Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.
Abstract
Eiwit-eiwitinteracties in celmembraansystemen spelen een cruciale rol in een breed scala aan biologische processen, van cel-tot-celinteracties tot signaaltransductie; van het detecteren van omgevingssignalen tot biologische respons; van metabole regulatie tot ontwikkelingscontrole. Nauwkeurige structurele informatie over eiwit-eiwitinteracties is cruciaal voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van membraaneiwitcomplexen en voor het ontwerp van zeer specifieke moleculen om deze eiwitten te moduleren. Er zijn veel in vivo en in vitro benaderingen ontwikkeld voor de detectie en analyse van eiwit-eiwit interacties. Onder hen is de structurele biologiebenadering uniek omdat het directe structurele informatie kan geven over eiwit-eiwitinteracties op atomair niveau. De huidige structurele biologie van membraaneiwitten is echter nog steeds grotendeels beperkt tot methoden op basis van detergentia. Het grote nadeel van methoden op basis van detergentia is dat ze vaak membraaneiwitcomplexen dissocieren of denatureren zodra hun inheemse lipide-bilayeromgeving wordt verwijderd door wasmiddelmoleculen. We hebben een native cell membrane nanodeeltjes systeem ontwikkeld voor membraan eiwit structurele biologie. Hier demonstreren we het gebruik van dit systeem bij de analyse van eiwit-eiwitinteracties op het celmembraan met een case study van de oligomere toestand van AcrB.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPI) spelen een cruciale rol in de biologie, van het behoud van de structuur en functie van eiwitten tot de regulering van hele systemen. PPR's zijn er in veel verschillende vormen en kunnen worden gecategoriseerd op basis van welke soorten interacties ze vormen. Een dergelijke categorisatie is homooligomerisch of heterooligomerisch, gebaseerd op de vraag of de interacties tussen identieke subeenheden of verschillende eiwitten zijn die als subeenheden werken. Een andere categorisatie is gebaseerd op de kracht van de interactie als de interacties leiden tot de vorming van stabiele complexen of voorbijgaande complexe toestanden. Structurele informatie over de PPR's tussen eiwitten is cruciaal om het mechanisme te begrijpen waarmee eiwitten hun functie uitvoeren. Geschat wordt dat meer dan 80% van de eiwitten afhankelijk is van complexe vorming om hun functionele rol uit te voeren1. Gezien het percentage waargenomen eiwitten dat afhankelijk is van PPR's voor een goede aangeboren werking, is hun betekenis in de biologie duidelijk, maar het goed kunnen onderzoeken van de eiwitten die deelnemen aan deze interacties is een uitdaging gebleven vanwege beperkingen in de technieken die beschikbaar zijn om experimenteel te observeren wanneer eiwitten PPR's vormen.
Er is een grote mate van onenigheid tussen de resultaten voor veel experimenteel bepaalde PPR's vanwege de hoge hoeveelheid ruis, valse positieven en valse negatieven die zijn afgeleid van veel van de momenteel beschikbare PPI-bepalingstechnieken. Dit geldt met name voor het gist tweehybride (Y2H)-systeem, tandemaffiniteitzuiveringsmassaspectrometrie (TAP-MS) en fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET), die drie van de meest gebruikte methoden voor PPI-bepaling2,3,4,5,6,7vertegenwoordigen . Ter vergelijking: eiwitstructuurbiologietechnieken, zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR), röntgenkristallografie en elektronenmicroscopie (EM), kunnen worden gebruikt om structurele informatie in hoge resolutie over eiwit-eiwitinteracties tot op atomair niveau te verkrijgen en de directe visuele bevestiging mogelijk te maken van de interacties die optreden voor een doeleiwit van belang. Alle momenteel beschikbare niet-structuurgebaseerde PPI-bepalende onderzoekstechnieken (bijv. Y2H, TAP-MS en FRET) missen dit vermogen en hebben bovendien moeite met het identificeren van zwakke en voorbijgaande interacties tussen eiwitten5. Deze tekortkomingen worden verder versterkt bij het bestuderen van membraaneiwitten vanwege de extra complexiteit veroorzaakt door de extra variabele van de lipideomgeving die de vorming van de juiste quaternaire structuur en heteromere complexe assemblage beïnvloedt.
Membraaneiwitten vormen een groot deel van het proteoom en staan erom bekend dat ze veel cruciale rollen spelen bij het goed functioneren van cellen in alle levende organismen. Ondanks het feit dat membraaneiwitten naar schatting 27% van het menselijk genoom uitmaken en ~ 60% van alle huidige medicijndoelenvormen,is er een grote anomalie in het aantal opgeloste modellen voor membraaneiwitten die slechts ~ 2,2% van alle gepubliceerde eiwitstructurenuitmaken 8,9,10. De belangrijkste oorzaak van de discrepantie in de beschikbaarheid van structurele informatie ligt in de intrinsieke eigenschappen van membraaneiwitten zelf. Vanwege hun slechte oplosbaarheid, afhankelijkheid van interacties met een lipideomgeving voor het behoud van de inheemse structuur en functie, en verschillende fysisch-chemische eigenschappen van het lipidemembraan zelf, blijven membraaneiwitten een aanzienlijk probleem vormen bij het implementeren van structurele biologietechnieken om ze te bestuderen. Van deze intrinsieke eigenschappen is de belangrijkste voor het verkrijgen van nauwkeurige structurele informatie de vereiste van interacties met hun natuurlijke lipideomgeving om hun oorspronkelijke structuur en functie te behouden. De lipideomgeving is zo'n integraal onderdeel van de structuur en functie van membraaneiwitten dat het concept memteïne (een combinatie van de woorden membraan en eiwit) is voorgesteld als de fundamentele eenheid van membraan-eiwitstructuur en functie11. Ondanks het belang van lipide-eiwitinteracties vereisen de momenteel beschikbare structuurgebaseerde PPI-bepalingstechnieken vaak dat de bestudeerde eiwitten oplosbaar zijn of worden opgelost met detergentia. Blootstelling aan agressieve detergentia kan de eiwitten denatureren of valse positieven en negatieven veroorzaken als gevolg van delipidatie, wat aggregatie, denaturatie van eiwitten, dissociatie van niet-covalente interacties en vorming van kunstmatige oligomere toestanden kan veroorzaken. Vanwege de noodzaak van het handhaven van een natuurlijke lipideomgeving voor nauwkeurige bepaling van de inheemse oligomere toestand van membraaneiwitten hebben we een Native Cell Membrane Nanoparticles system (NCMNs)12 ontwikkeld op basis van de eerder gerapporteerde Styreen Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13-methode.
