Summary
Presenteras här är ett protokoll för bestämning av oligomeriskt tillstånd av membranproteiner som använder ett inhemskt cellmembran nanopartiklar system i samband med elektronmikroskopi.
Abstract
Proteinproteininteraktioner i cellmembransystem spelar avgörande roller i ett brett spektrum av biologiska processer - från cell-till-cell-interaktioner till signaltransduktion; från avkänning av miljösignaler till biologisk respons, från metabolisk reglering till utvecklingsstyrning. Korrekt strukturell information om proteinproteininteraktioner är avgörande för att förstå molekylära mekanismer hos membranproteinkomplex och för utformningen av mycket specifika molekyler för att modulera dessa proteiner. Många in vivo- och in vitro-metoder har utvecklats för detektion och analys av proteinproteininteraktioner. Bland dem är det strukturella biologiska tillvägagångssättet unikt genom att det kan ge direkt strukturell information om proteinproteininteraktioner på atomnivå. Nuvarande membranproteinstrukturbiologi är dock fortfarande till stor del begränsad till tvättmedelsbaserade metoder. Den största nackdelen med tvättmedelsbaserade metoder är att de ofta dissocierar eller denature membranproteinkomplex när deras inhemska lipid bilayer miljö avlägsnas av tvättmedel molekyler. Vi har utvecklat ett inhemskt cellmembran nanopartiklar system för membran protein strukturbiologi. Här visar vi användningen av detta system i analysen av protein-protein interaktioner på cellmembranet med en fallstudie av oligomeric tillstånd acrB.
Introduction
Proteinproteininteraktioner (PPI) spelar centrala roller genom hela biologin, från upprätthållandet av proteinstrukturen och proteinfunktionen till regleringen av hela system. Protonpumpshämmare finns i många olika former och kan kategoriseras baserat på vilka typer av interaktioner de bildar. En sådan kategorisering är homooligomerisk eller heterooligomerisk, baserat på om interaktionerna är mellan identiska underenheter eller olika proteiner som fungerar som underenheter. En annan kategorisering baseras på interaktionens styrka om interaktionerna leder till bildandet av stabila komplex eller övergående komplexa tillstånd. Strukturell information om protonpumpshämmarna mellan proteiner är avgörande för att förstå den mekanism genom vilken proteiner utför sin funktion. Det har uppskattats att över 80% av proteinerna är beroende av komplex bildning för att utföra sina funktionella roller1. Med tanke på att andelen proteiner som observerats vara beroende av protonpumpshämmare för korrekt medfödd funktion är deras betydelse i biologin lätt uppenbar, men att kunna undersöka de proteiner som deltar i dessa interaktioner på ett korrekt sätt har förblivit utmanande på grund av begränsningar i de tekniker som finns tillgängliga för att experimentellt observera när proteiner bildar protonpumpshämmare.
Det finns en hög grad av oenighet mellan resultaten för många experimentellt fastställda protonpumpshämmare på grund av den höga mängden buller, falska positiva och falska negativ som härrör från många av de för närvarande tillgängliga PPI-bestämningsteknikerna. Detta är särskilt för jäst tvåhybrid (Y2H) systemet, tandem affinitet rening-massa spektrometri (TAP-MS) och fluorescens resonans energiöverföring (FRET), som representerar tre av de vanligaste metoderna för PPI bestämning2,3,4,5,6,7. I jämförelse kan proteinstrukturbiologiska tekniker, såsom kärnmagnetisk resonans (NMR), röntgenkristallografi och elektronmikroskopi (EM), användas för att få högupplöst strukturell information om proteinproteininteraktioner ner till atomnivå och möjliggöra direkt visuell bekräftelse av de interaktioner som uppstår för ett målprotein av intresse. Alla de för närvarande tillgängliga icke-strukturbaserade PPI-bestämmande forskningsteknikerna (t.ex. Y2H, TAP-MS och FRET) saknar denna förmåga och lider dessutom av svårigheter att identifiera svaga och övergående interaktioner mellan proteiner5. Dessa brister förbättras ytterligare när man studerar membranproteiner på grund av den extra komplexiteten som orsakas av den ytterligare variabeln av lipidmiljön som påverkar bildandet av korrekt kvartär struktur och heteromerisk komplex montering.
Membranproteiner utgör en stor del av proteomen och är kända för att spela många avgörande roller i korrekt cellfunktion inom alla levande organismer. Trots det faktum att membranproteiner uppskattas utgöra 27% av det mänskliga genomet och utgör ~ 60% av alla nuvarande läkemedelsmål finns det en stor anomali i antalet lösta modeller för membranproteiner som bara utgör ~ 2,2% av alla publicerade proteinstrukturer8,9,10. Den främsta orsaken till diskrepansen i tillgången på strukturell information ligger i de inneboende egenskaperna hos själva membranproteinerna. På grund av deras dåliga löslighet, beroende av interaktioner med en lipidmiljö för att upprätthålla inhemsk struktur och funktion och olika fysikaliskkemiska egenskaper hos lipidmembranet själv, fortsätter membranproteiner att representera ett betydande problem när man implementerar strukturella biologitekniker för att studera dem. Av dessa inneboende egenskaper är det viktigaste för att få korrekt strukturell information kravet på att ha interaktioner med sin naturliga lipidmiljö för att de ska kunna behålla sin inhemska struktur och funktion. Lipidmiljön är en så integrerad del av membranproteinernas struktur och funktion att begreppet memtein (en kombination av orden membran och protein) har föreslagits som den grundläggande enheten för membranproteinstruktur och funktion11. Trots vikten av lipidproteininteraktioner kräver de för närvarande tillgängliga strukturbaserade PPI-bestämningsteknikerna ofta att de proteiner som studeras är lösliga eller lösliga med tvättmedel. Exponering för hårda tvättmedel kan denaturera proteinerna eller orsaka falska positiva och negativa på grund av delipidation, vilket kan inducera aggregering, denaturering av protein, dissociation av icke-kovamenta interaktioner och bildandet av konstgjorda oligomemetriska tillstånd. På grund av behovet av att upprätthålla en naturlig lipidmiljö för korrekt bestämning av det inhemska oligomemetriska tillståndet hos membranproteiner har vi utvecklat ett inhemskt cellmembrannanopartiklarsystem (NCMNs)12 baserat på den tidigare rapporterade Styren maleinsyra lipidpartiklar (SMALP)13-metoden.
