Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Published: July 16, 2020 doi: 10.3791/61298
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

Summary

هنا هو بروتوكول لتحديد الدولة القلة من البروتينات الغشاء الذي يستخدم نظام غشاء الخلايا الأصلية نانو جسيمات بالاقتران مع المجهر الإلكتروني.

Abstract

التفاعلات البروتينية البروتينية في أنظمة غشاء الخلية تلعب أدواراً حاسمة في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية - من التفاعلات بين الخلايا إلى الخلية إلى تحويل الإشارة؛ من استشعار الإشارات البيئية إلى الاستجابة البيولوجية؛ من تنظيم التمثيل الغذائي إلى التحكم في النمو. إن المعلومات الهيكلية الدقيقة للتفاعلات البروتينية البروتينية أمر حاسم لفهم الآليات الجزيئية لمجمعات البروتينات الغشائية وتصميم جزيئات محددة للغاية لتعديل هذه البروتينات. وقد تم تطوير العديد من في الحي وفي المختبر النهج للكشف عن وتحليل التفاعلات البروتين البروتين. ومن بينها نهج البيولوجيا الهيكلية هي فريدة من نوعها من حيث أنه يمكن أن توفر معلومات هيكلية مباشرة من البروتين البروتين التفاعلات على المستوى الذري. ومع ذلك، لا يزال الغشاء الحالي البيولوجيا الهيكلية البروتين تقتصر إلى حد كبير على الأساليب القائمة على المنظفات. العيب الرئيسي للطرق القائمة على المنظفات هو أنها غالبا ما تتفكك أو تجزئة مجمعات البروتين غشاء مرة واحدة يتم إزالة البيئة ثنائية الطبقة الدهون الأصلية من قبل جزيئات المنظفات. لقد تم تطوير نظام جسيمات نانوية غشاء الخلية المحلية للغشاء البيولوجيا الهيكلية البروتين. هنا، ونحن نثبت استخدام هذا النظام في تحليل التفاعلات البروتين البروتين على غشاء الخلية مع دراسة حالة من الدولة القلة من AcrB.

Introduction

تلعب التفاعلات البروتينية (PPI) أدوارًا محورية في جميع أنحاء علم الأحياء ، من الحفاظ على بنية ووظيفة البروتينات إلى تنظيم الأنظمة بأكملها. تأتي مؤشرات أسعار المنتجين في أشكال مختلفة ويمكن تصنيفها استنادًا إلى أنواع التفاعلات التي تشكلها. أحد هذه التصنيفات هو هو homooligomeric أو هيترووليجومي، على أساس ما إذا كانت التفاعلات بين الوحدات الفرعية متطابقة أو بروتينات مختلفة تعمل كمكونات فرعية. ويستند تصنيف آخر على قوة التفاعل إذا كانت التفاعلات تؤدي إلى تشكيل مجمعات مستقرة أو حالات معقدة عابرة. المعلومات الهيكلية حول PPIs بين البروتينات أمر بالغ الأهمية في فهم الآلية التي البروتينات تنفيذ وظيفتها. وقد قدر أن أكثر من 80٪ من البروتينات تعتمد على تشكيل معقد من أجل القيام بأدوارهم الوظيفية1. وبالنظر إلى النسبة المئوية للبروتينات التي لوحظت أنها تعتمد على مؤشرات أسعار المنتجين من أجل الأداء الفطري السليم، فإن أهميتها في علم الأحياء واضحة بسهولة، ومع ذلك فإن القدرة على التحقيق بشكل صحيح في البروتينات التي تشارك في هذه التفاعلات ظلت صعبة بسبب القيود في التقنيات المتاحة لمراقبة تجريبية عندما تشكل البروتينات مؤشرات أسعار المنتجين.

هناك درجة عالية من الاختلاف بين النتائج للعديد من PPIs محددة تجريبيا بسبب كمية عالية من الضوضاء ، والإيجابيات الكاذبة ، والسلبيات الكاذبة التي هي مستمدة من العديد من التقنيات المتاحة حاليا تحديد مؤشر أسعار المنتجين. هذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للخميرة اثنين الهجين (Y2H) النظام ، جنبا إلى جنب تقارب تنقية الطيف الكتلي (TAP - MS) ، ونقل الطاقة الرنين الفلوري (فريت) ، والتي تمثل ثلاثة من الأساليب الأكثر استخداما لتحديد PPI2،3،4،5،6،7. وبالمقارنة، يمكن استخدام تقنيات البيولوجيا البنيوية للبروتين، مثل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والتصوير البلوري بالأشعة السينية والمجهر الإلكتروني (EM)، للحصول على معلومات هيكلية عالية الدقة حول تفاعلات البروتين والبروتين وصولاً إلى المستوى الذري والسماح بالتأكد البصري المباشر من التفاعلات التي تحدث لبروتين ذي فائدة مستهدفة. جميع المتاحة حاليا غير هيكل أساس PPI تحديد تقنيات البحث (على سبيل المثال، Y2H، TAP-MS، وFRET) تفتقر إلى هذه القدرة، ويعانون بالإضافة إلى ذلك من صعوبة في تحديد التفاعلات الضعيفة والعابرة بين البروتينات5. وتتعزز هذه النقائص عند دراسة البروتينات الغشاء بسبب التعقيد الإضافي الناجم عن المتغير الإضافي للبيئة الدهنية التي تؤثر على تشكيل الهيكل الرباعي السليم والتجميع المعقد غير الستيري.

تشكل بروتينات الأغشية جزءًا كبيرًا من البروتيوم ومن المعروف أنها تلعب العديد من الأدوار الحاسمة في عمل الخلايا السليمة داخل جميع الكائنات الحية. على الرغم من أن البروتينات الغشاء تقدر لتشكل 27٪ من الجينوم البشري وتشكل ~ 60٪ من جميع أهداف المخدرات الحالية هناك شذوذ كبير في عدد النماذج حلها للبروتينات الغشاء التي تشكل فقط ~ 2.2٪ من جميع الهياكل البروتينية المنشورة8،9،10. السبب الرئيسي للتباين في توافر المعلومات الهيكلية يكمن في الخصائص الجوهرية للبروتينات الغشاء أنفسهم. بسبب ضعف الذوبان، والاعتماد على التفاعلات مع بيئة الدهون للحفاظ على بنية ووظيفة الأم، والخصائص الفيزيائية الكيميائية المختلفة للغشاء الدهني نفسه، لا تزال البروتينات الغشاء يمثل مشكلة كبيرة عند تنفيذ تقنيات البيولوجيا الهيكلية لدراستها. من هذه الخصائص الجوهرية، أهم للحصول على معلومات هيكلية دقيقة هو شرط وجود تفاعلات مع البيئة الطبيعية للدهون بالنسبة لهم للحفاظ على هيكلها الأصلي ووظيفتها. البيئة الدهنية مثل هذا جزء لا يتجزأ من هيكل ووظيفة البروتينات الغشاء أن مفهوم memtein (مزيج من الكلمات غشاء والبروتين) وقد اقترح كوحدة أساسية من هيكل غشاء البروتين وظيفة11. على الرغم من أهمية التفاعلات البروتين الدهني المتوفرة حاليا على أساس هيكل PPI تقنيات تحديد غالبا ما تتطلب أن البروتينات التي يجري دراستها تكون قابلة للذوبان أو أن solubilized مع المنظفات. التعرض للمنظفات القاسية يمكن أن تشوه البروتينات أو تسبب ايجابيات وسلبيات كاذبة بسبب إزالة الليببيديشن، والتي يمكن أن تحفز التجميع، denaturation البروتين، تفكك التفاعلات غير التكافؤ، وتشكيل الدول القلوية الاصطناعية. نظرا لضرورة الحفاظ على بيئة الدهون الطبيعية لتحديد دقيق للدولة oligomeric الأصلي من البروتينات الغشاء وضعنا نظام جسيمات نانوية غشاء الخلايا الأصلية (NCMNs)12 استنادا إلى ذكر سابقا الستيرين حمض الجزيئات الدهنية (SMALP)13 طريقة.

