Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Published: July 16, 2020 doi: 10.3791/61298
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

Abstract

אינטראקציות חלבון-חלבון במערכות קרום התא ממלאות תפקידים מכריעים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, החל מאינטראקציות בין תא לתא ועד העברת אותות; החל מחישה של אותות סביבתיים ועד לתגובה ביולוגית; מוויסות מטבולי לבקרה התפתחותית. מידע מבני מדויק של אינטראקציות חלבון-חלבון חיוני להבנת המנגנונים המולקולריים של קומפלקסים של חלבוני ממברנה ולעיצוב מולקולות ספציפיות מאוד לווסת חלבונים אלה. גישות רבות in vivo ו- in vitro פותחו לגילוי וניתוח של אינטראקציות חלבון-חלבון. ביניהם הגישה הביולוגית המבנית היא ייחודית בכך שהיא יכולה לספק מידע מבני ישיר של אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית. עם זאת, הביולוגיה המבנית של חלבון הממברנה הנוכחי עדיין מוגבלת במידה רבה לשיטות מבוססות חומר ניקוי. החיסרון העיקרי של שיטות מבוססות חומר ניקוי הוא שהם לעתים קרובות לנתק או denature קומפלקסים חלבון קרום פעם הסביבה המקומית שלהם bilayer השומנים מוסר על ידי מולקולות דטרגנט. פיתחנו מערכת ננו-חלקיקים של קרום התא המקומי לביולוגיה מבנית של חלבון קרום. כאן, אנו מדגימים את השימוש במערכת זו בניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון על קרום התא עם מקרה מבחן של המצב האוליגומרי של AcrB.

Introduction

אינטראקציות חלבון חלבון (PPI) ממלאות תפקידים מרכזיים בביולוגיה, החל מתחזוקת המבנה והתפקוד של חלבונים ועד לוויסות מערכות שלמות. PPIs מגיעים בצורות רבות ושונות וניתן לסווג על סמך סוגי האינטראקציות שהם יוצרים. סיווג אחד כזה הוא הומו-אוליגומרי או הטרואוליגומרי, בהתבסס על השאלה אם האינטראקציות הן בין יחידות משנה זהות או חלבונים שונים הפועלים כיוני משנה. סיווג נוסף מבוסס על עוצמת האינטראקציה אם האינטראקציות מובילות להיווצרות קומפלקסים יציבים או מצבים מורכבים חולפים. מידע מבני על PPIs בין חלבונים הוא חיוני בהבנת המנגנון שבאמצעותו חלבונים לבצע את תפקידם. ההערכה היא כי מעל 80% של חלבונים להסתמך על היווצרות מורכבת על מנת לבצע את תפקידם התפקודי1. בהתחשב באחוז החלבונים שנצפו להסתמך על PPIs לתפקוד מולד תקין משמעותם בביולוגיה ניכרת בקלות, אך היכולת לחקור כראוי את החלבונים העוסקים באינטראקציות אלה נותרה מאתגרת בשל מגבלות בטכניקות הזמינות לצפייה ניסיונית כאשר חלבונים יוצרים PPIs.

יש רמה גבוהה של חילוקי דעות בין התוצאות עבור PPIs רבים שנקבעו בניסויים בשל כמות גבוהה של רעש, תוצאות חיוביות שגויות, ותשלילים כוזבים הנגזרים רבים של טכניקות קביעת PPI זמין כיום. זה במיוחד עבור מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H), ספקטרומטריית טיהור-מסה טנדם (TAP-MS), והעברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET), המייצגים שלוש מהשיטות הנפוצות ביותר לקביעת PPI2,3,4,5,6,7. לשם השוואה, ניתן להשתמש בטכניקות ביולוגיה מבנית של חלבונים, כגון תהודה מגנטית גרעינית (NMR), קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), כדי להשיג מידע מבני ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות חלבון-חלבון עד לרמה האטומית ולאפשר אישור חזותי ישיר של האינטראקציות המתרחשות עבור חלבון יעד בעל עניין. כל PPI שאינו מבוסס על מבנה זמין כיום הקובע טכניקות מחקר (למשל, Y2H, TAP-MS ו- FRET) חסר יכולת זו ובנוסף סובלים מקושי בזיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות בין חלבונים5. חסרונות אלה משופרים עוד יותר כאשר לומדים חלבונים קרום בשל המורכבות הנוספת הביא על ידי המשתנה הנוסף של סביבת השומנים המשפיעה על היווצרות של מבנה quaternary הנכון הרכבה מורכבת הטרומרית.

חלבוני ממברנה מהווים חלק גדול של פרוטאום ידועים לשחק תפקידים מכריעים רבים בתפקוד התא תקין בתוך כל האורגניזמים החיים. למרות העובדה כי חלבוני ממברנה מוערך לפצות 27% של הגנום האנושי ומהווים ~ 60% מכל מטרות התרופה הנוכחית יש אנומליה גדולה במספר המודלים שנפתרו עבור חלבוני ממברנה המהווים רק ~ 2.2% מכלל מבני החלבון שפורסמו8,9,10. הגורם העיקרי לפער בזמינות של מידע מבני טמון בתכונות המהותיות של חלבוני הממברנה עצמם. בשל המסיסות הירודה שלהם, הסתמכות על אינטראקציות עם סביבת השומנים לשמירה על מבנה ותפקוד מקומיים, ותכונות פיזיוכימיות שונות של קרום השומנים עצמו, חלבוני קרום ממשיכים לייצג בעיה משמעותית בעת יישום טכניקות ביולוגיה מבנית כדי ללמוד אותם. מבין תכונות מהותיות אלה, החשוב ביותר להשגת מידע מבני מדויק הוא הדרישה לקיים אינטראקציות עם סביבת השומנים הטבעית שלהם כדי לשמור על המבנה והתפקוד המקוריים שלהם. סביבת השומנים היא חלק בלתי נפרד מהמבנה והתפקוד של חלבוני הממברנה שהמושג של ממטאין (שילוב של המילים קרום וחלבון) הוצע כיחידה הבסיסית של מבנה חלבון קרום ותפקוד11. למרות החשיבות של אינטראקציות חלבון השומנים, טכניקות קביעת PPI המבוססות על מבנה הזמינות כיום דורשות לעתים קרובות שהחלבונים הנחקרים יהיו מסיסים או יהיו מסיסים בחומרי ניקוי. חשיפה לחומרי ניקוי קשים יכולה לרוקן את החלבונים או לגרום לחיוביות ותשלילים כוזבים עקב דילול, אשר יכול לגרום לצבירה, denaturation של חלבון, ניתוק של אינטראקציות שאינן covalent, היווצרות של מצבים אוליגומריים מלאכותיים. בשל הצורך בשמירה על סביבת שומנים טבעית לקביעה מדויקת של המצב האוליגומרי המקורי של חלבוני ממברנה פיתחנו מערכת חלקיקי קרום התא המקומי (NCMNs)12 בהתבסס על שיטת Styrene Maleic Acid Lipid (SMALP)13 שדווחה בעבר.

SMALP משתמשת בקופולימר חומצה גברית סטירן כמו פולימר פעיל קרום כדי לחלץ ולטבול חלבוני קרום. פולי (Styrene-co-Maleic Acid) הוא פולימר אמפיפילי ייחודי בשל הסטירן ההידרופובי שלו moiety ו diametricic מול חומצה גברית הידרופילית moiety. זה יוצר חלקיקים על ידי ספיחה, ערעור היציבות, ושיבוש קרום התא במנגנון תלוי pH14. פעילות תפקודית זו של SMA היא המאפשרת לו להיות מנוצל כמערכת ללא חומרי ניקוי עבור מיצוי חלבון קרום ו solubilization. מערכת NCMN נבדלת ממערכת SMALP במספר היבטים. התכונה הייחודית ביותר של מערכת NCMN היא שיש לה ספריית פולימר פעילה קרום עם שפע של פולימרים בעלי תכונות ייחודיות שהופכות אותם מתאימים לבידוד של חלבוני ממברנה רבים ושונים הדורשים תנאים שונים ליציבות ותפקוד ילידי. למערכת NCMN יש גם פרוטוקולים שונים בהשוואה לשיטת SMALP כשמדובר בהכנת הננו-חלקיקים. דוגמה אחת לכך היא ש- NCMNs משתמשים בטיהור עמודת זיקה ניקל חד-שלבית לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה; ההשפעה של פרוטוקולים שונים אלה ניתן לראות בעת השוואת פרוטוקול NCMNs, אשר יצר 3.2 ו 3.0 Å קריו-EM AcrB מבנים, עם מחקר דומה באמצעות שיטת SMALP, אשר הביא מבנה AcrB cryo-EM ב 8.8 Åרזולוציה 12,15. תכונות ייחודיות אלה של מערכת NCMN הן השיפורים שנעשו בשיטת SMALP שהוקמה בעבר ולהפוך אותה למועמד אידיאלי לחקר PPIs.

טרנספורטר efflux multidrug AcrB קיים כהומוטרימר פונקציונלי ב E. coli12. ניתוח מוטגני הציע כי מוטציה נקודת P223G אחת, הממוקמת על לולאה האחראית ליציבות של שולי AcrB, מערערת את מצב השליש ומניבה מונומר AcrB כאשר הוא מוכן עם DDM חומר הניקוי, אשר יכול להיות מזוהה עם אלקטרופורזה ג'ל כחול יליד16. עם זאת, ניתוח FRET של מוטציית AcrB-P223G הציע כי כאשר בסביבת bilayer השומנים קרום התא המקורי, רוב מוטציה AcrB-P223G עדיין היה קיים כמו טרימר וכי רמות הביטוי עבור שני סוג פראי AcrB ו AcrB-P223G דומים. עם זאת, למרות תוצאות ניתוח FRET, בדיקה פעילות עבור טרנספורטר מוטנטים הראה כי הפעילות ירדה באופן דרמטי בהשוואה לסוג פראי16. למרות טכנולוגיית FRET שימשה העממית לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון, מחקרים הראו כי זה יכול לעתים קרובות לתת תוצאות חיוביות שגויות17,18,19,20.

לאחרונה, מבנים ברזולוציה גבוהה cryo-EM של טרימר AcrB נקבעו אשר הראו את האינטראקציה של AcrB עם bilayer השומנים קרום התא המקורי המשויך שלה באמצעות NCMNs12. באופן עקרוני, NCMNs יכול להיות מנוצל בקלות לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון נמצאו על קרום התא המקומי. במבחן של מערכת זו, ניסויים בוצעו כדי לבחון ישירות את המצב האוליגומרי של AcrB-P223G עם שימוש חלקיקי קרום התא המקומי מיקרוסקופ אלקטרונים כתמים שליליים. כדי להשוות עם חלקיקי AcrB מסוג פראי, השתמשנו באותו פולימר פעיל קרום (SMA2000 שנעשו במעבדה שלנו, אשר אינדקס כמו NCMNP1-1 בספריית NCMN) המשמש לקביעת מבנה cryo-EM ברזולוציה גבוהה של AcrB ופולימרים חלופיים שנמצאו בספריית NCMNs12. בהתבסס על התוצאות שדווחו בעבר, זה היה צפוי כי רוב מוטציה AcrB-P223G יתקיים בצורה של חלקיקי קרום תא מקורי טריטרי21. עם זאת, לא נמצאו חותכי AcrB במדגם, כגון אלה שנצפו עם סוג הפרא AcrB. זה מרמז על הרוב של AcrB-P223G אינו יוצר קוצצים על קרום התא המקורי כפי שהוצע בעבר.

כאן אנו מדווחים על ניתוח מפורט של המוטנט E. coli AcrB-P223G בהשוואה לסוג הפראי E. coli AcrB באמצעות NCMNs. מקרה מבחן זה של AcrB מצביע על NCMNs היא מערכת טובה לניתוח אינטראקציה חלבון חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ביטוי חלבון

  1. לחסן 15 מ"ל של מרק נהדר (TB) מדיה עם אנטיביוטיקה ספציפית פלסמידים עם BL21(DE3) pLysS תאים המכילים את AcrB המביעים פלסמידים ב 50 צינורות מ"ל לילה ב 37 °C (69 °F) עם רועד ב 250 סל"ד.
  2. בדוק את הצפיפות האופטית של תרבות הלילה ב 600 ננומטר (OD600) ולוודא שזה מעל 2.0.
  3. לדלל 5 מ"ל של תרבות התא לתוך 1 L של מדיה שחפת המכילה אנטיביוטיקה ספציפית פלסמידים דגירה ב 37 °C (67 °F) עם רועד עד OD600=0.8 ולאחר מכן לגרום עם IPTG כי יש ריכוז סופי של 1 mM.
  4. לבצע אינדוקציה ב 20 מעלות צלזיוס עם רועד במשך 20 שעות.
  5. גלולה במורד התאים באמצעות צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ו 4,000 x גרם.

2. תמוגת תאים ובידוד קרום

  1. Resuspend גלולת התא במאגר A(טבלה 1, להשתמש DDM מאגר A או NCMNs מאגר A בהתאם ערכת טיהור כי הוא לעקוב) באמצעות 80 מ"ל עבור כל 20 גרם של גלולת התא.
  2. הומוגניזציה כדורי התא resuspended באמצעות homogenizer Dounce זכוכית ב 4 מעלות צלזיוס או אם בטמפרטורת החדר הקפד לשים על קרח מיד לאחר.
  3. מעבירים את הדגימה לתוך כיפת מתכת על קרח ו lyse התאים על ידי טעינת אותם לתוך הומוגניזר בלחץ גבוה ב 4 מעלות צלזיוס ו 1,500 בר.
    1. חזור על תהליך הטעינה של התאים לתוך homogenizer ומאפשר להם לעבור את homogenizer במשך 3-4 מחזורים או עד lysate מתחיל להבהיר.
  4. צנטריפוגה lysate ב 15,000 x g במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. לאסוף את supernatant ולהעמיס לתוך צינורות ultracentrifuge וצנטריפוגה ב 215,000 x g עבור 1 שעה ב 4 °C (69 °F).
  6. להשליך את supernatant ולאסוף את כדורי הממברנה מן הצינורות ultracentrifuge. לאחסן כל גלולה קרום עודף ב -80 מעלות צלזיוס.

3. הכנת חלקיקי קרום התא המקומי

  1. Resuspend 1 גרם של גלולת ממברנה ב 10 מ"ל NCMNs מאגר A(טבלה 1).
  2. הומוגניזציה של דגימת קרום התא בשימוש חוזר עם homogenizer Dounce זכוכית ב 20 °C (69 °F).
  3. העבר את דגימת הממברנה המושעית לצינור פוליפרופילן 50 מ"ל והוסף פתרון מלאי פולימרים פעילים ממברנה ומאגר NCMNs נוסף A כדי להביא את המדגם לריכוז סופי של 2.5% (w / v) ממברנה פולימר פעיל (NCMNP1-1 או NCMNP5-2).
    הערה: פתרונות מלאי של פולימרים פעילים קרום צריך להתבצע במים מזוקקים כפולים ניתן לשמור בריכוזים שונים, אבל בדרך כלל 10% (w / v).
  4. לנער את המדגם במשך 2 שעות ב 20 מעלות צלזיוס.
  5. לטעון את המדגם לתוך ultracentrifuge ולהסתובב ב 150,000 x g עבור 1 שעה ב 20 °C (69 °F).
  6. בעוד המדגם הוא להיות אולטרה צנטריפוגה להתחיל לאיזון עמודה 5 מ"ל Ni-NTA עם 25 מ"ל של מאגר NCMNs A.
  7. לאסוף את supernatant לאחר ultracentrifugation הושלם לטעון אותו על 5 מ"ל של עמודה Ni-NTA בטמפרטורת החדר עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק.
  8. לשטוף קווי כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) עם מספיק NCMNs מאגר B (טבלה 1) כדי לשטוף לחלוטין את המערכת ולאחר מכן לחבר את העמודה למכונת FPLC.
  9. לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר NCMNs B עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.
  10. לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר NCMNs C (טבלה 1) עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.
  11. יש לאלוט את החלבון ב-20 מ"ל של NCMNs Buffer D(טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף את הדגימה באמצעות אספן שברים והשברים שכל אחד מהם מוגדר ל-1.0 מ"ל.
  12. אחסן את דגימות החלבון ב-4°C.
  13. הפעל בדיקת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE על מנת לבדוק את הדגימות המתאימות לפסגות שנצפו בגרף elution FPLC.

4. אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE

  1. הכינו את תא הליהוק על ידי הידוק הזכוכית למנגנון הליהוק.
  2. מכינים את ג'ל ההפרדה 12% על פי המתכון המפורט בטבלה 1.
    הערה: לאחר הוספת TEMED הג'ל יתמזג במהירות ולכן רק להוסיף את זה פעם אחת מוכן לשפוך את הג'ל.
  3. יוצקים את הג'ל, משאירים 2 ס"מ מתחת לתחתית המסרק עבור ג'ל הערימה.
  4. הסר את כל הבועות על ידי שכבות החלק העליון של הג'ל עם 100% isopropanol ולחכות ג'ל ההפרדה כדי polymerize.
  5. הסר את isopropanol ולשטוף את כל העקבות של isopropanol עם מים מזוקקים.
  6. מכינים את ג'ל הערימה לפי המתכון המפורט בטבלה 1.
    הערה: לאחר הוספת TEMED הג'ל יתמזג במהירות ולכן רק להוסיף את זה פעם אחת מוכן לשפוך את הג'ל.
  7. יוצקים את ג'ל הערימה על גבי ג'ל ההפרדה.
  8. מוסיפים מסרק לתא כדי ליצור את הבארות ומחכים שהג'ל לערום יתוקן לחלוטין.
  9. מניחים μL אחד של 1 M DTT לתוך צינור microcentrifuge עבור כל מדגם שבר שצריך לרוץ על הג'ל.
  10. הוסף 7 μL של מאגר טעינה 4x לכל צינור גם כן.
  11. הוסף 20 μL של מדגם מן השברים כי צריך להיות לרוץ על הג'ל לכל צינור microcentrifuge.
  12. וורטקס הצינורות המכילים את הדגימות.
  13. סובבו את צינורות הדגימה באמצעות מיקרוצנטריפוגה על השולחן במשך 3 שניות וודאו שכל הדגימה חזרה לתחתית הצינורות.
  14. הכינו את תא האלקטרופורזה של הג'ל על ידי אבטחת קלטת ג'ל פוליאקרילמיד 12% למקומו ומילוי התאים הפנימיים והחיצונים של התא במאגר Tris-acetate-EDTA (TAE)(טבלה 1).
  15. טען את סמן המשקל המולקולרי לנתיב הראשון של הג'ל עם הנפח המתאים הנדרש על פי הוראותיו.
  16. טען 28 μL של המדגם מכל צינור מעורבב עם DTT ומאגר טעינה.
  17. הנח את המכסה של תא האלקטרופורזה על גבי התיבה וחבר את המכסה לאספקת החשמל.
  18. הפעל את ספק הכוח והגדר אותו ל- 100 V ואפשר לו לפעול במשך 20 דקות.
  19. לאחר 20 דקות, להגדיל את זרם אספקת החשמל ל 140 V ולהמשיך להפעיל אותו עוד 30-40 דקות או עד הלהקה של צבע מאגר טעינה מגיע לתחתית קלטת הג'ל.
  20. לאחר השלמת כתם אלקטרופורזה ו de-stain הג'ל כדי לדמיין את רצועות החלבון הכלולות בתוך הג'ל.

5. טיהור חלבונים באמצעות DDM

הערה: מטרת ביצוע תהליך טיהור זה היא לשמש כבקרה לניסויים העושים שימוש בפולימרים הפעילים של הממברנה.

  1. Resuspend 6-10 גרם של גלולת ממברנה, משלב 2.6, ב DDM Buffer A (טבלה 1) באמצעות 5 מ"ל / גרם של גלולת ממברנה.
  2. הומוגניזציה מדגם resuspended עם homogenizer Dounce זכוכית ב 4 מעלות צלזיוס או אם בטמפרטורת החדר הקפד לשים על קרח מיד לאחר.
  3. להעביר מדגם 50 מ"ל של צינור פוליפרופילן ולהוסיף DDM ומאגר DDM נוסף A להביא את המדגם לריכוז הסופי של 2% DDM.
  4. לנער את המדגם במשך 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. טען את הדגימה לתוך צינורות ultracentrifuge וצנטריפוגה עבור 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס ו 150,000 x גרם.
  6. בעוד המדגם הוא להיות אולטרה צנטריפוגה להתחיל להכין את 5 מ"ל של עמודה Ni-NTA על ידי כביסה עם 25 מ"ל של מאגר DDM A (טבלה 1).
  7. לאחר השלמת ultracentrifugation, לאסוף את supernatant ולהעמיס אותו על 5 מ"ל Ni-NTA עמודה ב 4 °C (69 °F) עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק.
  8. שטיפת קווי FPLC עם מספיק DDM Buffer B + 0.05% DDM (טבלה 1)כדי לרוקן לחלוטין את המערכת ולאחר מכן לחבר את העמודה למכונת FPLC.
  9. לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר DDM B + 0.05% DDM עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.
  10. לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר DDM C + 0.05% DDM (טבלה 1) עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.
  11. יש לטבול את החלבון ב-20 מ"ל של DDM Buffer D + 0.05% DDM(טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף את הזרימה באמצעות אספן שברים והשברים שכל אחד מהם מוגדר ל-1.0 מ"ל.
  12. בחר את השברים המכילים את שיא elution עבור איגום והתרכזות באמצעות רכז צנטריפוגלי צנטריפוגה ב 4,000 x g ו 4 °C (60 °F) עד להגיע 500 μL.
  13. באמצעות לולאת μL 500 לטעון את המדגם לתוך מכונת FPLC ולאחר מכן על עמודת אי הכללה בגודל 25 מ"ל ב 4 °C (69 °F). יש להשתמש ב-30 מ"ל של DDM Buffer E + 0.05% DDM (טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף כשברים כשגדלי השבר מוגדרים כ- 0.5 מ"ל לשבר.
  14. קח את השברים ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות ספיגה של 280 ננומטר כדי לאשר עקומת UV-Vis מגרף elution FPLC.
  15. לאסוף 20 μL מכל שבר מדגם התואמים פסגות שנצפו על גרף elution FPLC ואושרו להיות מדויק עם בדיקת הספיגה.
  16. להקפיא את שאר שברי מדגם אלה באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש aliquots הרצוי ולאחסן דגימות חלבון ב -80 מעלות צלזיוס.
  17. הפעל בדיקת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE כפי שתואר קודם לכן כדי לבדוק את הדגימות המתאימות לפסגות שנצפו בגרף elution FPLC.

6. הכנת רשת כתמים שלילית

  1. מניחים את הרשתות כי הם הולכים לשמש להכנת מדגם על שקופית זכוכית עטוף נייר מסנן עם צד הפחמן פונה כלפי מעלה.
  2. מניחים את שקופית הזכוכית עם רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים לתוך התא של הפרש זוהר בין שתי האלקטרודות ולהחליף את מכסה הזכוכית לוודא שהוא ממורכז ואטום היטב.
  3. הפעל את מכונת פריקת הזוהר וודא שהאור הסגול שנוצר על-ידי הפלזמה נראה לעין.
  4. כאשר המכונה נעשית פועל, לחכות עד התא הגיע ללחץ אטמוספרי כדי להסיר את מכסה הזכוכית ולאחר מכן להחזיר את השקופית עם הרשתות לספסל שבו דגימות יהיה טעון עליהם.
  5. להתאים את הריכוז של דגימות חלבון מטוהרים על 0.1 מ"ג / מ"ל על ידי דילול המדגם עם המאגר המתאים או להתרכז באמצעות רכז צנטריפוגלי.
  6. לטעון 3.5 μL של דגימת חלבון על רשת פחמן 10 ננומטר עבה ולחכות 1 דקות.
  7. הסר את הנוזל מפני השטח של רשת EM עם נייר מסנן.
  8. לשטוף את משטח הרשת 3x על ידי להרים 3 טיפות μL של מים עם הרשת והסרת המים מהרשת עם נייר מסנן בין להרים כל טיפה.
  9. לשטוף את משטח הרשת 2x על ידי להרים 3 טיפות μL של טרי, מסונן 2% אורניום אצטט ולהסיר את פתרונות לשטוף על הרשת עם נייר מסנן בין להרים כל טיפה.
  10. הכתים את הרשת עם טיפה 3 μL של טרי, מסונן 2% אצטט אורניום במשך 1 דקות.
  11. הסר את פתרון אצטט אורניום על פני השטח של רשת EM עם נייר מסנן ואוויר לייבש את הרשת לפחות 1 דקות.
  12. אחסן את הרשת בתיבת רשת לשימוש במועד מאוחר יותר.

7. הדמיה EM

  1. טען את הרשת המוכנה למחזיק הרשת בשולחן עבודה בטוח.
  2. מכינים את המיקרוסקופ על ידי הצבת המיקרוסקופים dewar לתוך תיבת פוליסטירן ולמלא את dewar 3/4th מלא חנקן נוזלי.
  3. ודא כי כיסוי הגומי של חלון המיקרוסקופ מכסה אותו ולאחר מכן לטעון את dewar על המיקרוסקופ על ידי הצבת חוטי נחושת לתוך dewar עד שהוא מתאים על הפלטפורמה.
  4. ממלאים את שארית החנקן בנוזל ומניחים כובע על גבי ה dewar כדי לכסות אותו.
  5. להפעיל את המתח הגבוה, להתנות את המיקרוסקופ, ולחכות מיקרוסקופ להתחמם וליצור רמת ואקום בטוח לשימוש.
  6. ברגע שהמיקרוסקופ מוכן לפתוח את שסתום העמודה ולאשר את הקרן קיימת על ידי הסרת כיסוי הגומי על חלון המיקרוסקופ.
  7. בדוק את סטיגמות הקרן על ידי התפשטות פנימה והחוצה על ידי התאמת עוצמת הקרן. אם אסטיגמציה קיימת הקרן תהיה צורה אליפטית כמו אחד נע מן הצלבה ואת הקרן צריכה להיות באותה צורה אליפטית משני הצדדים.
  8. התאם את משקפת המיקרוסקופ כך שתהיה הגובה והמרחק הנכונים לפי עיניו של הצופה.
  9. בדוק את מיקום הקרן עבור מצבי חיפוש, מיקוד וחשיפה על-ידי רכיבה על אופניים בכל שלושת המצבים עד שהקרן תמרכז בכל אחד מהם.
  10. סגור את שסתום העמודה והמשך לטעון את מחזיק הרשת למיקרוסקופ האלקטרונים.
  11. התאם את המיקרוסקופ לגובה האוצנטרי באמצעות התכונה microscopes wobbler והתאמת תנועת הבמה באמצעות ציר Z עד שלא תהיה תנועה מצד לצד של המדגם במרכז.
  12. באמצעות מצב חיפוש במינון נמוך על מיקרוסקופ לחפש את הרשת עבור אזור רצוי של ניגודיות סבירה עם מולקולות מדגם נוכח להתמקד במדגם.
  13. התמקד בדוגמה במצב מיקוד באמצעות גודל שלב גבוה עד שהדוגמה תיראה ולאחר מכן הקטן שלבים למציאת רמת המוקד הנכונה.
  14. אפס וריק הקרן ולאחר מכן להיות בטוח כרית הגומי מכסה את חלון המיקרוסקופ.
  15. במצב חשיפה, צלם את התמונה של אזור הרשת הרצוי לחשיפה של 1 שניות בהגדלה של 62,000x ובדוק את התמונה שהתקבלה.
  16. כאשר נעשה הדמיה רשת לסגור את שסתומי העמודה ולהסיר את מחזיק הרשת מהעמודה.
  17. כאשר סיים לדמיין את כל רשתות העניין לכבות את המיקרוסקופ על ידי כיבוי כוח חוטים והסרת חנקן נוזלי dewar מן המיקרוסקופ.
  18. מניחים משהו לספוג לחות על הדוכן שבו דיואר ישב לתפוס עיבוי מן סלילי הנחושת של המיקרוסקופ.
  19. הפעל את מצב מחזור Cryo וודא שמשאבת הטורבו כבויה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההליכים המוצגים כאן, דגימות של סוג פראי E. coli AcrB ו E. coli מוטציה AcrB-P223G טוהרו. הדגימות נספגו אז לרשתות מיקרוסקופיות של אלקטרון כתם שלילי פחמן ומוכתמות באמצעות אורניל אצטט בשיטת הכתםהצדדית 22. תמונות כתם שליליות נאספו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. תמונת הכתם השלילית של דגימת סוג הבר AcrB המטוהרת באמצעות DDM חושפת פתרון הומוגני של חלקיקים חד-ממדיים כאשר החלבון מציג מבנה רבעוני שלישוני מוגדר היטב (איור 1A). מבנים טרימריים אלה תואמים לכרומטוגרמה של אי-הכללת הגודל שנצפה בעת הטיהור (איור משלים 1). לשם השוואה, כאשר מסתכלים על תמונת הכתם השלילית של מוטנט AcrB-P223G, המטוהר גם עם DDM, ניתן להבחין בתמיסה הטרוגנית של חלקיקים רב-ממדיים עם נטייה לצבירה, אך ללא שוליים מקומיים ניתנים לצפייה (איור 1B). תוצאות אלה נתמכות גם על ידי פרופיל elution שנצפה בעת ביצוע כרומטוגרפיה אי הכללת גודל (איור משלים 1). כדי לקבוע אם חוסר חלבוני מצב טרימרי עבור המוטנט היה בשל טיפול עם חומר ניקוי או נגרם אך ורק על ידי מוטציה מערערת של P223G החלבונים טוהרו גם באמצעות NCMNP1-1, אחד הפולימרים הפעילים קרום בתוך ספריית NCMNs. תמונת הכתם השלילית של מדגם סוג הפרא AcrB המטוהר עם NCMNP1-1, שוב, חושפת פתרון הומוגני של חלקיקים חד-דיספריים כאשר החלבון מציג מבנה רב-וריטרי מוגדר היטב (איור 1C). ובדיוק כמו עם טיהור DDM, כאשר מוטציית AcrB-P223G מטוהרת עם NCMNP1-1 תמונת הכתם השלילית מראה פתרון הטרוגניים של חלקיקים רב-ממדיים עם נטייה לצבירה, אך ללא שוליים מקומיים נצפים (איור 1D). כדי לאשר עוד יותר כי מוטציית P223G משבשת את שולי AcrB על קרום התא פולימר אחר (NCMNP5-2) נבחר מספריית הפולימרים הפעילה של קרום NCMNs הקניינית. NCMNP5-2 יכול ליצור חלקיקי קרום התא המקורי בגדלים גדולים בהרבה, ובכך לאפשר גוזמי AcrB מרובים להיות בתמונה בחלקיק קרום התא המקורי יחיד. כתוצאה מכך, נצפתה כי גוזמי AcrB מסוג פראי מרובים נכללו בחלקיקים בודדים (איור 1E); עם זאת, לא נצפו חלקיקי חותך AcrB-P223G כמו אלה שנוצרו על ידי סוג פראי AcrB, גם כאשר מסתכלים על מדבקות bilayer קרום התא המקורי הגדול (איור 1F). זה מרמז AcrB-P223G אינו קיים כמו trimer על קרום התא כפי שהוצע בעבר21 ומציע הסבר הגיוני מדוע AcrB-P223G מראה ירידה דרמטית בפעילות כאשר assayed16. כדי לאשר את טוהר הדגימות ואת נוכחות החלבון הנכון, ג'לים אלקטרופורזה נוהלו עבור כל דגימות החלבון המטוהרות. הכתמים שהתקבלו אישרו את נוכחותה של AcrB בכל הדגימות עם טוהר של 95% ומיקום הכתם תואם למשקל המולקולרי החזוי של AcrB (איור 1G). התוצאות מהמחקר שלנו אינן עולות בקנה אחד עם הבדיקה המתוארת לעיל FRET לגבי קביעת המצב האוליגומרי של חלבון הממברנה AcrB-P223G16. על ידי ניצול פולימרים פעילים קרום מיקרוסקופ אלקטרונים כמתואר בפרוטוקול המצב האוליגומרי המקורי של החלבון היה נצפה ישירות. קביעה מדויקת יותר של האופן שבו המונומרים של החלבון מתקשרים זה עם זה תדרוש קביעת מבנים קריו-EM ברזולוציה גבוהה.

Figure 1
איור 1: כתמים שליליים ותמונות ג'ל אלקטרופורזה של מבני AcrB מטוהרים. (A) תמונת כתם שלילית שצולמה עבור סוג פראי AcrB מטוהר עם DDM. (B)תמונת כתם שלילית שצולמה עבור מבנה החלבון AcrB-P223G מטוהר עם DDM. (C) תמונת כתם שלילית שצולמה עבור סוג פראי AcrB מטוהר עם NCMNP1-1. (D) תמונת כתם שלילית נלקחה עבור מבנה AcrB-P223G מטוהר עם NCMNP1-1. (ה)תמונת כתם שלילית שצולמה עבור סוג פראי AcrB מטוהר עם NCMNP5-2 (התיבה האדומה מדגישה כמה חלקיקי טרימר שנצפו בתמונה). (F) תמונת כתם שלילית שצולמה עבור AcrB-P223G מטוהרת עם NCMNP5-2 (התיבה הירוקה מדגישה חלק ממדבקות השומנים שנלכדו על ידי NCMNP5-2 שנצפו בתמונה). (G)SDS-PAGE ג'ל לרוץ באמצעות המוצרים הסופיים מן הטיהורים של AcrB-P223G עם DDM (נתיב 1), NCMNP1-1 (נתיב2), (H) SDS-PAGE ג'ל לרוץ באמצעות המוצרים הסופיים מן הטיהורים של AcrB-P223G עם NCMNP5-2. (I) הגדלה של התכונות המסומנות מאיור 1E. (J) הגדלה של התכונות המסומנות מ- F. כל תמונות הכתמים השליליות באיור 1 כוללות פס קנה מידה זהה של 50 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מאגרי טיהור DDM מאגרי טיהור פולימרים מאגרי אלקטרופורזה ג'ל
מאגר א' 50 מ"מ HEPES, עמ' 7.8 מאגר NCMN A 50 מ"מ HEPES, עמ' 8.4 מאגר TAE בסיס טריס 40 מ"מ
300 מ"מ NaCl 500 מ"מ NaCl 1 מ"מ אדטה
5% גליצרול 5% גליצרול 20 מ"מ חומצה אצטית
20 מ"מ Imidazole 20 מ"מ Imidazole
1 mM MgCl2-6 H2O 0.1 מ"מ TCEP
0.1 מ"מ TCEP
מאגר ב' 50 מ"מ HEPES, עמ' 7.8 מאגר NCMN B 25 מ"מ HEPES, עמ' 7.8 ביטול תיוג מאגר 40% מתנול
300 מ"מ NaCl 500 מ"מ NaCl 10% חומצה אצטית
5% גליצרול 5% גליצרול
40 מ"מ אימידזולה 40 מ"מ אימידזולה
1 mM MgCl2-6 H2O 0.1 מ"מ TCEP
0.1 מ"מ TCEP
מאגר C 50 מ"מ HEPES, עמ' 7.8 מאגר NCMN C 25 מ"מ HEPES, עמ' 7.8 ג'ל לערום 1.5 M Tris pH 8.8 (0.63 מ"ל)
300 מ"מ NaCl 500 מ"מ NaCl 30% אקרילאמיד/ביס (0.43 מ"ל)
5% גליצרול 5% גליצרול 10% SDS (0.025 מ"ל)
75 מ"מ אימידזול 75 מ"מ אימידזול 10% APS (0.025 מ"ל)
1 mM MgCl2-6 H2O 0.1 מ"מ TCEP TEMED (4 מיקרומטר)
0.1 מ"מ TCEP H2O (1.39 מ"ל)
מאגר D 50 מ"מ HEPES, עמ' 7.8 מאגר NCMN D 25 מ"מ HEPES, עמ' 7.8 12% ג'ל מפריד 1.5 M Tris pH 8.8 (1.3 מ"ל)
300 מ"מ NaCl 500 מ"מ NaCl 30% אקרילאמיד/ביס (2 מ"ל)
5% גליצרול 5% גליצרול 10% SDS (0.05 מ"ל)
300 מ"מ אימידזול 300 מ"מ אימידזול 10% APS (0.05 מ"ל)
1 mM MgCl2-6 H2O 0.1 מ"מ TCEP TEMED (5 מיקרומטר)
0.1 מ"מ TCEP H2O (1.6 מ"ל)
מאגר E 40 מ"מ HEPES, עמ' 7.8 מאגר NCMN E 40 מ"מ HEPES, עמ' 7.8
200 מ"מ NaCl 200 מ"מ NaCl
0.1 מ"מ TCEP 0.1 מ"מ TCEP

טבלה 1: רשימת מאגרי טיהור המשמשים לכרומטוגרפיה של עמודה ואלקטרופורזה של ג'ל.

איור משלים 1: פרופילי אלות כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל. (A)גרף כיסוי של שני פרופילי elution שנצפו עבור ניסויים כרומטוגרפיה הדרת גודל שבוצעו בעת טיהור עם DDM וסוג פראי AcrB (כתום) ועם DDM ואת מוטציה AcrB-P223G (כחול). (B) פרופיל כיול עמודות עבור עמודת אי-הכללת גודל המשמשת לניסויי DDM.
1: תירוגלובולין (מר 669 000), 2: פריטין (מר 440 000), 3: אלדולאז (מר 158 000), 4: קונלבומין (מר 75 000), 5: אובלבומין (מר 44 000), 6: Anhydrase קרבוני (מר 29 000), 7: ריבונוקלאאז A (מר 13 700). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אינטראקציות חלבון חלבון חשובות לשלמות המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה. גישות רבות פותחו כדי לחקור אינטראקציות חלבון חלבון. בהשוואה לחלבונים מסיסים, חלבוני ממברנה ו- PPIs שלהם קשה יותר ללמוד בשל המאפיינים המהותיים הייחודיים של חלבוני ממברנה. קושי זה נובע בעיקר מהדרישה של חלבוני ממברנה להיות מוטבע בסביבה bilayer השומנים המקומי עבור יציבות מבנית ופונקציונליות. זה הופך להיות בעייתי כי על מנת לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של החלבונים הם חייבים להיות מופקים מן קרום התא. FRET כבר טכנולוגיה פופולרית לחקור אינטראקציות חלבון חלבון על קרום התא, עם זאת, הרזולוציה נמוכה ולעתים קרובות מייצרת תוצאות חיוביות שגויות17,18,19,20. כאן הוא הוכיח, בפעם הראשונה, כי NCMNs יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבון חלבון קרום על ידי ניתוח מבני של סוג פראי AcrB trimer ו מונומר AcrB-P223G על קרום התא המקורי והשוואת תוצאות עם הניתוח הקודם באמצעות FRET. על ידי השוואת מיקרוסקופ אלקטרונים תמונות חלקיק יחיד מסוג AcrB ו AcrB-P223G, הוא הציע כי רוב AcrB-P223G אינו יוצר trimers על קרום התא E.coli כמו חלבון AcrB סוג הבר כאשר מטוהרים באמצעות פולימרים פעילים קרום, כמו NCMNP1-1 ו NCMNP5-2. אנו מציעים כאן כי התוצאות מניתוח FRET עשויות להיות חיוביות כוזבות הנובעות ממגבלת ההחלטה של גישת FRET. קשר דיסולפיד מלאכותי שייצב את קויצר AcrB-P223G יכול להיות גם חפץ שהתרחש בפתרון21. תמונות הכתם השליליות מצביעות על כך שהמוטציה P223G מנעה היווצרות של גוזם AcrB וכי הצורה המונומרית של AcrB לא יכלה להישאר באותו קונפורמציה שנצפתה כאשר בצורתה הטרימרית. הלולאה המכילה מוטציה זו הוצגה בעבר כקריטית לחלוטין להיווצרות השלוחה באמצעות ניתוח מוטגני ומביני, שהראה את משמעותה המבנית בשל האינטראקציות שכל לולאה יוצרת על ידי קבורה לתוך מונומר AcrB השכן23.

על ידי ניצול מערכת ננו-חלקיקים קרום התא המקורי לגילוי וניתוח אינטראקציה חלבון-חלבון ניתן לזהות ישירות את המצב האוליגומרי של חלבון על ידי שמירה על החלבונים קרום (s) בסביבת קרום התא המקורי באמת, אשר ניתן להשתמש בהם להשגת מידע מבני ברזולוציה גבוהה ברמה האטומית באמצעות ניתוח קריו-EM חלקיק יחיד של המדגם. מערכת NCMN מסייעת למנוע את תוצאות חיוביות שגויות תכופות ותשלילים כוזבים שנצפו בזיהוי PPI הנגרמים על ידי טיפול בדגימות עם חומרי ניקוי24. תוצאות כוזבות אלה מתעוררות בדרך כלל, בגלל הצבירה, denaturation של דגימת חלבון, ניתוק של אינטראקציות שאינן covalent, היווצרות של מצבים אוליגומריים מלאכותיים הנגרמת על ידי השפעות ההזיות של חומרי ניקוי. בנוסף, שימוש בניתוח מבני בשילוב עם NCMNs מספק מידע מבני נוסף ומאפשר תצפית ישירה של אינטראקציות מולקולריות, שהן קריטיות להבנת PPIs ובדרך כלל אבדו בעת שימוש בשיטות מבוססות בעבר של זיהוי PPI. שיטה זו שימשה בהצלחה למחקרים מבניים מסוג בר AcrB ויכולה להיות ישימות רחבה לצורות אחרות של ניתוח מבני, כגון קריסטלוגרפיה רנטגן ומצב מוצק NMR, וחלבונים רבים ושונים המשמשים במחקרים אחרים המבקשים לקבוע את האינטראקציות המוצגות על ידי מטרות חלבון חדשניות.

על מנת להשיג תוצאות לשחזור עם תשואות חלבון סבירות של טוהר גבוה ישנם מספר צעדים קריטיים בתהליך הטיהור עם פולימרים פעילים קרום שיש לעקוב אחריהם. הצעד הקריטי הראשון הוא תהליך של בידוד ממברנה, ולכן זה קריטי כדי צנטריפוגה התא lysate ב 15,000 x g ובצע את הצעד הזה עם ultracentrifugation ב 215,000 x g על מנת לבודד באמת את קרום התא משאר lysate התא. השלב הקריטי הבא הוא לסכל את שבר הממברנה עם פולימרים פעילים קרום בריכוז של 2.5% בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. ניסויי אופטימיזציה של הטיהור בוצעו וניצול פרמטרים אלה בשלב זה הוכח כדי להבטיח כי הכמות האופטימלית של AcrB מופק מן הממברנה היווצרות נכונה של חלקיקי קרום התא המקורי מתרחשת. השלב הקריטי האחרון של תהליך הטיהור הוא טעינת הדגימה על עמוד Ni-NTA בטמפרטורת החדר. זה הכרחי, כי פולימרים פעילים קרום הם מסיסים יותר בטמפרטורת החדר מאשר ב 4 מעלות צלזיוס, ובכך טעינה בטמפרטורת החדר יגדיל את כמות החלבון מחייב על עמוד הזיקה ולהימנע מלחץ גבוה שנגרם על ידי הצטברות פולימר בלתי מסיס שעלול לגרום נזק לעמוד. חשובים כמעט באותה מידה להשגת מידע מבני מדויק הם השלבים הכלולים בהליך הכתם השלילי שהוזכר לעיל. ההיבטים הקריטיים ביותר של הליך זה כוללים את השימוש ברשתות פחמן חוריות בעובי 10 ננומטר, כמויות מים ואצטט אורניל, ואת משך הזמן לספחה לדוגמה וכתמים. ניצול של פרמטרים מרכזיים אלה במהלך הכנת מדגם יבטיח נתונים מבניים איכותיים שניתן להשתמש בהם להערכה מדויקת של המצבים האוליגומריים של המדגם להיות בתמונה. שינויים בפרוטוקול הטיהור עשויים להיות נחוצים בעת שימוש בחלבונים שונים כדי לפתור את הבעיות שעלולות להתעורר בשל המאפיינים הייחודיים של פוליפפטידים שונים. הגורמים העיקריים שיש לקחת בחשבון שינוי כאשר מתקשים לקבל כמות נאותה של דגימת חלבון צריך להיות הפרמטרים המשמשים במהלך שלב האינדוקציה, כמות שבר קרום בשימוש בשלב solubilization, ואת משך הזמן והטמפרטורה עבור תהליך solubilization. אם יש בעיה עם טוהר ייתכן שיהיה צורך להשתמש בעמודות זיקה חלופיות, כגון עמודת זיקה ביוטין, במקום להשתמש בעמודה Ni-NTA לטיהור. באופן דומה, אם יש צורך בשמירה על אינטראקציות חלשות/ארעיות של חלבון חלבון, החלפת עמודת Ni-NTA בעמודת זיקה לתג TAP מועילה לתוצאות מיטביות. לבסוף, כאשר לומדים חלבוני יונקים, יש להשתמש במערכות ביטוי של יונקים כדי לשמור על הרכבי שומנים אמיתיים של קרום התא המקומי הדרושים לקביעה מדויקת של המצב האוליגומרי הטבעי של החלבון. פעולה זו תדרוש תיקון מלא של ביטוי החלבון ושלבי התמוגה של פרוטוקול זה. במקרים כאלה, יש לעקוב אחר פרוטוקולים שנקבעו בעבר לביטוי חלבון ולתזה של תאים התואמים למערכת הביטוי הדרושה לחלבון היעד המעניין.

השימוש ב- NCMNs עם מיקרוסקופ אלקטרונים מציג יתרונות גדולים בהשוואה ל- FRET לשימוש בזיהוי PPIs. כפי שמראה תוצאות מחקר זה, הניסויים שבוצעו בעבר FRET לא היו עולים בקנה אחד עם הניתוח המבני של המבנה האוליגומרי של חלבון מוטציה AcrB21. זה הוצג בבירור ואושר ישירות על ידי התמונות שצולמו עם מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי, אשר עולים בקנה אחד עם אובדן הפעילות שתואר בעבר עבור מוטציה AcrB-P223G16. אם AcrB-P223G אכן יצרו גוזרים ב- vivo הפולימר NCMNP5-2 היה תופס אותם במדבקות קרום התא המקומי הגדול שהוא מחלץ. ייתכן כי ניתוח FRET של מוטציה AcrB הביא חיובי כוזב בשל כל המגבלות מספר כי הם מהותיים לתהליכים הפיזיים הטכניקה מסתמכת על הטכנולוגיה מנוצלת כדי למדוד את העברות אנרגיה תהודה פלואורסצנטית. מגבלה מרכזית אחת של FRET היא מגבלות הרזולוציה של מיקרוסקופיה קונפוקלית וזה מוביל למגבלות חמורות במרחקים הבין-מולקולריים המסוגלים להיפתר עם מבחני FRET19. לשם השוואה, שימוש ב- NCMNs בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים אינו כפוף למגבלה הנ"ל של FRET, עם מגבלות רזולוציה גבוהות משמעותית בהשוואה לאלה של מיקרוסקופיה קונפוקלית. בהתבסס על מגבלות אלה שיש השפעות פוטנציאליות על מבחני FRET שתוארו קודם לכן, אנו מניחים כי זיהוי שגוי של חותך AcrB-P223G ב vivo נבע ממגבלת הרזולוציה הנמוכה של FRET21. מלבד היתרונות על פני רק FRET הצביע ישירות על ידי נייר זה, באמצעות NCMNs בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים יש את היתרון על פני כל טכניקות האינטראקציה הנוכחי חלבון חלבון, כגון מערכת Y2H ו TAP-MS, בכך שניתן להשתמש בו כדי לבחון אינטראקציות חלבון חלבון בסביבות קרום התא המקומי ישירות ברזולוציה גבוהה ויש לו פוטנציאל לשמש כדי לקבוע את מבני החלבון ברמה האטומית.

פולימרים פעילים ממברנה ומיקרוסקופ אלקטרונים אינם ללא מגבלות גם כן. נכון לעכשיו, הנושא העיקרי של טיהור NCMN הוא יעילות החילוץ הנמוכה יותר שלה בהשוואה לשיטות מבוססות חומר ניקוי (הפולימרים בספריית NCMN מציגים ~ 70% את יעילות החילוץ של DDM). כמו כן, יש לו בעיות תאימות עם עמודות זיקה מסוימות, כגון עמודות איגוד maltose. יתר על כן, טיהור NCMN עדיין לא מוצלח מאוד עם חלבונים או קומפלקסים קרום דינמי מאוד (נתונים שלא פורסמו). שימוש בפולימרים פעילים בקרום ובמיקרוסקופ אלקטרונים לניסויים בקביעת מצב אוליגומרי דורש הסרת החלבונים מסביבת התאים המקומית, ואילו FRET מתבצע ב- vivo. עם זאת, חלקיקים שנוצרו על ידי פולימרים פעילים קרום לאפשר את הסביבה הטבעית ביותר האפשרית בעת חילוץ החלבונים מתאים, כדי להפחית את אי דיוקים נגזרים ניסיונית פוטנציאלי הידוע להיגרם על ידי מיצוי חלבון וטיהור. בנוסף, בעוד שנושא הרזולוציה וגודל החלקיקים כמגבלה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת פחת באופן משמעותי בעשור האחרון, המיקרוסקופים שעדיין משמשים לניתוח כתמים שלילי עדיין יוגבלו יחסית למולקולות גדולות יותר או למתחמים מולקולריים (>200 kDa) מכיוון שבדרך כלל יש להם מגבלת מידע של כ 0.1-0.3 ננומטר25. SMALP גם הוכיח להיות גמיש מאוד במונחים של יישומים, אך מציג מגבלות גדולות עוד יותר מאשר NCMNs. nanodiscs שנוצרו על ידי SMA יש קוטר מרבי של בערך 15 ננומטר ולכן הם בדרך כלל לא יעיל לחילוץ חלבונים קומפלקסים חלבון כי הם מעל 400 kDa26. בנוסף למגבלה זו, SMA גם אינו מסוגל לעבוד עם חלבונים הקיימים בסביבות pH נמוכות או לנצל יונים דו-כיווניים למטרות מבניות ותפקודיות. בשל מנגנון SMALPs של פעולה להיות תלוי pH, זה לא יכול לשמש עם תנאים נמוכים pH ו chelates יונים דו-זמנית. בעוד שיטות SMILP ו- DIBMA הציעו הבטחה לגבי התגברות על מגבלות אלה, הישימות שלהם חלבונים סטים מגוונים נשארבלתי נראה 27,28. NCMNs מבקש להתגבר על מגבלות אלה באמצעות ניתוח קשרי מבנה-פעילות (SAR) כדי ליצור פולימרים חלופיים שיכולים ליצור חלקיקים גדולים יותר, לתפקד בתנאי חומציות נמוכים ולהימנע מכלום יונים דו-צדדיים. דוגמה אחת כזו לפולימרים שפותחו עבור NCMNs היא הפולימר NCMNP5-2 המציג את היכולת ליצור חלקיקים גדולים יותר כפי שמודגם באיור 1E,F.

בנוסף להתקדמות שתוארה קודם לכן בטכנולוגיית ננו-חלקיקים, הכיוון העתידי של NCMNs הוא בפיתוח פולימרים פעילים ממברנה עוד יותר שיעניקו לספריית הפולימרים NCMNs יעילות מיצוי מוגברת והיכולת לעבוד עם חלבונים בכל הגדלים השונים של אזור טרנסממברנה, הפועלים ברמות pH רחבות בהרבה, או מסתמכים על כל סוג של יון לשמירה על המבנה והתפקוד שלהם. זה יאפשר לכל חוקרי חלבון הממברנה להשתמש בטכנולוגיה זו בניסויים שלהם ויש להם גישה לתוצאות מדויקות יותר ורלוונטיות ביולוגית. על ידי הבאת היתרונות של חלקיקי פולימר למגוון רחב יותר של חלבונים התקווה היא כי זה יוביל לפתרון מבנים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים חלבון קרום יליד ברמה האטומית ובכך לקבוע את האינטראקציות האטומיות תוך מולקולריות להיכנס לשמירה על מתחמים אלה. התקדמות כזו תאפשר גם אפשרויות חדשות רבות במונחים של גילוי ופיתוח תרופות חלבון קרום באמצעות מאמצי תכנון תרופות מבוססי מבנה. ניצול של טכניקות עיצוב תרופות מבוססות מבנה עבור חלבונים קרום יהיה יתרון עצום עבור התעשייה הרפואית כמו זה יגדיל את הספציפיות מחייבת התרופה ויעילות על מנת להפחית תופעות לוואי לא רצויות ואת כמות המתחם הדרוש כדי לעורר את ההשפעות הטיפוליות הרצויות, ובכך להפוך תרופות היעד חלבונים קרום באופן משמעותי בטוח ויעיל יותר. מערכת חלקיקי קרום התא המקומי עדיין בשלבים ההתפתחותיים שלה, אך כבר הוכיחה את עצמה כעוצמתית מאוד בכך שהיא מאפשרת לראשונה את חקר חלבוני הממברנה במצבם הטבעי באמת ומבהירה את האינטראקציות הטבעיות של חלבון-חלבון המתרחשות על קרום התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

י.ג. רשום כממציא מערכת הפולימר הפעילה של הממברנה NCMNP5-2 ו- NCMN.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי קרן הסטארט-אפ VCU (לי.ג.) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01GM132329 (ל- Y.G.) התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים למונטסראט סאמסו וקווין מקרוברטס על תמיכתם הנדיבה בהקלטת וידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) Bio-Rad 161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) Bio-Rad 1610747
Acetic Acid Glacial ThermoFisher Scientific A38S-212
Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700
Chloramphenicol Goldbio C-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder Bio-Rad 161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free Goldbio DTT10
Glycerol ThermoFisher Scientific G33-4
HEPES ThermoFisher Scientific BP310-1
Imidazole Affymetrix 17525 1 KG
IPTG Goldbio I2481C100
Kanamycin Goldbio K-120-25
Magnesium chloride hexahydrate ThermoFisher Scientific AA3622636
Methanol ThermoFisher Scientific A412-4
N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) Merck 8.03779.0100
NCMNS-P5-2 Not commercially available yet Submit request for obtaining to corresponding author
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) Bio-Rad 161-0301
SMA2000 Cray Valley Submit request for obtaining to corresponding author
Sodium Chloride ThermoFisher Scientific S271-10
TCEP-HCl Goldbio TCEP25
TEMED Bio-Rad 161-0800
Terrific Broth Media Affymetrix 75856 1 KG
Tris Base Bio-Rad 161-0719
Uranyl Acetate Ambinter Amb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPI Beckman Coulter B14538
Avanti JXN-30 Beckman Coulter B34193
Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) Electron Microscopy Sciences CF300-Cu-TH
Con-Torque Tissue Homogenizer Eberbach E7265
Corning LSE Mini Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 07-203-954
EmulsiFlex-C3 Avestin
Fraction Collector F9-R GE Healthcare Life Sciences 29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 165-8004
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder Wheaton 358013
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump Razel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 28990944
Tecnai F20 200kV FEI
Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter
General Materials
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa Millipore Sigma UFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLC GE Healthcare Life Sciences 29018225
BL21(DE3)pLysS Cells ThermoFisher Scientific C606003
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A
HisTrap HP 5 ml Column GE Healthcare Life Sciences 17524802
pET-24a EMD Biosciences 69749-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

Tags

ביוכימיה בעיה 161 SMALP מערכת חלקיקי קרום התא המקומי חלבון קרום ממטין חלקיקים קביעת מצב אוליגומרי
מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kroeck, K. G., Qiu, W., Catalano,… More

Kroeck, K. G., Qiu, W., Catalano, C., Trinh, T. K. H., Guo, Y. Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis. J. Vis. Exp. (161), e61298, doi:10.3791/61298 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter