kontrol kuyularında hedef hücre canlılığına göre seçilmiştir (lösemi hücre hatları için ~%90'ın üzerinde, sağlıklı PBMC'ler için ~%70'in üzerinde).
DİkKAT: Hoechst 33342 ve propidium iyodür potansiyel karsinojenlerdir. Bunları kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
- Kuluçkadan sonra, her kuyuya 10 μL 10x boyama tamponu eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için pipet uçlarının ortama dokunmadığından emin olun. - Yavaşça karıştırmak ve kabarcıklar temizlemek için plaka dokunun. 15 dk için 37 °C'de leke.
- Plakayı 4 dk için 200 g'da santrifüj edin ve tüm hücreleri plakanın altına getirin. Görüntülemeyi engelleyecek lifleri ve/veya enkazı çıkarmak için plakanın altını nemli bir kimwipe ile dikkatlice silin.
NOT 1: Plakanın santrifüjü, tüm hücrelerin görüntüde yakalanması için en yüksek şansı sağlar. Genellikle ölü hücreler sitotoksisite yanıltıcı değerler sağlayarak, ayırmak ve yüzer. Santrifüj bu etkiyi azaltır.
NOT 2: Plaka santrifüjden sonra ideal olarak 15 dakika içinde mümkün olduğunca hızlı görüntülenmelidir. Santrifüj PI boyama seçiciliğini azaltabilir ve hücrelerin yavaş yavaş propidium iyodür tahakkuk etmesine izin verebilir. Ölü hücreleri görselleştirerek elde edilen doğruluk artışı, PI boyamadaki hafif artıştan daha ağır basar. Görüntülemenin santrifüjden sonraki 1 saat içinde tamamlanması tavsiye edilir.
3. Sitotoksisite Tsay: veri toplama
- Hoechst 33342 (uyarma maksimum 350 nm, emisyon maksimum 461 nm) ve PI (uyarma maksimum 493 nm, emisyon maksimum 636 nm) için floresan algılamak için otomatik mikroskop/ plaka görüntüleyici için yazılım ayarlayın. Her iki kanalda her kuyu için görüntü edinin.
- Yazılımı kullanarak (CellProfiler, MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ veya Gen5 gibi özel yazılım dayalı ücretsiz bir görüntü analiz stüdyosu gibi) her kanalda her kuyuda hücreleri saymak.
NOT: Her hücre Hoechst 33342 ile boyanması ve ölü hücrelerin PI ile boyanması gerektiğinden, ölülerin hepsine oranı ölü hücrelerin fraksiyonunu temsil eder. Örneğin, işlenmemiş örnekteki otomatik sayımda PI (ölü hücreler) ile boyanmış 467 hücre ve Hoechst 33342 (toplam hücre) ile boyanmış 2335 hücre varsa, ölü kesir %0,2 veya %20'dir. Bu değer daha sonra tedavinin kullanıldığı aynı şekilde işlenmiş bir örnekle karşılaştırılır. - Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader ve Gen5 v. 3.00 yazılımını kullanarak Hoechst/PI veri toplamanın ayrıntılı açıklaması:
- Cytation5 çok modlu plaka okuyucu /görüntüleyiciyi düz alt, 96 kuyudaki genel siyah plastik plakalı görüntü hücrelerine ayarlayın.
- Standart DAPI ve Texas Red filtre kümelerini kullanmak için bir görüntüleme protokolü ayarlayın. 4x büyütme amacı kullanarak kuyu merkezinde fotoğraf çekmek. Ofset (X/Y veya Z) kullanmayın. Aşağıdaki görüntüleme ayarlarını kullanın: DAPI - LED - 10, entegrasyon süresi - 99, kazanç - 0; Texas Red - LED - 8, entegrasyon süresi - 950, kazanç - 18. DAPI sinyalini kullanarak otomatik netleme yapın; kanallar arasında odaklama hiçbir ofset olmalıdır.
- Gen5 yazılımı v 3.00 kullanarak görüntü analizi gerçekleştirin. Yazılım ayarlarında, hücreleri boyutları 5 ile 25 m arasında şekiller olarak tanımlayın. Birincil kenar nesnelerini hariç tutarak dokunmanesnelerini ayırın ve "Dokunma nesnelerini böl" seçeneğini açarak dokunma nesneleri bölün. Ardından, arka planı kaldırmak (koyu arka plan çıkarma), nükleer maske (eşik değeri DAPI >= 6000 AU) uygulamak ve nesneleri saymak için görüntüyü işleyin. PI boyama (eşik değeri Texas Red >= 5000 AU) dayalı bir alt popülasyon çözümlemesi gerçekleştirin ve nesneleri sayın. Hücre canlılığı % olarak tanımlanır (1 -
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Söz konusu protokol, temsili akut miyeloid lösemi hücre hattı olarak alınan OCI-AML2 hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir. AML kemik iliğinde farklılaşmamış ve fonksiyonel olmayan hematopoetik hücrelerin anormal çoğalması ile karakterizedir26. AML hedefli tedavideki son gelişmelere rağmen, bakım standardı birkaç on yıl boyunca değişmeden kalmıştır ve indüksiyon tedavisi (genellikle antrasikline üç gün oluşur, örneğin, daunorubicin, idarubicin, veya antranedione mitoksantah, ve sitarabine 7 gün) konsolidasyon takip (genellikle kurtarma dönemleri takip cybintarae tedavi tur oluşan)36.
Şekil 1A'dabelirtilen protokole göre, OCI-AML2 hücreleri 96-iyi tabaklarda tohumlandı ve çeşitli konsantrasyonlarda mitokondriyal uncoupler carbonyl siyanür m-klorofenil hidrat (CCCP) veya glikolitik inhibitör 2-deoksi-D-glukoz (2-DG) ile tedavi edildi. Hücreler serumsuz RPMI-1640 ortamlarında 37 °C'de 24 saat tedavi edildi ve daha sonra trypan mavisi (TB) dışlama veya dört canlılık tahlillerinden biri (Hoechst/PI diferansiyel nükleer boyama, LDH salınım tahlil, MTT veya alamarBlue) kullanılarak canlılık değerlendirildi. Hoechst/PI ile boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri Şekil 2A'dagösterilmiştir. Birkaç önemli gözlemler hemen yapılabilir. İlk olarak, toplam hücre sayısı (Hoechst boyama) oldukça yüksektir ve ölü hücre sayısından (PI boyama) belirgin bir şekilde daha fazladır. Bu durum, medya koşullarının yüksek hücre ölüm oranlarını tetiklemediğini göstermektedir. İkinci olarak, yalnızca Hoechst ve PI ile etiketlenen hücreler ölü olarak sayıldığından (birleştirilmiş görüntüdeki mor hücreler), enkaz sayma olasılığı çok düşüktür. Bu resim düzgün lekeli hücrelerin iyi bir örnek gösterir.
Şekil 1. Deneysel zaman çizelgesi ve mevcut sitotoksisite tahlilleri karşılaştırma. (A) Deneysel prosedürün zaman çizelgesini özetleyen akış şeması, örneğin Hoechst/PI boyama. (B) Bu çalışmada bazıları kullanılan sitotoksisite tahlillerinin karşılaştırılması. Boya dışlama tahlilleri, ölü hücreleri tehlikeye atılmış plazma zarıyla lekeleyen impermeant nükleer boyaları içerir: TB – trypan mavisi, PI – propidium iyodür, EtBr – ethidyum bromür ve SYTOX. Tahliller Ikinci grup hücresel metabolizma bağlıdır, örneğin, tetrazolyum tuzları MTT, XTT, ve CKK-8 (WST-8), resazurin tabanlı reaktif alamarBlue, vb bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Trippan mavi sitotoksisite tahlilleri bir panel karşılaştırma. (A)Toplam (Hoechst 33342) ve ölü (propidium iyodür, PI) OCI-AML2 hücrelerinin Hoechst/PI boyama yoluyla temsili görüntüleri. (B) OCI-AML2 hücrelerinin CCCP(üst)veya 2-DG(alt)konsantrasyonları gradyanı ile tedavi den sonra farklı yöntemler le canlılığının değerlendirilmesi. OCI-AML2, hücre canlılığının belirlenmesinden önce 24 saat süreyle serumsuz RPMI-1640'ta CCCP veya 2-DG ile tedavi edildi. Gösterilen ortalama, hata çubukları SEM. C. Sitotoksisite tahlilleri arasındaki hücre canlılığı farkı temsil (B) ve trypan mavi boyama (tam sayılar ve medyan fark için Ek Tablolar S1-2 bakınız). Yıldızlar vsönemli bir fark gösterir. trypan mavi boyama. ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns – önemsiz. Grup karşılaştırması birdenfazla hipotez testi için düzeltme ile t -testi ile yapıldı. Üç bağımsız biyolojik kopya yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Biz son zamanlarda rapor19,lösemiler mitotoksik tedavilere karşı çok duyarlıdır, hangi hücrelerin zaten altta yatan mitokondriyal hasar olduğunu gösterir. Bu temelde, mitokondriyal enzim aktivitesine dayanan MTT ve alamarBlue testlerinin hücresel canlılığı yanlış bir şekilde ölçeceğini öngörmüştük. Beklendiği gibi, bu tahliller (özellikle alamarBlue) trypan mavi dışlama ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük canlılık gösterdi, Şekil 2B, C, Ek Tablolar S1-S2bakınız). Bu apoptoz veya nekroz ikna etmek için gerekli bu bileşiklerin dozları mitokondriyal fonksiyonu tehlikeye gerekli olandan daha yüksek olduğu gerçeği ile tutarlıdır.
Test edildi tahliller arasında, Hoechst 33342 ve PI ile çift boyama sağlamlık, duyarlılık ve TB boyama ile tutarlılık en iyi kombinasyonu vardı, CCCP veya 2-DG tedavisi sonrası TB dışlama yöntemien en küçük medyan sapma ile(Ek Tablolar S1-2). İlginçtir ki, Hoechst/PI veya Tüberküloz ile tahmin edilen yüksek dozlarda CCCP (50 ve 100 μM) canlılık düşük dozlara göre artırıldı(Şekil 2B, üst). Bu büyük olasılıkla yüksek dozlarda yüksek dozlarda CCCP yağış nedeniyle hidrofobiklik nedeniyle, etkili konsantrasyonu ve hücreler üzerindeki etkisini azaltarak. CCCP dozunun artırılması Hoechst/PI-OCI-AML2 hücrelerinin ortalama canlılığını daha da azalttı, ancak: 150 μM'de %74, 200 μM'de %62, 300 μM'de %6(veriler gösterilmedi).
Hoechst/PI teşhebi, diğer mitokondri hedefleyen moleküllerle tedavi sonrası hücresel canlılığı belirlemede de etkili oldu. Bunlar arasında mitokondriyal elektron taşımazincirininKompleks I'den ödün veren bir zehir olan rotenon ve 3-bromopyruvate, mitokondriyal solunum ve mitokondriyal metabolizmayı bozan glikolitik inhibitör ve alkilleyici ajan38 (Şekil 3A-D, Ek Tablolar S3-4)yer almaktadır.
Şekil 3. Lösemi hücrelerinde Hoechst/PI sitotoksisite titreşisinin doğrulanması. (A,B) OCI-AML2 (AML) hücreleri farklı rotenon konsantrasyonları ile tedavi edildi (A) veya 3-bromopyruvate, 3-BP(B) serumsuz RPMI-1640 media 24 saat, daha sonra canlılık belirlendi. Gösterilen SEM ile ortalamadır. (C,D) Hoechst/PI testi ile trypan mavi boyama arasındaki canlılık farkının karşılaştırılması (A-B'dekihücreler için, sayısallaştırma için Ek Tablolar S3-4'e bakınız). Yıldızlar istatistiksel anlamlılığı gösterir ve trippan mavi boyamaya karşı. ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns – önemsiz. Grup karşılaştırması birdenfazla hipotez testi için düzeltme ile t -testi ile yapıldı. E.MOLM-13 (AML), bir hastadan izole edilen primer AML hücreleri, MOLT-4 (ALL) ve K562 (CML) hücreleri, Hoechst/PI boyama kullanılarak canlılık tayininden önce 24 saat boyunca serumsuz RPMI-1640 ortamlarında rotenon konsantrasyonları ile tedavi edildi. Gösterilen SEM ile ortalamadır. Üç bağımsız biyolojik kopya yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Hoechst/PI sitotoksisite tahlili, birden fazla lösemi türünü ve primer hücreleri temsil eden bir dizi lösemi hücre hattı kullanılarak doğrulandı. Bunlar arasında MOLM-13 (AML hücre hattı), temsili bir hasta örneğinden elde edilen primer AML hücreleri, MOLT-4 (akut lenfoblastik lösemi hücre hattı, ALL) ve K562 (kronik miyelonisli lösemi hücre hattı, KML)(Şekil 3E, Ek Şekil S1)yer almaktadır. Hoechst/PI tahsinin sonuçları, bu hücrelerin çok hassas (MOLT-4) dirençli (K562) hücrelere kadar rotenon duyarlılığında derin farklılıklar olduğunu göstermiştir.