SMALP gebruikt styreen maleïnezuurcopolymeer als een membraan actief polymeer om membraaneiwitten te extraheren en op te slubiliseren. Poly (Styreen-co-Maleic Acid) (SMA) is een uniek amfifiel polymeer vanwege zijn hydrofobe styreen moiety en diametraal tegengestelde hydrofiele maleïnezuur moiety. Het vormt nanodeeltjes door het celmembraan te adsorberen, destabiliseren en verstoren in een pH-afhankelijk mechanisme14. Deze functionele activiteit van SMA maakt het mogelijk om het te gebruiken als een wasmiddelvrij systeem voor membraaneiwitextractie en oplosbaarheid. Het NCMN-systeem onderscheidt zich in verschillende aspecten van het SMALP-systeem. Het meest unieke kenmerk van het NCMN-systeem is dat het een membraan actieve polymeerbibliotheek heeft met een veelheid aan polymeren die unieke eigenschappen hebben die ze geschikt maken voor de isolatie van veel verschillende membraaneiwitten die verschillende omstandigheden voor stabiliteit en native werking vereisen. Het NCMN-systeem heeft ook verschillende protocollen in vergelijking met de SMALP-methode als het gaat om het voorbereiden van de nanodeeltjes. Een voorbeeld hiervan is dat NCMN's een kolomzuivering met nikkelaffiniteit in één stap gebruiken voor de bepaling van de structuur met hoge resolutie; het effect van deze verschillende protocollen kan worden waargenomen bij het vergelijken van het NCMNs-protocol, dat 3,2 en 3,0 Å cryo-EM AcrB-structuren genereerde, met een vergelijkbare studie met behulp van de SMALP-methode, wat resulteerde in een cryo-EM AcrB-structuur met een resolutie van 8,8 Å12,15. Deze unieke kenmerken van het NCMN-systeem zijn de verbeteringen die zijn aangebracht op de eerder vastgestelde SMALP-methode en maken het een ideale kandidaat voor de studie van PPR's.
De multidrug efflux transporter AcrB bestaat als functionele homotrimeer in E. coli12. Een mutagene analyse suggereerde dat een enkele P223G-puntmutatie, gelegen op een lus die verantwoordelijk is voor de stabiliteit van de AcrB-trimer, de trimertoestand destabiliseert en een AcrB-monomeer oplevert wanneer deze wordt bereid met het wasmiddel DDM, dat kan worden gedetecteerd met native blue gel electrophoresis16. De FRET-analyse van de AcrB-P223G-mutant suggereerde echter dat in de oorspronkelijke celmembraanlipide-bilayeromgeving de meerderheid van mutant AcrB-P223G nog steeds als trimer bestond en dat de expressieniveaus voor zowel wild type AcrB als AcrB-P223G vergelijkbaar zijn. Maar ondanks de resultaten van de FRET-analyse toonde een activiteitstest voor de mutante transporter aan dat de activiteit drastisch daalde in vergelijking met het wilde type16. Hoewel FRET-technologie in de volksmond is gebruikt voor de analyse van eiwit-eiwitinteracties, heeft onderzoek aangetoond dat het vaak valse positieven kan geven17,18,19,20.
Onlangs werden cryo-EM-structuren met hoge resolutie van de AcrB-trimer bepaald die de interactie van AcrB met de bijbehorende inheemse celmembraanlipide-bilayer lieten zien door het gebruik van de NCMNs12. In principe kunnen de NCMN's gemakkelijk worden gebruikt voor de analyse van eiwit-eiwitinteracties op het inheemse celmembraan. In een test van dit systeem werden experimenten uitgevoerd om de oligomere toestand van AcrB-P223G direct te observeren met behulp van native cell membrane nanodeeltjes en negatieve vlekkende elektronenmicroscopie. Om te vergelijken met het wilde type AcrB nanodeeltjes, gebruikten we hetzelfde membraan actieve polymeer (SMA2000 gemaakt in ons laboratorium, dat is geïndexeerd als NCMNP1-1 in de NCMN-bibliotheek) gebruikt voor hoge resolutie cryo-EM structuurbepaling van AcrB en alternatieve polymeren gevonden in de NCMN's bibliotheek12. Op basis van de eerder gerapporteerde resultaten werd verwacht dat de meerderheid van de AcrB-P223G-mutant zou bestaan in de vorm van trimerische inheemse celmembraan nanodeeltjes21. Er werden echter geen AcrB-trimers in het monster gevonden, zoals die welke werden waargenomen met het wilde type AcrB. Dit suggereert dat de meerderheid van AcrB-P223G geen trimers vormt op het oorspronkelijke celmembraan zoals eerder gesuggereerd.
Hier rapporteren we een gedetailleerde analyse van de mutant E. coli AcrB-P223G in een vergelijking met het wilde type E. coli AcrB met behulp van de NCMNs. Deze case study van AcrB suggereert dat NCMNs een goed systeem is voor eiwit-eiwit interactie analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eiwitexpressie
- Ent 15 ml Terrific Bouillon (TB) media met antibiotica specifiek voor plasmiden met BL21(DE3) pLysS cellen die de AcrB uitdrukken plasmiden in 50 ml buizen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 250 tpm.
- Controleer de optische dichtheid van de nachtcultuur bij 600 nm (OD600) en zorg ervoor dat deze meer dan 2,0 is.
- Verdun 5 ml celkweek tot 1 L tbc-media die antibiotica bevatten die specifiek zijn voor plasmiden en incubeer bij 37 °C met schudden tot OD600=0,8 en induceer vervolgens met IPTG met een uiteindelijke concentratie van 1 mM.
- Voer inductie uit bij 20 °C met schudden gedurende 20 uur.
- Pellet door de cellen met behulp van centrifugatie gedurende 15 minuten bij 4 °C en 4.000 x g.
2. Cellyse en membraanisolatie
- Resuspend de celpellet in Buffer A(tabel 1, gebruik DDM Buffer A of NCMNs Buffer A afhankelijk van het te volgen zuiveringsschema) met 80 ml voor elke 20 g van de celpellet.
- Homogeniseer de geresuspendeerde celkorrels met behulp van een glazen Dounce-homogenisator bij 4 °C of als u bij kamertemperatuur onmiddellijk daarna op het ijs zet.
- Breng het monster over in een metalen bekerglas op ijs en lyseer de cellen door ze te laden in een hogedrukhomogenisator bij 4 °C en 1.500 bar.
- Herhaal het proces van het laden van de cellen in de homogenisator en laat ze gedurende 3-4 cycli door de homogenisator gaan of totdat het lysaat begint te verduidelijken.
- Centrifugeer het lysaat bij 15.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C.
- Verzamel de supernatant en laad in ultracentrifugebuizen en centrifugeer bij 215.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Gooi de supernatant weg en verzamel de membraankorrels uit de ultracentrifugebuizen. Bewaar overtollige membraankorrels bij -80 °C.
3. Voorbereiding van inheemse celmembraan nanodeeltjes
- Resuspend 1 g membraankorrel in 10 ml NCMNs Buffer A (tabel 1).
- Homogeniseer het geresuspendeerde celmembraanmonster met een glazen Dounce-homogenisator bij 20 °C.
- Breng het gesuspendeerde membraanmonster over in een polypropyleenbuis van 50 ml en voeg membraan actieve polymerenvoorraadoplossing en extra NCMNs Buffer A toe om het monster naar een uiteindelijke concentratie van 2,5% (w/v) membraan actief polymeer (NCMNP1-1 of NCMNP5-2) te brengen.
OPMERKING: Voorraadoplossingen van membraanactieve polymeren moeten worden gemaakt in dubbel gedestilleerd water en kunnen in verschillende concentraties worden bewaard, maar meestal 10% (w/v). - Schud het monster gedurende 2 uur bij 20 °C.
- Laad het monster in een ultracentrifuge en draai bij 150.000 x g gedurende 1 uur bij 20 °C.
- Terwijl het monster ultracentrifugeert, begint het een Ni-NTA-kolom van 5 ml in evenwicht te gebracht met 25 ml NCMNs-buffer A.
- Verzamel de supernatant nadat de ultracentrifugatie is voltooid en laad deze op 5 ml Ni-NTA-kolom bij kamertemperatuur met een debiet van 0,5 ml/min met behulp van een spuitpomp.
- Was snelle eiwitvloeistofchromatografielijnen (FPLC) met voldoende NCMNs Buffer B (tabel 1) om het systeem volledig door te spoelen en sluit de kolom vervolgens aan op de FPLC-machine.
- Was de kolom met 30 ml NCMNs Buffer B met een debiet van 1 ml/min en verzamel de stroom door.
- Was de kolom met 30 ml NCMNs Buffer C (tabel 1) met een debiet van 1 ml/min en verzamel de stroom door.
- Eluteer het eiwit met 20 ml NCMNs Buffer D (tabel 1) bij een debiet van 0,5 ml/min en verzamel het monster met behulp van een fractiecollector en de fracties die elk op 1,0 ml worden ingesteld.
- Bewaar de eiwitmonsters op 4 °C.
- Voer een SDS-PAGE gelelektroforesetest uit om de monsters te controleren die overeenkomen met pieken die in de FPLC-elutiegrafiek worden waargenomen.
4. SDS-PAGE gel elektroforese
- Bereid de gietkamer voor door het glas aan het gietapparaat te klemmen.
- Bereid de 12% scheidingsgel volgens het recept in tabel 1.
OPMERKING: Zodra TEMED is toegevoegd, zal de gel snel polymeriseren, dus voeg dit pas toe zodra u klaar bent om de gel te gieten. - Giet de gel, laat 2 cm onder de bodem van de kam voor de stapelgel.
- Verwijder eventuele bubbels door de bovenkant van de gel te gelaagd met 100% isopropanol en wacht tot de scheidingsgel polymeriseert.
- Verwijder de isopropanol en was eventuele sporen van de isopropanol met gedestilleerd water.
- Bereid de stapelgel volgens het recept in tabel 1.
OPMERKING: Zodra TEMED is toegevoegd, zal de gel snel polymeriseren, dus voeg dit pas toe zodra u klaar bent om de gel te gieten. - Giet de stapelgel bovenop de scheidingsgel.
- Voeg een kam toe aan de kamer om de putten te vormen en wacht tot de stapelgel volledig polymeriseert.
- Plaats 1 μL van 1 M DTT in een microcentrifugebuis voor elk fractiemonster dat op de gel moet worden uitgevoerd.
- Voeg ook 7 μL 4x laadbuffer toe aan elke buis.
- Voeg 20 μL monster van de fracties die op de gel moeten worden uitgevoerd toe aan elke microcentrifugebuis.
- Vortex de buizen met de monsters.
- Draai de monsterbuizen af met een tabletop microcentrifuge gedurende 3 s en zorg ervoor dat al het monster is teruggekeerd naar de bodem van de buizen.
- Bereid de gel-elektroforesecel voor door een gelcassette van 12% polyacrylamide op zijn plaats te zetten en de binnen- en buitenkamers van de cel te vullen met Tris-acetaat-EDTA (TAE) Buffer (tabel 1).
- Plaats de markering van het molecuulgewicht in de eerste rijstrook van de gel met het juiste volume dat vereist is door de instructies.
- Laad 28 μL van het monster van elke buis gemengd met DTT en laadbuffer.
- Plaats het deksel van de elektroforesecel op de doos en sluit het deksel aan op de voeding.
- Schakel de voeding in en stel deze in op 100 V en laat deze 20 minuten draaien.
- Verhoog na 20 minuten de voedingsstroom tot 140 V en blijf deze nog 30-40 minuten draaien of totdat de ladingsbufferkleurstof de bodem van de gelcassette bereikt.
- Na het voltooien van elektroforesevlek en het ontsmetten van de gel om de eiwitbanden in de gel te visualiseren.
5. Eiwitzuivering met DDM
OPMERKING: Het doel van het uitvoeren van dit zuiveringsproces is om te dienen als een controle voor de experimenten met behulp van de membraan actieve polymeren.
- Resuspend 6-10 g membraanpellet, vanaf stap 2.6, in DDM Buffer A (tabel 1) met 5 ml/g membraanpellet.
- Homogeniseer het geresuspendeerde monster met een glazen Dounce-homogenisator bij 4 °C of zorg ervoor dat u bij kamertemperatuur onmiddellijk daarna op het ijs zet.
- Breng het monster over naar een polypropyleenbuis van 50 ml en voeg DDM en extra DDM Buffer A toe om het monster tot een uiteindelijke concentratie van 2% DDM te brengen.
- Schud het monster gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Plaats het monster in ultracentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 1 uur bij 4 °C en 150.000 x g.
- Terwijl het monster ultracentrifugeert, begint u de 5 ml Ni-NTA-kolom voor te bereiden door te wassen met 25 ml DDM-buffer A (tabel 1).
- Nadat de ultracentrifugatie is voltooid, verzamelt u het supernatant en laadt u het op de 5 ml Ni-NTA-kolom bij 4 °C met een debiet van 0,5 ml/min met behulp van een spuitpomp.
- Was FPLC-lijnen met voldoende DDM Buffer B + 0,05% DDM(tabel 1)om het systeem volledig door te spoelen en bevestig vervolgens de kolom aan de FPLC-machine.
- Was de kolom met 30 ml DDM Buffer B + 0,05% DDM met een debiet van 1 ml/min en verzamel de stroom door.
- Was de kolom met 30 ml DDM Buffer C + 0,05% DDM (tabel 1) met een debiet van 1 ml/min en verzamel de stroom door.
- Eluteer het eiwit met 20 ml DDM Buffer D + 0,05% DDM (tabel 1) met een debiet van 0,5 ml/min en verzamel de stroom door met behulp van een fractiecollector en de fracties die elk worden ingesteld op 1,0 ml.
- Selecteer de breuken die de elutiepiek bevatten voor het poolen en concentreren met behulp van een centrifugaalconcentrator en centrifugeren bij 4.000 x g en 4 °C tot 500 μL.
- Met behulp van een lus van 500 μL laadt u het monster in de FPLC-machine en vervolgens op de uitsluitingskolom van 25 ml bij 4 °C. Elute met 30 ml DDM Buffer E + 0,05% DDM (tabel 1) met een debiet van 0,5 ml/min en verzamel als breuken met de fractiegroottes ingesteld op 0,5 ml per fractie.
- Neem de fracties en meet de eiwitconcentratie met behulp van 280 nm absorptie om de UV-Vis-curve uit de FPLC-elutiegrafiek te bevestigen.
- Verzamel 20 μL van elke monsterfractie die overeenkomt met pieken die in de FPLC-elutiegrafiek worden waargenomen en die met de absorptietest nauwkeurig zijn bevestigd.
- Vries de rest van die monsterfracties in met vloeibare stikstof of droogijs in de gewenste aliquots en bewaar eiwitmonsters bij -80 °C.
- Voer een SDS-PAGE gel elektroforesetest uit zoals eerder beschreven om de monsters te controleren die overeenkomen met pieken die zijn waargenomen in de FPLC-elutiegrafiek.
6. Negatieve vlek raster voorbereiding
- Plaats de roosters die voor de monstervoorbereiding zullen worden gebruikt op een glazen glijbaan gewikkeld in filterpapier met de koolstofkant naar boven gericht.
- Plaats de glazen schuif met de elektronenmicroscooproosters in de kamer van een gloeiontladingsregelaar tussen de twee elektroden en vervang het glazen deksel om ervoor te zorgen dat het gecentreerd en goed afgedicht is.
- Voer de gloeiontladingsmachine uit en zorg ervoor dat het paarse licht dat door het plasma wordt gegenereerd zichtbaar is.
- Wanneer de machine klaar is met draaien, wacht u tot de kamer atmosferische druk heeft bereikt om het glazen deksel te verwijderen en breng u de schuif met de roosters terug naar de bank waar monsters op worden geladen.
- Pas de concentratie van de gezuiverde eiwitmonsters aan tot ongeveer 0,1 mg/ml door het monster te verdunnen met de juiste buffer of te concentreren met behulp van een centrifugaalconcentrator.
- Laad 3,5 μL eiwitmonster op het 10 nm dikke koolstofraster en wacht 1 minuut.
- Verwijder de vloeistof met een filterpapier van het oppervlak van het EM-rooster.
- Was het roosteroppervlak 3x door 3 μL waterdruppels met het rooster op te pakken en het water uit het rooster te verwijderen met filterpapier ertussen om elke druppel op te pakken.
- Was het roosteroppervlak 2x door 3 μL druppeltjes vers, gefilterd 2% uraniumacetaat op te pakken en verwijder de wasoplossingen op het rooster met filterpapier ertussen om elke druppel op te pakken.
- Bevlek het rooster met een druppel verse, gefilterde 2% uraniumacetaat gedurende 1 minuut.
- Verwijder de uraniumacetaatoplossing op het oppervlak van het EM-rooster met filterpapier en droog het rooster minstens 1 minuut aan de lucht.
- Bewaar het raster in een rastervak voor later gebruik.
7. EM-beeldvorming
- Laad het voorbereide rooster op een veilige werkbank in de roosterhouder.
- Bereid de microscoop voor door de dewar-microscopen in een polystyreendoos te plaatsen en vul de dewar 3/4e vol vloeibare stikstof.
- Bevestig dat de rubberen afdekking van het microscoopvenster het bedekt en laad de dewar vervolgens op de microscoop door de koperen draden in de dewar te plaatsen totdat deze op het platform past.
- Vul de rest van de dewar met vloeibare stikstof en plaats een dop bovenop de dewar om deze te bedekken.
- Zet de hoge spanning aan, conditioneer de microscoop en wacht tot de microscoop opwarmt en een veilig vacuümniveau vaststelt voor gebruik.
- Zodra de microscoop klaar is, opent u de kolomklep en bevestigt u dat de straal aanwezig is door het rubberen deksel op het microscoopvenster te verwijderen.
- Controleer de beam stigmation door zich in en uit te spreiden door de intensiteit van de straal aan te passen. Als astigmatisme aanwezig is, zal de balk een elliptische vorm hebben als men weggaat van cross-over en de balk aan beide zijden dezelfde ovale vorm moet hebben.
- Stel de verrekijker van de microscoop in op de juiste hoogte en afstand volgens de ogen van de waarnemer.
- Controleer de bundelpositionering voor zoek-, focus-en belichtingsmodi door door alle drie de modi te fietsen totdat de balk in elk midden staat.
- Sluit de kolomklep en laad de roosterhouder in de elektronenmicroscoop.
- Stel de microscoop in op eucentrische hoogte met behulp van de wiebelfunctie van de microscopen en pas de beweging van het podium aan met behulp van de Z-as totdat er geen zijwaartse beweging van het monster in het midden is.
- Met behulp van de lage dosis Zoekmodus op de microscoop doorzoek het raster naar een wenselijk gebied van redelijk contrast met aanwezige monstermoleculen om zich op het monster te concentreren.
- Focus op het monster in de focusmodus met behulp van een hoge stapgrootte totdat het monster wordt gezien en verlaag vervolgens de stappen om het juiste scherpstelniveau te vinden.
- Nul en blank de straal en zorg er dan voor dat het rubberen kussentje het microscoopvenster bedekt.
- Neem met behulp van de belichtingsmodus het beeld van het gewenste rastergebied voor een belichting van 1 s bij een vergroting van 62.000x en controleer de verkregen afbeelding.
- Als u klaar bent met het in beeld brengen van een raster, sluit u de kolomkleppen en verwijdert u de roosterhouder uit de kolom.
- Wanneer klaar met het in beeld brengen van alle aandachtspunten sluit u de microscoop af door de gloeidraadvoeding uit te schakelen en de vloeibare stikstofdewar uit de microscoop te verwijderen.
- Plaats iets om vocht op te nemen op de standaard waar de dewar zat om condensatie van de koperspiralen van de microscoop op te vangen.
- Activeer de Cryo Cycle-modus en zorg ervoor dat de turbopomp is uitgeschakeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hier gepresenteerde procedures werden monsters van het wilde type E. coli AcrB en de E. coli mutant AcrB-P223G gezuiverd. De monsters werden vervolgens geadsorbeerd aan koolstofnegatieve vlekkenelektronenmicroscopieroosters en bevlekt met uranylacetaat met de zijvlekkenmethode22. Negatieve vlekkenbeelden werden verzameld met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Het negatieve vlekkenbeeld voor het met DDM gezuiverde acrB-wildmonster onthult een homogene oplossing van monodispergeerde deeltjes, waarbij het eiwit een goed gedefinieerde trimerische kwartenstructuur vertoont (figuur 1A). Deze trimerische structuren komen overeen met het waargenomen grootte-uitsluitingschromatogram bij zuivering (aanvullend figuur 1). Ter vergelijking: als we kijken naar het negatieve vlekkenbeeld voor de AcrB-P223G-mutant, ook gezuiverd met DDM, kan men een heterogene oplossing van polydispergeerde nanodeeltjes waarnemen met een neiging tot aggregatie, maar geen waarneembare inheemse trimers (figuur 1B). Deze resultaten worden ook ondersteund door het waargenomen elutieprofiel bij het uitvoeren van grootte-uitsluitingschromatografie (aanvullend figuur 1). Om te bepalen of het gebrek aan trimerische toestandseiwitten voor de mutant te wijten was aan behandeling met wasmiddel of uitsluitend werd veroorzaakt door de destabiliserende mutatie van P223G, werden de eiwitten ook gezuiverd met NCMNP1-1, een van de membraanactieve polymeren in de NCMNs-bibliotheek. Het negatieve vlekkenbeeld voor het met NCMNP1-1 gezuiverde monster van het AcrB-wildtype onthult opnieuw een homogene oplossing van monodispergeerde deeltjes met het eiwit dat een goed gedefinieerde trimerische kwartenaire structuur vertoont (figuur 1C). En net als bij de DDM-zuivering, wanneer de AcrB-P223G-mutant wordt gezuiverd met NCMNP1-1, toont het negatieve vlekkenbeeld een heterogene oplossing van polydispergeerde nanodeeltjes met een neiging tot aggregatie, maar geen waarneembare native trimers(figuur 1D). Om verder te bevestigen dat de P223G-mutatie de AcrB-trimer op het celmembraan verstoort, werd een ander polymeer (NCMNP5-2) geselecteerd uit de eigen NCMNs-membraan actieve polymeerbibliotheek. NCMNP5-2 kan inheemse celmembraan nanodeeltjes in veel grotere maten vormen, waardoor meerdere AcrB-trimers in één inheems celmembraandeeltje kunnen worden gebeeldreerd. Als gevolg hiervan werd waargenomen dat meerdere in het wild levende AcrB-trimers in enkele deeltjes zaten (figuur 1E); er werden echter geen AcrB-P223G trimerdeeltjes waargenomen zoals die gevormd door wild type AcrB, zelfs niet bij het bekijken van de grote inheemse celmembraan bilayer patches (Figuur 1F). Dit suggereert dat AcrB-P223G niet bestaat als trimer op het celmembraan zoals eerder gesuggereerd21 en biedt een logische verklaring waarom AcrB-P223G een dramatische afname van activiteit vertoont bij een test16. Om de zuiverheid van de monsters en de aanwezigheid van het juiste eiwit te bevestigen, werden elektroforesegels uitgevoerd voor alle gezuiverde eiwitmonsters. De resulterende vlekken bevestigden de aanwezigheid van AcrB in alle monsters met een zuiverheid van >95% en de locatie van de vlek kwam overeen met het voorspelde molecuulgewicht van AcrB (figuur 1G). De resultaten van onze studie zijn inconsistent met de eerder beschreven FRET-test met betrekking tot het bepalen van de oligomere toestand van het membraaneiwit AcrB-P223G16. Door gebruik te maken van membraan actieve polymeren en elektronenmicroscopie zoals beschreven in het protocol was de inheemse oligomere toestand van het eiwit direct waarneembaar. Een nauwkeurigere bepaling van hoe de monomeren van het eiwit met elkaar interageren, vereist de bepaling van cryo-EM-structuren met hoge resolutie.
Figuur 1: Negatieve vlekken en elektroforese gel afbeeldingen van gezuiverde AcrB constructies. (A) Negatieve vlek afbeelding genomen voor wild type AcrB gezuiverd met DDM. (B) Negatieve vlekafbeelding genomen voor de AcrB-P223G eiwitconstructie gezuiverd met DDM. (C) Negatieve vlek afbeelding genomen voor wild type AcrB gezuiverd met NCMNP1-1. (D) Negatieve vlek afbeelding genomen voor AcrB-P223G constructie gezuiverd met NCMNP1-1. (E) Negatieve vlekafbeelding genomen voor wild type AcrB gezuiverd met NCMNP5-2 (het rode vak markeert enkele van de trimer nanodeeltjes die in de afbeelding worden waargenomen). (F) Negatieve vlek afbeelding genomen voor AcrB-P223G gezuiverd met NCMNP5-2 (de groene doos markeert een deel van de lipide patches gevangen door NCMNP5-2 waargenomen in de afbeelding). (G) SDS-PAGE gel run met behulp van de eindproducten van de zuiveringen van AcrB-P223G met DDM (Lane 1), NCMNP1-1 (lane2), (H) SDS-PAGE gel run met behulp van de eindproducten van de zuiveringen van AcrB-P223G met NCMNP5-2. (I) Zoom in op de gemarkeerde objecten uit figuur 1E. (J) Zoom in op de gemarkeerde objecten van F. Alle negatieve vlekkenafbeeldingen in figuur 1 hebben dezelfde schaalbalk van 50 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| DDM Zuiveringsbuffers | Polymeerzuiveringsbuffers | Gel Elektroforese Buffers | |||
| Buffer A | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer A | 50 mM HEPES, pH 8,4 | TAE-buffer | 40 mM Tris Basis |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 20 mM Azijnzuur | |||
| 20 mM Imidazol | 20 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffer B | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer B | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Buffer vasthouden | 40% Methanol |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 10% azijnzuur | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | ||||
| 40 mM Imidazol | 40 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffer C | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer C | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Stapelgel | 1,5 M Tris pH 8,8 (0,63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrylamide/Bis (0,43 ml) | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 10% SDS (0,025 ml) | |||
| 75 mM Imidazol | 75 mM Imidazol | 10% APS (0,025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (4 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,39 ml) | ||||
| Buffer D | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer D | 25 mM HEPES, pH 7,8 | 12% Scheidingsgel | 1,5 M Tris pH 8,8 (1,3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrylamide/Bis (2 ml) | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 10% SDS (0,05 ml) | |||
| 300 mM Imidazol | 300 mM Imidazol | 10% APS (0,05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (5 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,6 ml) | ||||
| Buffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0,1 mM TCEP | 0,1 mM TCEP | ||||
Tabel 1: Lijst van zuiveringsbuffers die worden gebruikt voor kolomchromatografie en gelelektroforese.
Aanvullende figuur 1: Grootte uitsluiting chromatografie elutieprofielen. (A) Overlaygrafiek van de twee waargenomen elutieprofielen voor de experimenten met grootte-uitsluitingschromatografie die zijn uitgevoerd bij het zuiveren met DDM en het wilde type AcrB (oranje) en met DDM en de mutant AcrB-P223G (blauw). (B) Kolomkalibratieprofiel voor kolomgrootte-uitsluiting die wordt gebruikt voor DDM-experimenten.
1: Thyroglobuline (de heer 669 000), 2: Ferritine (de heer 440 000), 3: Aldolase (de heer 158 000), 4: Conalbumine (de heer 440 000), 3: Aldolase (de heer 158 000), 4: Conalbumine (de heer 4 75 000), 5: Ovalbumine (de heer 44 000), 6: Koolzuuranhydrase (de heer 29 000), 7: Ribonuclease A (de heer 13 700). Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor de integriteit van de structuur en functie van membraaneiwitten. Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken. In vergelijking met oplosbare eiwitten zijn membraaneiwitten en hun PPR's moeilijker te bestuderen vanwege de unieke intrinsieke eigenschappen van membraaneiwitten. Deze moeilijkheid komt voornamelijk voort uit de eis van membraaneiwitten om te worden ingebed in een inheemse lipide-bilayeromgeving voor structurele stabiliteit en functionaliteit. Dit wordt problematisch omdat om hoge resolutiestructuren van de eiwitten te bepalen, ze uit het celmembraan moeten worden geëxtraheerd. FRET is een populaire technologie geweest om eiwit-eiwitinteracties op het celmembraan te onderzoeken, maar de resolutie is laag en produceert vaak valse positieven17,18,19,20. Hier wordt voor het eerst aangetoond dat NCMN's kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van membraaneiwit-eiwitinteracties door structureel het wilde type AcrB-trimer en AcrB-P223G-monomeer op het oorspronkelijke celmembraan te analyseren en de resultaten te vergelijken met de eerdere analyse met FRET. Door de elektronenmicroscopie enkele deeltjesbeelden van wild type AcrB en AcrB-P223G te vergelijken, wordt gesuggereerd dat de meerderheid van AcrB-P223G geen trimers vormt op het E.coli-celmembraan zoals het wilde type AcrB-eiwit wanneer het wordt gezuiverd met behulp van membraanactieve polymeren, zoals NCMNP1-1 en NCMNP5-2. Wij stellen hier voor dat de resultaten van de FRET-analyse een vals-positief kunnen zijn als gevolg van de oplossingsbeperking van de FRET-aanpak. De kunstmatige disulfidebinding die de AcrB-P223G trimer stabiliseerde, kan ook een artefact zijn dat voorkwam in oplossing21. De negatieve vlekken suggereren dat de P223G-mutatie de vorming van de AcrB-trimer voorkwam en dat de monomere vorm van AcrB niet in dezelfde exterieur kon blijven die werd waargenomen wanneer deze in zijn trimerische vorm was. De lus die deze mutatie bevat, bleek eerder absoluut kritiek te zijn voor de vorming van de trimer door middel van mutagene en structurele analyse, die aantoonde dat de structurele betekenis ervan te wijten was aan de interacties die elke lus vormt door zich te begraven in het naburige AcrB-monomeer23.