SMALP يستخدم الستيرين حمض البيلومير حمض المالويك كما البوليمر غشاء نشط لاستخراج و solubilize البروتينات الغشاء. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) هو بوليمر أمفيفيلي فريد بسبب مويت الستيرين الماعور ويعارض تماماً حمض ماليك هيدروفيلي. وهو يشكل الجسيمات النانوية عن طريق التمصاص ، وزعزعة الاستقرار ، وتعطيل غشاء الخلية في آلية تعتمد على الأسى والh14. هذا النشاط الوظيفي من SMA هو ما يسمح لها أن تستخدم كنظام خال من المنظفات لاستخراج البروتين غشاء و solubilization. يتميز نظام NCMN عن نظام SMALP في عدة جوانب. الميزة الأكثر فريدة من نوعها من نظام NCMN هو أن لديها مكتبة البوليمر غشاء نشط مع العديد من البوليمرات التي لها خصائص فريدة من نوعها التي تجعلها مناسبة لعزل العديد من البروتينات الغشاء المختلفة التي تتطلب ظروف مختلفة للاستقرار والأداء الأصلي. كما أن نظام NCMN لديه بروتوكولات مختلفة مقارنة بطريقة SMALP عندما يتعلق الأمر بإعداد الجسيمات النانوية. ومن الأمثلة على ذلك أن الناصحات الوطنية للنقان تستخدم تنقية عمود تقارب النيكل أحادي الخطي لتحديد الهيكل عالي الدقة؛ ويمكن ملاحظة تأثير هذه البروتوكولات المختلفة عند مقارنة بروتوكول NCMNs ، الذي ولدت 3.2 و 3.0 Å Å كريو - م AcrB الهياكل ، مع دراسة مماثلة باستخدام طريقة SMALP ، مما أدى إلى هيكل 12 15 Åالقرار. هذه السمات الفريدة لنظام NCMN هي التحسينات التي أدخلت على طريقة SMALP التي تم إنشاؤها سابقاً وتجعلها مرشحًا مثاليًا لدراسة مؤشرات أسعار المنتجين.

و متعدد المخدرات efflux الناقل AcrB موجود كما homotrimer وظيفية في E. القولونية12. واقترح تحليل مطفرة أن طفرة نقطة P223G واحدة، وتقع على حلقة التي هي المسؤولة عن استقرار تريم AcrB، يزعزع استقرار حالة الثلث ويسفر عن مونومر AcrB عند إعدادها مع المنظفات DDM، والتي يمكن الكشف عنها مع الجيل الأزرق الأصلي الكهربائي16. ومع ذلك ، فإن تحليل FRET من AcrB - P223G متحولة اقترح أنه عندما في الخلية الأصلية غشاء الدهون bilayer البيئة ، وغالبية متحولة AcrB - P223G لا تزال موجودة كما تريم وأن مستويات التعبير عن كل من نوع البرية AcrB و AcrB - P223G متشابهة. ومع ذلك، وعلى الرغم من نتائج تحليل فريت، أظهرت مقايسة نشاط النقل متحولة أن النشاط انخفض بشكل كبير بالمقارنة مع نوع البرية16. على الرغم من أن تكنولوجيا فريت قد استخدمت شعبيا لتحليل البروتين البروتين التفاعلات, وقد أظهرت الأبحاث أنه يمكن أن تعطي في كثير من الأحيان ايجابيات كاذبة17,18,19,20.

في الآونة الأخيرة، تم تحديد عالية الدقة هياكل cryo-EM من تريمر AcrB الذي أظهر التفاعل مع AcrB مع غشاء الخلية الأصلية المرتبطة بها bilayer الدهون من خلال استخدام NCMNs12. من حيث المبدأ، يمكن بسهولة استخدام الـ NCMNs لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين الموجودة على غشاء الخلية الأصلية. في اختبار لهذا النظام، أجريت تجارب لمراقبة حالة القلة في AcrB-P223G مباشرة باستخدام الجسيمات النانوية لغشاء الخلايا الأصلية والمجهر الإلكتروني السلبي الملطخ. من أجل مقارنة مع نوع البرية AcrB الجسيمات النانوية، استخدمنا نفس البوليمر النشط غشاء (SMA2000 المحرز في مختبرنا، والتي يتم فهرستها كما NCMNP1-1 في مكتبة NCMN) تستخدم لتحديد هيكل عالي الدقة كريو EM من AcrB والبوليمرات البديلة الموجودة في مكتبة NCMNs12. استنادا إلى النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا، كان من المتوقع أن غالبية متحولة AcrB-P223G موجودة في شكل جسيمات نانوية غشاء الخلايا الأصلية ثلاثية الكرسية21. ومع ذلك، لم يتم العثور على أي تقليم AcrB موجودة في العينة، مثل تلك التي لوحظت مع نوع البرية AcrB. وهذا يشير إلى أن غالبية AcrB-P223G لا تشكل تقليم على غشاء الخلية الأصلية كما اقترح سابقا.

هنا نبلغ عن تحليل مفصل لـ E. coli AcrB-P223G في مقارنة مع النوع البري E. القولونية AcrB باستخدام NCMNs. هذه الدراسة الحالة من AcrB تشير إلى أن الـ NCMNs هو نظام جيد لتحليل التفاعل بين البروتين والبروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تعبير البروتين

  1. تلقيح 15 مل من رائع مرق (السل) وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية المحددة لbsmids مع BL21 (DE3) pLysS الخلايا التي تحتوي على AcrB التعبير عن plasmids في 50 مل أنابيب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة.
  2. تحقق من الكثافة البصرية للثقافة بين عشية وضحاها في 600 نانومتر (OD600) وتأكد من أن أكثر من 2.0.
  3. تمييع 5 مل من خلية الثقافة في 1 L من وسائل الإعلام السل التي تحتوي على المضادات الحيوية محددة لplsmids واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز حتى OD600= 0.8 ثم حث مع IPTG التي لديها تركيز النهائي من 1 mM.
  4. تنفيذ التعريفي في 20 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة 20 ساعة.
  5. بيليه أسفل الخلايا باستخدام الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية و 4000 س ز.

2. تحلل الخلايا وعزل الغشاء

  1. Resuspend بيليه الخلية في العازلة A(الجدول 1، استخدم DDM العازلة A أو NCMNs العازلة اعتمادا على نظام تنقية الذي هو لمتابعة) باستخدام 80 مل لكل 20 غرام من بيليه الخلية.
  2. التجانس الكريات الخلية resuspended باستخدام التجانس Dounce الزجاج في 4 درجة مئوية أو إذا كان في درجة حرارة الغرفة تأكد من وضع على الجليد مباشرة بعد.
  3. نقل العينة إلى كقار معدني على الجليد وفك الخلايا عن طريق تحميلها في التجانس الضغط العالي في 4 درجة مئوية و 1500 بار.
    1. كرر عملية تحميل الخلايا في المهيج والسماح لهم بالمرور من خلال التجانس لدورات 3-4 أو حتى يبدأ lysate في التوضيح.
  4. الطرد المركزي في 15،000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 °C.
  5. جمع supernatant وتحميل في أنابيب الطرد الفائقة والطرد المركزي في 215000 × ز ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
  6. تجاهل supernatant وجمع الكريات الغشاء من أنابيب فائقة التركيز. تخزين أي بيليه غشاء الزائدة في -80 درجة مئوية.

