Summary
Здесь представлен протокол для определения олигомерного состояния мембранных белков, который использует наночастицу родной клеточной мембраны в сочетании с электронной микроскопией.
Abstract
Белково-белковые взаимодействия в клеточных мембранных системах играют решающую роль в широком диапазоне биологических процессов - от взаимодействия клеток к клетке до трансдукции сигнала; от зондирования экологических сигналов до биологической реакции; от метаболической регуляции до контроля развития. Точная структурная информация белково-белковых взаимодействий имеет решающее значение для понимания молекулярных механизмов мембранных белковых комплексов и для разработки высокоспецифических молекул для модулирования этих белков. Для обнаружения и анализа белково-белковых взаимодействий были разработаны многие подходы in vivo и in vitro. Среди них структурный подход биологии уникален тем, что он может обеспечить прямую структурную информацию белково-белковых взаимодействий на атомном уровне. Тем не менее, текущая мембрана белка структурной биологии по-прежнему в значительной степени ограничивается моющих средств на основе методов. Основным недостатком моющих средств на основе методов является то, что они часто диссоциируют или денатурации мембраны белковых комплексов, как только их родной липидный двуслой окружающей среды удаляется моющих средств молекул. Мы разрабатываем родная клеточная мембранная наночастица системы мембранного белка структурной биологии. Здесь мы демонстрируем использование этой системы в анализе белково-белковых взаимодействий на клеточной мембране с помощью исследования олигомерного состояния AcrB.
Introduction
Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) играют ключевую роль на протяжении всей биологии, от поддержания структуры и функции белков до регуляции целых систем. ИЦП бывают разных форм и могут быть классифицированы в зависимости от того, какие типы взаимодействий они формируют. Одной из таких категоризации является гомоолигомерная или гетероолигомерная, основанная на том, находятся ли взаимодействия между идентичными субъединицами или различными белками, действующими в качестве субъедилентов. Другая категоризация основана на силе взаимодействия, если взаимодействия приводят к формированию стабильных комплексов или переходных сложных состояний. Структурная информация о ИЦП между белками имеет решающее значение для понимания механизма, с помощью которого белки выполняют свою функцию. Было подсчитано, что более 80% белков полагаются на сложное образование для того, чтобы выполнять свои функциональные функции1. Учитывая процент белков наблюдается полагаться на ИЦП для надлежащего врожденного функционирования их значение в биологии является очевидным, но возможность правильно исследовать белки, которые участвуют в этих взаимодействий остается сложной задачей из-за ограничений в методах, доступных для экспериментального наблюдения, когда белки формируют ИЦП.
Существует высокая степень разногласий между результатами для многих экспериментально определенных ИЦП из-за большого количества шума, ложных срабатываний и ложных негативов, которые являются производными от многих из имеющихся в настоящее время методов определения ИЦП. Это особенно актуально для дрожжей двух-гибридной (Y2H) системы, тандем сродства очистки массы спектрометрии (TAP-MS), и флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET), которые представляют собой три изнаиболее часто используемых методов дляопределения ИЦП 2,3,4,5,6,7. Для сравнения, методы структурной биологии белка, такие как ядерный магнитный резонанс (NMR), рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия (EM), могут быть использованы для получения структурной информации высокого разрешения о белково-белковых взаимодействиях вплоть до атомного уровня и позволяют прямое визуальное подтверждение взаимодействий, происходящих для целевого белка интереса. Все имеющиеся в настоящее время неконституции на основе ИЦП определения методов исследования (например, Y2H, TAP-MS, и FRET) не имеют этой способности и дополнительно страдают от трудностей в выявлении слабых и переходных взаимодействий междубелками 5. Эти недостатки еще больше усиливаются при изучении мембранных белков из-за дополнительной сложности, вызванной дополнительной переменной липидной среды, которая влияет на формирование надлежащей четвертичных структур и гетеромерной сложной сборки.
Мембранные белки составляют большую часть протеома и, как известно, играют важную роль в надлежащем функционировании клеток во всех живых организмах. Несмотря на то, что мембранные белки, по оценкам, составляют 27% генома человека и составляют 60% от всех текущих целей наркотиков есть серьезная аномалия в количестве решенных моделей мембранных белков, которые составляют лишь 2,2% от всех опубликованныхбелковых структур 8,9,10. Основная причина расхождения в доступности структурной информации заключается в внутренних свойствах самих мембранных белков. Из-за их плохой solubility, опоры на взаимодействия с липидной средой для поддержания родной структуры и функции, и различные физико-химические свойства самой липидной мембраны, мембранные белки продолжают представлять собой существенную проблему при реализации структурных методов биологии для их изучения. Из этих свойств, наиболее важным для получения точной структурной информации является требование иметь взаимодействия с их естественной липидной среды для них, чтобы сохранить свою родную структуру и функцию. Липидная среда является такой неотъемлемой частью структуры и функции мембранных белков, что концепция memtein (сочетание слов мембраны и белка) была предложена в качестве основной единицы мембраны-белковой структуры ифункции 11. Несмотря на важность липидно-белковых взаимодействий, имеющиеся в настоящее время методы определения ИЦП на основе структуры часто требуют, чтобы изучаемые белки были растворимыми или растворялись моющими средствами. Воздействие суровых моющих средств может денатурировать белки или вызвать ложные срабатывания и негативы из-за делипидации, которые могут вызвать агрегацию, денатурацию белка, диссоциацию нековалентных взаимодействий и образование искусственных олигомерных состояний. В связи с необходимостью поддержания естественной липидной среды для точного определения родного олигомерного состояния мембранных белков мы разработали систему наночастиц коренных клеток Membrane (NCMNs)12 на основе ранее зарегистрированного метода Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.
SMALP использует стирола мужской кислоты кополитера в качестве мембраны активного полимера для извлечения и solubilize мембранных белков. Поли (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) является уникальным амфифилическим полимером из-за его гидрофобного стирола moiety и диаметрально противоположных гидрофильных мужских кислот moiety. Он образует наночастицы путем адсорбирования, дестабилизации и нарушения клеточной мембраны в рН-зависимом механизме14. Эта функциональная деятельность SMA является то, что позволяет использовать его в качестве моющего средства свободной системы для извлечения мембранного белка и solubilization. Система NCMN отличается от системы SMALP по нескольким аспектам. Самой уникальной особенностью системы NCMN является то, что она имеет мембранную активную полимерную библиотеку с множеством полимеров, которые имеют уникальные свойства, которые делают их пригодными для изоляции различных мембранных белков, которые требуют различных условий для стабильности и постоянного функционирования. Система NCMN также имеет различные протоколы по сравнению с методом SMALP, когда дело доходит до подготовки наночастиц. Одним из таких примеров является то, что NCMNs используют одноступенчатую очистку столбца сродства никеля для определения структуры с высоким разрешением; эффект этих различных протоколов можно наблюдать при сравнении протокола NCMNs, который генерируется 3,2 и 3,0 кро-EM AcrB структур, с аналогичным исследованием с использованием метода SMALP, в результате чего крио-EM AcrB структуры на 8,8й разрешение 12,15. Эти уникальные особенности системы NCMN являются улучшения, сделанные на ранее установленный метод SMALP и сделать его идеальным кандидатом для изучения ИЦП.
Многоразовой эффлюкс транспортер AcrB существует как функциональный гомотример в кишечной палочке12. Мутагеничный анализ показал, что одна мутация точки P223G, расположенная на петле, которая отвечает за стабильность тримера AcrB, дестабилизирует состояние тримера и дает мономер AcrB при приготовлении с моющим средством DDM, который может быть обнаружен с помощью родного синегогеля электрофорез 16. Тем не менее, анализ FRET мутанта AcrB-P223G показал, что, когда в среде липидного бислойного облизываемых клеток, большинство мутантов AcrB-P223G все еще существовали как тример и что уровни экспрессии как для дикого типа AcrB, так и для AcrB-P223G похожи. Тем не менее, несмотря на результаты анализа FRET, анализ активности для мутантного транспортера показал, что активность резко снизилась по сравнению с диким типом16. Хотя технология FRET широко используется для анализа белково-белковых взаимодействий, исследования показали, что она часто может давать ложныесрабатывания 17,18,19,20.
Недавно были определены крио-ЭМ-структуры тримера AcrB, которые показали взаимодействие AcrB с связанным с ним липидным бислойным бислойным липидным бислоем изместных клетокс помощью NCMNs 12 . В принципе, NCMNs можно охотно использовать для анализа взаимодействий протеин-протеина найденных на родной мембране клетки. В ходе испытания этой системы были проведены эксперименты по непосредственному наблюдаю за олигомерным состоянием AcrB-P223G с использованием наночастиц наночастиц на мембраны родных клеток и отрицательной окрашивающей электронной микроскопией. Для сравнения с наночастицами дикого типа AcrB мы использовали тот же мембранный активный полимер (SMA2000, сделанный в нашей лаборатории, который индексирован как NCMNP1-1 в библиотеке NCMN), используемый для определения структуры AcrB с высоким разрешением и альтернативных полимеров, найденных в библиотеке NCMNs12. Основываясь на ранее сообщенных результатах, ожидалось, что большинство мутантов AcrB-P223G будет существовать в виде тримерных наночастицнаночастиц на мембраны родной клетки 21. Тем не менее, не AcrB тримеры были найдены присутствующих в образце, таких, как те, которые наблюдались с диким типом AcrB. Это говорит о том, что большинство AcrB-P223G не формирует тримеры на мембране родной клетки, как предполагалось ранее.
Здесь мы сообщаем подробный анализ мутанта E. coli AcrB-P223G в сравнении с диким типом E. coli AcrB с использованием NCMNs. Это исследование AcrB предполагает, что NCMNs является хорошей системой для анализа взаимодействия белка и белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выражение белка
- Прививка 15 мл потрясающий бульон (ТБ) СМИ с антибиотиками, специфичные для плазмидов с BL21(DE3) pLysS клеток, содержащих AcrB экспрессии плазмидов в 50 мл трубки ночь при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 250 об/мин.
- Проверьте оптическую плотность ночной культуры на 600 нм (OD600) и убедитесь, что она составляет более 2,0.
- Разбавить 5 мл клеточной культуры в 1 л противотуберкулезных средств, содержащих антибиотики, специфичные для плазмидов и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с встряхивания до OD6000,8, а затем вызвать с IPTG, который имеет окончательную концентрацию 1 мМ.
- Провести индукцию при 20 градусов по Цельсию со встряхивания в течение 20 ч.
- Пеллет вниз клетки с помощью центрифугации в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию и 4000 х г.
2. Клеточныйлиз и мембранная изоляция
- Повторное использование клеточной гранулы в буфере A(таблица 1, использование DDM Buffer A или NCMNs Buffer A в зависимости от схемы очистки, которая должна следовать) с использованием 80 мл на каждые 20 г клеточной гранулы.
- Гомогенизировать перерасход гранулы клеток с помощью стекла Dounce гомогенизатор при температуре 4 градусов по Цельсию или если при комнатной температуре не забудьте поставить на лед сразу после.
- Перенесите образец в металлический стакан на льду и высасывайте клетки, загрузив их в гомогенизатор высокого давления при 4 градусах Цельсия и 1500 бар.
- Повторите процесс загрузки клеток в гомогенизатор и позволяя им проходить через гомогенизатор в течение 3-4 циклов или до тех пор, пока лизат не начнет проясняться.
- Центрифуга лизате при 15 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
- Соберите супернатант и загрузите в ультрацентрифуговые трубки и центрифугу при 215 000 х г за 1 ч при 4 градусах Цельсия.
- Откажитесь от супернатанта и соберите мембранные гранулы из ультрацентрифуговых трубок. Храните излишки мембранных гранул при -80 градусов по Цельсию.
3. Подготовка наночастиц наночастиц на мембраны родных клеток
- Resuspend 1 г мембранных гранул в 10 мл NCMNs Buffer A (Таблица 1).
- Гомогенизировать образец повторной клеточной мембраны со стеклянным гомогенизатором Dounce при 20 градусах Цельсия.
- Перенесите подвесной образец мембраны в полипропиленую трубку 50 мл и добавьте мембранный активный полимерный раствор и дополнительные NCMNs Buffer A, чтобы довести образец до конечной концентрации 2,5% (w/v) мембранного активного полимера (NCMNP1-1 или NCMNP5-2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы мембранных активных полимеров должны быть сделаны в двойной дистиллированной воде и могут храниться в различных концентрациях, но, как правило, 10% (w/v). - Встряхните образец в течение 2 ч при 20 градусах Цельсия.
- Загрузите образец в ультрацентрифуг и вращайте при 150 000 х г в течение 1 ч при 20 градусах Цельсия.
- В то время как образец в настоящее время ультра-центрифугированных начинают уравночные 5 мл Ni-NTA колонки с 25 мл NCMNs Buffer A.
- Соберите супернатант после ультрацентрифугации и загрузите его на 5 мл колонки Ni-NTA при комнатной температуре со скоростью потока 0,5 мл/мин с помощью шприц-насоса.
- Вымойте быструю белковую жидкую хроматографию (FPLC) линиями с достаточным количеством NCMNs Buffer B(таблица 1),чтобы полностью промыть систему, а затем подключить столбец к машине FPLC.
- Вымойте столбец с 30 мл NCMNs Buffer B с скоростью потока 1 мл/мин и соберите поток до конца.
- Вымойте столбец с 30 мл NCMNs Buffer C (Таблица 1) с скоростью потока 1 мл/мин и соберите поток до конца.
- Уберите белок с 20 мл NCMNs Buffer D(таблица 1) со скоростью потока 0,5 мл/мин и соберите образец с помощью коллектора фракций и фракций, каждая из которых устанавливается до 1,0 мл.
- Храните образцы белка при 4 градусах Цельсия.
- Запустите SDS-PAGE гель электрофорез анализа для того, чтобы проверить образцы, которые соответствуют пикам наблюдается на графике FPLC elution.
4. Электрофорез геля SDS-PAGE
- Подготовьте литье камеры, зажимая стекло для литья аппарата.
- Подготовка 12% разделение гель в соответствии с рецептом, перечисленным в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только TEMED добавляется гель будет полимеризировать быстро так только добавить это один раз готовы залить гель. - Налейте гель, оставляя 2 см ниже нижней части гребня для укладки геля.
- Удалите пузырьки, наслоив верхнюю часть геля 100% изопропанолом и подождите, пока гель разделения полимеризуется.
- Удалите изопропанол и вымойте любые следы изопропанола дистиллированной водой.
- Подготовка укладки геля в соответствии с рецептом, перечисленным в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только TEMED добавляется гель будет полимеризировать быстро так только добавить это один раз готовы залить гель. - Налейте укладку геля поверх геля разделения.
- Добавить гребень в камеру, чтобы сформировать колодцы и ждать укладки гель полностью полимеризации.
- Поместите 1 МКЛ из 1 МТТ в микроцентрифугную трубку для каждого образца фракции, который должен быть запущен на геле.
- Добавьте 7 йл буфера загрузки 4x к каждой трубке также.
- Добавьте 20 МКЛ образца из фракций, которые должны быть запущены на гель для каждой микроцентрифуг трубки.
- Вихрь труб, содержащих образцы.
- Спин вниз образца труб с помощью столешницы микроцентрифуг для 3 с и убедитесь, что все образцы вернулись в нижней части труб.
- Подготовьте гель-электрофорезную клетку, закрепив 12% полиакриламинидную гелевую кассету на место и заполнив внутренние и внешние камеры клетки буфером Tris-acetate-EDTA (TAE)(таблица 1).
- Загрузите молекулярный маркер веса в первую полосу геля с соответствующим объемом, требуемым его инструкциями.
- Загрузите 28 МКЛ образца из каждой трубки, смешанной с DTT и буфером загрузки.
- Поместите крышку электрофорезной ячейки поверх коробки и подключите крышку к электросети.
- Включите источник питания и установите его до 100 В и дайте ему работать в течение 20 минут.
- Через 20 минут увеличьте ток питания до 140 В и продолжайте запускать его еще 30-40 минут или до тех пор, пока полоса погрузочного буферного красителя не достигнет дна кассеты с гелем.
- После завершения электрофорез пятно и де-пятно гель, чтобы визуализировать белковые полосы, содержащиеся в гель.
5. Очистка белка с помощью DDM
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель проведения этого процесса очистки заключается в том, чтобы служить в качестве контроля для экспериментов с использованием мембранных активных полимеров.
- Resuspend 6-10 г мембранных гранул, от шага 2.6, в DDM Buffer A (Таблица 1) с использованием 5 мл/г мембранных гранул.
- Гомогенизировать перерасход образца со стеклом Dounce гомогенизатор при температуре 4 градусов по Цельсию или если при комнатной температуре не забудьте поставить на лед сразу после.
- Перенесите образец в 50 мл полипропиленовой трубки и добавьте DDM и дополнительный DDM Buffer A, чтобы довести образец до конечной концентрации 2% DDM.
- Встряхните образец в течение 2 ч при 4 градусах Цельсия.
- Загрузите образец в ультрацентрифуговые трубки и центрифугу на 1 ч при 4 градусах Цельсия и 150 000 х г.
- В то время как образец в настоящее время ультра-центрифугированных начинают готовить 5 мл колонки Ni-NTA путем мытья с 25 мл DDM Buffer A (Таблица 1).
- После завершения ультрацентрифугации соберите супернатант и загрузите его на 5 мл колонки Ni-NTA при скорости потока 0,5 мл/мин с помощью шприц-насоса.
- Вымойте линии FPLC с достаточным DDM Buffer B и 0,05% DDM(таблица 1), чтобы полностью промыть систему, а затем прикрепить столбец к машине FPLC.
- Вымойте столбец с 30 мл DDM Buffer B и 0,05% DDM со скоростью потока 1 мл/мин и соберите поток до конца.
- Вымойте столбец с 30 мл DDM Buffer C и 0,05% DDM(таблица 1) со скоростью потока 1 мл/мин и соберите поток до конца.
- Уберите белок с 20 мл DDM Buffer D и 0,05% DDM(таблица 1) при скорости потока 0,5 мл/мин и соберите поток с помощью коллектора фракций и фракций, каждая из которых устанавливается до 1,0 мл.
- Выберите фракции, содержащие пик элюции для объединения и концентрации, используя центробежный концентратор и центрифугирование на уровне 4000 х г и 4 градусов по Цельсию до достижения 500 МКЛ.
- Используя цикл 500 йл, загрузите образец в машину FPLC, а затем на столбец исключения размером 25 мл при 4 градусах Цельсия. Elute с использованием 30 мл DDM Buffer E и 0,05% DDM(таблица 1) при скорости потока 0,5 мл/мин и собирать в качестве фракций с размерами фракции установлен на уровне 0,5 мл на фракцию.
- Возьмите фракции и измерить концентрацию белка с помощью 280 нм абсорбции для подтверждения УФ-Vis кривой из графика FPLC elution.
- Соберите 20 йл с каждой фракции выборки, которые соответствуют пикам, наблюдаемым на графике FPLC elution, и было подтверждено, что они точны с тестом на абсорбцию.
- Заморозить оставшуюся часть этих фракций образца с использованием жидкого азота или сухого льда в желаемых алицитах и хранить образцы белка при -80 градусов по Цельсию.
- Запустите SDS-PAGE гель электрофорез анализ, как описано ранее, чтобы проверить образцы, которые соответствуют пикам, наблюдаемым на графике FPLC elution.
6. Отрицательная подготовка сетки пятна
- Поместите сетки, которые будут использоваться для подготовки образца, на стеклянной горке, завернутой в фильтровальную бумагу с углеродной стороной вверх.
- Поместите стеклянную горку с сетками электронного микроскопа в камеру разгрузщика свечения между двумя электродами и замените стеклянную крышку, убедившись, что она по центру и хорошо запечатана.
- Запустите светясь разгрузив машину и убедитесь, что фиолетовый свет, генерируемый плазмой, виден.
- Когда машина будет запущена, подождите, пока камера не достигла атмосферного давления, чтобы снять стеклянную крышку, а затем вернуть слайд с сетками на скамейку, где образцы будут загружены на них.
- Отрегулируйте концентрацию очищенных образцов белка примерно до 0,1 мг/мл, либо разбавляя образец соответствующим буфером, либо концентрируясь с помощью центробежного концентратора.
- Загрузите 3,5 мл образца белка на 10 нм толщиной углеродной сетки и подождите 1 мин.
- Удалите жидкость с поверхности сетки EM с помощью фильтровальной бумаги.
- Вымойте поверхность сетки 3x, подбирая 3 капли воды с сеткой и удаление воды из сетки с фильтровальной бумагой между собирание каждой капли.
- Вымойте поверхность сетки 2x, подбирая 3 капли свежих, фильтрованных 2% ацетата урана и удалить растворы мытья на сетке с фильтровальной бумагой между собирание каждой капли.
- Пятно сетки с каплей 3 йл свежего, фильтрованного 2% ацетата урана в течение 1 мин.
- Удалите раствор ацетата урана на поверхности сетки EM с помощью фильтровальной бумаги и высушите сетку не менее 1 мин.
- Храните сетку в сетке для более длительного использования.
7. EM изображения
- Загрузите подготовленную сетку в держатель сетки на безопасной рабочей скамье.
- Подготовьте микроскоп, поместив микроскопы dewar в полистирол поле и заполнить двойной 3/4th полный жидкого азота.
- Подтвердите, что резиновая крышка окна микроскопа покрывает его, а затем загрузить двойки на микроскоп, поместив медные провода в двойки, пока он не помещается на платформе.
- Заполните оставшуюся часть двойки жидким азотом и поместите крышку поверх двойки, чтобы покрыть ее.
- Включите высокое напряжение, состояние микроскопа, и ждать микроскопа, чтобы согреться и установить безопасный уровень вакуума для использования.
- После того, как микроскоп готов открыть клапан колонки и подтвердить луч присутствует, удалив резиновую крышку на микроскоп окно.
- Проверьте клеймо луча путем распространения в и из путем корректировки интенсивности пучка. Если астигматизм присутствует, луч будет иметь эллиптической формы, как один отходит от перекрестного и луч должен быть той же овальной формы с обеих сторон.
- Отрегулируйте бинокль микроскопа, чтобы быть правильной высотой и расстоянием в соответствии с глазами наблюдателя.
- Проверьте позиционирование луча для поиска, Фокус, и режимы экспозиции, езда на велосипеде через все три режима, пока луч находится в центре в каждом.
- Закройте столбец клапана и перейти к загрузке держателя сетки в электронный микроскоп.
- Отрегулируйте микроскоп до eucentric высоты с помощью функции воблер микроскопов и регулировки движения сцены с помощью оси З, пока не будет из стороны в сторону движения образца в центре.
- Используя режим поиска низких доз на микроскопе, ищите сетку для желаемой области разумного контраста с присутствующими молекулами образца, чтобы сосредоточиться на образце.
- Сосредоточьтесь на примере в режиме Фокус, используя высокий размер шага, пока не будет виден образец, а затем уменьшите шаги, чтобы найти правильный уровень фокусировки.
- Нулевой и пустой луч, а затем убедитесь, что резиновая колодка покрывает окно микроскопа.
- Используя режим Экспозиции, сделайте изображение нужной области сетки для экспозиции 1 с при увеличении в 62 000 раз и проверьте полученное изображение.
- При выполненной визуализации сетка закрывает клапаны столбца и удаляет держатель сетки из столбца.
- При законченной визуализации все сетки, представляющие интерес, выключают микроскоп, выключая мощность нити и удаляя живойну жидкого азота из микроскопа.
- Поместите что-то поглощать влагу на стенде, где девар сидел, чтобы поймать конденсат из медных катушек микроскопа.
- Активируйте режим Cryo Cycle и убедитесь, что турбо-насос выключен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя представленные здесь процедуры, были очищены образцы дикого типа E. coli AcrB и мутанта E. coli AcrB-P223G. Образцы были затем адсорбированы до углеродного отрицательного пятна электронной микроскопии сетки и окрашенных с помощью уранил ацетата с боковойметодом blotting 22. Отрицательные изображения пятен были собраны с помощью электронной микроскопии передачи. Отрицательное пятно изображения для AcrB дикий тип образца очищены с DDM показывает однородное решение монодисперсных частиц с белком отображения четко определенной тримерической квартерной структуры (Рисунок 1A). Эти тримерные структуры соответствуют наблюдаемому размеру хломатограммы при очистке(дополнительный рисунок 1). Для сравнения, при взгляде на отрицательное пятно изображения для мутанта AcrB-P223G, также очищенный с DDM, можно наблюдать неоднородный раствор полидисперсных наночастиц со склонностью к агрегации, но не наблюдаемые родные тримеры (рисунок 1B). Эти результаты также поддерживаются наблюдаемым профилем элюции при проведении хроматографии исключения размера(дополнительная цифра 1). Чтобы определить, если отсутствие тримерного состояния белков для мутанта было связано с лечением моющим средством или исключительно вызвано дестабилизирующей мутации P223G белки были также очищены с помощью NCMNP1-1, один из мембранных активных полимеров в библиотеке NCMNs. Отрицательное пятно изображения для образца дикого типа AcrB очищены NCMNP1-1, опять же, показывает однородный раствор монодисперсных частиц с белком отображения четко определенной тримерной квартенерной структуры (Рисунок 1C). И так же, как с очисткой DDM, когда мутант AcrB-P223G очищается с NCMNP1-1 отрицательное пятно изображение показывает неоднородный раствор полидисперсных наночастиц со склонностью к агрегации, но не наблюдаемых местных тримеры (Рисунок 1D). Для дальнейшего подтверждения того, что мутация P223G нарушает тример AcrB на клеточной мембране, другой полимер (NCMNP5-2) был выбран из собственной мембраны NCMNs активной полимерной библиотеки. NCMNP5-2 может образовывать наночастицы мембраны родных клеток в гораздо больших размерах, что позволяет несколько тримеры AcrB, которые будут изображены в одной родной частицы мембраны клетки. В результате было отмечено, что несколько тримеры дикого типа AcrB содержались в одиночных частицах(рисунок 1E); однако, никакие частицы тримера AcrB-P223G как те сформированные одичалым типом AcrB не наблюдались, даже смотрящ большие родные заплаты bilayer мембраны родной клетки(рисунок 1F). Это говорит о том, AcrB-P223G не существует в качестве тримера на клеточноймембране, как ранее предлагалось 21 и предлагает логическое объяснение того, почему AcrB-P223G показывает резкое снижение активности прианализе 16. Чтобы подтвердить чистоту образцов и наличие правильного белка, электрофорез гели были запущены для всех очищенных образцов белка. Полученные пятна подтвердили наличие AcrB во всех образцах с чистотой 95% и расположением пятна соответствовали прогнозируемому молекулярному весу AcrB (Рисунок 1G). Результаты нашего исследования несовместимы с ранее описанным анализом FRET в отношении определения олигомерного состояния мембранного белка AcrB-P223G16. Используя мембранные активные полимеры и электронную микроскопию, как описано в протоколе, непосредственно наблюдалось родное олигомерное состояние белка. Более точное определение того, как мономеры белка взаимодействуют друг с другом, потребует определения крио-ЭМ-структур высокого разрешения.
Рисунок 1: Отрицательные пятна и электрофорез гель изображения очищенных конструкций AcrB. (A)Отрицательное пятно изображение, принятое для дикого типа AcrB очищены с DDM. (B)Отрицательное пятно изображение, принятое для AcrB-P223G белка построить очищены с DDM. (C)Отрицательное пятно изображение, принятое для дикого типа AcrB очищены NCMNP1-1. (D)Отрицательное пятно изображение, принятое для AcrB-P223G построить очищены NCMNP1-1. (E) Отрицательное пятно изображение, принятое для дикого типа AcrB очищены NCMNP5-2 (красная коробка подчеркивает некоторые из тример наночастиц наблюдается на изображении). (F) Отрицательное пятно изображение, принятое для AcrB-P223G очищены NCMNP5-2 (зеленая коробка подчеркивает часть липидных патчей, захваченных NCMNP5-2 наблюдается на изображении). (G) SDS-PAGE гель работать с использованием конечных продуктов из очистки AcrB-P223G с DDM (Лейн 1), NCMNP1-1 (lane2), (H) SDS-PAGE гель работать с использованием конечных продуктов от очистки AcrB-P223G с NCMNP5-2. (I) Увеличить выделенные функции с рисунка 1E. (J) Увеличить выделенные функции от F. Все негативные изображения пятна на рисунке 1 имеют одинаковую шкалу бар 50 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Буферы очистки DDM | Полимерные буферы очистки | Гель Электрофорез буферы | |||
| Буфер A | 50 мМ HEPES, рН 7,8 | NCMN Буфер A | 50 мМ HEPES, рН 8,4 | TAE Буфер | База Трис 40 мМ |
| 300 мМм НаКл | 500 мМм НаКл | 1 мМ EDTA | |||
| 5% Глицерол | 5% Глицерол | 20 мМ уксусная кислота | |||
| 20 мМ Имидазол | 20 мМ Имидазол | ||||
| 1 мМ MgCl2-6 H2O | 0,1 мМТ TCEP | ||||
| 0,1 мМТ TCEP | |||||
| Буфер B | 50 мМ HEPES, рН 7,8 | NCMN Буфер B | 25 мМ HEPES, рН 7,8 | Дестинирование буфера | 40% метанол |
| 300 мМм НаКл | 500 мМм НаКл | 10% уксусная кислота | |||
| 5% Глицерол | 5% Глицерол | ||||
| 40 мМ Имидазол | 40 мМ Имидазол | ||||
| 1 мМ MgCl2-6 H2O | 0,1 мМТ TCEP | ||||
| 0,1 мМТ TCEP | |||||
| Буфер C | 50 мМ HEPES, рН 7,8 | NCMN Буфер C | 25 мМ HEPES, рН 7,8 | Укладка гель | 1.5 M Tris pH 8.8 (0.63 мл) |
| 300 мМм НаКл | 500 мМм НаКл | 30% акриламид/бис (0,43 мл) | |||
| 5% Глицерол | 5% Глицерол | 10% SDS (0.025 мл) | |||
| 75 мМ Имидазол | 75 мМ Имидазол | 10% АПС (0,025 мл) | |||
| 1 мМ MgCl2-6 H2O | 0,1 мМТ TCEP | ТЕМЕ ЭД (4 мкл) | |||
| 0,1 мМТ TCEP | H2O (1,39 мл) | ||||
| Буфер D | 50 мМ HEPES, рН 7,8 | NCMN Буфер D | 25 мМ HEPES, рН 7,8 | 12% Разделение геля | 1.5 M Tris pH 8.8 (1.3 мл) |
| 300 мМм НаКл | 500 мМм НаКл | 30% акриламид/бис (2 мл) | |||
| 5% Глицерол | 5% Глицерол | 10% SDS (0.05 мл) | |||
| 300 мМ Имидазол | 300 мМ Имидазол | 10% АПС (0,05 мл) | |||
| 1 мМ MgCl2-6 H2O | 0,1 мМТ TCEP | ТЕМЕ ЭД (5 мкл) | |||
| 0,1 мМТ TCEP | H2O (1,6 мл) | ||||
| Буфер E | 40 мМ HEPES, рН 7,8 | NCMN Буфер E | 40 мМ HEPES, рН 7,8 | ||
| 200 мМм НаКл | 200 мМм НаКл | ||||
| 0,1 мМТ TCEP | 0,1 мМТ TCEP | ||||
Таблица 1: Список буферов очистки, используемых для хроматографии столбца и электрофореза геля.
Дополнительная цифра 1: Размер исключения хроматографии elution профилей. (A)График наложения двух профилей элюциона, наблюдаемых для экспериментов по хроматографии исключения размера, проведенных при очистке с помощью DDM и дикого типа AcrB (оранжевый) и с DDM и мутантом AcrB-P223G (синий). (B)Профиль калибровки столбца для столбца исключения размера, используемого для экспериментов DDM.
1: Тироглобулин (г-н 669 000), 2: Ферритин (г-н 440 000), 3: Aldolase (г-н 158 000), 4: Conalbumin (г-н 75 000), 5: Овалбумин (г-н 44 000), 6: Карбоническая ангидраза (г-н 29 000), 7: Рибонуклеаза А (г-н 13 700). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Белково-белковые взаимодействия важны для целостности структуры и функции мембранных белков. Многие подходы были разработаны для исследования белково-белковых взаимодействий. По сравнению с растворимыми белками мембранные белки и их ИЦП труднее изучать из-за уникальных внутренних свойств мембранных белков. Эта трудность в основном исходит от требования мембранных белков, которые должны быть встроены в родной липидной среды двуслойных для структурной стабильности и функциональности. Это становится проблематичным, потому что для того, чтобы определить структуры высокого разрешения белков, они должны быть извлечены из клеточной мембраны. FRET была популярной технологией для исследования белково-белковых взаимодействий на клеточной мембране, однако, разрешение низкоеи часто производит ложные срабатывания 17,18,19,20. Здесь впервые попродемонстрировано, что NCMNs могут быть использованы для изучения мембранных белково-белковых взаимодействий путем структурного анализа дичь типа AcrB тример и мономер AcrB-P223G на родной клеточной мембране и сравнения результатов с предыдущим анализом с использованием FRET. Сравнивая электронную микроскопию изображений отдельных частиц дикого типа AcrB и AcrB-P223G, предполагается, что большинство AcrB-P223G не образуют тримеры на клеточной мембране E.coli, как белок AcrB дикого типа при очистке с помощью мембранных активных полимеров, таких как NCMNP1-1 и NCMNP5-2. Здесь мы предлагаем, чтобы результаты анализа ФРЕТ могли быть ложноположими в результате ограничения разрешения подхода ФРЕТ. Искусственная дисульфидная связь, стабилизирующая тример AcrB-P223G, также может быть артефактом, который произошел в растворе21. Отрицательные изображения пятна предполагают, что мутация P223G предотвратила образование тримера AcrB и что мономерная форма AcrB не могла оставаться в той же конформации, наблюдаемой в ее тримерной форме. Цикл, который содержит эту мутацию ранее было показано, что абсолютно важно для формирования тримера через мутагенный и структурный анализ, который показал свою структурную значимость, чтобы быть из-за взаимодействий каждой формы цикла, закапывать в соседний мономер AcrB23.
Используя родную клеточную мембранную наночастицу системы обнаружения и анализа взаимодействия белково-белкового белка, можно непосредственно обнаружить олигомерное состояние белка, удерживая мембранный белок (ы) в действительно родной клеточной мембранной среде, которая может быть использована для получения структурной информации высокого разрешения на атомном уровне путем анализа образца одной частицы крио-EM. Система NCMN помогает избежать частых ложных срабатываний и ложных негативов, наблюдаемых при обнаружении ИЦП, вызванных лечением образцов моющими средствами24. Эти ложные результаты обычно возникают из-за агрегации, денатурации образца белка, диссоциации нековалентных взаимодействий и формирования искусственных олигомерных состояний, вызванных эффектами делипидации моющих средств. Кроме того, использование структурного анализа в сочетании с NCMNs предоставляет дополнительную структурную информацию и позволяет осуществлять прямое наблюдение молекулярных взаимодействий, которые имеют решающее значение для понимания ИЦП и, как правило, теряются при использовании ранее установленных методов обнаружения ИЦП. Этот метод успешно используется для структурных исследований дикого типа AcrB и может иметь широкую применимость к другим формам структурного анализа, таким как рентгеновская кристаллография и твердое состояние ЯМР, и много различных белков, используемых в других исследованиях, стремящихся определить взаимодействия отображаются новые цели белка.
Для получения воспроизводимых результатов с разумной белковой урожайностью высокой чистоты существует несколько важных этапов в процессе очистки мембранными активными полимерами, которым необходимо следовать. Первым важным шагом является процесс мембранной изоляции, поэтому крайне важно центрифугировать лизоляцию клетки на уровне 15 000 х г и следовать этому шагу с ультрацентрифугированием в 215 000 х г, чтобы по-настоящему изолировать клеточную мембрану от остальной части лизоляции клетки. Следующим важным шагом является solubilizing мембранной фракции с мембранными активными полимерами в концентрации 2,5% при комнатной температуре в течение двух часов. Были проведены эксперименты по оптимизации очистки, и использование этих параметров на этом этапе было показано, чтобы обеспечить оптимальное количество AcrB извлекается из мембраны и правильное формирование наночастиц наночастиц на мембраны родной клетки происходит. Заключительным критическим этапом процесса очистки является загрузка образца на столбец Ni-NTA при комнатной температуре. Это необходимо, потому что мембранные активные полимеры более растворимы при комнатной температуре, чем при температуре 4 градусов по Цельсию, таким образом, загрузка при комнатной температуре увеличит количество белка, связывающего колонку сродства, и позволит избежать высокого давления, вызванного нерастворимым накоплением полимера, которое потенциально может повредить столбец. Почти не менее важными для получения точной структурной информации являются шаги, содержащиеся в процедуре отрицательного окрашивания, упомянутой выше. Наиболее важными аспектами этой процедуры являются использование 10 нм толщиной дыристые углеродные сетки, объемы воды и уранил ацетата, а также продолжительность времени для образца adorption и окрашивания. Использование этих ключевых параметров при подготовке выборки обеспечит качественные структурные данные, которые могут быть использованы для точной оценки олигомерных состояний изображенной выборки. Изменения в протоколе очистки могут быть необходимы при использовании различных белков для устранения проблем, которые могут возникнуть из-за уникальных характеристик различных полипептидов. Основными факторами для рассмотрения изменения при наличии трудностей с получением достаточного количества образца белка должны быть параметры, используемые во время индукции шаг, количество мембранной фракции, используемой в шаге solubilization, и продолжительность времени и температуры для процесса solubilization. При проблеме с чистотой может возникнуть необходимость в использовании альтернативных столбцов сродства, таких как колонка биотинового сродства, вместо использования столбца Ni-NTA для очистки. Аналогичным образом, если необходимо поддержание слабых/переходных белково-белковых взаимодействий, обмен колонки Ni-NTA на столбец сродства TAP-тега полезен для оптимальных результатов. Наконец, при изучении белков млекопитающих, системы экспрессии млекопитающих должны использоваться для поддержания истинных местных клеточных мембранных липидных композиций, необходимых для точного определения естественного олигомерного состояния белка. Это потребует полного пересмотра экспрессии белка и шагов клеточного лиза этого протокола. В таких случаях должны соблюдаться ранее установленные протоколы экспрессии белка и клеточного лиза, соответствующие системе экспрессии, необходимой для целевого белка интереса.
Использование NCMNs с электронной микроскопией отображает большие преимущества по сравнению с FRET для использования в обнаружении ИЦП. Как показывают результаты этого исследования, ранее проведенные эксперименты FRET были несовместимы со структурным анализом олигомерной структуры белка мутанта AcrB21. Это было ясно показано и непосредственно подтверждено изображениями, сделанными с отрицательным пятном электронной микроскопии, которые согласуются с ранее описанной потерей активности для мутанта AcrB-P223G16. Если AcrB-P223G сделал форму тримеры in vivo NCMNP5-2 полимер поймал бы их в больших местных патчей мембраны клеток он извлекает. Вполне возможно, что анализ FRET мутант AcrB привело к ложному срабатыванию из-за любого из нескольких ограничений, которые присущи физическим процессам техника опирается на и технологии, используемые для измерения флуоресцентного резонанса передачи энергии. Одним из основных ограничений FRET является разрешение пределов конфокальные микроскопии, и это приводит к серьезным ограничениям в интермолекулярных расстояниях, способных быть решена с анализами FRET19. Для сравнения, использование NCMNs в сочетании с электронной микроскопией не подлежит вышеупомянутому ограничению FRET, со значительно более высокими ограничениями разрешения по сравнению с конфокальные микроскопии. Основываясь на этих ограничениях, имеющих потенциальное влияние на ранее описанные анализы FRET, мы утверждаем, что неправильное обнаружение тримера AcrB-P223G in vivo является результатом ограничения низкого разрешения FRET21. Помимо преимуществ по сравнению с просто FRET указал непосредственно на эту бумагу, используя NCMNs в сочетании с электронной микроскопии имеет преимущество над всеми текущими белково-белковых методов взаимодействия, таких как система Y2H и TAP-MS, в том, что он может быть использован для наблюдения белково-белковых взаимодействий в родной среде мембраны клетки непосредственно в высоком разрешении и имеет потенциал для использования для определения белковых структур на атомном уровне.
Мембранные активные полимеры и электронная микроскопия также не без ограничений. В настоящее время основной проблемой очистки NCMN является ее более низкая эффективность извлечения по сравнению с моющими методами (полимеры в библиотеке NCMN отображают 70% эффективности извлечения DDM). Он также имеет проблемы совместимости с некоторыми столбцами сродства, такими как столбцы связывания мальтозы. Кроме того, очистка NCMN по-прежнему не очень успешна с высокодинамистными мембранными белками или комплексами (данные неопубликованные). Использование мембранных активных полимеров и электронной микроскопии для экспериментов по определению олигомерного состояния требует удаления белков из родной клеточной среды, в то время как ФРЕТ проводится in vivo. Тем не менее, наночастицы, образованные мембранными активными полимерами, позволяют при извлечении белков из клеток использовать самую родную окружающую среду, чтобы уменьшить потенциальные экспериментально полученные неточности, которые, как известно, вызваны извлечением и очисткой белка. Кроме того, в то время как вопрос разрешения и размера частиц в качестве ограничения передачи электронной микроскопии значительно уменьшилась за последнее десятилетие, микроскопы, которые все еще используются для отрицательного анализа пятен, по-прежнему будут относительно ограничены более крупными молекулами или молекулярными комплексами (Nogt;200 kDa), поскольку они, как правило, имеют информационный предел около 0,1-0,3 нм25. SMALP также показал свою высокую гибкость с точки зрения приложений, но отображает еще большие ограничения, чем NCMNs. Нанодиски, образованные SMA, имеют максимальный диаметр около 15 нм и, таким образом, обычно неэффективны для извлечения белков и белковых комплексов, которые более 400 kDa26. В дополнение к этому ограничению, SMA также не в состоянии работать с белками, которые существуют в условиях низкого рН или использовать диванные ионы для структурных и функциональных целей. Из-за SMALPs механизм действия зависит рН, он не может быть использован с низкими условиями рН и chelates дивалентных ионов. В то время как методы SMILP и DIBMA обещали в отношении преодоления этих ограничений, их применимость к различным белкам наборов остается невидимым27,28. NCMNs стремится преодолеть эти ограничения с помощью структуры деятельности отношения (SAR) анализ для создания альтернативных полимеров, которые могут образовывать большие наночастицы, функционирующие в условиях низкого рН, и избежать chelating дивалентных ионов. Одним из таких примеров полимеров, которые были разработаны для NCMNs является NCMNP5-2 полимер, который отображает способность создавать большие наночастицы, как показано на рисунке 1E,F.
В дополнение к ранее описанным достижениям в области технологии наночастиц, будущее направление NCMNs заключается в разработке еще более мембранных активных полимеров, которые дадут библиотеке полимеров NCMNs повышенную эффективность извлечения и способность работать с белками всех различных размеров трансмембранной области, которые функционируют на гораздо более широких уровнях рН, или полагаются на любой тип иона для поддержания их структуры и функции. Это позволит всем исследователям мембранного белка использовать эту технологию в своих экспериментах и иметь доступ к более точным и биологически релевантным результатам. Привнося преимущества полимерных наночастиц в более широкий спектр белков, мы надеемся, что это приведет к решению структур с высоким разрешением местных мембранных белковых комплексов на атомном уровне и тем самым определит внутримолекулярные атомные взаимодействия, которые входят в поддержание этих комплексов. Такие достижения также позволили бы создать много новых возможностей с точки зрения открытия и разработки мембранных белковых препаратов на основе усилий по разработке лекарственных средств на основе структуры. Использование структуры на основе методов проектирования наркотиков для мембранных белков будет массовым преимуществом для медицинской промышленности, как это приведет к увеличению наркотиков обязательной специфичности и эффективности в целях сокращения нежелательных побочных эффектов и количество соединений, необходимых для получения желаемого терапевтического эффекта, что делает препараты, которые нацелены мембранных белков значительно безопаснее и эффективнее. Родная система наночастиц мембраны клетки все еще находится в своих этапах развития но уже доказывала быть неимоверной мощной путем позволять for the first time изучение протеинов мембраны в их поистине родных положениях и разъясняя родные взаимодействия протеин-белка которые происходят на мембране клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.G указан как изобретатель мембранного активного полимера NCMNP5-2 и системы NCMN.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано VCU стартовый фонд (для YG) и Национальный институт общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии R01GM132329 (к YG) Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения. Мы благодарим Монтсеррат Самсо и Кевина МакРоберта за их щедрую поддержку видеозаписи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