Testin sağlamlığını göstermek için, OCI-AML2 hücreleri yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi 3-bromopyruvate konsantrasyon gradyanı ile tedavi edildi. Hücre sayımları her konsantrasyonda 6 kuyu için toplanmış ve gösterilmiştir(Şekil 4A,B). Bu sayımlar canlılığı hesaplamak için kullanıldı ve az sayıda 4 kuyunun doğru bir şekilde analiz sonucunu yakalamak için yeterli olduğunu gösterdi (Şekil 4C). Elde edilen doz-yanıt eğrisi gösterilmiştir (Şekil 4D).
Şekil 4. Hoechst/PI boyamanın tekrarlanabilirliği. 3-bromopyruvate (3-BP) farklı konsantrasyonlarda tedavi 24 saat sonra OCI-AML2 hücrelerinin canlılığı. (A) Hoechst 33342 boyama yoluyla sayılan toplam hücre sayısı, (B) Propidium iyodür boyama yoluyla sayılan ölü hücre sayısı. (C) Canlılık (%) (A-B)kullanılarak hesaplanır. (D) Temsili doz-yanıt grafiği. Gösterilen SEM ile ortalamadır. Üç bağımsız biyolojik kopya yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tsurc nispeten sağlam olmasına rağmen, yine de dikkatli olunmalıdır. Tazbın yanlış performansı doğruluğundan ödün verebilir. Çeşitli tehlikeye sonuçlar sorun giderme amacıyla gösterilir (Şekil 5). Görüntülerin ilk seti pi ile aşırı boyama sonuçlarını gösterir, hangi aşağıdaki kaynaklardan kaynaklanabilir: çok yüksek konsantrasyonda boya kullanarak, çok uzun süre boyama, ya da kırmızı kanalda çok yüksek LED yoğunluğu / entegrasyon süresi kullanarak(Şekil 5A). Bu hatalar, yapay olarak şişirilmiş ölü hücre sayısı oluşturur. İkinci konu ise santrifüj adımının ihmal edilmesinden kaynaklanmaktadır. Genellikle, ölü hücreler çanak yüzeyinden bağlılıklarını kaybetmeye başlar. Sonuç olarak, genellikle kuyunun dibine yakın olarak meydana gelen görüntü edinimi sırasında yeterince temsil edilemeyecektir (Şekil 5B). Son olarak, Hoechst kanalındaki aşırı pozlama yapay olarak hücrelerin boyutunu genişleterek, kuyu başına düşen toplam sayıları önemli ölçüde azaltır ve ispat gücünü sınırlar (Şekil 5C).
Şekil 5. Optimal ve alt-optimal analiz parametrelerinin karşılaştırılması. Optimize edilmiş parametreler (solda) veya en uygun un altında parametreler (sağda) ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması. (A) Sağlıklı PBMC'ler görüntülemeden önce 15 dakika boyunca 1 μg/mL (solda) veya 5 μg/mL (sağda) propidium iyodür ile boyandı. (B) OCI-AML2 hücrelerinin görüntüleri (solda) veya (sağ) plaka santrifüjsüz olarak alınır. (C) Hoechst kanalı için optimal (sol) veya aşırı (sağ) entegrasyon süresi ile elde edilen OCI-AML2 hücrelerinin görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Trypan mavi yöntemi ile fark, % | ||||
| CCCP, μM | Hoechst/PI | LDH analizi | Mtt | Alamar Mavi |
| 3.1 | -1.19 | 33.00 | -31.05 | -59.04 |
| 6.3 | 6.99 | 41.90 | -11.03 | -59.34 |
| 12.5 | 0.71 | 41.60 | 4.31 | -52.52 |
| 25 | 30.73 | 66.33 | -3.68 | -51.85 |
| 50 | 47.38 | 50.71 | -17.71 | -60.27 |
| 100 | 13.81 | 17.12 | -45.31 | -67.25 |
| Medyan | 10.40 | 41.75 | -14.37 | -59.19 |
Ek Tablo S1. CCCP tedavisinden sonra OCI-AML2 hücrelerinde tahliller bir panel için canlılık farklılıkları. CccP farklı konsantrasyonlarda tedavi 24 saat sonra canlılık değerlendirmesi yapıldı. Test edilmiş tahliller (Hoechst/PI, LDH, MTT veya alamarBlue) ile otomatik sayımlı trypan mavisi boyama arasındaki ortanca canlılık farkları her ilaç konsantrasyonundaki canlılık farklılıklarına göre hesaplanmıştır.
| Trypan mavi yöntemi ile fark, % | ||||
| 2-DG, mM | Hoechst/PI | LDH analizi | Mtt | Alamar Mavi |
| 3.1 | 16.16 | 20.77 | 5.82 | -20.27 |
| 6.3 | 22.93 | 31.96 | -11.13 | -31.11 |
| 12.5 | 30.85 | 45.07 | -34.27 | -36.29 |
| 25 | 13.81 | 42.39 | -55.79 | -52.29 |
| 50 | 16.96 | 81.12 | -29.38 | -47.68 |
| 100 | 7.79 | 149.16 | -19.37 | -28.67 |
| Medyan | 16.56 | 43.73 | -24.38 | -33.70 |
Ek Tablo S2. 2-DG tedavisinden sonra OCI-AML2 hücrelerinde tahliller paneli için canlılık farklılıkları. 2-DG farklı konsantrasyonlarda tedavi 24 saat sonra canlılık değerlendirmesi yapıldı. Test edilmiş tahliller (Hoechst/PI, LDH, MTT veya alamarBlue) ile otomatik sayımlı trypan mavisi boyama arasındaki ortanca canlılık farkları, her ilaç konsantrasyonundaki canlılık farklılıklarına göre hesaplanmıştır.
| Rotenon, μM | Canlılık farkı, % (Hoechst/PI-trypanmavisi) |
| 10 | 4.45 |
| 25 | 7.61 |
| 50 | 17.70 |
| 100 | 7.74 |
| 150 | 56.38 |
| 200 | 16.57 |
| Medyan | 12.15 |
Ek Tablo S3. Rotenon tedavisinden sonra OCI-AML2 hücrelerinde Hoechst/PI ve TB dışlama yöntemi arasındaki canlılık farkı. Farklı rotenon konsantrasyonları ile tedavinin 24 saat sonra canlılık değerlendirmesi yapıldı. Hoechst/PI ile otomatik sayım ile trippan mavisi boyama arasındaki ortanca canlılık farkı, her ilaç konsantrasyonundaki canlılık farklılıklarına göre hesaplanmıştır.
| 3-BP, μM | Canlılık farkı, % (Hoechst/PI-trypan mavisi) |
| 5 | 5.73 |
| 10 | 9.00 |
| 25 | 7.72 |
| 50 | -1.90 |
| 100 | -28.23 |
| 200 | -20.77 |
| Median | 1.91 |
Ek Tablo S4. 3-bromopyruvate (3-BP) tedavisinden sonra OCI-AML2 hücrelerinde Hoechst/PI ve TB dışlama yöntemi arasındaki canlılık farkı. 3-BP. Hoechst/PI arasındaki ortanca canlılık farkı ile tedavinin 24 saat sonra uygulanabilirlik değerlendirmesi yapıldı ve otomatik sayma ile trippan mavi boyama her ilaç konsantrasyonundaki canlılık farklılıkları na göre hesaplandı.
Ek Şekil S1. 24 saat için serumiçermeyen RPMI-1640 ortamlarında belirtilen konsantrasyonlarda rotenon tedavisi olan veya rotenone olmayan Hoechst/PI ile boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri: A-B. AML: MOLM-13 hücre hattı (A), ve birincil AML hücreleri (B) temsili bir hasta örneğinden türetilmiştir. C. MOLT-4 hücre hattı. D. CML: K562 hücre hattı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoechst/PI sitotoksisite tahkizi protokolü sağlam olmasına ve nispeten az uygulamalı zaman gerektirmesine rağmen, doğru sonuçları sağlamak için çok önemli olan birkaç deneysel ayrıntı vardır. İlk olarak, DMSO konsantrasyonunun %0,5'in (v/v) altında kaldığından emin olmak önemlidir. Genellikle DMSO bile düşük dozlarda maruz önemli ölçüde morfolojisi ve hücrelerin eki değiştirebilir ve önemli ölçüde hücre döngüsü ilerlemesini geciktirmek kabul edilir39,40.
İkinci olarak, boyama tedaviden sonra mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. Hiçbir yıkama adımları olduğundan, bileşik kuyularda kalır ve hücrelere zarar vermeye devam edebilirsiniz. Önceki protokol35ile karşılaştırıldığında, hücreler sadece 15 dakika boyunca lekeli idi. Bu, canlı hücrelerin yanlışlıkla propidium iyodür ile boyanmış olabilir olasılığını sınırlar. Bu nedenle, ikiden fazla tabak tedavi edilecekse şaşırtıcı tedaviler ve boyama öneririz. Bu plakalar arasında görüntüleme süresi sağlar ve tekrarlanabilirliği artırır.
Üçüncü olarak, uygun boya konsantrasyonu hücre tipine bağlıdır. Bir ortogonal referans olarak trippan mavi boyama kullanarak, tedavi edilmemiş hücreler ile başlayan, optimize propidium iyodür konsantrasyonu ampirik belirlemek önemlidir.
Son olarak, görselleştirmeden hemen önce santrifüj adımı da önemlidir. Bu protokole göre, 500-4.000 hücre (tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak) bir dizi kaydedilir. Bu iyi daha önce35kullanılan başına 100-400 hücreleri üzerinde önemli bir gelişmedir. Kanser hücrelerinin (özellikle birincil hücrelerin) popülasyonundaki değişim göz önüne alındığında, analiz için daha fazla hücreye sahip olmak önemlidir ve daha sağlam veri analizine olanak sağlayabilir.
Yöntemin göreceli basitliği nedeniyle, çok çeşitli değişiklikler kolayca yapılabilir. Örneğin, diğer birçok hücre impermeant boyalar satıcıların bir dizi mevcuttur ve propidium iyodür yerine olabilir. Bu ikame kendi başına nispeten daha az değere sahip olsa da, artan renk paleti daha karmaşık denemeleryapılabilir anlamına gelir. Örneğin, üçüncü bir rengin eklenmesi, akış sitometrisi ile yaygın olarak yapıldığı gibi, hücre alt popülasyonları arasında diferansiyel sağkalım ın değerlendirilmesine olanak sağlar.
Protokolün daha önemli bir değişiklik hücre görselleştirme ve yerine bir spektrofotometre kullanarak öncesinde. Bu yaklaşım ekipman neredeyse her yerde parça (bir mikroplaka okuyucu ile standart bir spektrofotometre) kullanma avantajı vardır ve veri elde etmek için en hızlı yöntemdir. Ancak, bu yöntem çok daha az doğrudur. Floresan yoğunluğu hücre boyama temsilcisidir, ancak boyama yoğunluğu stokhastik varyasyonları, nispeten daha küçük örnek alan ile birlikte, önemli değişkenlik tanıtmak. Daha fazla optimizasyon (fiksatif dahil edilmesi gibi, ek yıkama adımları, ya da örneklerin daha fazla sayıda) bu sorunları ele alabilir iken, floresan mikroskopi genellikle üstün bir yaklaşımdır.
Sonuç olarak, modifiye Hoechst /PI protokolü mitokondriyal fonksiyondan bağımsız hızlı, doğru, ucuz, yüksek iş letimatif bir sitotoksisite titrecidir. Bu tsay verimli mitokondri hedef bileşikler veya bileşik kombinasyonları tarama için önemli bir yarar vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
NVK, Kanser Araştırma bir CPRIT bilim adamı, teşekkür Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü Texas (CPRIT) onların cömert destek için, CPRIT hibe RR150044. Bu çalışma aynı zamanda Welch Vakfı Araştırma Hibe C-1930 tarafından desteklendi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R35 GM129294 tarafından NVK verildi. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
References
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12.18 (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