3. إعداد الجسيمات النانوية غشاء الخلية الأصلية

  1. Resuspend 1 غرام من بيليه غشاء في 10 مل NCMNs العازلة A(الجدول 1).
  2. التجانس عينة غشاء الخلية resuspended مع التجانس Dounce الزجاج في 20 درجة مئوية.
  3. نقل عينة الغشاء المعلق إلى أنبوب البولي بروبلين 50 مل وإضافة غشاء البوليمرات النشطة حل الأسهم إضافية NCMNs العازلة A لتحقيق التركيز النهائي من 2.5٪ (ث / الخامس) غشاء البوليمر النشط (NCMNP1-1 أو NCMNP5-2).
    ملاحظة: يجب أن يتم إجراء حلول المخزون من البوليمرات النشطة الغشاء في الماء المقطر المزدوج ويمكن الاحتفاظ بها بتركيزات مختلفة، ولكن عادة 10٪ (ث / الخامس).
  4. هز العينة لمدة 2 ساعة في 20 درجة مئوية.
  5. قم بتحميل العينة إلى طارد فائق التركيز وتدور عند 150,000 x غم مقابل 1 ساعة عند 20 درجة مئوية.
  6. في حين يجري العينة فائقة الطرد تبدأ في اكويات عمود 5 مل ني NTA مع 25 مل من NCMNs العازلة A.
  7. جمع سوبراتين بعد الطرد الفائق اكتمال وتحميله على 5 مل من العمود NI-NTA في درجة حرارة الغرفة مع معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة باستخدام مضخة حقنة.
  8. غسل البروتين السائل الكروماتوغرافيا (FPLC) خطوط مع ما يكفي NCMNs المخزن المؤقت B(الجدول 1)لطرد النظام تماما ومن ثم ربط العمود إلى الجهاز FPLC.
  9. غسل العمود مع 30 مل من NCMNs المخزن المؤقت B مع معدل تدفق 1 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال.
  10. غسل العمود مع 30 مل من NCMNs العازلة C(الجدول 1) مع معدل تدفق 1 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال.
  11. Elute البروتين مع 20 مل من NCMNs العازلة D(الجدول 1)بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة وجمع العينة باستخدام جامع كسر والكسور التي يتم تعيين كل إلى 1.0 مل.
  12. تخزين عينات البروتين في 4 درجة مئوية.
  13. تشغيل مقايسة كهرباء هلام SDS-PAGE من أجل التحقق من العينات التي تتوافق مع القمم التي لوحظت على الرسم البياني FPLC elution.

4. SDS-PAGE هلام الكهرباء

  1. إعداد غرفة الصب عن طريق لقط الزجاج إلى جهاز الصب.
  2. إعداد هلام الفصل بنسبة 12٪ وفقا للوصفة المذكورة في الجدول 1.
    ملاحظة: مرة واحدة يتم إضافة TEMED سوف هلام البلمرة بسرعة حتى أضيف هذا مرة واحدة فقط على استعداد لصب الجل.
  3. صب الجل، وترك 2 سم تحت الجزء السفلي من المشط لجل التراص.
  4. إزالة أي فقاعات عن طريق طبقات الجزء العلوي من هلام مع isopropanol 100٪ وانتظر هلام الفصل البلمرة.
  5. إزالة الايزوبروبانول وغسل أي آثار من ايزوبروبانول مع الماء المقطر.
  6. إعداد هلام التراص وفقا لوصفة المذكورة في الجدول 1.
    ملاحظة: مرة واحدة يتم إضافة TEMED سوف هلام البلمرة بسرعة حتى أضيف هذا مرة واحدة فقط على استعداد لصب الجل.
  7. صب هلام التراص على رأس هلام الفصل.
  8. إضافة مشط إلى الغرفة لتشكيل الآبار والانتظار لجل التراص البلمرة تماما.
  9. مكان 1 ميكرولتر من 1 M DTT في أنبوب microcentrifuge لكل عينة الكسر التي تحتاج إلى أن يتم تشغيلها على الجل.
  10. إضافة 7 ميكرولتر من 4x تحميل العازلة لكل أنبوب كذلك.
  11. إضافة 20 ميكرولتر من عينة من الكسور التي تحتاج إلى أن يتم تشغيلها على هلام إلى كل أنبوب microcentrifuge.
  12. دوامة الأنابيب التي تحتوي على العينات.
  13. تدور أسفل أنابيب العينة باستخدام الطاولة microcentuge لمدة 3 ق وتأكد من أن جميع العينة قد عاد إلى أسفل الأنابيب.
  14. تحضير الخلية الكهربائية هلام عن طريق تأمين 12٪ الكاسيت هلام polyacrylamide في مكان وملء الغرف الداخلية والخارجية للخلية مع تريس-خلات-EDTA (تاي) العازلة(الجدول 1).
  15. قم بتحميل علامة الوزن الجزيئي في الممر الأول من الجل مع الحجم المناسب المطلوب من خلال تعليماته.
  16. تحميل 28 ميكرولتر من العينة من كل أنبوب مختلطة مع DTT وتحميل العازلة.
  17. ضع غطاء الخلية الكهربائية فوق الصندوق وقم بتوصيل الغطاء بمزود الطاقة.
  18. بدوره على امدادات الطاقة وتعيينه إلى 100 V والسماح لها لتشغيل لمدة 20 دقيقة.
  19. بعد 20 دقيقة، وزيادة التيار امدادات الطاقة إلى 140 V والاستمرار في تشغيله لآخر 30-40 دقيقة أو حتى الفرقة من صبغة العازلة تحميل تصل إلى الجزء السفلي من الكاسيت هلام.
  20. بعد الانتهاء من تشويه البقعة و de-stain الجل لتصور عصابات البروتين الواردة داخل الجل.

5. تنقية البروتين باستخدام DDM

ملاحظة: الغرض من تنفيذ عملية التنقية هذه هو أن تكون بمثابة عنصر تحكم للتجارب باستخدام البوليمرات النشطة الغشاء.