Door gebruik te maken van het native cell membrane nanoparticle systeem voor eiwit-eiwit interactie detectie en analyse kan men direct de oligomere toestand van een eiwit detecteren door het membraaneiwit(en) in een echt inheemse celmembraanomgeving te houden, die kan worden gebruikt voor het verkrijgen van structurele informatie met hoge resolutie op atomair niveau door middel van cryo-EM-analyse van het monster met één deeltje. Het NCMN-systeem helpt de frequente valse positieven en valse negatieven te vermijden die worden waargenomen bij PPI-detectie veroorzaakt door het behandelen van monsters met detergentia24. Deze valse resultaten ontstaan meestal, vanwege de aggregatie, denaturatie van eiwitmonsters, dissociatie van niet-covalente interacties en vorming van kunstmatige oligomere toestanden veroorzaakt door de delipidatie-effecten van detergentia. Bovendien biedt het gebruik van structurele analyse in combinatie met de NCMN's aanvullende structurele informatie en maakt het de directe observatie van moleculaire interacties mogelijk, die zowel van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van PPR's als meestal verloren gaan bij het gebruik van eerder vastgestelde methoden voor PPI-detectie. Deze methode is met succes gebruikt voor structurele studies van wild type AcrB en zou een brede toepasbaarheid kunnen hebben op andere vormen van structurele analyse, zoals röntgenkristallografie en solid state NMR, en veel verschillende eiwitten die worden gebruikt in ander onderzoek om de interacties te bepalen die worden weergegeven door nieuwe eiwitdoelen.
Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen met redelijke eiwitopbrengsten van hoge zuiverheid zijn er verschillende kritieke stappen in het zuiveringsproces met membraanactieve polymeren die moeten worden gevolgd. De eerste kritieke stap is het proces van membraanisolatie, dus het is van cruciaal belang om de cellysaat op 15.000 x g te centrifugeren en deze stap te volgen met ultracentrifugatie bij 215.000 x g om het celmembraan echt te isoleren van de rest van de cel lysaat. De volgende kritieke stap is het opslubiliseren van de membraanfractie met membraanactieve polymeren bij een concentratie van 2,5% bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Optimalisatie-experimenten van de zuivering werden uitgevoerd en het gebruik van deze parameters bij deze stap werd aangetoond om ervoor te zorgen dat de optimale hoeveelheid AcrB uit het membraan wordt geëxtraheerd en dat de juiste vorming van de inheemse celmembraannanodeeltjes optreedt. De laatste kritieke stap van het zuiveringsproces is het laden van het monster op de Ni-NTA-kolom bij kamertemperatuur. Dit is nodig, omdat actieve polymeren van het membraan beter oplosbaar zijn bij kamertemperatuur dan bij 4 °C, waardoor het laden bij kamertemperatuur de hoeveelheid eiwit die zich aan de affiniteitskolom bindt, verhoogt en hoge druk vermijdt die wordt veroorzaakt door onoplosbare polymeeropbouw die de kolom mogelijk kan beschadigen. Bijna even belangrijk voor het verkrijgen van nauwkeurige structurele informatie zijn de stappen in de bovengenoemde negatieve kleuringsprocedure. De meest kritieke aspecten van deze procedure zijn het gebruik van 10 nm dikke holey koolstofroosters, hoeveelheden water en uranylacetaat, en de tijdsduur voor monster adsorptie en kleuring. Het gebruik van deze belangrijke parameters tijdens de monstervoorbereiding zal zorgen voor structurele kwaliteitsgegevens die kunnen worden gebruikt voor een nauwkeurige beoordeling van de oligomere toestanden van het monster dat wordt weergegeven. Wijzigingen in het zuiveringsprotocol kunnen nodig zijn bij het gebruik van verschillende eiwitten om problemen op te lossen die kunnen optreden als gevolg van de unieke kenmerken van verschillende polypeptiden. De belangrijkste factoren om te overwegen om te wijzigen wanneer u moeite heeft met het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid eiwitmonster, moeten de parameters zijn die tijdens de inductiestap worden gebruikt, de hoeveelheid membraanfractie die in de oplosstap wordt gebruikt en de tijds- en temperatuurduur voor het oplosproces. Als er een probleem is met zuiverheid, kan het nodig zijn om alternatieve affiniteitskolommen te gebruiken, zoals een kolom met biotineaffiniteit, in plaats van de kolom Ni-NTA te gebruiken voor zuivering. Evenzo, als onderhoud van zwakke/voorbijgaande eiwit-eiwitinteracties nodig is, is het uitwisselen van de Ni-NTA-kolom voor een TAP-tag affiniteitskolom gunstig voor optimale resultaten. Ten slotte moeten bij het bestuderen van zoogdiereiwitten zoogdierexpressiesystemen worden gebruikt om echte inheems celmembraanlipidesamenstellingen te behouden die nodig zijn voor nauwkeurige bepaling van de natuurlijke oligomere toestand van het eiwit. Dit vereist een volledige herziening van de eiwitexpressie en cellysestappen van dit protocol. In dergelijke gevallen moeten eerder vastgestelde protocollen voor eiwitexpressie en cellyse worden gevolgd die overeenkomen met het expressiesysteem dat nodig is voor het doeleiwit van belang.
Het gebruik van de NCMN's met elektronenmicroscopie biedt grote voordelen in vergelijking met FRET voor gebruik bij de detectie van PPR's. Zoals de resultaten van deze studie aantonen, waren de eerder uitgevoerde FRET-experimenten inconsistent met de structurele analyse van de oligomere structuur van het AcrB-mutante eiwit21. Dit werd duidelijk getoond en direct bevestigd door de beelden genomen met negatieve vlek elektronenmicroscopie, die consistent zijn met het eerder beschreven verlies van activiteit voor de mutant AcrB-P223G16. Als AcrB-P223G trimers in vivo zou vormen, zou het NCMNP5-2-polymeer ze hebben gevangen in de grote inheemse celmembraanpleisters die het extraheert. Het is mogelijk dat de FRET-analyse van mutant AcrB resulteerde in een vals positief vanwege een van de verschillende beperkingen die inherent zijn aan de fysieke processen waarop de techniek vertrouwt en de technologie die wordt gebruikt om de fluorescerende resonantie-energieoverdrachten te meten. Een belangrijke beperking van FRET zijn de resolutielimieten van confocale microscopie en dit leidt tot ernstige beperkingen in de intermoleculaire afstanden die kunnen worden opgelost met FRET-tests19. Ter vergelijking: het gebruik van NCMNs in combinatie met elektronenmicroscopie is niet onderworpen aan de bovengenoemde beperking van FRET, met aanzienlijk hogere resolutielimieten in vergelijking met die van confocale microscopie. Op basis van deze beperkingen die potentiële effecten hebben op de eerder beschreven FRET-tests, stellen we dat de onjuiste detectie van een AcrB-P223G-trimer in vivo het gevolg was van de lage resolutiebeperking van FRET21. Afgezien van de voordelen ten opzichte van alleen FRET die rechtstreeks door dit artikel worden opgemerkt, heeft het gebruik van NCMNs in combinatie met elektronenmicroscopie het voordeel ten opzichte van alle huidige eiwit-eiwitinteractietechnieken, zoals het Y2H-systeem en TAP-MS, in die zin dat het kan worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties in inheemse celmembraanomgevingen direct in hoge resolutie te observeren en het potentieel heeft om te worden gebruikt om de eiwitstructuren op atomair niveau te bepalen.
Membraan actieve polymeren en elektronenmicroscopie zijn ook niet zonder beperkingen. Momenteel is het belangrijkste probleem van NCMN-zuivering de lagere extractie-efficiëntie in vergelijking met op detergenten gebaseerde methoden (de polymeren in de NCMN-bibliotheek geven ~ 70% de extractie-efficiëntie van DDM weer). Het heeft ook compatibiliteitsproblemen met sommige affiniteitskolommen, zoals maltosebindende kolommen. Bovendien is de NCMN-zuivering nog steeds niet erg succesvol met zeer dynamische membraaneiwitten of complexen (gegevens ongepubliceerd). Het gebruik van membraanactieve polymeren en elektronenmicroscopie voor oligomere toestandsbepalingsexperimenten vereist verwijdering van de eiwitten uit de inheemse celomgeving, terwijl FRET in vivo wordt uitgevoerd. De nanodeeltjes gevormd door membraan actieve polymeren zorgen echter voor een zo inheems mogelijke omgeving bij het extraheren van de eiwitten uit cellen, om de potentiële experimenteel afgeleide onnauwkeurigheden waarvan bekend is dat ze worden veroorzaakt door eiwitextractie en zuivering te verminderen. Bovendien, terwijl de kwestie van resolutie en deeltjesgrootte als beperking van transmissie-elektronenmicroscopie het afgelopen decennium aanzienlijk is afgenomen, zullen de microscopen die nog steeds worden gebruikt voor negatieve vlekkenanalyse nog steeds relatief beperkt zijn tot grotere moleculen of moleculaire complexen (>200 kDa), omdat ze over het algemeen een informatielimiet hebben van ongeveer 0,1-0,3 nm25. SMALP is ook zeer flexibel gebleken in termen van toepassingen, maar geeft nog grotere beperkingen weer dan NCMN's. De nanodiscs gevormd door SMA hebben een maximale diameter van ongeveer 15 nm en zijn dus vaak niet effectief voor het extraheren van eiwitten en eiwitcomplexen die meer dan 400 kDa26zijn . Naast deze beperking is SMA ook niet in staat om te werken met eiwitten die bestaan in omgevingen met een lage pH of divalente ionen te gebruiken voor structurele en functionele doeleinden. Omdat het SMALPs-werkingsmechanisme afhankelijk is van de pH, kan het niet worden gebruikt bij lage pH-omstandigheden en chelatendivalente ionen. Hoewel de SMILP - en DIBMA-methoden beloftes hebben gedaan met betrekking tot het overwinnen van deze beperkingen , is hun toepasbaarheid op verschillende verzamelingen eiwitten ongezien gebleven27,28. NCMN's probeert deze beperkingen te overwinnen door sar-analyse (structure-activity relationship) te gebruiken om alternatieve polymeren te maken die grotere nanodeeltjes kunnen vormen, die in lage pH-omstandigheden functioneren en chelaatdivalente ionen voorkomen. Een voorbeeld van de polymeren die voor NCMN's zijn ontwikkeld, is het NCMNP5-2-polymeer dat de mogelijkheid weergeeft om grotere nanodeeltjes te maken, zoals aangetoond in figuur 1E,F.
Naast de eerder beschreven vooruitgang in nanodeeltjestechnologie, is de toekomstige richting van NCMNs in het ontwikkelen van nog meer membraan actieve polymeren die de NCMNs polymeerbibliotheek een verhoogde extractie-efficiëntie en de mogelijkheid zullen geven om te werken met eiwitten van alle verschillende transmembrane regiogroottes, die op veel bredere pH-niveaus functioneren, of vertrouwen op elk type ion voor onderhoud van hun structuur en functie. Dit zal alle membraaneiwitonderzoekers in staat stellen om deze technologie in hun experimenten te gebruiken en toegang te hebben tot nauwkeurigere en biologisch relevante resultaten. Door de voordelen van polymeer nanodeeltjes naar een grotere verscheidenheid aan eiwitten te brengen, is de hoop dat dit zal leiden tot het oplossen van hoge resolutie structuren van inheemse membraaneiwitcomplexen op atomair niveau en zo de intramoleculaire atoominteracties zal bepalen die gaan in het onderhoud van deze complexen. Dergelijke vooruitgang zou ook veel nieuwe mogelijkheden mogelijk maken op het gebied van de ontdekking en ontwikkeling van membraaneiwitgenee geneesmiddelen door middel van op structuur gebaseerde inspanningen voor het ontwerpen van geneesmiddelen. Het gebruik van structuurgebaseerde medicijnontwerptechnieken voor membraaneiwitten zou een enorm voordeel zijn voor de medische industrie, omdat dit de specificiteit en werkzaamheid van de drugbinding zou verhogen om ongewenste bijwerkingen en de hoeveelheid verbinding te verminderen die nodig is om de gewenste therapeutische effecten uit te lokken, waardoor geneesmiddelen die zich richten op membraaneiwitten aanzienlijk veiliger en effectiever worden. Het native cell membrane nanodeeltjessysteem bevindt zich nog in de ontwikkelingsfase, maar heeft al bewezen ongelooflijk krachtig te zijn door voor het eerst de studie van membraaneiwitten in hun echt inheemse toestand toe te staan en de inheemse eiwit-eiwitinteracties die op het celmembraan voorkomen, op te helderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.G wordt vermeld als uitvinder van het membraan actieve polymeer NCMNP5-2 en NCMN systeem.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het VCU startup fund (aan Y.G.) en het National Institute Of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number R01GM132329 (to Y.G.) De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. We danken Montserrat Samso en Kevin McRoberts voor hun gulle steun voor video-opname.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