SMALP använder styren maleinsyra copolymer som en membranaktiv polymer för att extrahera och lösliga membranproteiner. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) är en unik amfifil polymer på grund av dess hydrofoba styren moiety och diametralt motsatt hydrofil maleic syra moiety. Den bildar nanopartiklar genom att adsorbera till, destabilisera och störa cellmembranet i en pH-beroendemekanism 14. Denna funktionella aktivitet hos SMA är det som gör att den kan användas som ett tvättmedelsfritt system för membranproteinutvinning och löslighet. NCMN-systemet skiljer sig från SMALP-systemet i flera avseenden. Det mest unika med NCMN-systemet är att det har ett membranaktivt polymerbibliotek med en mängd polymerer som har unika egenskaper som gör dem lämpliga för isolering av många olika membranproteiner som kräver olika förutsättningar för stabilitet och inhemsk funktion. NCMN-systemet har också olika protokoll jämfört med SMALP-metoden när det gäller att förbereda nanopartiklarna. Ett sådant exempel är att ncmns använder en enstegs nickel affinitetskolonn rening för högupplöst strukturbestämning; effekten av dessa olika protokoll kan observeras när man jämför NCMNs-protokollet, som genererade 3,2 och 3,0 Å cryo-EM AcrB-strukturer, med en liknande studie med SMALP-metoden, vilket resulterade i en cryo-EM AcrB-struktur med en 8,8 Å-upplösning12,15. Dessa unika egenskaper hos NCMN-systemet är de förbättringar som gjorts på den tidigare etablerade SMALP-metoden och gör det till en idealisk kandidat för studier av protonpumpshämmare.
Multidrug efflux transportören AcrB finns som funktionell homotrimer i E. coli12. En mutagena analys föreslog att en enda P223G punkt mutation, ligger på en slinga som är ansvarig för stabiliteten i AcrB trimer, destabiliserar trimer tillstånd och ger en AcrB monomer när den framställs med tvättmedel DDM, som kan detekteras med inhemska blå gel elektrofores16. FRET-analysen av AcrB-P223G mutant föreslog dock att när i den inhemska cellmembran lipid bilayer miljön, majoriteten av mutant AcrB-P223G fortfarande existerade som en trimer och att uttryck nivåer för både vilda typ AcrB och AcrB-P223G är liknande. Men trots FRET-analysresultaten visade en aktivitetsanalys för mutanttransportören att aktiviteten minskade dramatiskt jämfört med den vilda typen16. Även om FRET-teknik har använts populärt för analys av proteinproteininteraktioner, har forskning visat att det ofta kan ge falska positiva17,18,19,20.
Nyligen fastställdes högupplösta cryo-EM strukturer av AcrB trimer som visade interaktionen mellan AcrB med dess tillhörande inhemska cellmembran lipid bilayer genom användning av NCMNs12. I princip kan NCMNs lätt användas för analys av protein-protein interaktioner som finns på det inhemska cellmembranet. I ett test av detta system utfördes experiment för att direkt observera det oligomeriska tillståndet i AcrB-P223G med användning av inhemska cellmembrannanopartiklar och negativ färgning elektronmikroskopi. För att jämföra med den vilda typen AcrB nanopartiklar använde vi samma membranaktiva polymer (SMA2000 tillverkad i vårt laboratorium, som indexeras som NCMNP1-1 i NCMN-biblioteket) som används för högupplöst cryo-EM-strukturbestämning av AcrB och alternativa polymerer som finns i NCMNs bibliotek12. Baserat på de tidigare rapporterade resultaten förväntades majoriteten av AcrB-P223G-mutanten existera i form av trimeriska inhemska cellmembran nanopartiklar21. Det fanns dock inga AcrB-trimrar i provet, såsom de som observerades med den vilda typen AcrB. Detta tyder på att majoriteten av AcrB-P223G inte bildar trimers på det inhemska cellmembranet som tidigare föreslagits.
Här rapporterar vi en detaljerad analys av mutanten E. coli AcrB-P223G i jämförelse med den vilda typen E. coli AcrB med ncmns. Denna fallstudie av AcrB tyder på ncmns är ett bra system för protein-protein interaktion analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Proteinuttryck
- Inokulera 15 ml Fantastic Broth (TB) media med antibiotika som är specifika för plasmider med BL21 (DE3) pLysS-celler som innehåller AcrB som uttrycker plasmider i 50 ml-rör över natten vid 37 °C med skakningar vid 250 varv/min.
- Kontrollera den optiska densiteten hos nattkulturen vid 600 nm (OD600)och se till att den är över 2,0.
- Späd 5 ml cellkultur till 1 L TB-medier som innehåller antibiotika som är specifika för plasmider och inkubera vid 37 °C med skakningar fram till OD600=0, 8 och inducera sedan med IPTG som har en slutlig koncentration på 1 mM.
- Utför induktion vid 20 °C med skakningar i 20 timmar.
- Pellet ner i cellerna med centrifugering i 15 min vid 4 °C och 4 000 x g.