  1. Resuspend 6-10 غرام من بيليه غشاء، من الخطوة 2.6، في DDM العازلة(الجدول 1)باستخدام 5 مل / غرام من بيليه غشاء.
  2. التجانس العينة resuspended مع التجانس Dounce الزجاج في 4 درجة مئوية أو إذا كان في درجة حرارة الغرفة تأكد من وضع على الجليد مباشرة بعد.
  3. نقل عينة إلى 50 مل من أنبوب البولي بروبلين وإضافة DDM وDDM إضافية العازلة A لتحقيق العينة إلى تركيز النهائي من 2٪ DDM.
  4. هز العينة لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.
  5. تحميل العينة في أنابيب الطرد الفائق والطرد المركزي لمدة 1 ساعة في 4 °C و 150،000 x ز.
  6. بينما يتم تشغيل نموذج الطرد المركزي فائقة لإعداد 5 مل من العمود ني NTA عن طريق غسل مع 25 مل من DDM العازلة A(الجدول 1).
  7. بعد اكتمال الطرد الفائق، وجمع المغرور وتحميله على العمود 5 مل ني NTA في 4 درجة مئوية مع معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة باستخدام مضخة حقنة.
  8. غسل خطوط FPLC مع ما يكفي من DDM المخزن المؤقت ب + 0.05٪ DDM(الجدول 1)لمسح النظام تماما ثم إرفاق العمود إلى الجهاز FPLC.
  9. غسل العمود مع 30 مل من DDM العازلة ب + 0.05٪ DDM مع معدل تدفق 1 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال.
  10. غسل العمود مع 30 مل من DDM العازلة C + 0.05٪ DDM(الجدول 1)مع معدل تدفق 1 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال.
  11. Elute البروتين مع 20 مل من DDM العازلة D + 0.05٪ DDM(الجدول 1)بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال استخدام جامع كسر والكسور التي يتم تعيين كل إلى 1.0 مل.
  12. حدد الكسور التي تحتوي على ذروة elution لتجميع والتركيز باستخدام تركيز الطرد المركزي والطرد المركزي في 4000 × ز و 4 درجة مئوية حتى تصل إلى 500 ميكرولتر.
  13. باستخدام حلقة 500 μL تحميل العينة في الجهاز FPLC ومن ثم على حجم 25 مل عمود الاستبعاد في 4 درجة مئوية. Elute باستخدام 30 مل من DDM العازلة E + 0.05٪ DDM(الجدول 1)بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة وجمع ككسور مع أحجام الكسور تعيين إلى أن تكون 0.5 مل لكل كسر.
  14. خذ الكسور و قم بقياس تركيز البروتين باستخدام امتصاص 280 نانومتر لتأكيد منحنى الأشعة فوق البنفسجية-فيس من الرسم البياني FPLC elution.
  15. جمع 20 ميكرولتر من كل كسر عينة التي تتوافق مع القمم لوحظت على الرسم البياني FPLC elution وتأكد أن تكون دقيقة مع اختبار الامتصاص.
  16. تجميد ما تبقى من تلك الكسور عينة باستخدام النيتروجين السائل أو الجليد الجاف في aliquots المطلوب وتخزين عينات البروتين في -80 درجة مئوية.
  17. تشغيل مقايسة كهرباء هلام SDS-PAGE كما هو موضح سابقا للتحقق من العينات التي تتوافق مع القمم التي لوحظت على الرسم البياني FPLC elution.

6. الإعداد السلبي شبكة وصمة عار

  1. ضع الشبكات التي سيتم استخدامها لإعداد العينة على شريحة زجاجية ملفوفة في ورق التصفية مع جانب الكربون الذي يواجه ما يصل.
  2. ضع الشريحة الزجاجية مع شبكات المجهر الإلكتروني في غرفة مُتفري التوهج بين القطبين واستبدل الغطاء الزجاجي مع التأكد من أن المركز ومغلق بشكل جيد.
  3. تشغيل آلة التفريغ توهج وتأكد من أن الضوء الأرجواني التي تولدها البلازما مرئية.
  4. عندما يتم تشغيل الجهاز، انتظر حتى وصلت الغرفة إلى الضغط الجوي لإزالة الغطاء الزجاجي ومن ثم إعادة الشريحة مع الشبكات إلى مقاعد البدلاء حيث سيتم تحميل العينات عليها.
  5. ضبط تركيز عينات البروتين المنقى إلى حوالي 0.1 ملغ / مل عن طريق إما تخفيف العينة مع المخزن المؤقت المناسب أو التركيز باستخدام مكثف الطرد المركزي.
  6. تحميل 3.5 ميكرولتر من عينة البروتين على شبكة الكربون سميكة 10 نانومتر وانتظر لمدة 1 دقيقة.
  7. إزالة السائل من سطح شبكة م مع ورقة مرشح.
  8. اغسل سطح الشبكة 3x عن طريق التقاط 3 ميكرولتر من قطرات الماء مع الشبكة وإزالة المياه من الشبكة بورق التصفية بين التقاط كل قطرة.
  9. غسل سطح الشبكة 2x عن طريق التقاط 3 ميكرولتر قطرات من الطازجة، تمت تصفيتها 2٪ خلات اليورانيوم وإزالة حلول الغسيل على الشبكة مع ورقة التصفية في ما بين التقاط كل قطرة.
  10. وصمة عار الشبكة مع 3 ميكرولتر قطرات من الطازجة، وتصفيتها 2٪ خلات اليورانيوم لمدة 1 دقيقة.
  11. إزالة محلول خلات اليورانيوم على سطح شبكة م مع ورقة فلتر والهواء الجافة الشبكة لمدة 1 دقيقة على الأقل.
  12. تخزين الشبكة في مربع شبكة للاستخدام لاحقاً.

7. التصوير EM

  1. قم بتحميل الشبكة المعدة إلى حامل الشبكة في منضدة آمنة.
  2. إعداد المجهر عن طريق وضع dewar المجاهر في مربع البوليسترين وملء ديوار 3/4th كامل من النيتروجين السائل.
  3. تأكد من أن الغطاء المطاطي من نافذة المجهر يغطيه ثم قم بتحميل ديوار على المجهر عن طريق وضع الأسلاك النحاسية في الوَرَد حتى تلائمه على المنصة.
  4. ملء ما تبقى من ديوار مع النيتروجين السائل ووضع سقف على رأس ديوار لتغطية ذلك.
  5. بدوره على التوتر العالي، شرط المجهر، وانتظر المجهر للاحماء وإنشاء مستوى فراغ آمن للاستخدام.
  6. مرة واحدة في المجهر هو استعداد فتح صمام العمود وتأكيد شعاع موجود عن طريق إزالة الغطاء المطاطي على نافذة المجهر.
  7. تحقق من وصمة شعاع عن طريق انتشار داخل وخارج عن طريق ضبط شدة الحزمة. إذا كان الاستجماتيزم موجوداً فإن الشعاع سيكون له شكل بيضاوي الشكل بينما يتحرك المرء بعيدًا عن العبور وينبغي أن يكون الشعاع هو نفس الشكل البيضاوي على كلا الجانبين.
  8. ضبط مناظير المجهر لتكون الارتفاع الصحيح والمسافة وفقا لعينات المراقب.
  9. تحقق من تحديد موضع شعاع للبحث، التركيز، وسائط التعرض عن طريق ركوب الدراجات من خلال جميع الأوضاع الثلاثة حتى شعاع هو مركز في كل.
  10. أغلق صمام العمود واشرع في تحميل حامل الشبكة في المجهر الإلكتروني.
  11. ضبط المجهر إلى ارتفاع eucentric باستخدام المجاهر متذبذب ميزة وضبط حركة المرحلة باستخدام Z-محور حتى لا يكون هناك حركة جنبا إلى جنب من العينة في المركز.
  12. باستخدام وضع البحث جرعة منخفضة على المجهر البحث الشبكة لمنطقة مرغوب فيه من الجزيئات معقولة مع عينة موجودة للتركيز على العينة.
  13. التركيز على العينة في وضع التركيز باستخدام حجم خطوة عالية حتى يتم مشاهدة العينة ثم قم بتقليل الخطوات للبحث عن مستوى التركيز الصحيح.
  14. صفر وفارغة شعاع ومن ثم تأكد من وسادة المطاط يغطي نافذة المجهر.
  15. باستخدام وضع التعرض تأخذ صورة منطقة الشبكة المطلوبة للتعرض 1 s في 62،000x التكبير والتحقق من الصورة التي تم الحصول عليها.
  16. عند الانتهاء من تصوير شبكة إغلاق صمامات العمود وإزالة حامل الشبكة من العمود.
  17. عند الانتهاء من تصوير جميع الشبكات من الفائدة اغلاق المجهر عن طريق إيقاف السلطة خيوط وإزالة ديوار النيتروجين السائل من المجهر.
  18. مكان شيء لامتصاص الرطوبة على المنصة حيث جلس ديوار للقبض على التكثيف من لفائف النحاس من المجهر.
  19. قم بتنشيط وضع دورة التبريد وتأكد من إيقاف تشغيل مضخة التوربو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام الإجراءات المعروضة هنا، تم تنقية عينات من نوع E. القولونية AcrB البرية و E. القولونية متحولة AcrB-P223G. ثم تم امتصاص العينات إلى شبكات المجهر الإلكتروني السلبي للصبغة الكربونية والملطخة باستخدام خلات أورانيل مع طريقة النشاف الجانبية22. تم جمع صور البقع السالبة باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال. صورة البقعة السلبية لعينة نوع AcrB البرية تنقيتها مع DDM يكشف عن حل متجانس من الجسيمات أحادية مع البروتين عرض هيكل ثلاثي البروتين المعري محددة جيدا (الشكل 1A). هذه الهياكل ثلاثية الهجرات تتوافق مع الكروماتوغرام استبعاد حجم لوحظ عند تنقيتها (الشكل التكميلي 1). وبالمقارنة، عند النظر إلى صورة البقعة السلبية لمتحول AcrB-P223G، المنقى أيضا مع DDM، يمكن للمرء أن يلاحظ حلا غير متجانسة من الجسيمات النانوية متعددة التخصصات مع ميل نحو التجميع، ولكن لا يمكن ملاحظة تقليم الأصلي(الشكل 1B). هذه النتائج هي أيضا مدعومة بملف تعريف elution الملاحظة عند تنفيذ اللوني استبعاد الحجم (الشكل التكميلي 1). لتحديد ما إذا كان نقص البروتينات الدولة ثلاثية اميركية للمتحولة بسبب العلاج مع المنظفات أو فقط بسبب طفرة مزعزعة للاستقرار من P223G البروتينات أيضا تنقية باستخدام NCMNP1-1، واحدة من البوليمرات النشطة غشاء داخل مكتبة NCMNs. صورة البقعة السلبية لعينة نوع AcrB البرية تنقيتها مع NCMNP1-1، مرة أخرى، يكشف عن حل متجانس من الجسيمات أحادية مع البروتين عرض بنية ثلاثية quartenary محددة جيدا (الشكل 1C). وتمهيدا كما هو الحال مع تنقية DDM، عندما يتم تنقية متحولة AcrB-P223G مع NCMNP1-1 صورة وصمة عار سلبية يظهر حلا غير متجانسة من الجسيمات النانوية متعددةdisdispersed مع ميل نحو التجميع، ولكن لا يمكن ملاحظتها الزخارف الأصلية(الشكل 1D). للتأكد من أن طفرة P223G يعطل تقليم AcrB على غشاء الخلية تم اختيار البوليمر مختلفة (NCMNP5-2) من الملكية NCMNs غشاء مكتبة البوليمر النشطة. يمكن أن تشكل NCMNP5-2 جسيمات نانوية غشاء الخلية الأصلية في أحجام أكبر بكثير، مما يسمح عدة تقليم AcrB أن تكون صورة في غشاء الخلية الجسيمات الأصلية واحد. ونتيجة لذلك، لوحظ أن أنواعاً برية متعددة من نوع AcrB الثلاثة كانت واردة في جسيمات مفردة(الشكل 1E)؛ ومع ذلك ، لم يلاحظ أي جسيمات تقليم AcrB-P223G مثل تلك التي شكلتها نوع البرية AcrB ، حتى عند النظر في غشاء الخلايا الأصلية الكبيرة بقع bilayer (الشكل 1F). وهذا يشير إلى أن AcrB-P223G غير موجود كقطع على غشاء الخلية كما اقترح سابقا21 ويقدم تفسيرا منطقيا لماذا AcrB-P223G يظهر انخفاضا كبيرا في النشاط عندمامقايسة 16. للتأكد من نقاء العينات ووجود البروتين الصحيح، تم تشغيل المواد الهلامية الكهربائية لجميع عينات البروتين النقي. أكدت البقع الناتجة وجود AcrB في جميع العينات مع > نقاء 95٪ وموقع البقعة يتوافق مع الوزن الجزيئي المتوقع من AcrB (الشكل 1G). نتائج دراستنا لا تتفق مع مُقايسة فريت الموصوفة سابقاً فيما يتعلق بتحديد حالة القلة للبروتين الغشاء AcrB-P223G16. باستخدام البوليمرات النشطة الغشاء والمجهر الإلكتروني كما هو موضح في البروتوكول كانت الدولة القلوكمية الأصلية للبروتين يمكن ملاحظتها بشكل مباشر. وسيتطلب تحديد أكثر دقة لكيفية تفاعل مونومرات البروتين مع بعضها البعض تحديد هياكل التبريد-EM عالية الدقة.

Figure 1
الشكل 1: البقعة السلبية وصور هلام electrophoresis من نقائه AcrB ثوابت. (A) صورة البقعة السلبية التي اتخذت لنوع البرية AcrB تنقيتها مع DDM. (B) صورة البقعة السلبية التي اتخذت لبناء بروتين AcrB-P223G تنقيتها مع DDM. (C) صورة البقعة السلبية التي اتخذت لنوع البرية AcrB تنقية مع NCMNP1-1. (D) صورة وصمة عار سلبية اتخذت لبناء AcrB -P223G تنقيتها مع NCMNP1-1. (E) صورة البقعة السلبية التي اتخذت لنوع البرية AcrB تنقيتها مع NCMNP5-2 (مربع أحمر يسلط الضوء على بعض من الأجزاء النانوية تريمل لوحظ في الصورة). (F) صورة البقعة السلبية التي اتخذت لCRB-P223G تنقيتها مع NCMNP5-2 (مربع أخضر يسلط الضوء على جزء من بقع الدهون التي تم التقاطها من قبل NCMNP5-2 لوحظ في الصورة). (G) SDS-PAGE هلام تشغيل باستخدام المنتجات النهائية من تنقية AcrB-P223G مع DDM (لين 1)، NCMNP1-1 (lane2)،(H) SDS-PAGE هلام تشغيل باستخدام المنتجات النهائية من تنقية AcrB-P223G مع NCMNP5-2. (I) تكبير من الميزات المميزة من الشكل 1E. (J) تكبير من الميزات البارزة من F. جميع الصور البقع السلبية في الشكل 1 لديها شريط مقياس نفسه من 50 نانومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

