Summary
El protocolo describe un ensayo rápido, de alto rendimiento, confiable, económico e imparcial para determinar eficientemente la viabilidad celular. Este ensayo es particularmente útil cuando las mitocondrias de las células han sido dañadas, lo que interfiere con otros ensayos. El ensayo utiliza el conteo automatizado de células manchadas con dos tintes nucleares: Hoechst 33342 y yoduro de propidium.
Abstract
La contribución de las mitocondrias a la transformación oncogénica es un tema de amplio interés y estudio activo. A medida que el campo del metabolismo del cáncer se vuelve más complejo, el objetivo de apuntar a las mitocondrias utilizando varios compuestos que infligen daño mitocondrial (los llamados mitocanes) se está volviendo bastante popular. Desafortunadamente, muchos ensayos de citotoxicidad existentes, como los basados en sales de tetrazolium o resazurin requieren enzimas mitocondriales funcionales para su rendimiento. El daño infligido por los compuestos que apuntan a las mitocondrias a menudo compromete la precisión de estos ensayos. Aquí, describimos un protocolo modificado basado en la tinción diferencial con dos tintes fluorescentes, uno de los cuales es permeante de células (Hoechst 33342) y el otro de los cuales no es (yoduro de propidium). La diferencia en la tinción permite discriminar las células vivas y muertas. El ensayo es susceptible de microscopía automatizada y análisis de imágenes, lo que aumenta el rendimiento y reduce el sesgo. Esto también permite que el ensayo se utilice de manera de alto rendimiento utilizando placas de 96 pozos, por lo que es una opción viable para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos, particularmente cuando los fármacos en cuestión tienen algún nivel de mitotoxicidad. Es importante destacar que los resultados obtenidos por el ensayo de tinción Hoechst/PI muestran una mayor consistencia, tanto con los resultados de exclusión azul tripano como entre réplicas biológicas cuando el ensayo se compara con otros métodos.
Introduction
El primer paso para identificar tratamientos eficaces contra el cáncer es la selección de un ensayo de citotoxicidad robusto e imparcial que se puede utilizar para examinar el efecto del tratamiento. Una opción común para experimentos de bajo rendimiento es la exclusión del tinte azul trypan de las células vivas. Este método se ve favorecido porque permite un método relativamente imparcial para cuantificar la supervivencia celular. el azul de tripano se difunde pasivamente en las células cuyas membranas están comprometidas, pero está efectivamente bloqueado para entrar en las células sanas1. El cociente de las células vivas y las células totales representa el porcentaje de viabilidad, lo que indica la eficacia del tratamiento. La desventaja más significativa del ensayo azul tripano es que es poco adecuado para metodologías de alto rendimiento. Tiene una relación señal-ruido relativamente baja y la tinción prolongada puede resultar en artefactos debido a la tinción de células viables. Por lo tanto, la exclusión azul de trypan suele ser, pero no siempre2,relegada al recuento manual. Esto hace que sea demasiado lento e introduce la fuerte posibilidad de sesgo debido al juicio subjetivo del investigador (a menos que se utilicen recuentos cegados o independientes, lo que reduce aún más el rendimiento del laboratorio). En general, el rendimiento de este ensayo es insuficiente para el descubrimiento de fármacos modernos.
Los ensayos de viabilidad, que generalmente tienen un rendimiento mucho mayor, permiten a los investigadores eludir esta limitación, pero vienen con advertencias significativas (véase el Cuadro 1). Estos métodos generalmente se dividen en dos grupos. Un grupo se compone de ensayos colorimétricos que se basan en la función de las enzimas redox celulares. Los sustratos incoloros o no fluorescentes se convierten en productos vibrantes que se pueden cuantificar mediante un espectrofotómetro. Ejemplos clásicos incluyen sales de tetrazolium (MTT, WST-1, XTT, etc.) y resazurin. Esta categoría también incluye ensayos luminiscentes que utilizan luciferina para evaluar el nivel de ATP. Los ensayos de este tipo tienen la limitación subyacente de que están midiendo el metabolismo celular, que no es la viabilidad celular per se. Es bastante común que las células se vuelvan en reposo en condiciones adversas, pero aún así conservan la capacidad de dividir3,4,5. Por ejemplo, las células madre cancerosas son a menudo relativamente metabólicamente en reposo6,7,8,9, y es probable que sean difíciles de ensayar utilizando estas técnicas. También es probable que la eficacia de los tratamientos que dañan la función mitocondrial, como la mayoría de los mitocanos, se sobreestime significativamente.
Una metodología alternativa aprovecha las propiedades químicas de varias sustancias que les permiten cruzar o no cruzar membranas biológicas. Un ejemplo son las manchas nucleares como SYTOX o yoduro propidium (PI). Esta categoría también incluye ensayos que son similares en concepto pero diferentes en función, como el ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH), que mide la liberación de LDH en el ambiente extracelular como indicador de necrosis celular (Figura 1, Tabla 1). Estos ensayos son más capaces de distinguir entre células metabólicamente inactivas y células muertas.
| Ensayo/teñido | Tipo(s) de muerte celular detectada | Equipo necesario | Características clave |
| MTT, CKK-8, Azul Alamar (resazurin) | Apoptosis/Necrosis | Espectrofotómetro | Barato, rápido; ensayo de punto final; actividad de las enzimas (exclusivamente mitocondrial en caso de MTT) y no discrimina entre los modos de muerte celular1,10 |
| Versión de LDH | Necrosis | Espectrofotómetro | Rápido, independiente de la actividad de las enzimas mitocondriales; costoso para pruebas de alto rendimiento; detecta células necróticas con membrana plasmáticacompromizada 11,12 |
| Azul Trypan (TB) | Apoptosis/Necrosis | Microscopio | Celda-impermeante; no discrimina entre los modos de muerte celular; laborioso y no adecuado para el cribado de alto rendimiento; más difícil de usar con células adherentes; propensa al juicio subjetivo del usuario, pero se considera el método estándar de medición de la viabilidad celular13 |
| Naranja acridina (AO) | Apoptosis/Necrosis/ | Microscopio de fluorescencia | Un tinte de ácido nucleico con propiedades espectrales únicas, puede distinguir entre apoptosis y necrosis/necroptosis14 |
| Necroptosis | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptosis | Microscopio de fluorescencia o citómetro de flujo | Permeable a la célula; inapropiado por sí solo para monitorear la muerte celular; útil para la co-tinción; se puede utilizar para evaluar la condensación de cromatina y la fragmentación de los núcleos en la apoptosis temprana; puede ser emparejado con yoduro propidium para distinguir la apoptosis de la necrosis15,16 |
| Yoduro de propidium (PI) | Apoptosis/Necrosis tardía | Microscopio de fluorescencia o citómetro de flujo | Intercalador de células impermeant; detecta tanto la apoptosis tardía como los modos de necrosis de la muerte celular17. Tóxico y permeable después de largos tiempos de incubación18 |
Tabla 1. Lista de ensayos de citotoxicidad. Los ensayos de citotoxicidad, algunos de los cuales se utilizaron en este estudio, enumeraron junto con la breve descripción de sus características clave.
Estudios recientes han demostrado que el metabolismo mitocondrial se altera en algunos tipos de cáncer19,20,21,22,23,24,25. Por ejemplo, se ha demostrado que las leucemias mieloides agudas (LMA) regulan su masa mitocondrial, su contenido en ADNnm y la respiración mitocondrial para satisfacer sus demandas energéticas19,26,27. Por otro lado, algunos tumores sólidos se caracterizan por una disfunción mitocondrial, o más bien "reprogramación metabólica", como la regulación descendente de las proteínas mitocondriales implicadas en OXPHOS o la disminución del contenido de ADNm, que se ha asociado con la invasividad tumoral, el potencial metastásico y la resistencia a los medicamentos inductores de apoptosis28,29. Además, recientemente, ha habido un mayor interés en el uso de compuestos mecanicísticamente diversos que afectan la función mitocondrial (generalmente llamados mitocanes30), como terapias potenciales para cánceres particulares. Estos fármacos se dirigen a la síntesis de ATP, ADN mitocondrial, OXPHOS, y la producción de ROS, así como proteínas pro-apoptóticas y anti-apoptóticas asociadas con las mitocondrias30,31. Varios estudios han demostrado que este enfoque tiene una promesa significativa19,32,33,34. Sin embargo, estas desviaciones metabólicas en la biología de las células cancerosas o los tratamientos dirigidos a las mitocondrias pueden afectar significativamente a los ensayos de viabilidad convencionales que se basan en la funcionalidad mitocondrial.
Aquí se describe un protocolo optimizado para un ensayo diferencial de tinción nuclear. El protocolo permite una determinación rápida y precisa de la citotoxicidad de los mitocanes o sus combinaciones con otros compuestos. Hoechst 33342 es un tinte nuclear permeante de células que cruza fácilmente las membranas celulares para manchar el ADN, lo que permite obtener el recuento total de células. Al co-tinción con PI, que sólo entra en los núcleos de las células muertas, la proporción de células vivas (solo Hoechst) y muertas (manchadas con ambas) se puede determinar con precisión. Este protocolo refina el ensayo publicado35 añadiendo un paso para la optimización de la concentración de tinte (mediante la referencia cruzada de resultados con el método ortogonal trypan blue) y la centrifugación de la placa antes de la toma de imágenes. Dado que muchas líneas celulares son semiadheridas o suspendidas, la centrifugación aumenta la proporción de células que se utilizan y mejora fuertemente la precisión. El ensayo tiene varias ventajas, incluyendo que la tinción no requiere la eliminación de medios o lavado. La mezcla de tinte también es económica, fácil de preparar y compatible con sistemas de pipeteo multicanal/robótico.
Después de que las células han sido manchadas, se toman imágenes con un microscopio automatizado. Esto tiene la ventaja añadida de crear un registro permanente de las imágenes que se pueden volver a analizar más adelante y los efectos de determinados compuestos se pueden reevaluar mediante la inspección visual de las imágenes capturadas. Una vez obtenidas las imágenes, las celdas se pueden contar manualmente o mediante cualquiera de los varios paquetes de software, incluyendo tanto software gratuito (por ejemplo, ImageJ, CellProfiler, etc.) como software comercial (por ejemplo, Metamorph, Gen5, etc.). El recuento automatizado de células es generalmente preferible, ya que las tuberías de recuento de células automatizadas desarrolladas correctamente son más precisas y menos sesgadas que los recuentos manuales. También ignoran de manera más efectiva los desechos celulares o los complejos insolubles. El desarrollo de estas tuberías es generalmente sencillo y se simplifica por la eficiencia de las manchas utilizadas. La salida es cuantitativa ya que el número real de celdas muertas se calcula automáticamente con respecto al número de celda total, y se pueden aplicar diferentes umbrales para aumentar o disminuir la rigurosidad de la detección35. Para mayor comodidad, se incluyen parámetros optimizados para contar celdas mediante el lector multimodo Cytation 5 Cell Imaging compatible con el software Gen5 v. 3.00.
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Protocol
1. Ensayo de citotoxicidad: Configuración
- Preparar soluciones de compuestos de interés a las concentraciones deseadas en los medios apropiados (sin suero o 1, 2,5 o 5% FBS RPMI-1640).
- Para medir la citotoxicidad de un solo compuesto (por ejemplo, para determinar dosis efectivas), prepare compuestos a 2 veces la concentración final.
- Para medir la citotoxicidad de las combinaciones de compuestos, prepare compuestos a 4x concentración final.
- Prepare controles solo con disolventes mezclando la misma cantidad de disolvente con el medio adecuado. Por ejemplo, si los compuestos de ensayo se disuelven en DMSO y metanol, realice un control solo con disolventes para cada disolvente.
- Recoger las células de un plato de cultivo o matraz en un tubo cónico de 15 ml.
- Transfiera 10 l de suspensión celular a un tubo de microcentrífuga y manche con 10 l 0,4% de color azul tripano. Utilice un hemocitociómetro para contar células viables e in viables para cada fuente celular.
- Células de pellets a 200 g durante 5 min. Aspirar o decantar sobrenadante.
- Resuspendid pellet de células en medios apropiados para el ensayo (libre de suero o 1, 2.5, 5% FBS RPMI-1640) a una densidad celular de 3*105 células/ml.
NOTA 1: La densidad celular de 3*105 células/ml proporciona una densidad de siembra de 15.000 células/pozo. La densidad de siembra es un parámetro importante e idealmente debe estar predefinida antes del experimento. La densidad de siembra debe tener en cuenta 1) tamaño de celda – por lo general, las células más grandes se siembran a una densidad más baja; 2) duración del tratamiento – las células se siembran típicamente a una densidad más baja para experimentos que durarán más tiempo; y 3) tasa de división celular – las células con una mayor tasa de división se siembran a una densidad más baja. Ejemplos específicos de densidades de siembra optimizadas: células K562, más grandes, duración de 24 horas – 10.000 células/pozo; Células MOLM-13, tamaño moderado, tratamiento de 24 h – 15.000/pozo; Células MOLM-13, tratamiento de 48 h – 8.000/pozo; pequeñas células mononucleares de sangre periférica sana (PBMC), tratamiento de 24 h – 50.000/pozo; células LMA primarias, tratamiento de 24 h – 15,000-20,000/well.
NOTA 2: La presencia de FBS en los medios puede afectar a la actividad de los compuestos. La reducción de la concentración de FBS puede hacer que los resultados del ensayo sean más fáciles de interpretar, pero también reduce la precisión fisiológica. - Semilla de 50 ml de suspensión celular desde el paso 1.5 en cada pocómo de una placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal.
- Agregue compuestos de la siguiente manera:
- Para ensayos compuestos individuales, agregue 50 l de solución compuesta 2x en cada pocól. Para los pozos de control de disolventes, añada 50 l de medios de ensayo que contengan el disolvente a la concentración de 2x.
- Para ensayos combinados, añada 25 l de cada uno de los compuestos (soluciones 4x) en cada pocól. Para pozos de control compuesto único, añada 25 l de solución compuesta de 4x y 25 ml de medio de ensayo. Para los pozos de control de disolventes, añada 50 l de medio de ensayo o medio de ensayo que contenga el disolvente.
NOTA 1: La concentración final de DMSO no debe exceder el 0,5%.
NOTA 2: Se recomienda añadir el soporte que contiene los compuestos con la pipeta tocando la pared de cada pozo debido a su bajo volumen.
- Toque suavemente la placa para asegurar la mezcla del contenido de los pozos.
- Incubar las placas a 37oC en una atmósfera humidificada de 5% deCO2 durante un tiempo adecuado, por ejemplo, 24 h.
2. Ensayo de citotoxicidad: tinción con Hoechst 33342 y yoduro propidium
- Prepare una solución de tinción 10x. Esta solución debe prepararse de nuevo antes de cada experimento, no se puede almacenar. Las concentraciones finales de tinte deben determinarse antes del experimento.
- Para las líneas celulares de la leucemia y las células de leucemia primaria, 1 ml de tampón de tinción de 10x contiene 10 l de 20 mM Hoechst 33342 y 50 l de yoduro de propidium de 1 mg/ml en PBS estéril (concentraciones finales: Hoechst 33342 20 m, PI 5 g/ml).
- Para los PBMC sanos, 1 ml de tampón de tinción de 10x contiene 10 ml de 20 mM Hoechst 33342 y 10 l de yoduro propidium de 1 mg/ml en PBS estéril (concentraciones finales: Hoechst 33342 20 m, PI 1 g/ml).
NOTA: La concentración final de yoduro propidium debe determinarse antes de los experimentos. Las células deben probarse utilizando un rango de concentraciones de PI (1, 2,5, 5 g/ml), y luego la viabilidad calculada por Hoechst/PI debe compararse con la viabilidad medida a través del azul tripano. Las concentraciones de PI enumeradas anteriormente se eligieron en función de la viabilidad de las células diana en pozos de control de medios (por encima del 90 % para las líneas celulares de leucemia, por encima del 70 % para los PBCC sanos).
ADVERTENCIA: Hoechst 33342 y yoduro propidium son potenciales carcinógenos. Use el equipo de protección personal adecuado cuando los manipule.
- Después de la incubación, utilice una pipeta multicanal para añadir 10 l de tampón de tinción 10x a cada pocól.
NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, asegúrese de que las puntas de la pipeta no toquen el soporte. - Toque suavemente la placa para mezclar y limpiar las burbujas. Mancha a 37oC durante 15 min.
- Centrifugar la placa a 200 g durante 4 min para llevar todas las células a la parte inferior de la placa. Limpie cuidadosamente la parte inferior de la placa con un kimwipe húmedo para eliminar fibras y/o desechos que interfieran con la toma de imágenes.
NOTA 1: La centrifugación de la placa garantiza las mayores posibilidades de capturar todas las celdas en la imagen. A menudo, las células muertas se desprenden y flotan, proporcionando valores engañosos de citotoxicidad. La centrifugación mitiga este efecto.
NOTA 2: La placa debe ser imagen tan rápido como sea posible después de la centrifugación, idealmente, dentro de 15 min. La centrifugación puede reducir la selectividad de la tinción de PI y puede permitir que las células acumulen lentamente yoduro de propidio. La mejora en la precisión obtenida al visualizar las células muertas supera el ligero aumento de la tinción de PI. Se recomienda terminar la toma de imágenes dentro de 1 h de centrifugación.
3. Ensayo de citotoxicidad: adquisición de datos
- Configure el software para el microscopio automatizado/imágenes de placa para detectar la fluorescencia para Hoechst 33342 (máximo de excitación 350 nm, emisión máxima 461 nm) y PI (máximo de excitación 493 nm, emisión máxima 636 nm). Adquiere imágenes para cada pozo en ambos canales.
- Usando el software (como CellProfiler, un estudio de análisis de imágenes gratuito basado en MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ o software propietario como Gen5) cuentan las celdas en cada pozo en cada canal.
NOTA: Dado que cada celda debe estar manchada con Hoechst 33342, y las células muertas deben mancharse con PI, la proporción de muertos a todos representa la fracción de células que están muertas. Por ejemplo, si el recuento automatizado en la muestra no tratada muestra 467 células manchadas con PI (células muertas) y 2335 células manchadas con Hoechst 33342 (células totales), la fracción muerta es 0,2 o 20%. Este valor se compara entonces con una muestra de tratamiento idéntico donde se utilizó el tratamiento. - Descripción detallada de la adquisición de datos Hoechst/PI utilizando Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader y el software Gen5 v. 3.00:
- Establezca el lector/imágenes de placas multimodo Cytation5 en celdas de imagen en placas de plástico negro genéricos de 96 pozos y fondo plano.
- Establezca un protocolo de imágenes para utilizar los conjuntos de filtros DAPI y Texas Red estándar. Tome imágenes en el centro del pozo usando un objetivo de aumento 4x. No utilice ningún desplazamiento (X/Y o Z). Utilice los siguientes ajustes de imagen: DAPI – LED - 10, tiempo de integración - 99, ganancia - 0; Texas Red – LED - 8, tiempo de integración - 950, ganancia - 18. Realizar el enfoque automático utilizando la señal DAPI; no debe haber ningún desplazamiento en el enfoque entre los canales.
- Realice análisis de imágenes con el software Gen5 v 3.00. En la configuración del software, defina las celdas como formas entre 5 y 25 m en su tamaño. Excluya los objetos de arista primarios y divida los objetos que se tocan activando la opción especial "Dividir objetos tocables". A continuación, procese la imagen para eliminar el fondo (resta de fondo oscuro), aplique una máscara nuclear (valor de umbral DAPI > 6000 AU) y cuente los objetos. Realice un análisis de subpoblación basado en la tinción de PI (valor umbral Texas Red > 5000 AU) y cuente los objetos. El % de viabilidad celular se define como (1 -
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Representative Results
El protocolo antes mencionado se ha desarrollado utilizando células OCI-AML2, que fueron tomadas como una línea celular representativa de la leucemia mieloide aguda. La LMA se caracteriza por una proliferación anormal de células hematopoyéticas indiferenciadas y no funcionales en la médula ósea26. A pesar de los recientes avances en la terapia dirigida a LMA, el estándar de atención ha permanecido inalterado durante varias décadas, y consiste en terapia de inducción (típicamente compuesta de tres días de antraciclina, por ejemplo, daunubicina, idarubicina, o anthracenedione mitoxanthrone, y 7 días de citorabina) seguido de consolidación (típicamente compuesta de rondas de tratamiento con citorabina seguidas de períodos de recuperación)36.
Siguiendo el protocolo descrito en la Figura 1A,las células OCI-AML2 se siembran en placas de 96 pozos y se trataron con el desacoplador mitocondrial de carbonil cianuro m-hidrozona de clorofenilo (CCCP) o el inhibidor de la glicótica 2-dexi-D-glucosa (2-DG) en un rango de concentraciones. Las células fueron tratadas durante 24 h a 37 oC en medios RPMI-1640 libres de suero, y luego se evaluó la viabilidad utilizando la exclusión de color azul tripano (TB) o uno de los cuatro ensayos de viabilidad (tinción nuclear diferencial Hoechst/PI, ensayo de liberación de LDH, MTT o alamarBlue). Las imágenes representativas de las celdas manchadas con Hoechst/PI se muestran en la Figura 2A. Se pueden hacer varias observaciones importantes inmediatamente. En primer lugar, el número total de células (tinción de Hoechst) es razonablemente alto y es notablemente mayor que el número de células muertas (tinción PI). Esto sugiere que las condiciones de los medios de comunicación no están desencadenando altas tasas de muerte celular. En segundo lugar, dado que solo las celdas que se etiquetan con Hoechst y PI se cuentan como muertas (células púrpuras en la imagen combinada), la probabilidad de contar los escombros es muy baja. Esta imagen muestra un buen ejemplo de celdas manchadas correctamente.
Figura 1. Cronología experimental y comparación de los ensayos de citotoxicidad existentes. (A) Diagrama de flujo que resume el cronograma del procedimiento experimental, por ejemplo, tinción Hoechst/PI. (B) Comparación de ensayos de citotoxicidad, algunos de los cuales se utilizaron en este estudio. Los ensayos de exclusión de tintes implican tintes nucleares impermeantes que manchan las células muertas con membrana plasmática comprometida: TB – trypan blue, PI – yoduro propidium, EtBr – bromuro de etidio y SYTOX. El segundo grupo de ensayos depende del metabolismo celular, por ejemplo, las sales de tetrazolium MTT, XTT y CKK-8 (WST-8), el reactivo a base de resazurin alamarBlue, etc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Comparación de un panel de ensayos de citotoxicidad con exclusión azul tripano. (A) Imágenes representativas del total (Hoechst 33342) y de células muertas (yoduro de propidium, PI) OCI-AML2 a través de la tinción Hoechst/PI. (B) Evaluación de la viabilidad de las células OCI-AML2 utilizando diferentes métodos después del tratamiento con un gradiente de concentraciones de PCCC(superior)o 2-DG(abajo). OCI-AML2 se trataron con PCC o 2 DG en RPMI-1640 sin suero durante 24 h antes de la determinación de la viabilidad celular. Se muestra la media, las barras de error representan SEM. C. Diferencia en la viabilidad celular entre los ensayos de citotoxicidad en (B) frente a la tinción azul tripano (ver Tablas Suplementarias S1-2 para los números exactos y la diferencia mediana). Las estrellas indican diferencias significativas frente a. tinción azul trypan. ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns – no significativo. La comparación de grupos se realizó a través de la prueba tcon corrección para pruebas de hipótesis múltiples. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como hemos informado recientemente19, las leucemias son muy sensibles a los tratamientos mitotóxicos, lo que indica que las células ya tienen daño mitocondrial subyacente. Sobre esta base, predijimos que los ensayos MTT y alamarBlue, que se basan en la actividad de la enzima mitocondrial, medirían inexactamente la viabilidad celular. Como era de esperar, estos ensayos (especialmente alamarBlue) mostraron una viabilidad significativamente menor en comparación con la exclusión azul de tripano, véase la Figura 2B,C, Tablas Suplementarias S1-S2). Esto es consistente con el hecho de que las dosis de estos compuestos necesarios para inducir apoptosis o necrosis son más altas que las necesarias para comprometer la función mitocondrial.
Entre los ensayos que se probaron, la tinción dual con Hoechst 33342 y PI tuvo la mejor combinación de robustez, sensibilidad y consistencia con la tinción de la tuberculosis, con la desviación mediana más pequeña del método de exclusión de la tuberculosis después del tratamiento CCCP o 2-DG(Tablas suplementarias S1-2). Curiosamente, a dosis más altas de CCCP (50 y 100 m) la viabilidad estimada con Hoechst/PI o TB se incrementó en comparación con dosis más bajas(Figura 2B, superior). Esto es probablemente debido a la precipitación de PCCC a dosis más altas debido a su hidrofobicidad, reduciendo su concentración efectiva y el impacto en las células. Sin embargo, el aumento de la dosis de PCCC redujo aún más la viabilidad media estimada en Hoechst/PI de las células OCI-AML2: 74% a 150 m, 62% a 200 m, 6% a 300 m(datos no mostrados).
El ensayo Hoechst/PI también fue eficaz para determinar la viabilidad celular después del tratamiento con otras moléculas dirigidas a mitocondrias. Estos incluyeron rotenona, un veneno que compromete el Complejo I de la cadena de transporte de electrones mitocondriales37, y 3-bromopyruvate, un inhibidor de la glicótica y agente alquilante que afecta la respiración mitocondrial y el metabolismo mitocondrial38 (Figura 3A-D, Tablas Suplementarias S3-4).
Figura 3. Validación del ensayo de citotoxicidad Hoechst/PI en células de leucemia. (A,B) Las células OCI-AML2 (AML) fueron tratadas con diferentes concentraciones de rotenona (A) o 3-bromopilruvato, 3-BP (B) en medios RPMI-1640 libres de suero durante 24 h, entonces se determinó la viabilidad. Se muestra la media con SEM. (C,D) Comparación de la diferencia de viabilidad entre el ensayo Hoechst/PI frente a la tinción azul de tripano (para las celdas de A-B, consulte Tablas suplementarias S3-4 para la cuantificación). Las estrellas indican significancia estadística frente a la tinción azul de tripano. ** p < 0.01, *** p < 0.001, ns – no significativo. La comparación de grupos se realizó a través de la prueba tcon corrección para pruebas de hipótesis múltiples. E. MOLM-13 (AML), células AML primarias aisladas de un paciente, MOLT-4 (ALL) y células K562 (CML) fueron tratadas con las concentraciones indicadas de rotenona en medios RPMI-1640 libres de suero durante 24 h, antes de la determinación de viabilidad utilizando la tinción Hoechst/PI. Se muestra significa con SEM. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El ensayo de citotoxicidad Hoechst/PI se validó aún más utilizando un panel de líneas celulares de leucemia que representan múltiples tipos de leucemia, así como células primarias. Incluyeron MOLM-13 (una línea celular de LMA), células LMA primarias derivadas de una muestra de paciente representativa, MOLT-4 (una línea celular aguda de leucemia linfoblástica, ALL), y K562 (una línea celular de leucemia mielógena crónica, LMC) (Figura 3E, Figura suplementaria S1). Los resultados del ensayo Hoechst/PI mostraron que estas células tenían profundas diferencias en la sensibilidad a la rotenona, que van desde células muy sensibles (MOLT-4) hasta células resistentes (K562).
Para demostrar la solidez del ensayo, las células OCI-AML2 fueron tratadas con un gradiente de concentración de 3-bromopyruvato, como se describe en el protocolo anterior. Los recuentos de células se recogieron para 6 pozos en cada concentración y se muestran(Figura 4A,B). Estos recuentos se utilizaron para calcular la viabilidad, y mostraron que tan pocos como 4 pozos eran suficientes para capturar con precisión el resultado del ensayo (Figura 4C). Se muestra la curva de dosis-respuesta resultante (Figura 4D).
Figura 4. Reproducibilidad de la tinción Hoechst/PI. Viabilidad de las células OCI-AML2 después de 24 horas de tratamiento con diferentes concentraciones de 3-bromopyruvato (3-BP). (A) Número total de células contadas a través de la tinción Hoechst 33342, (B) Número de células muertas contadas a través de la tinción de yoduro propidium. (C) Viabilidad (%) calculado utilizando (A-B). (D) Gráfico representativo de dosis-respuesta. Se muestra significa con SEM. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aunque el ensayo es relativamente robusto, aún se debe tener cuidado. El rendimiento incorrecto del ensayo puede comprometer su precisión. Varios resultados comprometidos se muestran para solucionar problemas(Figura 5). El primer conjunto de imágenes muestra las consecuencias de la sobremanación con PI, que puede surgir de las siguientes fuentes: el uso del tinte a una concentración demasiado alta, la tinción durante demasiado tiempo, o el uso de una intensidad/tiempo de integración LED demasiado alto en el canal rojo (Figura 5A). Estos errores generarán un número artificialmente inflado de células muertas. El segundo problema surge de descuidar el paso de centrifugación. A menudo, las células muertas comienzan a perder su apego de la superficie del plato. Por lo tanto, estarán subrepresentados durante la adquisición de imágenes, que generalmente ocurre cerca de la parte inferior del pozo (Figura 5B). Por último, la sobreexposición en el canal Hoechst amplía artificialmente el tamaño de las células, reduciendo significativamente los recuentos totales por pozo y limitando la potencia del ensayo (Figura 5C).
Figura 5. Comparación de parámetros de ensayo óptimos y subópticos. Comparación de resultados adquiridos a través de parámetros optimizados (izquierda) o parámetros subóptimo (derecha). (A) Los PBMC sanos se tiñeron con yoduro de propidio a 1 g/ml (izquierda) o a 5 g/ml (derecha) durante 15 minutos antes de la toma de imágenes. (B) Imágenes de células OCI-AML2 tomadas con (izquierda) o sin centrifugación de placa (derecha). (C) Imágenes de células OCI-AML2 adquiridas con un tiempo de integración óptimo (izquierda) o excesivo (derecha) para el canal Hoechst. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Diferencia con el método azul tripano, % | ||||
| CCCP, | Hoechst/PI | Ensayo LDH | Mtt | Alamar Blue |
| 3.1 | -1.19 | 33.00 | -31.05 | -59.04 |
| 6.3 | 6.99 | 41.90 | -11.03 | -59.34 |
| 12.5 | 0.71 | 41.60 | 4.31 | -52.52 |
| 25 | 30.73 | 66.33 | -3.68 | -51.85 |
| 50 | 47.38 | 50.71 | -17.71 | -60.27 |
| 100 | 13.81 | 17.12 | -45.31 | -67.25 |
| Mediana | 10.40 | 41.75 | -14.37 | -59.19 |
Tabla complementaria S1. Diferencias de viabilidad para un panel de ensayos en células OCI-AML2 después del tratamiento con PCCC. La evaluación de la viabilidad se realizó después de 24 horas de tratamiento con diferentes concentraciones de PCCC. Las diferencias medianas de viabilidad entre los ensayos probados (Hoechst/PI, LDH, MTT o alamarBlue) y la tinción azul de tripano con con recuento automatizado se calcularon sobre la base de las diferencias de viabilidad en cada concentración de fármaco.
| Diferencia con el método azul tripano, % | ||||
| 2-DG, mM | Hoechst/PI | Ensayo LDH | Mtt | Alamar Blue |
| 3.1 | 16.16 | 20.77 | 5.82 | -20.27 |
| 6.3 | 22.93 | 31.96 | -11.13 | -31.11 |
| 12.5 | 30.85 | 45.07 | -34.27 | -36.29 |
| 25 | 13.81 | 42.39 | -55.79 | -52.29 |
| 50 | 16.96 | 81.12 | -29.38 | -47.68 |
| 100 | 7.79 | 149.16 | -19.37 | -28.67 |
| Mediana | 16.56 | 43.73 | -24.38 | -33.70 |
Tabla complementaria S2. Diferencias de viabilidad para un panel de ensayos en células OCI-AML2 después del tratamiento con 2-DG. La evaluación de la viabilidad se realizó después de 24 horas de tratamiento con diferentes concentraciones de 2-DG. Las diferencias medianas de viabilidad entre los ensayos probados (Hoechst/PI, LDH, MTT o alamarBlue) y las tinciones azules de tripano con con recuento automatizado se calcularon sobre la base de las diferencias de viabilidad en cada concentración de fármaco.
| Rotenone, M | Diferencia de viabilidad, % (Hoechst/PI-trypan blue) |
| 10 | 4.45 |
| 25 | 7.61 |
| 50 | 17.70 |
| 100 | 7.74 |
| 150 | 56.38 |
| 200 | 16.57 |
| Mediana | 12.15 |
Tabla complementaria S3. Diferencia de viabilidad entre Hoechst/PI y el método de exclusión de la tuberculosis en células OCI-AML2 después del tratamiento con rotenona. La evaluación de la viabilidad se realizó después de 24 horas de tratamiento con diferentes concentraciones de rotenona. La mediana de la viabilidad entre la tinción de Hoechst/PI y la tinción azul tripano con con recuento automatizado se calculó sobre la base de las diferencias de viabilidad en cada concentración de fármaco.
| 3-BP, M | Diferencia de viabilidad, % (Hoechst/PI-trypan blue) |
| 5 | 5.73 |
| 10 | 9.00 |
| 25 | 7.72 |
| 50 | -1.90 |
| 100 | -28.23 |
| 200 | -20.77 |
| Median | 1.91 |
Tabla suplementaria S4. Diferencia de viabilidad entre Hoechst/PI y el método de exclusión de la tuberculosis en células OCI-AML2 después del tratamiento con 3-bromopyruvato (3-BP). La evaluación de la viabilidad se realizó después de 24 horas de tratamiento con diferentes concentraciones de 3-BP. La mediana de la viabilidad entre Hoechst/PI y la tinción azul de tripano con conteo automatizado se calculó sobre la base de las diferencias de viabilidad en cada concentración de fármaco.
Figura suplementaria S1. Imágenes representativas de células manchadas con Hoechst/PI, con o sin tratamiento con rotenona a concentraciones indicadas en medios RPMI-1640 libres de suero durante 24 h: A-B. AML: línea celular MOLM-13(A) y células AML primarias (B) derivadas de una muestra de paciente representativa. C. TODO: Línea celular MOLT-4. D. CML: Línea celular K562. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aunque el protocolo para el ensayo de citotoxicidad Hoechst/PI es robusto y requiere relativamente poco tiempo práctico, hay varios detalles experimentales que son muy importantes para garantizar resultados precisos. En primer lugar, es esencial asegurarse de que la concentración de DMSO se mantenga por debajo del 0,5% (v/v). Generalmente se acuerda que la exposición a dosis incluso bajas de DMSO puede alterar sustancialmente la morfología y la unión de las células y retrasar significativamente la progresión del ciclo celular39,40.
En segundo lugar, la tinción debe realizarse tan pronto como sea posible después del tratamiento. Puesto que no hay pasos de lavado, el compuesto permanece en los pozos y puede seguir infligiendo daño a las células. En comparación con el protocolo anterior35,las células se mancharon durante sólo 15 minutos. Esto limita la posibilidad de que las células viables puedan ser manchadas inadvertidamente con yoduro propidium. Por esta razón, sugerimos tratamientos asombrosos y manchas si se tratarán más de dos placas. Esto permite el tiempo de imagen entre placas y mejora la reproducibilidad.
En tercer lugar, la concentración adecuada del tinte depende del tipo de célula. Es importante determinar empíricamente la concentración optimizada de yoduro propidium, comenzando con células no tratadas, utilizando la tinción azul de tripano como referencia ortogonal.
Por último, el paso de centrifugación inmediatamente antes de la visualización también es crítico. Según este protocolo, se registra un rango de 500-4.000 células (dependiendo de la densidad de siembra). Esta es una mejora notable con respecto a las 100-400 células por pozo utilizado anteriormente35. Teniendo en cuenta la variación en la población de células cancerosas (especialmente las células primarias), tener más células para el análisis es importante, y puede permitir un análisis de datos más robusto.
Debido a la relativa simplicidad del método, una amplia variedad de modificaciones se pueden realizar fácilmente. Por ejemplo, muchos otros tintes de celulosa-impermeant están disponibles de un número de proveedores y se pueden sustituir por yoduro propidium. Aunque esta sustitución tiene relativamente poco valor por sí sola, la paleta aumentada de colores significa que se pueden realizar experimentos más complejos. Por ejemplo, la adición de un tercer color permitirá evaluar la supervivencia diferencial entre subpoblaciones de células, como se suele realizar con citometría de flujo.
Una modificación más sustancial del protocolo es renunciar a la visualización celular y el uso de un espectrofotómetro en su lugar. Este enfoque tiene la ventaja de utilizar un equipo casi ubicuo (un espectrofotómetro estándar con un lector de microplacas) y es el método más rápido para adquirir datos. Sin embargo, este método es mucho menos preciso. La intensidad de la fluorescencia es representativa de la tinción celular, pero las variaciones estocásticas en la intensidad de la tinción, combinadas con el área de muestra relativamente más pequeña, introducen una variabilidad significativa. Si bien la optimización adicional (como la inclusión de un fijador, pasos de lavado adicionales o un mayor número de muestras) puede abordar estos problemas, la microscopía de fluorescencia es generalmente un enfoque superior.
En conclusión, el protocolo Hoechst/PI modificado es un ensayo de citotoxicidad rápido, preciso, económico y de alto rendimiento que es independiente de la función mitocondrial. Este ensayo tiene una utilidad sustancial para la detección eficiente de compuestos o combinaciones compuestas que se dirigen a las mitocondrias.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
NVK, un estudiante de CPRIT en Investigación del Cáncer, agradece al Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (CPRIT) por su generoso apoyo, la subvención CPRIT RR150044. Este trabajo también fue apoyado por la Beca de Investigación C-1930 de la Fundación Welch, y por los Institutos Nacionales de Salud R35 GM129294 otorgados a NVK. Los financiadores no tenían ningún papel en el diseño de estudios, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
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