2. Celllys och membranisolering
- Återanvänd cellpelleten i buffert A (Tabell 1, använd DDM-buffert A eller NCMNs Buffer A beroende på vilket reningssystem som ska följas) med 80 ml för varje 20 g av cellpelleten.
- Homogenisera de återanvända cellpelletsen med hjälp av en glas-Dounce homogenisator vid 4 °C eller om du vid rumstemperatur måste lägga på is omedelbart efter.
- Överför provet till en metallbeaker på is och lysa cellerna genom att lasta dem i en högtryckshom homogenisator vid 4 °C och 1 500 bar.
- Upprepa processen att ladda cellerna i homogenisatorn och låta dem passera genom homogenisatorn i 3-4 cykler eller tills lysatet börjar klargöra.
- Centrifugera lysatet vid 15 000 x g i 30 min vid 4 °C.
- Samla supernatanten och lasta i ultracentrifugrör och centrifugera vid 215 000 x g i 1 timme vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och samla membranpelletsen från ultracentrifugerören. Förvara överflödig membranpellet vid -80 °C.
3. Beredning av inhemska cellmembrannanopartiklar
- Återanvänd 1 g membranpellets i 10 ml NCMNs Buffer A (Tabell 1).
- Homogenisera det återanvända cellmembranprovet med en Dounce-homogenisator i glas vid 20 °C.
- Överför det upphängda membranprovet till ett 50 ml polypropylenrör och tillsätt membranaktiv polymerer stamlösning och ytterligare NCMNs Buffer A för att föra provet till en slutlig koncentration av 2,5% (w/v) membranaktiv polymer (NCMNP1-1 eller NCMNP5-2).
OBS: Stamlösningar av membranaktiva polymerer bör tillverkas i dubbelt destillerat vatten och kan hållas i olika koncentrationer, men vanligtvis 10% (w/v). - Skaka provet i 2 timmar vid 20 °C.
- Ladda provet i en ultracentrifug och snurra vid 150 000 x g i 1 timme vid 20 °C.
- Medan provet ultracentreras börjar det jämvikta en 5 ml Ni-NTA-kolumn med 25 ml NCMNs Buffer A.
- Samla supernatanten efter ultracentrifugation är klar och ladda den på 5 ml Ni-NTA-kolonn vid rumstemperatur med en flödeshastighet på 0,5 ml/min med hjälp av en sprutpump.
- Tvätta FPLC-linjer (Fast Protein Liquid Chromatography) med tillräckligt med NCMNs Buffer B (Tabell 1) för att helt spola systemet och anslut sedan kolonnen till FPLC-maskinen.
- Tvätta kolonnen med 30 ml NCMNs Buffer B med en flödeshastighet på 1 ml/min och samla in flödet.
- Tvätta kolonnen med 30 ml NCMNs Buffer C (Tabell 1) med en flödeshastighet på 1 ml/min och samla in flödet.
- Eluera proteinet med 20 ml NCMNs Buffer D(tabell 1)med en flödeshastighet på 0,5 ml/min och samla in provet med hjälp av en fraktionsuppsamlare och fraktionerna som var och en är inställd på 1,0 ml.
- Förvara proteinproverna vid 4 °C.
- Kör en SDS-PAGE gelelektroforesanalys för att kontrollera de prover som motsvarar toppar som observerats på FPLC-elueringsdiagrammet.
4. SDS-PAGE gel elektrofores
- Förbered gjutkammaren genom att spänna fast glaset i gjutapparaturen.
- Förbered 12% separationsgel enligt receptet som anges i tabell 1.
OBS: När TEMED har tillsatts polymeriseras gelén snabbt så tillsätt den bara när den är klar att hälla gelén. - Häll gelén och lämna 2 cm under kammens botten för staplingsgelen.
- Ta bort eventuella bubblor genom att skikta toppen av gelén med 100% isopropanol och vänta på att separationsgelen polymeriseras.
- Ta bort isopropanol och tvätta bort eventuella spår av isopropanol med destillerat vatten.
- Förbered staplingsgelen enligt receptet i tabell 1.
OBS: När TEMED har tillsatts polymeriseras gelén snabbt så tillsätt den bara när den är klar att hälla gelén. - Häll staplingsgelen ovanpå separationsgelen.
- Tillsätt en kam till kammaren för att bilda brunnarna och vänta på att staplingsgelen helt polymeriseras.
- Placera 1 μL 1 M DTT i ett mikrocentrifugrör för varje fraktionsprov som måste köras på gelén.
- Tillsätt 7 μL 4x lastbuffert till varje rör också.
- Tillsätt 20 μL prov från de fraktioner som behöver köras på gelén till varje mikrocentrifugrör.
- Virvel rören som innehåller proverna.
- Snurra ner provrören med hjälp av en bordsmikrocentrifug i 3 s och se till att allt prov har återvänt till botten av rören.
- Förbered gelelektroforescellen genom att fästa en 12% polyakrylamidgelkassett på plats och fylla cellens inre och yttre kammare med Tris-acetat-EDTA -buffert (tabell1).
- Ladda molekylviktsmarkören i gelens första körfält med den volym som krävs enligt anvisningarna.
- Ladda 28 μL av provet från varje rör blandat med DTT och lastbuffert.
- Placera locket på elektroforescellen ovanpå lådan och anslut locket till strömförsörjningen.
- Slå på strömförsörjningen och ställ in den på 100 V och låt den gå i 20 minuter.
- Efter 20 min, öka strömförsörjningsströmmen till 140 V och fortsätt att köra den i ytterligare 30-40 min eller tills bandet av lastbuffertfärgämne når botten av gelkassetten.
- Efter avslutad elektroforesfläck och de-stain gelen för att visualisera proteinbanden som finns i gelén.
5. Proteinrening med DDM
OBS: Syftet med att utföra denna reningsprocess är att fungera som en kontroll för de experiment som använder de membranaktiva polymererna.
- Återanvänd 6-10 g membranpellets, från steg 2.6, i DDM-buffert A (tabell 1) med 5 ml/g membranpellets.
- Homogenisera det återanvända provet med en Dounce-homogenisator i glas vid 4 °C eller om du vid rumstemperatur måste lägga på is omedelbart efter.
- Överför provet till ett 50 ml polypropylenrör och tillsätt DDM och ytterligare DDM-buffert A för att föra provet till en slutlig koncentration på 2 % DDM.
- Skaka provet i 2 timmar vid 4 °C.
- Lasta provet i ultracentrifugrör och centrifugera i 1 timme vid 4 °C och 150 000 x g.
- Medan provet är ultracentrerat börjar det förbereda 5 ml Ni-NTA-kolonnen genom att tvätta med 25 ml DDM-buffert A (tabell 1).
- När ultracentrifugationen är klar, samla supernatanten och ladda den på 5 ml Ni-NTA-kolonnen vid 4 °C med en flödeshastighet på 0,5 ml/min med hjälp av en sprutpump.
- Tvätta FPLC-ledningar med tillräckligt med DDM-buffert B + 0,05 % DDM (tabell 1) för att helt spola systemet och anslut sedan kolonnen till FPLC-maskinen.
- Tvätta kolonnen med 30 ml DDM-buffert B + 0,05% DDM med en flödeshastighet på 1 ml/min och samla in flödet.
- Tvätta kolonnen med 30 ml DDM-buffert C + 0,05 % DDM (tabell 1) med en flödeshastighet på 1 ml/min och samla in flödet.
- Eluera proteinet med 20 ml DDM-buffert D + 0,05% DDM(tabell 1)med en flödeshastighet på 0,5 ml/min och samla in flödet med hjälp av en fraktionsuppsamlare och fraktionerna som var och en är inställd på 1,0 ml.
- Välj de fraktioner som innehåller elueringstoppen för sammanslagning och koncentration med hjälp av en centrifugalkoncentrator och centrifugering vid 4 000 x g och 4 °C tills den når 500 μL.
- Använd en 500 μL-slinga och ladda provet i FPLC-maskinen och sedan på 25 ml-storleksuteslutningskolonnen vid 4 °C. Elute med 30 ml DDM-buffert E + 0,05% DDM (tabell 1) med en flödeshastighet på 0,5 ml/min och samla som fraktioner med fraktionsstorlekarna inställda på att vara 0,5 ml per bråkdel.
- Ta fraktionerna och mät proteinkoncentrationen med hjälp av 280 nm absorbans för att bekräfta UV-Vis-kurvan från FPLC-elueringsdiagrammet.
- Samla in 20 μL från varje provfraktion som motsvarar toppar som observerats på FPLC-elueringsdiagrammet och bekräftades vara korrekta med absorbanstestet.
- Frys resten av dessa provfraktioner med flytande kväve eller torris i önskade alikvoter och lagra proteinprover vid -80 °C.
- Kör en SDS-PAGE gelelektroforesanalys som tidigare beskrivits för att kontrollera de prover som motsvarar toppar som observerats på FPLC-elueringsdiagrammet.
6. Förberedelse av negativt fläcknät
- Placera de galler som ska användas för provberedningen på en glasrutschbana insvept i filterpapper med kolsidan uppåt.
- Placera glasrutschbanan med elektronmikroskopnäten i en glödurladdningskammare mellan de två elektroderna och sätt tillbaka glaslocket och se till att det är centrerat och väl förseglat.
- Kör glödladdningsmaskinen och se till att det lila ljuset som genereras av plasman är synligt.
- När maskinen är klar med driften, vänta tills kammaren har nått atmosfärstryck för att ta bort glaslocket och sätt sedan tillbaka rutschkanan med gallret till bänken där proverna kommer att lastas på dem.
- Justera koncentrationen av de renade proteinproverna till ca 0,1 mg/ml genom att antingen späda ut provet med lämplig buffert eller koncentrera med hjälp av en centrifugalkoncentrator.
- Ladda 3,5 μL proteinprov på det 10 nm tjocka kolnätet och vänta i 1 minut.
- Ta bort vätskan från EM-gallrets yta med ett filterpapper.
- Tvätta gallerytan 3x genom att plocka upp 3 μL droppar vatten med gallret och ta bort vattnet från gallret med filterpapper mellan att plocka upp varje droppe.
- Tvätta gallerytan 2x genom att plocka upp 3 μL droppar färskt, filtrerat 2% uranacetat och ta bort tvättlösningarna på gallret med filterpapper mellan att plocka upp varje droppe.
- Färga gallret med en 3 μL droppe färskt, filtrerat 2% uranacetat i 1 min.
- Ta bort uranacetatlösningen på EM-nätets yta med filterpapper och lufttorka gallret i minst 1 minut.
- Lagra rutnätet i en rutnätsruta för senare användning.
7. EM-avbildning
- Ladda det förberedda gallret i näthållaren på en säker arbetsbänk.
- Förbered mikroskopet genom att placera mikroskopen dewar i en polystyrenlåda och fyll dewar 3/4th full av flytande kväve.
- Kontrollera att mikroskopfönstrets gummiskydd täcker det och ladda sedan dewar på mikroskopet genom att placera koppartrådarna i dewar tills det passar på plattformen.
- Fyll resten av dewar med flytande kväve och placera ett lock ovanpå dewar för att täcka det.
- Slå på den höga spänningen, konditiona mikroskopet och vänta tills mikroskopet värms upp och upprätta en säker vakuumnivå för användning.
- När mikroskopet är klart öppnar du kolonnventilen och bekräftar att balken finns genom att ta bort gummiskyddet på mikroskopfönstret.
- Kontrollera strålens stigmation genom att sprida in och ut genom att justera strålens intensitet. Om astigmatism är närvarande kommer balken att ha en elliptisk form när man rör sig bort från cross-over och balken ska vara samma ovala form på båda sidor.
- Justera mikroskopets kikare så att den är rätt höjd och avstånd enligt observatörens ögon.
- Kontrollera strålpositionering för lägena Sök, Fokusoch Exponering genom att cykla genom alla tre lägena tills strålen är i mitten i varje.
- Stäng kolonnventilen och fortsätt att ladda näthållaren i elektronmikroskopet.
- Justera mikroskopet till eucentrisk höjd genom att använda mikroskopens wobblerfunktion och justera scenens rörelse med Z-axeln tills det inte finns någon sida vid sida-rörelse av provet i mitten.
- Använd lågdos sökläget på mikroskopet sök i rutnätet efter ett önskvärt område med rimlig kontrast med de provmolekyler som finns för att fokusera på provet.
- Fokusera på exemplet i fokusläge genom att använda en hög stegstorlek tills exemplet ses och minska sedan stegen för att hitta rätt fokusnivå.
- Noll och nollställ balken och se sedan till att gummidynan täcker mikroskopfönstret.
- Använd exponeringsläget ta bilden av önskat rutnätsområde för en 1 s exponering vid 62 000x förstoring och kontrollera den erhållna bilden.
- När du är klar med avbildningen stänger du kolonnventilerna och tar bort näthållaren från kolonnen.
- När du är klar med avbildningen stänger alla rutnät av intresse mikroskopet genom att stänga av glödtrådseffekten och ta bort det flytande kvävede kriget från mikroskopet.
- Placera något för att absorbera fukt på stativet där dewar satt för att fånga kondens från mikroskopets kopparspolar.
- Aktivera Cryo Cycle-läget och se till att turbopumpen är avstängd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av de procedurer som presenteras här renades prover av E. coli AcrB vilda typ och E. coli mutant AcrB-P223G. Proverna adsorberades sedan till kolnegativa färgelektronmikroskopinät och färgades med uranylacetat med sidoblottningsmetoden22. Negativa fläck bilder samlades in med hjälp av överföring elektronmikroskopi. Den negativa fläckbilden för acrB-provet av vild typ renat med DDM avslöjar en homogen lösning av monodispersed partiklar med proteinet som visar en väldefinierad trimerisk kvartärstruktur (Figur 1A). Dessa trimeriska strukturer överensstämmer med det observerade kromatogrammet för uteslutning av storlek när de renas (kompletterande figur 1). I jämförelse, när man tittar på den negativa fläckbilden för AcrB-P223G-mutanten, också renad med DDM, kan man observera en heterogen lösning av polydisperserade nanopartiklar med benägenhet mot aggregering, men inga observerbara inhemska trimers (Figur 1B). Dessa resultat stöds också av den observerade elueringsprofilen vid utförandet av kromatografi för storleksuteslutning (kompletterande figur 1). För att avgöra om bristen på trimeriska tillstånd proteiner för mutanten berodde på behandling med tvättmedel eller enbart orsakas av destabiliserande mutationen av P223G proteinerna var också renas med NCMNP1-1, en av membranet aktiva polymerer inom NCMNs bibliotek. Den negativa fläckbilden för acrB-provet av vild typ renat med NCMNP1-1 avslöjar återigen en homogen lösning av monodisperserade partiklar med proteinet som visar en väldefinierad trimerisk kvarttensalstruktur (figur 1C). Och precis som med DDM-reningen, när AcrB-P223G-mutanten renas med NCMNP1-1 visar den negativa fläckbilden en heterogen lösning av polydisperserade nanopartiklar med benägenhet mot aggregering, men inga observerbara inhemska trimers (Figur 1D). För att ytterligare bekräfta att P223G mutationen stör AcrB trimer på cellmembranet valdes en annan polymer (NCMNP5-2) från det proprietära NCMNs membran aktiva polymerbiblioteket. NCMNP5-2 kan bilda inhemska cellmembrannanopartiklar i mycket större storlekar, vilket gör att flera AcrB-trimers kan avbildas i en enda inhemsk cellmembranpartikel. Till följd av detta konstaterades att flera acrb-trimrar av vildtyp fanns i enstaka partiklar (figur 1E). Inga AcrB-P223G trimerpartiklar som de som bildas av vild typ AcrB observerades dock, även när man tittar på de stora inhemska cellmembran bilayer patcharna (Figur 1F). Detta tyder på acrB-P223G finns inte som en trimer på cellmembranet som tidigareföreslagits 21 och erbjuder en logisk förklaring till varför AcrB-P223G visar en dramatisk nedgång i aktivitet när analyseras16. För att bekräfta renheten hos proverna och närvaron av rätt protein, elektrofores geler köras för alla renade protein prover. De resulterande fläckarna bekräftade närvaron av AcrB i alla prover med >95% renhet och fläckens placering motsvarade acrB: s förväntademolekylvikt ( figur 1G). Resultaten från vår studie är oförenliga med den tidigare beskrivna FRET-analysen när det gäller att bestämma det oligomeriska tillståndet för membranproteinet AcrB-P223G16. Genom att använda membran aktiva polymerer och elektronmikroskopi som beskrivs i protokollet var proteinets inhemska oligomeric tillstånd direkt observerbart. En mer exakt bestämning av hur monomererna i proteinet interagerar med varandra kommer att kräva bestämning av högupplösta cryo-EM-strukturer.
Figur 1: Negativa fläckar och elektroforesgelbilder av renade AcrB-konstruktioner. (A) Negativ fläckbild tagen för vild typ AcrB renad med DDM. (B) Negativ fläckbild tagen för acrB-P223G-proteinkonstruktionen renad med DDM. (C) Negativ fläckbild tagen för vild typ AcrB renad med NCMNP1-1. (D) Negativ fläckbild tagen för AcrB-P223G konstruktion renad med NCMNP1-1. (E) Negativ fläckbild tagen för vild typ AcrB renad med NCMNP5-2 (den röda rutan belyser några av de trimernanopartiklar som observerats på bilden). (F) Negativ fläckbild tagen för AcrB-P223G renad med NCMNP5-2 (den gröna rutan belyser en del av lipidfläckarna som fångats av NCMNP5-2 som observerats på bilden). (G) SDS-PAGE gelkörning med slutprodukterna från reningen av AcrB-P223G med DDM (Lane 1), NCMNP1-1 (lane2), (H) SDS-PAGE gelkörning med slutprodukterna från reningen av AcrB-P223G med NCMNP5-2. (I) Zooma in de markerade funktionerna från bild 1E. (J) Zooma in de markerade funktionerna från F. Alla negativa fläckbilder i figur 1 har samma skalstreck på 50 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| DDM reningsbuffertar | Polymerreningsbuffertar | Gel elektrofores buffertar | |||
| Buffert A | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffert A | 50 mM HEPES, pH 8,4 | TAE-buffert | 40 mM Tris-bas |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 20 mM ättiksyra | |||
| 20 mM Imidazol | 20 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffert B | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffert B | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Kvarhållande buffert | 40% Metanol |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 10% ättiksyra | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | ||||
| 40 mM Imidazol | 40 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffert C | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffert C | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Staplingsgel | 1,5 M Tris pH 8,8 (0,63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% akrylamid/bis (0,43 ml) | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 10% SDS (0,025 ml) | |||
| 75 mM Imidazol | 75 mM Imidazol | 10% APS (0,025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (4 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,39 ml) | ||||
| Buffert D | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffert D | 25 mM HEPES, pH 7,8 | 12% Avskiljande gel | 1,5 M Tris pH 8,8 (1,3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% akrylamid/bis (2 ml) | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 10% SDS (0,05 ml) | |||
| 300 mM Imidazol | 300 mM Imidazol | 10% APS (0,05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (5 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,6 ml) | ||||
| Buffert E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffert E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0,1 mM TCEP | 0,1 mM TCEP | ||||
Tabell 1: Förteckning över reningsbuffertar som används för kolonnkromatografi och gelelektrofores.
Kompletterande figur 1: Storleksuteslutning av kromatografi elueringsprofiler. a)Överlagringsgraf för de två elueringsprofiler som observerats för de kromatografiexperiment för storleksuteslutning som utförs vid rening med DDM och vild typ AcrB (orange) och med DDM och mutant acrB-P223G (blå). (B) Kolumnkalibreringsprofil för kolumn för storleksuteslutning som används för DDM-experiment.
1: Thyroglobulin (669 000), 2: Ferritin (440 000), 3: Aldolase (158 000), 4: Conalbumin (75 000), 5: Ovalbumin (44 000), 6: Kolsyraanhydras (29 000), 7: Ribonukleas A (13 700). Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinproteininteraktioner är viktiga för membranproteinernas struktur och funktion. Många metoder har utvecklats för att undersöka proteinproteininteraktioner. Jämfört med lösliga proteiner är membranproteiner och deras protonpumpshämmare svårare att studera på grund av de unika inneboende egenskaperna hos membranproteiner. Denna svårighet kommer främst från kravet på membranproteiner som ska bäddas in i en inhemsk lipid bilayer miljö för strukturell stabilitet och funktionalitet. Detta blir problematiskt eftersom för att bestämma högupplösta strukturer av proteinerna måste de extraheras från cellmembranet. FRET har varit en populär teknik för att undersöka proteinproteininteraktioner på cellmembranet, men upplösningen är låg och producerar ofta falska positiva17,18,19,20. Här visas för första gången att NCMNs kan användas för att studera membranproteinproteininteraktioner genom att strukturellt analysera den vilda typen AcrB trimer och AcrB-P223G monomer på det inhemska cellmembranet och jämföra resultaten med den tidigare analysen med FRET. Genom att jämföra elektronmikroskopi enstaka partikelbilder av vild typ AcrB och AcrB-P223G, föreslås att majoriteten av AcrB-P223G inte bildar trimers på E.coli cellmembran som den vilda typen AcrB protein när renas med membran aktiva polymerer, som NCMNP1-1 och NCMNP5-2. Vi föreslår här att resultaten från FRET-analysen kan vara ett falskt positivt resultat av resolutionsbegränsningen för FRET-metoden. Den konstgjorda disulfidbindningen som stabiliserade AcrB-P223G-trimern kan också vara en artefakt som inträffade i lösning21. De negativa fläckbilderna tyder på att P223G mutation förhindrade bildandet av AcrB trimer och att monomeric form av AcrB inte kunde förbli i samma konformation observeras när i sin trimeriska form. Slingan som innehåller denna mutation visade sig tidigare vara absolut kritisk för bildandet av trimern genom mutagena och strukturella analys, som visade dess strukturella betydelse att bero på interaktionerna varje slinga bildas genom att begrava i den närliggande AcrB monomer23.
Genom att använda det inhemska cellmembrannanopartiklarsystemet för protein-proteininteraktionsdetektering och analys kan man direkt upptäcka det oligomeriska tillståndet hos ett protein genom att hålla membranproteinerna i en verkligt inhemsk cellmembranmiljö, som kan användas för att få högupplöst strukturell information på atomnivå genom en enda partikel cryo-EM-analys av provet. NCMN-systemet hjälper till att undvika de frekventa falska positiva och falska negativ som observerats vid PPI-detektering orsakad av behandling av prover med tvättmedel24. Dessa falska resultat uppstår vanligtvis, på grund av aggregering, denaturering av proteinprov, dissociation av icke-kovamenta interaktioner och bildandet av konstgjorda oligomeric tillstånd som orsakas av delipidation effekter av tvättmedel. Att använda strukturanalys i samband med de nationella kontaktpunkterna ger dessutom ytterligare strukturell information och möjliggör direkt observation av molekylära interaktioner, som både är avgörande för att förstå protonpumpshämmare och vanligtvis förlorade när man använder tidigare etablerade metoder för PPI-detektering. Denna metod har framgångsrikt använts för strukturella studier av vild typ AcrB och kan ha stor tillämplighet på andra former av strukturell analys, såsom röntgenkristallografi och fast tillstånd NMR, och många olika proteiner som används i annan forskning som försöker bestämma de interaktioner som visas av nya proteinmål.
För att erhålla reproducerbara resultat med rimliga proteinutbyten med hög renhet finns det flera kritiska steg i reningsprocessen med membranaktiva polymerer som måste följas. Det första kritiska steget är processen med membranisolering, så det är viktigt att centrifugera celllyset vid 15 000 x g och följa detta steg med ultracentrifugering vid 215 000 x g för att verkligen isolera cellmembranet från resten av celllyatet. Nästa kritiska steg är att lösligtisera membranfraktionen med membranaktiva polymerer vid en koncentration av 2,5% vid rumstemperatur i två timmar. Optimeringsexperiment av reningen utfördes och användning av dessa parametrar i detta steg visades för att säkerställa att den optimala mängden AcrB extraheras från membranet och korrekt bildning av de inhemska cellmembrannanopartiklarna uppstår. Det sista kritiska steget i reningsprocessen är att ladda provet på Ni-NTA-kolumnen vid rumstemperatur. Detta är nödvändigt, eftersom membranaktiva polymerer är mer lösliga vid rumstemperatur än vid 4 °C, vilket innebär att belastning vid rumstemperatur ökar mängden proteinbindning på affinitetskolonnen och undviker högt tryck som orsakas av olöslig polymeruppbyggnad som potentiellt kan skada kolonnen. Nästan lika viktigt för att få korrekt strukturell information är stegen i det negativa färgningsförfarande som nämns ovan. De mest kritiska aspekterna av denna procedur inkluderar användningen av 10 nm tjocka håliga kolnät, volymer av vatten och uranylacetat och tidens längder för prov adsorption och färgning. Användning av dessa nyckelparametrar under provberedningen säkerställer strukturella kvalitetsdata som kan användas för korrekt bedömning av det oligomeriska tillstånden för det prov som avbildas. Ändringar av reningsprotokollet kan vara nödvändiga när man använder olika proteiner för att felsöka de problem som kan uppstå på grund av de unika egenskaperna hos olika polypeptider. De primära faktorerna att överväga att modifiera när du har svårt att få en tillräcklig mängd proteinprov bör vara de parametrar som används under induktionssteget, mängden membranfraktion som används i löslighetssteget och längden på tid och temperatur för löslighetsprocessen. Om det finns ett problem med renhet kan det vara nödvändigt att använda alternativa tillhörighetskolonner, till exempel en biotintillhörighetskolumn, i stället för att använda Ni-NTA-kolumnen för rening. På samma sätt, om underhåll av svaga/ övergående proteinproteininteraktioner är nödvändigt, är utbyte av Ni-NTA-kolumnen för en TAP-tagg affinitet kolumn fördelaktigt för optimala resultat. Slutligen, när man studerar däggdjursproteiner, bör däggdjursuttryckssystem användas för att upprätthålla verkliga infödda cellmembran lipidkompositioner som är nödvändiga för korrekt bestämning av proteinets naturliga oligomeriska tillstånd. Detta kommer att kräva en total översyn av proteinuttrycket och celllysstegen i detta protokoll. I sådana fall bör tidigare etablerade protokoll för proteinuttryck och celllys som motsvarar det uttryckssystem som är nödvändigt för målproteinet av intresse följas.
Användning av NCMNs med elektronmikroskopi visar stora fördelar jämfört med FRET för användning vid detektion av protonpumpshämmarna. Som resultaten från denna studie visar var de tidigare utförda FRET-experimenten oförenliga med den strukturella analysen av den oligomeriska strukturen hos AcrB-mutantproteinet21. Detta visades tydligt och bekräftades direkt av de bilder tagna med negativ fläck elektronmikroskopi, som överensstämmer med den tidigare beskrivna förlusten av aktivitet för mutant acrB-P223G16. Om AcrB-P223G bildade trimers in vivo skulle NCMNP5-2-polymeren ha fångat dem i de stora inhemska cellmembranplåster som den extraherar. Det är möjligt att FRET-analysen av mutant AcrB resulterade i ett falskt positivt på grund av någon av de flera begränsningar som är inneboende i de fysiska processer som tekniken förlitar sig på och den teknik som används för att mäta fluorescerande resonansenergiöverföringar. En viktig begränsning av FRET är upplösningsgränserna för konfokal mikroskopi och detta leder till allvarliga begränsningar i de intermolecular avstånd som kan lösas med FRET-analyser19. I jämförelse är användning av NCMNs i samband med elektronmikroskopi inte föremål för ovannämnda begränsning av FRET, med betydligt högre upplösningsgränser jämfört med de för konfokal mikroskopi. Baserat på dessa begränsningar med potentiella effekter på de tidigare beskrivna FRET-analyserna, hävdar vi att felaktig detektering av en AcrB-P223G trimer in vivo resulterade från lågupplösningsbegränsningen fret21. Bortsett från fördelarna jämfört med bara FRET som påpekas direkt av detta dokument, att använda NCMNs i samband med elektronmikroskopi har fördelen jämfört med alla nuvarande protein-protein interaktionstekniker, såsom Y2H-systemet och TAP-MS, genom att det kan användas för att observera proteinproteininteraktioner i inhemska cellmembranmiljöer direkt i hög upplösning och har potential att användas för att bestämma proteinstrukturerna på atomnivå.
Membranaktiva polymerer och elektronmikroskopi är inte heller utan begränsningar. För närvarande är huvudfrågan om NCMN-rening dess lägre extraktionseffektivitet jämfört med tvättmedelsbaserade metoder (polymererna i NCMN-biblioteket visar ~ 70% extraktionseffektiviteten hos DDM). Den har också kompatibilitetsproblem med vissa tillhörighetskolumner, till exempel maltosbindningskolumner. Dessutom är NCMN-reningen fortfarande inte särskilt framgångsrik med mycket dynamiska membranproteiner eller komplex (data opublicerade). Användning av membran aktiva polymerer och elektronmikroskopi för oligomeric tillstånd bestämning experiment kräver avlägsnande av proteiner från den inhemska cellmiljön, medan FRET utförs in vivo. Nanopartiklarna som bildas av membranaktiva polymerer möjliggör dock den mest inhemska miljön som möjligt när proteinerna extraheras från celler, för att minska de potentiella experimentellt härledda felaktigheter som är kända för att orsakas av proteinutvinning och rening. Dessutom, medan frågan om upplösning och partikelstorlek som begränsning av transmissionselektronmikroskopi har minskat avsevärt under det senaste decenniet, kommer mikroskopen som fortfarande används för negativ fläckanalys fortfarande att vara relativt begränsade till större molekyler eller molekylära komplex (>200 kDa) eftersom de i allmänhet har en informationsgräns på cirka 0,1-0,3 nm25. SMALP har också visat sig vara mycket flexibelt när det gäller applikationer men visar ännu större begränsningar än NCMNs. Nanodiscs som bildas av SMA har en maximal diameter på ungefär 15 nm och är därför ofta ineffektiva för att extrahera proteiner och proteinkomplex som är över 400 kDa26. Utöver denna begränsning kan SMA inte heller arbeta med proteiner som finns i miljöer med lågt pH eller använda divalentjoner för strukturella och funktionella ändamål. På grund av att SMALPs verkningsmekanism är pH-beroende kan den inte användas med låga pH-förhållanden och kelater divalent joner. Medan SMILP- och DIBMA-metoderna har gett löfte när det gäller att övervinna dessa begränsningar, har deras tillämplighet på olika uppsättningar proteiner förblivit osynlig27,28. NCMNs försöker övervinna dessa begränsningar genom att använda struktur-aktivitet relation (SAR) analys för att skapa alternativa polymerer som kan bilda större nanopartiklar, fungera i låga pH förhållanden och undvika kelaterande divalent joner. Ett sådant exempel på de polymerer som har utvecklats för NCMNs är NCMNP5-2-polymeren som visar förmågan att skapa större nanopartiklar som visas i figur 1E,F.
Förutom de tidigare beskrivna framstegen inom nanopartikelteknik är ncmns framtida riktning att utveckla ännu mer membranaktiva polymerer som kommer att ge NCMNs polymerbibliotek ökad extraktionseffektivitet och förmågan att arbeta med proteiner av alla olika transmembrane-regionstorlekar, som fungerar på mycket bredare pH-nivåer, eller förlitar sig på någon typ av jon för underhåll av deras struktur och funktion. Detta kommer att göra det möjligt för alla membranproteinforskare att använda denna teknik i sina experiment och ha tillgång till mer exakta och biologiskt relevanta resultat. Genom att föra fördelarna med polymernanopartiklar till ett bredare utbud av proteiner är förhoppningen att detta kommer att leda till att lösa högupplösta strukturer av inhemska membranproteinkomplex på atomnivå och därmed bestämma de intramolekylära atominteraktioner som går till att upprätthålla dessa komplex. Sådana framsteg skulle också möjliggöra många nya möjligheter när det gäller upptäckt och utveckling av membranproteinläkemedel genom strukturbaserade läkemedelsdesigninsatser. Användning av strukturbaserade läkemedelsdesigntekniker för membranproteiner skulle vara en enorm fördel för den medicinska industrin eftersom detta skulle öka läkemedelsbindningsspecifikitet och effekt för att minska oönskade biverkningar och den mängd förening som krävs för att framkalla önskade terapeutiska effekter, vilket gör läkemedel som riktar sig mot membranproteiner betydligt säkrare och effektivare. Det inhemska cellmembrannanopartiklarsystemet är fortfarande i utvecklingsstadier men har redan visat sig vara otroligt kraftfullt genom att för första gången tillåta studier av membranproteiner i deras verkligt inhemska tillstånd och klargöra de inhemska proteinproteininteraktioner som uppstår på cellmembranet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.G är listad som uppfinnare av det membranaktiva polymer-NCMNP5-2- och NCMN-systemet.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av VCU startup fund (till Y.G.) och National Institute Of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under Award Number R01GM132329 (till Y.G.) Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter. Vi tackar Montserrat Samso och Kevin McRoberts för deras generösa stöd för videoinspelning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