DDM تنقية المخازن المؤقتة مخازن تنقية البوليمر جل الكهربائية المخازن المؤقتة
المخزن المؤقت A 50 mM HEPES، 7.8 pH المخزن المؤقت NCMN A 50 mM HEPES، 8.4 pH مخزن TAE المؤقت 40 mM تريس قاعدة
300 mM NaCl 500 mM NaCl 1 mM EDTA
5٪ غليسيرول 5٪ غليسيرول 20 mM حمض الخليك
20 mM Imidazole 20 mM Imidazole
1 mM MgCl2-6 H2O 0.1 mM TCEP
0.1 mM TCEP
المخزن المؤقت B 50 mM HEPES، 7.8 pH NCMN المخزن المؤقت B 25 mM HEPES، 7.8 pH المخزن المؤقت للديستين 40٪ ميثانول
300 mM NaCl 500 mM NaCl 10٪ حمض الخليك
5٪ غليسيرول 5٪ غليسيرول
40 mM Imidazole 40 mM Imidazole
1 mM MgCl2-6 H2O 0.1 mM TCEP
0.1 mM TCEP
المخزن المؤقت C 50 mM HEPES، 7.8 pH NCMN المخزن المؤقت C 25 mM HEPES، 7.8 pH ترص جل 1.5 M تريس 8.8 pH (0.63 مل)
300 mM NaCl 500 mM NaCl 30٪ أكريلاميد/بيس (0.43 مل)
5٪ غليسيرول 5٪ غليسيرول 10٪ من الـDDS (0.025 مل)
75 mM Imidazole 75 mM Imidazole 10٪ APS (0.025 مل)
1 mM MgCl2-6 H2O 0.1 mM TCEP TEMED (4 ميكرولتر)
0.1 mM TCEP H2O (1.39 مل)
المخزن المؤقت D 50 mM HEPES، 7.8 pH المخزن المؤقت NCMN D 25 mM HEPES، 7.8 pH 12٪ فصل جل 1.5 M تريس 8.8 pH (1.3 مل)
300 mM NaCl 500 mM NaCl 30٪ أكريلاميد/بيس (2 مل)
5٪ غليسيرول 5٪ غليسيرول 10٪ من الـDDS (0.05 مل)
300 mM Imidazole 300 mM Imidazole 10٪ APS (0.05 مل)
1 mM MgCl2-6 H2O 0.1 mM TCEP TEMED (5 ميكرولتر)
0.1 mM TCEP H2O (1.6 مل)
المخزن المؤقت E 40 mM HEPES، 7.8 pH المخزن المؤقت NCMN E 40 mM HEPES، 7.8 pH
200 mM NaCl 200 mM NaCl
0.1 mM TCEP 0.1 mM TCEP

الجدول 1: قائمة مخازن التنقية المستخدمة في كروماتوغرافيا العمود والهلام الكهربائي.

الشكل التكميلي 1: ملامح elution استبعاد اللوني. (A) تراكب الرسم البياني من اثنين من ملامح elution لوحظ لحجم استبعاد التجارب الكروماتوغرافيا التي أجريت عند تنقية مع DDM والبرية نوع AcrB (البرتقالي) ومع DDM و AcrB - P223G متحولة (الأزرق). (ب) ملف تعريف معايرة العمود لعمود استبعاد الحجم المستخدم في تجارب DDM.
1 : Thyroglobulin (السيد 669 000) ، 2 : Ferritin (السيد 440 000) ، 3 : Aldolase (السيد 158 000) ، 4 : Conalbumin (السيد 75 000)، 5: أوفالبويمين (السيد 44 000)، 6: أنهيدراس الكربونية (السيد 29 000)، 7: ريبونوكليس A (السيد 13 700). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتين البروتين التفاعلات مهمة لسلامة هيكل ووظيفة البروتينات الغشاء. وقد تم تطوير العديد من النهج لدراسة التفاعلات البروتينية البروتينية. عند مقارنتها مع البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات الغشائية و PPIs الخاصة بهم هي أكثر صعوبة في الدراسة بسبب الخصائص الجوهرية الفريدة للبروتينات الغشاء. هذه الصعوبة تأتي أساسا من شرط من البروتينات الغشاء لتكون جزءا لا يتجزأ في بيئة ثنائية الدهون الأصلية للاستقرار الهيكلية والوظائف. هذا يصبح إشكالية لأنه من أجل تحديد هياكل عالية الدقة من البروتينات يجب استخراجها من غشاء الخلية. وقد FRET التكنولوجيا الشعبية للتحقيق البروتين البروتين التفاعلات على غشاء الخلية، ومع ذلك، فإن القرار منخفض وتنتج في كثير من الأحيان ايجابيات كاذبة17،18،19،20. هنا هو ثبت, لأول مرة, أن NCMNs يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات البروتين البروتينية غشاء من خلال تحليل هيكليا من نوع AcrB تريمر البرية و AcrB-P223G مونومر على غشاء الخلية الأصلية ومقارنة النتائج مع التحليل السابق باستخدام فريت. من خلال مقارنة صور الجسيمات أحادية المجهر الإلكترون من نوع البرية AcrB و AcrB-P223G، ويقترح أن غالبية AcrB-P223G لا تشكل تقليم على غشاء الخلية الإشريكية مثل بروتين AcrB البرية عندما تنقية باستخدام البوليمرات النشطة غشاء، مثل NCMNP1-1 وNMNP5-2. نقترح هنا أن النتائج الناتجة عن تحليل فريت قد تكون إيجابية خاطئة ناتجة عن تحديد قرار نهج فريت. السندات كبريتيد الاصطناعية التي استقرت في AcrB-P223G الشمر يمكن أيضا أن يكون قطعة أثرية التي وقعت في الحل21. تشير صور البقعة السلبية إلى أن طفرة P223G منعت تشكيل تريمر AcrB وأن شكل AcrB أحادية اللون لا يمكن أن يبقى في نفس التشكل الملاحظ عندما يكون في شكله الثلاثي. الحلقة التي تحتوي على هذه الطفرة كان قد تبين سابقا أن تكون حاسمة للغاية لتشكيل تريمر من خلال التحليل المطفرة والهيكلية، والتي أظهرت أهميتها الهيكلية أن يكون بسبب التفاعلات كل شكل حلقة عن طريق دفن في المونومر AcrB المجاورة23.

باستخدام نظام جسيمات نانوية غشاء الخلية الأصلية للكشف عن التفاعل البروتين البروتيني وتحليل يمكن للمرء أن يكشف مباشرة حالة oligomeric من البروتين عن طريق الحفاظ على البروتين الغشاء (ق) في بيئة غشاء الخلية الأصلية حقا، والتي يمكن استخدامها للحصول على معلومات هيكلية عالية الدقة على المستوى الذري من خلال تحليل وحيد الجسيمات cryo-EM للعينة. نظام NCMN يساعد على تجنب الإيجابيات الكاذبة المتكررة والسلبيات الكاذبة التي لوحظت في الكشف عن مؤشر أسعار المنتجين الناجم عن معالجة العينات بالمنظفات24. وعادة ما تنشأ هذه النتائج الخاطئة، بسبب تجميع، denaturation عينة البروتين، تفكك التفاعلات غير التكافؤ، وتشكيل الدول القلة الاصطناعية الناجمة عن آثار delipidation من المنظفات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام التحليل الهيكلي بالاقتران مع الـ NCMNs يوفر معلومات هيكلية إضافية ويسمح بالمراقبة المباشرة للتفاعلات الجزيئية، التي تعتبر حاسمة في فهم مؤشرات أسعار المنتجين وعادة ما تضيع عند استخدام الأساليب التي سبق وضعها للكشف عن مؤشر أسعار المنتجين. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في الدراسات الهيكلية من نوع AcrB البرية ويمكن أن يكون لها انطباق واسع على أشكال أخرى من التحليل الهيكلي، مثل التصوير البلوري بالأشعة السينية و NMR الحالة الصلبة، والعديد من البروتينات المختلفة المستخدمة في البحوث الأخرى التي تسعى إلى تحديد التفاعلات التي تظهر من قبل أهداف البروتين رواية.

من أجل الحصول على نتائج استنساخها مع الغلة بروتين معقول من النقاء عالية هناك عدة خطوات حاسمة في عملية تنقية مع البوليمرات النشطة غشاء التي يجب اتباعها. الخطوة الحرجة الأولى هي عملية عزل الغشاء، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن الطرد المركزي الخلية في 15،000 × ز واتبع هذه الخطوة مع الrifugation فائقة في 215،000 × ز من أجل عزل حقا غشاء الخلية عن بقية الخلية lysate. الخطوة الحاسمة التالية هي solubilizing الغشاء كسر مع البوليمرات النشطة غشاء بتركيز 2.5 ٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. وقد أجريت تجارب التحسين من تنقية والاستفادة من هذه المعلمات في هذه الخطوة للتأكد من أن يتم استخراج المبلغ الأمثل من AcrB من الغشاء والتشكيل السليم للجسيمات النانوية غشاء الخلية الأصلية يحدث. الخطوة الحاسمة النهائية لعملية تنقية تحميل العينة على العمود NI-NTA في درجة حرارة الغرفة. هذا ضروري، لأن البوليمرات النشطة الغشاء أكثر قابلية للذوبان في درجة حرارة الغرفة من 4 درجات مئوية، وبالتالي فإن التحميل في درجة حرارة الغرفة سيزيد من كمية البروتين الملزمة على عمود التقارب وتجنب الضغط العالي الناجم عن تراكم البوليمر غير القابل للذوبان الذي يمكن أن يضر العمود. ولا تقل أهمية تقريبا عن الحصول على معلومات هيكلية دقيقة الخطوات الواردة في إجراء التلطيخ السلبي المذكور أعلاه. وتشمل الجوانب الأكثر أهمية من هذا الإجراء استخدام شبكات الكربون الثقوبية 10 نانومتر، وكميات من المياه وخلات أورانيل، وأطوال الوقت لالمزحم العينة وتلطيخ. وسيكفل استخدام هذه البارامترات الرئيسية أثناء إعداد العينات وجودة البيانات الهيكلية التي يمكن استخدامها لإجراء تقييم دقيق للولايات القلة العينة التي يجري تصويرها. قد تكون التعديلات على بروتوكول تنقية يكون ضروريا عند استخدام البروتينات المختلفة لاستكشاف المشاكل التي قد تنشأ بسبب الخصائص الفريدة لمختلف polypeptides. العوامل الأساسية للنظر في تعديل عند وجود صعوبة في الحصول على كمية كافية من عينة البروتين ينبغي أن تكون المعلمات المستخدمة خلال الخطوة التعريفية، وكمية الكسر الغشاء المستخدمة في الخطوة solubilization، وطول الفترة الزمنية ودرجة الحرارة لعملية solubilization. إذا كانت هناك مشكلة مع النقاء قد يكون من الضروري استخدام أعمدة تقارب بديلة، مثل عمود تقارب البيوتين، بدلاً من استخدام العمود Ni-NTA للتنقية. وبالمثل، إذا كان من الضروري الحفاظ على تفاعلات البروتينات الضعيفة/العابرة، فإن تبادل عمود Ni-NTA لعمود تقارب بطاقة TAP مفيد لتحقيق أفضل النتائج. وأخيراً، عند دراسة بروتينات الثدييات، ينبغي استخدام نظم التعبير الثدييات للحفاظ على تكوينات الدهون غشاء الخلية الأصلية الحقيقية اللازمة لتحديد دقيق لحالة القلة الطبيعية للبروتين. وهذا يتطلب مراجعة تماما التعبير البروتيني وخطوات تحلل الخلية من هذا البروتوكول. في مثل هذه الحالات، ينبغي اتباع البروتوكولات التي تم وضعها سابقا للتعبير البروتيني وتحلل الخلايا التي تتوافق مع نظام التعبير اللازم للبروتين المستهدف من الفائدة.

استخدام النتشافات مع المجهر الإلكتروني يعرض مزايا كبيرة عند مقارنتها مع فريت لاستخدامها في الكشف عن PPIs. كما تظهر نتائج هذه الدراسة، كانت التجارب التي أجريت سابقا FRET غير متناسقة مع التحليل الهيكلي للهيكل القلة من بروتين AcrB متحولة21. وقد تبين ذلك بوضوح وأكد مباشرة من الصور التي اتخذت مع المجهر الإلكتروني البقعة السلبية، والتي تتفق مع خسارة سبق وصفها من النشاط لـ AcrB-P223Gمتحولة 16. إذا لم AcrB-P223G شكل تقليم في الجسم الحي فإن البوليمر NCMNP5-2 قد اشتعلت لهم في بقع غشاء الخلية الأصلية الكبيرة التي تستخرج. ومن الممكن أن تحليل فريت من AcrB متحولة أسفرت عن إيجابية كاذبة بسبب أي من عدة قيود التي هي جوهرية للعمليات المادية التي تعتمد عليها التقنية والتكنولوجيا المستخدمة لقياس نقل الطاقة الرنين الفلورية. أحد القيود الرئيسية من فريت هو حدود القرار من المجهر confocal وهذا يؤدي إلى قيود خطيرة في المسافات بين الجزيئات قادرة على حلها مع فحص فريت19. وبالمقارنة، فإن استخدام النفثة الوطنية (NCMNs) بالاقتران مع المجهر الإلكتروني لا يخضع للقيود المذكورة أعلاه في فريت، مع حدود دقة أعلى بكثير بالمقارنة مع تلك التي في المجهر confocal. استنادا إلى هذه القيود وجود آثار محتملة على مغالى في فريت المذكورة سابقا، ونحن نفترض أن الكشف غير الصحيح من AcrB-P223G الثلث في الجسم الحي نتيجة للحد من قرار منخفض من فريت21. وبصرف النظر عن المزايا على مجرد فريت أشار مباشرة من قبل هذه الورقة، وذلك باستخدام NCMNs بالاشتراك مع المجهر الإلكتروني لديه ميزة على جميع التقنيات الحالية التفاعل البروتين البروتين، مثل نظام Y2H و تاب-MS، من حيث أنه يمكن استخدامها لمراقبة التفاعلات البروتين البروتيني في بيئات غشاء الخلايا الأصلية مباشرة في ارتفاع القرار ولديه القدرة على استخدامها لتحديد هياكل البروتين على المستوى الذري.

البوليمرات النشطة الغشاء والمجهر الإلكتروني ليست دون قيود أيضا. حاليا ، والقضية الرئيسية لتنقية NCMN هو انخفاض كفاءة الاستخراج بالمقارنة مع المنظفات القائمة على الأساليب (البوليمرات في مكتبة NCMN عرض ~ 70 ٪ من كفاءة استخراج DDM). كما أن لديها مشاكل التوافق مع بعض أعمدة التقارب مثل أعمدة الربط مالتوز. وعلاوة على ذلك، لا يزال تنقية NCMN غير ناجحة جدا مع البروتينات الغشاء ديناميكية عالية أو مجمعات (البيانات غير منشورة). استخدام البوليمرات النشطة الغشاء والمجهر الإلكتروني لتجارب تحديد الدولة القلة يتطلب إزالة البروتينات من بيئة الخلية الأصلية، في حين يتم تنفيذ فريت في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن الجسيمات النانوية التي تشكلها البوليمرات النشطة الغشاء تسمح للبيئة الأكثر شبها ممكن عند استخراج البروتينات من الخلايا، للحد من عدم الدقة المستمدة تجريبيا المحتملة المعروفة بأن سببها استخراج البروتين وتنقيته. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن مسألة القرار وحجم الجسيمات كقيد من المجهر الإلكتروني انتقال قد تضاءلت بشكل كبير على مدى العقد الماضي ، والمجاهر التي لا تزال تستخدم لتحليل البقع السلبية لا تزال محدودة نسبيا إلى أكبر الجزيئات أو المجمعات الجزيئية (> 200 كيلو Da) كما لديهم عموما حد المعلومات من حوالي 0.1-0.3 نانومتر25. وقد أظهرت SMALP أيضا أن تكون مرنة للغاية من حيث التطبيقات ولكن يعرض قيود أكبر من NCMNs. و nanodiscs التي شكلتها SMA لديها أقصى قطرها حوالي 15 نانومتر ، وبالتالي عادة غير فعالة لاستخراجالبروتينات والمجمعات البروتينية التي هي أكثر من 400 كيلو ا. بالإضافة إلى هذا القيد، SMA غير قادر أيضا على العمل مع البروتينات الموجودة في بيئات منخفضة الأس هيدرونية أو استخدام الأيونات المائي لأغراض هيكلية ووظيفية. بسبب آلية SMALPs للعمل يجري تعتمد على الأسى، فإنه لا يمكن استخدامها مع ظروف منخفضة من الأسي والتكلات الأيونات divalent. في حين أن أساليب SMILP و DIBMA قد قدمت وعدًا فيما يتعلق بالتغلب على هذه القيود ، فقد ظلت إمكانية تطبيقها على مجموعة متنوعة من البروتينات غير مرئية27،28. تسعى النتوءات الناشبة إلى التغلب على هذه القيود باستخدام تحليل العلاقة بين البنية والنشاط (SAR) لإنشاء بوليمرات بديلة يمكن أن تشكل جسيمات نانوية أكبر ، تعمل في ظروف منخفضة من الأسي ، وتجنب تكوين أيونات divalent. أحد الأمثلة على البوليمرات التي تم تطويرها لNCMNs هو البوليمر NCMNP5-2 الذي يعرض القدرة على إنشاء جسيمات نانوية أكبر كما هو موضح في الشكل 1E,F.

بالإضافة إلى التقدم الموصوف سابقا في تكنولوجيا الجسيمات النانوية، فإن الاتجاه المستقبلي للNCMNs هو في تطوير أكثر البوليمرات النشطة الغشاء الذي سيعطي مكتبة البوليمر NCMNs زيادة كفاءة الاستخراج والقدرة على العمل مع البروتينات من جميع أحجام منطقة عبر الجمجمة المختلفة، التي تعمل على مستويات أكبر بكثير من الأسى هيدروليكي، أو الاعتماد على أي نوع من الأيونات لصيانة هيكلها ووظيفتها. وهذا سيسمح لجميع الباحثين في مجال البروتين الغشائي باستخدام هذه التكنولوجيا في تجاربهم، والحصول على نتائج أكثر دقة وذات صلة بيولوجيا. من خلال جلب مزايا الجسيمات النانوية البوليمر إلى مجموعة أوسع من البروتينات والأمل هو أن هذا سيؤدي إلى حل هياكل عالية الدقة من مجمعات البروتين الغشاء الأصلي على المستوى الذري، وبالتالي تحديد التفاعلات الذرية داخل الجزيئات التي تذهب إلى الحفاظ على هذه المجمعات. ومن شأن هذه التطورات أن تتيح أيضاً العديد من الإمكانيات الجديدة من حيث اكتشاف المخدرات البروتينية الغشائية وتطويرها من خلال جهود تصميم العقاقير القائمة على الهيكل. استخدام تقنيات تصميم المخدرات القائمة على هيكل للبروتينات غشاء سيكون فائدة هائلة للصناعة الطبية لأن هذا من شأنه أن يزيد من خصوصية الدواء ملزمة وفعالية من أجل الحد من الآثار الجانبية غير المرغوب فيها وكمية من المركبات اللازمة لاثارة الآثار العلاجية المرجوة، مما يجعل الأدوية التي تستهدف البروتينات الأغشية بشكل ملحوظ أكثر أمانا وأكثر فعالية. لا يزال نظام الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الأصلي في مراحل نموه ولكنه أثبت بالفعل أنه قوي بشكل لا يصدق من خلال السماح لأول مرة بدراسة البروتينات الغشاء في حالاتها الأصلية حقًا وتوضيح تفاعلات البروتين والبروتين الأصلي التي تحدث على غشاء الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يتم سرد Y.G كمخترع للغشاء النشط البوليمر NCMNP5-2 ونظام NCMN.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث من قبل صندوق بدء العمل VCU (إلى Y.G.) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01GM132329 (إلى Y.G.) والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. ونشكر مونتسيرات سامسو وكيفن ماك روبرتس على دعمهما السخي لتسجيل الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) Bio-Rad 161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) Bio-Rad 1610747
Acetic Acid Glacial ThermoFisher Scientific A38S-212
Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700
Chloramphenicol Goldbio C-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder Bio-Rad 161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free Goldbio DTT10
Glycerol ThermoFisher Scientific G33-4
HEPES ThermoFisher Scientific BP310-1
Imidazole Affymetrix 17525 1 KG
IPTG Goldbio I2481C100
Kanamycin Goldbio K-120-25
Magnesium chloride hexahydrate ThermoFisher Scientific AA3622636
Methanol ThermoFisher Scientific A412-4
N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) Merck 8.03779.0100
NCMNS-P5-2 Not commercially available yet Submit request for obtaining to corresponding author
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) Bio-Rad 161-0301
SMA2000 Cray Valley Submit request for obtaining to corresponding author
Sodium Chloride ThermoFisher Scientific S271-10
TCEP-HCl Goldbio TCEP25
TEMED Bio-Rad 161-0800
Terrific Broth Media Affymetrix 75856 1 KG
Tris Base Bio-Rad 161-0719
Uranyl Acetate Ambinter Amb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPI Beckman Coulter B14538
Avanti JXN-30 Beckman Coulter B34193
Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) Electron Microscopy Sciences CF300-Cu-TH
Con-Torque Tissue Homogenizer Eberbach E7265
Corning LSE Mini Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 07-203-954
EmulsiFlex-C3 Avestin
Fraction Collector F9-R GE Healthcare Life Sciences 29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 165-8004
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder Wheaton 358013
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump Razel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 28990944
Tecnai F20 200kV FEI
Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter
General Materials
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa Millipore Sigma UFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLC GE Healthcare Life Sciences 29018225
BL21(DE3)pLysS Cells ThermoFisher Scientific C606003
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A
HisTrap HP 5 ml Column GE Healthcare Life Sciences 17524802
pET-24a EMD Biosciences 69749-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 161، SMALP، غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية، بروتين الغشاء، memtein، الجسيمات النانوية، تحديد الدولة القلوية
غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kroeck, K. G., Qiu, W., Catalano,… More

Kroeck, K. G., Qiu, W., Catalano, C., Trinh, T. K. H., Guo, Y. Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis. J. Vis. Exp. (161), e61298, doi:10.3791/61298 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter