Summary
Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.
Abstract
Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellmembransystemen spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse - von Zell-zu-Zell-Interaktionen bis hin zur Signaltransduktion; von der Erfassung von Umweltsignalen bis hin zur biologischen Reaktion; von der metabolischen Regulierung bis zur Entwicklungskontrolle. Genaue strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Membranproteinkomplexen und für die Entwicklung hochspezifischer Moleküle zur Modulation dieser Proteine. Für den Nachweis und die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden zahlreiche In-vivo- und In-vitro-Ansätze entwickelt. Unter ihnen ist der strukturbiologische Ansatz insofern einzigartig, als er direkte strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene liefern kann. Die derzeitige Membranproteinstrukturbiologie beschränkt sich jedoch noch weitgehend auf Waschmittel-basierte Methoden. Der Hauptnachteil von Waschmittel-basierten Methoden ist, dass sie oft Membranproteinkomplexe dissoziieren oder denaturieren, sobald ihre native Lipid-Doppelschichtumgebung durch Waschmittelmoleküle entfernt wird. Wir haben ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem für die Strukturbiologie von Membranproteinen entwickelt. Hier zeigen wir den Einsatz dieses Systems bei der Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Zellmembran mit einer Fallstudie des oligomeren Zustands von AcrB.
Introduction
Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) spielen in der gesamten Biologie eine zentrale Rolle, von der Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion von Proteinen bis hin zur Regulierung ganzer Systeme. PPIs gibt es in vielen verschiedenen Formen und können basierend auf den Arten von Interaktionen kategorisiert werden, die sie bilden. Eine solche Kategorisierung ist homooligomer oder heterooligomer, je nach, ob die Wechselwirkungen zwischen identischen Untereinheiten oder verschiedenen Proteinen, die als Untereinheiten wirken, bestehen. Eine weitere Kategorisierung basiert auf der Stärke der Wechselwirkung, wenn die Wechselwirkungen zur Bildung stabiler Komplexe oder transienter komplexer Zustände führen. Strukturelle Informationen über die PPI zwischen Proteinen sind entscheidend für das Verständnis des Mechanismus, mit dem Proteine ihre Funktion erfüllen. Es wurde geschätzt, dass über 80% der Proteine auf komplexe Bildung angewiesen sind, um ihre funktionellen Rollen durchzuführen1. Angesichts des Prozentsatzes der Proteine, die für eine ordnungsgemäße angeborene Funktion auf PPI angewiesen sind, ist ihre Bedeutung in der Biologie leicht erkennbar, aber die Fähigkeit, die Proteine, die an diesen Wechselwirkungen teilnehmen, richtig untersuchen zu können, ist aufgrund der Beschränkungen der Techniken, die zur experimentellen Beobachtung zur Verfügung stehen, um zu beobachten, wann Proteine PPI bilden, eine Herausforderung geblieben.
Es gibt ein hohes Maß an Uneinigkeit zwischen den Ergebnissen für viele experimentell ermittelte PPI aufgrund der hohen Menge an Rauschen, falsch positive und falsche Negative, die von vielen der derzeit verfügbaren PPI-Bestimmungstechniken abgeleitet werden. Dies gilt insbesondere für das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H), die Tandem-Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (TAP-MS) und die Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung (FRET), die drei der am häufigsten verwendeten Methoden zur PPI-Bestimmung2,3,4,5,6,7darstellen. Im Vergleich dazu können proteinstrukturbiologische Techniken wie Kernspinresonanz (NMR), Röntgenkristallographie und Elektronenmikroskopie (EM) verwendet werden, um hochauflösende Strukturinformationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen bis auf atomare Ebene zu gewinnen und eine direkte visuelle Bestätigung der Wechselwirkungen zu ermöglichen, die für ein Zielprotein von Interesse auftreten. Alle derzeit verfügbaren nicht-strukturbasierten PPI-bestimmenden Forschungstechniken (z. B. Y2H, TAP-MS und FRET) haben diese Fähigkeit und leiden zusätzlich unter Schwierigkeiten bei der Identifizierung schwacher und vorübergehender Wechselwirkungen zwischen Proteinen5. Diese Unzulänglichkeiten werden bei der Untersuchung von Membranproteinen aufgrund der zusätzlichen Komplexität, die durch die zusätzliche Variable der Lipidumgebung, die die Bildung einer richtigen quaternären Struktur und heteromeren komplexen Montage beeinflusst, noch verstärkt.
Membranproteine machen einen großen Teil des Proteoms aus und sind dafür bekannt, viele entscheidende Rollen bei der ordnungsgemäßen Zellfunktion in allen lebenden Organismen zu spielen. Trotz der Tatsache, dass Membranproteine schätzungsweise 27 % des menschlichen Genoms ausmachen und 60 % aller aktuellen Wirkstoffziele ausmachen, gibt es eine große Anomalie in der Anzahl der gelösten Modelle für Membranproteine, die nur 2,2 % aller veröffentlichten Proteinstrukturenausmachen 8,9,10. Die Hauptursache für die Diskrepanz bei der Verfügbarkeit von Strukturinformationen liegt in den intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen selbst. Aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit, der Abhängigkeit von Wechselwirkungen mit einer Lipidumgebung zur Aufrechterhaltung der einheimischen Struktur und Funktion und der verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lipidmembran selbst stellen Membranproteine weiterhin ein wesentliches Problem bei der Implementierung strukturbiologischer Techniken zur Untersuchung dar. Von diesen intrinsischen Eigenschaften ist die wichtigste für die Beschaffung genauer struktureller Informationen die Anforderung, Wechselwirkungen mit ihrer natürlichen Lipidumgebung zu haben, damit sie ihre native Struktur und Funktion erhalten. Die Lipidumgebung ist ein so integraler Bestandteil der Struktur und Funktion von Membranproteinen, dass das Konzept von Memtein (eine Kombination der Wörter Membran und Protein) als grundlegende Einheit der Membran-Protein-Struktur und Funktion vorgeschlagen wurde11. Trotz der Bedeutung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen erfordern die derzeit verfügbaren strukturbasierten PPI-Bestimmungstechniken oft, dass die untersuchten Proteine löslich sind oder mit Reinigungsmitteln löslich sind. Die Exposition gegenüber harten Waschmitteln kann die Proteine denaturiert oder falsche Positiv- und Negative aufgrund von Delipidation verursachen, die Aggregation, Denaturierung von Protein, Dissoziation nicht-kovalenter Wechselwirkungen und Bildung künstlicher oligomerer Zustände induzieren können. Aufgrund der Notwendigkeit, eine natürliche Lipidumgebung für die genaue Bestimmung des nativen oligomeren Zustands von Membranproteinen zu erhalten, haben wir ein Native Cell Membrane Nanoparticles System (NCMNs)12 auf Basis der zuvor berichteten Styrol Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 Methode entwickelt.
SMALP verwendet Styrol-Maleinsäure-Copolymer als membranaktives Polymer, um Membranproteine zu extrahieren und zu löslich. Poly (Styrene-Co-Maleic Acid) (SMA) ist ein einzigartiges amphiphiles Polymer aufgrund seiner hydrophoben Styrol-Moiety und diametral entgegengesetzten hydrophilen Maleinsäure-Moiety. Es bildet Nanopartikel, indem es in einem pH-abhängigen Mechanismus14adsorbiert, destabilisiert und die Zellmembran stört. Diese funktionelle Aktivität von SMA ermöglicht es, als waschmittelfreies System für membranproteinextraktion und Löslichkeit verwendet werden. Das NCMN-System unterscheidet sich in mehreren Aspekten vom SMALP-System. Das einzigartigste Merkmal des NCMN-Systems ist, dass es eine membranaktive Polymerbibliothek mit einer Vielzahl von Polymeren hat, die einzigartige Eigenschaften haben, die sie für die Isolierung vieler verschiedener Membranproteine geeignet machen, die unterschiedliche Bedingungen für Stabilität und native Funktion erfordern. Das NCMN-System hat auch andere Protokolle im Vergleich zur SMALP-Methode, wenn es um die Herstellung der Nanopartikel geht. Ein beispiel dafür ist, dass NCMNs eine einstufige Nickelaffinitätssäulenreinigung für die hochauflösende Strukturbestimmung verwenden. die Wirkung dieser verschiedenen Protokolle kann beim Vergleich des NCMNs-Protokolls, das 3,2 und 3,0 -C-Cryo-EM-AcrB-Strukturen erzeugte, mit einer ähnlichen Studie mit der SMALP-Methode beobachtet werden, die zu einer Kryo-EM-AcrB-Struktur mit einer Auflösung von 8,8 °12,15führte. Diese einzigartigen Merkmale des NCMN-Systems sind die Verbesserungen an der zuvor etablierten SMALP-Methode und machen es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung von PPI.
Der Multidrug Efflux Transporter AcrB existiert als funktioneller Homotrimer in E. coli12. Eine mutagene Analyse ergab, dass eine einzelne P223G-Punktmutation, die sich auf einer Schleife befindet, die für die Stabilität des AcrB-Trimmers verantwortlich ist, den Trimmerzustand destabilisiert und bei der Herstellung mit dem Waschmittel DDM ein AcrB-Monomer ergibt, das mit nativer Blaugelelektrophorese16nachgewiesen werden konnte. Die FRET-Analyse des AcrB-P223G-Mutanten ergab jedoch, dass in der nativen Zellmembran-Lipid-Bilayer-Umgebung die Mehrheit der mutierten AcrB-P223G noch als Trimmer existierte und dass die Expressionswerte für den Wildtyp AcrB und AcrB-P223G ähnlich sind. Doch trotz der ERGEBNISSE der FRET-Analyse zeigte ein Aktivitätstest für den mutierten Transporter, dass die Aktivität im Vergleich zum Wildtyp16dramatisch zurückging. Obwohl die FRET-Technologie im Volksmund für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde, hat die Forschung gezeigt, dass sie häufig falsch positive Ergebnisse geben kann17,18,19,20.
Kürzlich wurden hochauflösende Kryo-EM-Strukturen des AcrB-Trimers bestimmt, die die Wechselwirkung von AcrB mit der zugehörigen nativen Zellmembran Lipid-Bilayer durch den Einsatz der NCMNs12zeigten. Grundsätzlich können die NCMNs problemlos für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der nativen Zellmembran verwendet werden. In einem Test dieses Systems wurden Experimente durchgeführt, um den oligomeren Zustand von AcrB-P223G mit nativen Zellmembran-Nanopartikeln und negativer Färbeelektronenmikroskopie direkt zu beobachten. Um mit den wilden AcrB-Nanopartikeln zu vergleichen, verwendeten wir das gleiche membranaktive Polymer (SMA2000 made in our laboratory, which is indexed as NCMNP1-1 in the NCMN library), das für die hochauflösende Kryo-EM-Strukturbestimmung von AcrB und alternativen Polymeren verwendet wird, die in der NCMNs-Bibliothek gefunden werden12. Basierend auf den zuvor berichteten Ergebnissen wurde erwartet, dass die Mehrheit der AcrB-P223G-Mutation in Form von trimernativen Zellmembran-Nanopartikeln21existieren würde. Es wurden jedoch keine AcrB-Trimmer in der Stichprobe gefunden, wie z. B. diejenigen, die mit dem wilden Typ AcrB beobachtet wurden. Dies deutet darauf hin, dass die Mehrheit der AcrB-P223G nicht Trimmer auf der nativen Zellmembran bildet, wie zuvor vorgeschlagen.
Hier berichten wir über eine detaillierte Analyse des mutierten E. coli AcrB-P223G im Vergleich mit dem Wildtyp E. coli AcrB mit den NCMNs. Diese Fallstudie von AcrB legt nahe, dass NCMNs ein gutes System für die Protein-Protein-Interaktionsanalyse ist.
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Protocol
1. Proteinexpression
- Impfung von 15 ml Terrific Broth (TB) Medien mit plasmidspezifischen Antibiotika mit BL21(DE3) pLysS-Zellen, die die AcrB-Exzids in 50 ml-Röhrchen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min exemitenken.
- Überprüfen Sie die optische Dichte der Nachtkultur bei 600 nm (OD600) und stellen Sie sicher, dass sie über 2,0 liegt.
- 5 ml Zellkultur in 1 L TB-Medien verdünnen, die plasmidspezifische Antibiotika enthalten, und bei 37 °C mit Schütteln bis OD600=0,8 inkubieren und dann mit IPTG induzieren, das eine Endkonzentration von 1 mM aufweist.
- Induktion bei 20 °C mit Schütteln für 20 h durchführen.
- Pellet die Zellen mit Zentrifugation für 15 min bei 4 °C und 4.000 x g.
2. Zelllyse und Membranisolierung
- Setzen Sie das Zellpellet in Puffer A(Tabelle 1, Verwenden Sie DDM-Puffer A oder NCMNs-Puffer A je nach dem zu folgenden Reinigungsschema) mit 80 ml für jeweils 20 g des Zellpellets aus.
- Homogenisieren Sie die resuspendierten Zellpellets mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 4 °C oder bei Raumtemperatur sofort danach auf Eis legen.
- Die Probe in ein Metallbecher glasen auf Eis geben und die Zellen durch Beladen in einen Hochdruckhomogenisator bei 4 °C und 1.500 bar lysieren.
- Wiederholen Sie den Vorgang des Ladens der Zellen in den Homogenisator und lassen Sie sie durch den Homogenisator für 3-4 Zyklen passieren oder bis das Lysat beginnt zu klären.
- Zentrifugieren Sie das Lysat bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C.
- Den Überstand sammeln und bei 4 °C bei 215.000 x g bei 215.000 x g in Ultrazentrifugenrohre und Zentrifuge laden.
- Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie die Membranpellets aus den Ultrazentrifugenrohren. Überschüssiges Membranpellet bei -80 °C lagern.
3. Herstellung von nativen Zellmembran-Nanopartikeln
- 1 g Membranpellet in 10 ml NCMNs Puffer A (Tabelle 1) aufheben
- Homogenisieren Sie die resuspendierte Zellmembranprobe mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 20 °C.
- Übertragen Sie die suspendierte Membranprobe auf ein 50 ml Polypropylenrohr und fügen Sie membranaktive Polymere Lagerlösung und zusätzliche NCMNs Puffer A hinzu, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2,5% (w/v) Membran-aktivem Polymer (NCMNP1-1 oder NCMNP5-2) zu bringen.
HINWEIS: Lagerlösungen von membranaktiven Polymeren sollten in doppelt destilliertem Wasser hergestellt werden und können in unterschiedlichen Konzentrationen gehalten werden, in der Regel jedoch 10 % (w/v). - Schütteln Sie die Probe für 2 h bei 20 °C.
- Die Probe in eine Ultrazentrifuge laden und bei 150.000 x g bei 1 h bei 20 °C drehen.
- Während die Probe ultrazentrifugiert wird, beginnen Sie, eine 5 ml Ni-NTA-Säule mit 25 ml NCMNs Puffer A auszubalancieren.
- Sammeln Sie den Überstand, nachdem die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, und laden Sie ihn mit einer Spritzenpumpe auf 5 ml Ni-NTA-Säule bei Raumtemperatur mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min.
- Waschen Sie schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) Linien mit genügend NCMNs Puffer B (Tabelle 1), um das System vollständig zu spülen und dann die Säule mit der FPLC-Maschine zu verbinden.
- Waschen Sie die Säule mit 30 ml NCMNs Puffer B mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.
- Waschen Sie die Säule mit 30 ml NCMNs Puffer C (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.
- Das Protein mit 20 ml NCMNs Puffer D (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und die Probe mit einem Fraktionskollektor und den jeweils auf 1,0 ml eingestellten Fraktionen zu sammeln.
- Bewahren Sie die Proteinproben bei 4 °C auf.
- Führen Sie einen SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Assay durch, um die Proben zu überprüfen, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entsprechen.
4. SDS-PAGE Gelelektrophorese
- Bereiten Sie die Gießkammer vor, indem Sie das Glas an das Gießgerät spannen.
- Bereiten Sie das 12% Trenngel nach dem in Tabelle 1aufgeführten Rezept vor.
HINWEIS: Sobald TEMED hinzugefügt wurde, wird das Gel schnell polymerisieren, so fügen Sie diese nur einmal bereit, das Gel zu gießen. - Gießen Sie das Gel, so dass 2 cm unter der Unterseite des Kamms für das Stapelgel.
- Entfernen Sie alle Blasen, indem Sie die Oberseite des Gels mit 100% Isopropanol schichten und warten, bis das Trenngel polymerisiert ist.
- Entfernen Sie das Isopropanol und waschen Sie alle Spuren des Isopropanols mit destilliertem Wasser aus.
- Bereiten Sie das Stapelgel gemäß dem in Tabelle 1aufgeführten Rezept vor.
HINWEIS: Sobald TEMED hinzugefügt wurde, wird das Gel schnell polymerisieren, so fügen Sie diese nur einmal bereit, das Gel zu gießen. - Gießen Sie das Stapelgel auf das Trenngel.
- Fügen Sie einen Kamm in die Kammer, um die Brunnen zu bilden und warten, bis das Stapelgel vollständig polymerisiert.
- Legen Sie 1 L 1 M DTT in ein Mikrozentrifugenrohr für jede Bruchprobe, die auf dem Gel ausgeführt werden muss.
- Fügen Sie jedem Rohr auch 7 l 4x Ladepuffer hinzu.
- Fügen Sie jedem Mikrozentrifugenrohr 20 L Proben aus den Fraktionen hinzu, die auf dem Gel ausgeführt werden müssen.
- Wirbel die Rohre, die die Proben enthalten.
- Drehen Sie die Probenröhrchen mit einer Tisch-Mikrozentrifuge für 3 s nach unten und stellen Sie sicher, dass die gesamte Probe auf den Boden der Rohre zurückgekehrt ist.
- Bereiten Sie die Gelelektrophoresezelle vor, indem Sie eine 12% Polyacrylamid-Gelkassette einstecken und die inneren und äußeren Kammern der Zelle mit Tris-Acetat-EDTA (TAE) Buffer füllen (Tabelle 1).
- Laden Sie die Molekulargewichtsmarkierung mit dem entsprechenden Volumen, das in den Anweisungen vorgeschrieben ist, in die erste Spur des Gels ein.
- Laden Sie 28 l der Probe aus jedem Rohr gemischt mit DTT und Ladepuffer.
- Legen Sie den Deckel der Elektrophoresezelle auf die Box und stecken Sie den Deckel in das Netzteil.
- Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie es auf 100 V ein und lassen Sie es 20 min laufen.
- Nach 20 min erhöhen Sie den Netzstrom auf 140 V und führen Sie ihn weitere 30-40 min laufen oder bis das Band des Ladepufferfarbstoffs den Boden der Gelkassette erreicht.
- Nach Abschluss der Elektrophorese Fleck und Entfleckung des Gels, um die Proteinbänder im Gel enthalten zu visualisieren.
5. Proteinreinigung mit DDM
HINWEIS: Der Zweck dieser Reinigung ist es, als Kontrolle für die Experimente unter Verwendung der membranaktiven Polymere zu dienen.
- 6-10 g Membranpellet ab Schritt 2.6 in DDM-Puffer A (Tabelle 1) mit 5 ml/g Membranpellet aufheben.
- Homogenisieren Sie die resuspendierte Probe mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 4 °C oder wenn bei Raumtemperatur sofort danach auf Eis gelegt werden.
- Die Probe in ein 50 ml Polypropylenrohr übertragen und DDM und zusätzlichen DDM-Puffer A hinzufügen, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2% DDM zu bringen.
- Schütteln Sie die Probe für 2 h bei 4 °C.
- Die Probe in Ultrazentrifugenrohre und Zentrifuge für 1 h bei 4 °C und 150.000 x gladen.
- Während die Probe ultrazentrifugiert wird, beginnen Sie mit der Vorbereitung der 5 ml Ni-NTA-Säule durch Waschen mit 25 ml DDM-Puffer A (Tabelle 1).
- Nach Abschluss der Ultrazentrifugation den Überstand sammeln und mit einer Spritzenpumpe bei 4 °C bei 4 °C auf die 5 ml Ni-NTA-Säule laden.
- Waschen Sie FPLC-Leitungen mit genügend DDM-Puffer B + 0,05% DDM (Tabelle 1), um das System vollständig zu spülen und dann die Säule an die FPLC-Maschine anzuhängen.
- Waschen Sie die Säule mit 30 ml DDM-Puffer B + 0,05% DDM mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.
- Waschen Sie die Säule mit 30 ml DDM-Puffer C + 0,05% DDM (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.
- Das Protein mit 20 ml DDM-Puffer D + 0,05% DDM (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min zu versenken und den Durchfluss mit einem Bruchkollektor und den jeweils auf 1,0 ml eingestellten Fraktionen zu sammeln.
- Wählen Sie die Fraktionen, die den Elutionsspitzenfürst für die Pooling- und Konzentrationsspitze enthalten, mit einem Zentrifugalkonzentrator und Zentrifugieren bei 4.000 x g und 4 °C bis zu 500 l.
- Laden Sie die Probe mit einer 500-L-Schleife in die FPLC-Maschine und dann bei 4 °C in die 25 ml-Aussperrsäule. Elute mit 30 ml DDM Puffer E + 0,05% DDM (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und sammeln als Brüche mit den Bruchgrößen auf 0,5 ml pro Bruch eingestellt.
- Nehmen Sie die Fraktionen und messen Sie die Proteinkonzentration mit 280 nm Absorption, um die UV-Vis-Kurve aus dem FPLC-Elutionsdiagramm zu bestätigen.
- Sammeln Sie 20 l aus jeder Stichprobenfraktion, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entspricht und mit dem Absorptionstest als genau bestätigt wurde.
- Den Rest dieser Probenfraktionen mit flüssigem Stickstoff oder Trockeneis in den gewünschten Aliquots einfrieren und Proteinproben bei -80 °C lagern.
- Führen Sie einen SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Assay durch, wie zuvor beschrieben, um die Proben zu überprüfen, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entsprechen.
6. Negative Fleckengittervorbereitung
- Platzieren Sie die Gitter, die für die Probenvorbereitung verwendet werden, auf einem in Filterpapier eingewickelten Glasschlitten mit nach oben gerichteter Carbonseite.
- Legen Sie den Glasschlitten mit den Elektronenmikroskopgittern in die Kammer eines Glüh-Entladers zwischen den beiden Elektroden und ersetzen Sie den Glasdeckel, um sicherzustellen, dass er zentriert und gut versiegelt ist.
- Führen Sie die Glühlöschmaschine aus und stellen Sie sicher, dass das vom Plasma erzeugte violette Licht sichtbar ist.
- Wenn die Maschine fertig läuft, warten Sie, bis die Kammer den atmosphärischen Druck erreicht hat, um den Glasdeckel zu entfernen, und kehren Sie dann den Schlitten mit den Gittern auf die Bank zurück, wo Proben auf sie geladen werden.
- Stellen Sie die Konzentration der gereinigten Proteinproben auf etwa 0,1 mg/ml ein, indem Sie die Probe entweder mit dem entsprechenden Puffer verdünnen oder sich mit einem Zentrifugalkonzentrator konzentrieren.
- 3,5 l Proteinprobe auf das 10 nm dicke Kohlenstoffgitter laden und 1 min warten.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Filterpapier von der Oberfläche des EM-Gitters.
- Waschen Sie die Gitteroberfläche 3x, indem Sie 3 L Wassertröpfchen mit dem Gitter aufnehmen und das Wasser mit Filterpapier zwischen den Tropfen entfernen.
- Waschen Sie die Gitteroberfläche 2x, indem Sie 3 L Tröpfchen frisches, gefiltertes 2% Uranacetat aufnehmen und die Waschlösungen auf dem Gitter mit Filterpapier zwischen den Entnahmen jedes Tröpfchens entfernen.
- Färben Sie das Gitter mit einem 3 L Tröpfchen frisch, gefiltert 2% Uranacetat für 1 min.
- Entfernen Sie die Uranacetatlösung auf der Oberfläche des EM-Gitters mit Filterpapier und trocknen Sie das Gitter mindestens 1 min.
- Speichern Sie das Raster feld in einem Rasterfeld für die spätere Verwendung.
7. EM-Bildgebung
- Laden Sie das vorbereitete Gitter an einer sicheren Werkbank in den Gitterhalter.
- Bereiten Sie das Mikroskop vor, indem Sie die Mikroskope in eine Polystyrol-Box legen und den Dewar 3/4 voller flüssigem Stickstoff füllen.
- Bestätigen Sie, dass die Gummiabdeckung des Mikroskopfensters es bedeckt, und laden Sie den Dewar dann auf das Mikroskop, indem Sie die Kupferdrähte in den Dewar legen, bis er auf die Plattform passt.
- Füllen Sie den Rest des Krieges mit flüssigem Stickstoff und legen Sie eine Kappe auf den Dewar, um ihn zu bedecken.
- Schalten Sie die Hochspannung ein, konditionieren Sie das Mikroskop und warten Sie, bis sich das Mikroskop erwärmt und einen sicheren Vakuumpegel für den Einsatz festlegt.
- Sobald das Mikroskop fertig ist, öffnen Sie das Säulenventil und bestätigen Sie, dass der Strahl vorhanden ist, indem Sie die Gummiabdeckung am Mikroskopfenster entfernen.
- Überprüfen Sie die Strahlstigmation, indem Sie sich in und aus ausbreiten, indem Sie die Intensität des Strahls anpassen. Wenn Astigmatismus vorhanden ist, wird der Strahl eine elliptische Form haben, wenn man sich vom Cross-over entfernt und der Strahl sollte auf beiden Seiten die gleiche ovale Form haben.
- Passen Sie das Mikroskop-Fernglas so an, dass es die richtige Höhe und den richtigen Abstand gemäß den Augen des Beobachters hat.
- Überprüfen Sie die Strahlpositionierung für Such-, Fokus-und Belichtungsmodi, indem Sie durch alle drei Modi radeln, bis der Strahl in jedem Modus zentriert ist.
- Schließen Sie das Säulenventil, und laden Sie den Gitterhalter in das Elektronenmikroskop.
- Stellen Sie das Mikroskop auf die euzentrische Höhe ein, indem Sie die Wackelfunktion der Mikroskope verwenden und die Bewegung der Bühne mithilfe der Z-Achse anpassen, bis sich keine Seitenbewegung der Probe in der Mitte befindet.
- Mit dem niedrig dosierten Suchmodus am Mikroskop suchen Sie das Raster nach einem wünschenswerten Bereich von vernünftigem Kontrast zu den vorhandenen Probenmolekülen, um sich auf die Probe zu konzentrieren.
- Konzentrieren Sie sich im Fokusmodus auf die Stichprobe, indem Sie eine hohe Schrittgröße verwenden, bis die Stichprobe angezeigt wird, und verringern Sie dann die Schritte, um die richtige Fokusebene zu finden.
- Null und leeren Sie den Strahl und stellen Sie dann sicher, dass das Gummipad das Mikroskopfenster bedeckt.
- Nehmen Sie mit dem Belichtungsmodus das Bild der gewünschten Rasterfläche für eine Belichtungszeit von 1 s bei 62.000-facher Vergrößerung auf und überprüfen Sie das erhaltene Bild.
- Wenn die Bildgebung erfolgt ist, schließen Sie die Säulenventile und entfernen Sie den Gitterhalter aus der Säule.
- Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, schalten alle von Interesse sind den Mikroskop ab, indem sie die Filamentleistung ausschalten und den Flüssigstickstoff-Dewar aus dem Mikroskop entfernen.
- Legen Sie etwas, um Feuchtigkeit auf dem Ständer zu absorbieren, wo der Dewar saß, um Kondensation von den Kupferspulen des Mikroskops zu fangen.
- Aktivieren Sie den Cryo-Zyklus-Modus und stellen Sie sicher, dass die Turbopumpe ausgeschaltet ist.
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Representative Results
Mit den hier vorgestellten Verfahren wurden Proben des Wildtyps E. coli AcrB und des E. coli-Mutanten AcrB-P223G gereinigt. Die Proben wurden dann auf kohlenstoffnegative Fleckenelektronenmikroskopiegitter adsorbiert und mit Uranylacetat mit der Side Blotting Methode22gebeizt. Negative Fleckenbilder wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie gesammelt. Das negative Fleckenbild für die mit DDM gereinigte AcrB-Wild-Musterprobe zeigt eine homogene Lösung monodisperser Partikel mit dem Protein, das eine klar definierte trimerische Quartenstruktur aufweist (Abbildung 1A). Diese trimerischen Strukturen entsprechen dem beobachteten Größenausschlusschromatogramm, wenn sie gereinigt werden (Zusatzabbildung 1). Im Vergleich dazu kann man beim Betrachten des negativen Fleckenbildes für die AcrB-P223G Mutante, die auch mit DDM gereinigt wird, eine heterogene Lösung polydisperser Nanopartikel mit einer Neigung zur Aggregation, aber keine beobachtbaren nativen Trimmer beobachten (Abbildung 1B). Diese Ergebnisse werden auch durch das beobachtete Elutionsprofil bei der Durchführung der Größenausschlusschromatographie(Ergänzende Abbildung 1) unterstützt. Um festzustellen, ob der Mangel an trimerischen Zustandsproteinen für den Mutanten auf die Behandlung mit Waschmittel zurückzuführen war oder ausschließlich durch die destabilisierende Mutation von P223G verursacht wurde, wurden die Proteine auch mit NCMNP1-1 gereinigt, einem der membranaktiven Polymere innerhalb der NCMNs-Bibliothek. Das negative Fleckenbild für die mit NCMNP1-1 gereinigte AcrB-Wild-Muster zeigt wiederum eine homogene Lösung monodisperser Partikel mit dem Protein, das eine klar definierte trimerische Quartenarstruktur aufweist (Abbildung 1C). Und genau wie bei der DDM-Reinigung, wenn die AcrB-P223G Mutante mit NCMNP1-1 gereinigt wird, zeigt das negative Fleckenbild eine heterogene Lösung von polydispersen Nanopartikeln mit einer Neigung zur Aggregation, aber keine beobachtbaren nativen Trimmer (Abbildung 1D). Um weiter zu bestätigen, dass die P223G-Mutation den AcrB-Trimer auf der Zellmembran stört, wurde ein anderes Polymer (NCMNP5-2) aus der proprietären NCMNs-Membran-Aktivpolymerbibliothek ausgewählt. NCMNP5-2 kann native Zellmembran-Nanopartikel in viel größeren Größen bilden, sodass mehrere AcrB-Trimer in einem einzelnen nativen Zellmembranpartikel abgebildet werden können. Als Ergebnis wurde beobachtet, dass mehrere wilde Typ AcrB Trimer in einzelnen Partikeln enthalten waren (Abbildung 1E); Jedoch wurden keine AcrB-P223G Trimerpartikel beobachtet, wie sie vom wilden Typ AcrB gebildet wurden, selbst wenn man sich die großen nativen Zellmembran-Doppelschicht-Patches ansah (Abbildung 1F). Dies deutet darauf hin, dass AcrB-P223G nicht als Trimmer auf der Zellmembran existiert, wie zuvorvorgeschlagen 21 und bietet eine logische Erklärung dafür, warum AcrB-P223G zeigt einen dramatischen Rückgang der Aktivität, wenn Assayed16. Um die Reinheit der Proben und das Vorhandensein des richtigen Proteins zu bestätigen, wurden Elektrophoresegele für alle gereinigten Proteinproben ausgeführt. Die resultierenden Flecken bestätigten das Vorhandensein von AcrB in allen Proben mit >95% Reinheit und die Position des Flecks entsprach dem vorhergesagten Molekulargewicht von AcrB (Abbildung 1G). Die Ergebnisse unserer Studie stimmen nicht mit dem zuvor beschriebenen FRET-Assay zur Bestimmung des oligomeren Zustands des Membranproteins AcrB-P223G16überein. Durch die Verwendung von membranaktiven Polymeren und Elektronenmikroskopie, wie im Protokoll beschrieben, war der native oligomere Zustand des Proteins direkt beobachtbar. Eine genauere Bestimmung, wie die Monomere des Proteins miteinander interagieren, erfordert die Bestimmung von hochauflösenden Kryo-EM-Strukturen.
Abbildung 1: Negative Flecken- und Elektrophorese-Gelbilder von gereinigten AcrB-Konstrukten. (A) Negatives Fleckenbild für Wildtyp AcrB mit DDM gereinigt. (B) Negatives Fleckenbild für das mit DDM gereinigte AcrB-P223G-Proteinkonstrukt. (C) Negatives Fleckenbild für Wildtyp AcrB gereinigt mit NCMNP1-1. (D) Negatives Fleckenbild für AcrB-P223G-Konstrukt mit NCMNP1-1 gereinigt. (E) Negatives Fleckenbild für Wildtyp AcrB mit NCMNP5-2 gereinigt (die rote Box hebt einige der im Bild beobachteten Trimmer-Nanopartikel hervor). (F) Negatives Fleckenbild für AcrB-P223G mit NCMNP5-2 gereinigt (die grüne Box hebt einen Teil der Lipid-Patches hervor, die von NCMNP5-2 erfasst wurden, die im Bild beobachtet wurden). (G) SDS-PAGE Gellauf mit den Endprodukten aus den Reinigungen von AcrB-P223G mit DDM (Lane 1), NCMNP1-1 (Lane2), (H) SDS-PAGE Gellauf mit den Endprodukten aus den Reinigungen von AcrB-P223G mit NCMNP5-2. (I) Zoomen Sie die hervorgehobenen Features aus Abbildung 1E. (J) Zoomen Sie die hervorgehobenen Features aus F ein. Alle negativen Fleckenbilder in Abbildung 1 haben den gleichen Maßstabsbalken von 50 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| DDM-Reinigungspuffer | Polymer-Reinigungspuffer | Gel-Elektrophorese-Puffer | |||
| Puffer A | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-Puffer A | 50 mM HEPES, pH 8,4 | TAE-Puffer | 40 mM Tris Basis |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| 5% Glycerin | 5% Glycerin | 20 mM Essigsäure | |||
| 20 mM Imidazol | 20 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Puffer B | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-Puffer B | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Enttaining Buffer | 40% Methanol |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 10% Essigsäure | |||
| 5% Glycerin | 5% Glycerin | ||||
| 40 mM Imidazol | 40 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Puffer C | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-Puffer C | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Stapelgel | 1,5 M Tris pH 8,8 (0,63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrylamid/Bis (0,43 ml) | |||
| 5% Glycerin | 5% Glycerin | 10% SDS (0,025 ml) | |||
| 75 mM Imidazol | 75 mM Imidazol | 10% APS (0,025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (4 l) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,39 ml) | ||||
| Puffer D | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-Puffer D | 25 mM HEPES, pH 7,8 | 12% Trenngel | 1,5 M Tris pH 8,8 (1,3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrylamid/Bis (2 ml) | |||
| 5% Glycerin | 5% Glycerin | 10% SDS (0,05 ml) | |||
| 300 mM Imidazol | 300 mM Imidazol | 10% APS (0,05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (5 l) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,6 ml) | ||||
| Puffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-Puffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0,1 mM TCEP | 0,1 mM TCEP | ||||
Tabelle 1: Liste der Reinigungspuffer für die Säulenchromatographie und Gelelektrophorese.
Ergänzende Abbildung 1: Größenausschlusschromatographie-Elutionsprofile. (A) Overlay-Diagramm der beiden Elutionsprofile, die bei der Reinigung mit DDM und Wildtyp AcrB (orange) und mit DDM und dem mutierten AcrB-P223G (blau) beobachtet wurden. (B) Spaltenkalibrierungsprofil für die Spalte Größenausschluss, die für DDM-Experimente verwendet wird.
1: Thyroglobulin (Herr 669 000), 2: Ferritin (Herr 440 000), 3: Aldolase (Herr 158 000), 4: Conalbumin (Herr 75 000), 5: Ovalbumin (Herr 44 000), 6: Kohlensäureanhydrase (Herr 29 000), 7: Ribonuclease A (Herr 13 700). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Integrität der Struktur und Funktion von Membranproteinen. Viele Ansätze wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Im Vergleich zu löslichen Proteinen sind Membranproteine und ihre PPI aufgrund der einzigartigen intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen schwieriger zu untersuchen. Diese Schwierigkeit ergibt sich vor allem aus der Anforderung von Membranproteinen, die in eine native Lipid-Bilayer-Umgebung eingebettet werden müssen, um strukturelle Stabilität und Funktionalität zu erhalten. Dies wird problematisch, weil sie zur Bestimmung hochauflösender Strukturen der Proteine aus der Zellmembran extrahiert werden müssen. FRET ist eine beliebte Technologie zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Zellmembran, jedoch ist die Auflösung niedrig und produziert häufig falsch positive17,18,19,20. Hier wird erstmals nachgewiesen, dass NCMNs zur Untersuchung von Membranprotein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt werden können, indem der Wildetyp AcrB Trimer und DasacrB-P223G-Monomer auf der nativen Zellmembran strukturell analysiert und die Ergebnisse mit der vorherigen Analyse mit FRET verglichen werden. Durch den Vergleich der Elektronenmikroskopie Einzelpartikelbilder des wilden Typs AcrB und AcrB-P223G wird vermutet, dass die Mehrheit der AcrB-P223G keine Trimmer auf der E.coli-Zellmembran bildet, wie das Wildtyp AcrB-Protein, wenn es mit membranaktiven Polymeren wie NCMNP1-1 und NCMNP5-2 gereinigt wird. Wir schlagen hier vor, dass die Ergebnisse der FRET-Analyse ein falsch positives Ergebnis sein können, das sich aus der Auflösungsbeschränkung des FRET-Ansatzes ergibt. Die künstliche Disulfidbindung, die den AcrB-P223G Trimer stabilisierte, könnte auch ein Artefakt sein, das in Lösung21aufgetreten ist. Die negativen Fleckenbilder deuten darauf hin, dass die P223G-Mutation die Bildung des AcrB-Trimmers verhinderte und dass die monomere Form von AcrB nicht in derselben Konformation verbleiben konnte, die in ihrer trimerischen Form beobachtet wurde. Die Schleife, die diese Mutation enthält, erwies sich zuvor als absolut kritisch für die Bildung des Trimers durch mutagene und strukturelle Analyse, die ihre strukturelle Bedeutung aufgrund der Wechselwirkungen zeigte, die jede Schleife durch Vergraben in das benachbarte AcrB-Monomer23bildet.
Durch den Einsatz des nativen Zellmembran-Nanopartikelsystems für die Protein-Protein-Interaktionsdetektion und -analyse kann man den oligomeren Zustand eines Proteins direkt erkennen, indem man das Membranprotein(s) in einer wirklich nativen Zellmembranumgebung hält, die zur Gewinnung hochauflösender Strukturinformationen auf atomarer Ebene durch die Analyse der Probe durch Einzelne Partikelkryo-EM verwendet werden kann. Das NCMN-System hilft, die häufigen Fehlalarme und falsch negativen Ergebnisse zu vermeiden, die bei der PPI-Erkennung durch die Behandlung von Proben mit Reinigungsmitteln24beobachtet werden. Diese falschen Ergebnisse entstehen in der Regel aufgrund der Aggregation, Denaturierung der Proteinprobe, Dissoziation nicht-kovalenter Wechselwirkungen und Bildung künstlicher oligomerer Zustände, die durch die Delipidationseffekte von Detergenzien verursacht werden. Darüber hinaus liefert die Verwendung von Strukturanalysen in Verbindung mit den NCMN zusätzliche strukturelle Informationen und ermöglicht die direkte Beobachtung molekularer Wechselwirkungen, die sowohl für das Verständnis von PPI entscheidend sind als auch in der Regel verloren gehen, wenn zuvor etablierte Methoden der PPI-Erkennung verwendet werden. Diese Methode wurde erfolgreich für Strukturstudien des wilden Typs AcrB verwendet und könnte eine breite Anwendbarkeit auf andere Formen der Strukturanalyse haben, wie Röntgenkristallographie und Festkörper-NMR, und viele verschiedene Proteine, die in anderen Forschungen verwendet werden, um die Wechselwirkungen zu bestimmen, die von neuartigen Proteinzielen angezeigt werden.
Um reproduzierbare Ergebnisse mit einer angemessenen Proteinausbeute hoher Reinheit zu erzielen, gibt es mehrere kritische Schritte im Reinigungsprozess mit membranaktiven Polymeren, die befolgt werden müssen. Der erste kritische Schritt ist der Prozess der Membranisolierung, daher ist es wichtig, das Zelllysat bei 15.000 x g zu zentrieren und diesem Schritt mit Ultrazentrifugation bei 215.000 x g zu folgen, um die Zellmembran wirklich vom Rest des Zelllysats zu isolieren. Der nächste kritische Schritt ist die Löslichkeit der Membranfraktion mit membranaktiven Polymeren bei einer Konzentration von 2,5 % bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Optimierungsexperimente der Reinigung wurden durchgeführt und die Verwendung dieser Parameter in diesem Schritt wurde gezeigt, um sicherzustellen, dass die optimale Menge an AcrB aus der Membran extrahiert wird und die richtige Bildung der nativen Zellmembran-Nanopartikel erfolgt. Der letzte kritische Schritt des Reinigungsprozesses ist das Laden der Probe auf die Ni-NTA-Säule bei Raumtemperatur. Dies ist notwendig, da membranaktive Polymere bei Raumtemperatur löslicher sind als bei 4 °C, wodurch die Belastung bei Raumtemperatur die Menge an Proteinbindung an die Affinitätssäule erhöht und einen hohen Druck durch unlösliche Polymeransammlungen vermeidet, die die Säule möglicherweise beschädigen könnten. Fast ebenso wichtig für die Beschaffung genauer Strukturinformationen sind die Schritte, die in dem oben erwähnten negativen Färbeverfahren enthalten sind. Zu den wichtigsten Aspekten dieses Verfahrens gehören die Verwendung von 10 nm dicken holey Kohlenstoffgittern, Wassermengen und Uranylacetat sowie die Zeitdauer für die Probenadsorption und Färbung. Die Verwendung dieser Schlüsselparameter während der Probenvorbereitung stellt qualitativ hochwertige Strukturdaten sicher, die für eine genaue Bewertung der oligomeren Zustände der abgebildeten Probe verwendet werden können. Änderungen am Reinigungsprotokoll können erforderlich sein, wenn verschiedene Proteine verwendet werden, um die Probleme zu beheben, die aufgrund der einzigartigen Eigenschaften verschiedener Polypeptide auftreten können. Die wichtigsten Faktoren, die bei Schwierigkeiten mit dem Erhalt einer ausreichenden Menge an Proteinproben zu modifizieren sind, sollten die Parameter sein, die während des Induktionsschritts verwendet werden, die Menge der Membranfraktion, die im Löslichkeitsschritt verwendet wird, und die Länge der Zeit und Temperatur für den Löslichkeitsprozess. Wenn es ein Problem mit der Reinheit gibt, kann es notwendig sein, alternative Affinitätsspalten, wie z. B. eine Biotin-Affinitätsspalte, zu verwenden, anstatt die Ni-NTA-Spalte für die Reinigung zu verwenden. Wenn die Aufrechterhaltung schwacher/transienter Protein-Protein-Wechselwirkungen erforderlich ist, ist der Austausch der Ni-NTA-Säule gegen eine TAP-Tag-Affinitätssäule für optimale Ergebnisse von Vorteil. Schließlich sollten bei der Untersuchung von Säugetierproteinen Säugetierexpressionssysteme verwendet werden, um echte einheimische Zellmembran-Lipidzusammensetzungen aufrechtzuerhalten, die für eine genaue Bestimmung des natürlichen oligomeren Zustands des Proteins erforderlich sind. Dies erfordert eine vollständige Überarbeitung der Proteinexpression und der Zelllyseschritte dieses Protokolls. In solchen Fällen sollten zuvor festgelegte Protokolle für die Proteinexpression und Zelllyse befolgt werden, die dem Expressionssystem entsprechen, das für das Zielprotein von Interesse erforderlich ist.
Der Einsatz der NCMNs mit Elektronenmikroskopie weist im Vergleich zu FRET große Vorteile für den Einsatz bei der Detektion von PPI auf. Wie die Ergebnisse dieser Studie zeigen, waren die zuvor durchgeführten FRET-Experimente nicht mit der Strukturanalyse der oligomeren Struktur des AcrB-Mutantenproteins21vereinbar. Dies wurde durch die mit negativer Fleckenelektronenmikroskopie aufgenommenen Bilder, die mit dem zuvor beschriebenen Aktivitätsverlust für die Mutante AcrB-P223G16übereinstimmen, deutlich gezeigt und direkt bestätigt. Wenn AcrB-P223G In vivo Trimmer gemacht hätte, hätte das NCMNP5-2-Polymer sie in den großen nativen Zellmembran-Patches gefangen, die es extrahiert. Es ist möglich, dass die FRET-Analyse des mutierten AcrB aufgrund einer der verschiedenen Einschränkungen, die den physikalischen Prozessen innewohnen, auf die sich die Technik stützt, und der Technologie, die zur Messung der fluoreszierenden Resonanzenergieübertragungen eingesetzt wird, zu einem falschen Positiv geführt hat. Eine wesentliche Einschränkung von FRET sind die Auflösungsgrenzen der konfokalen Mikroskopie, was zu ernsthaften Einschränkungen der intermolekularen Entfernungen führt, die mit FRET-Assays gelöst werden können19. Im Vergleich dazu unterliegt die Verwendung von NCMNs in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nicht der oben genannten Beschränkung von FRET, mit deutlich höheren Auflösungsgrenzwerten im Vergleich zu denen der konfokalen Mikroskopie. Basierend auf diesen Einschränkungen mit möglichen Auswirkungen auf die zuvor beschriebenen FRET-Assays gehen wir davon aus, dass die falsche Erkennung eines AcrB-P223G-Trimmers in vivo auf die geringe Auflösungsbeschränkung von FRET21zurückzuführen ist. Abgesehen von den Vorteilen gegenüber nur FRET, auf die dieses Papier direkt hingewiesen hat, hat die Verwendung von NCMNs in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie den Vorteil gegenüber allen aktuellen Protein-Protein-Interaktionstechniken, wie dem Y2H-System und TAP-MS, da es zur Beobachtung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in nativen Zellmembranumgebungen direkt in hoher Auflösung verwendet werden kann und das Potenzial hat, zur Bestimmung der Proteinstrukturen auf atomarer Ebene verwendet zu werden.
Membranaktive Polymere und Elektronenmikroskopie sind ebenfalls nicht unbegrenzt. Derzeit ist das Hauptproblem der NCMN-Reinigung ihre geringere Extraktionseffizienz im Vergleich zu Waschmittel-basierten Methoden (die Polymere in der NCMN-Bibliothek zeigen 70 % der Extraktionseffizienz von DDM). Außerdem gibt es Kompatibilitätsprobleme mit einigen Affinitätsspalten, z. B. Maltose-Bindungsspalten. Darüber hinaus ist die NCMN-Reinigung mit hochdynamischen Membranproteinen oder -komplexen (Daten unveröffentlicht) noch nicht sehr erfolgreich. Die Verwendung von membranaktiven Polymeren und Elektronenmikroskopie für oligomere Zustandsbestimmungsexperimente erfordert die Entfernung der Proteine aus der nativen Zellumgebung, während FRET in vivo durchgeführt wird. Die Nanopartikel, die durch membranaktive Polymere gebildet werden, ermöglichen jedoch eine möglichst native Umgebung bei der Extraktion der Proteine aus Zellen, um die potenziellen experimentell abgeleiteten Ungenauigkeiten zu reduzieren, von denen bekannt ist, dass sie durch Proteinextraktion und -reinigung verursacht werden. Während die Frage der Auflösung und Partikelgröße als Begrenzung der Transmissionselektronenmikroskopie in den letzten zehn Jahren deutlich abgenommen hat, werden die Mikroskope, die immer noch für die negative Fleckenanalyse verwendet werden, immer noch relativ auf größere Moleküle oder molekulare Komplexe (>200 kDa) beschränkt sein, da sie im Allgemeinen eine Informationsgrenze von etwa 0,1-0,3 nm25aufweisen. SMALP hat sich auch in Bezug auf Anwendungen als sehr flexibel erwiesen, weist aber noch größere Einschränkungen auf als NCMNs. Die von SMA gebildeten Nanoscheiben haben einen maximalen Durchmesser von ca. 15 nm und sind daher häufig unwirksam für die Extraktion von Proteinen und Proteinkomplexen, die über 400 kDa26sind. Zusätzlich zu dieser Einschränkung ist SMA auch nicht in der Lage, mit Proteinen zu arbeiten, die in Umgebungen mit niedrigem pH-Wert existieren oder divalente Ionen für strukturelle und funktionelle Zwecke nutzen. Da der SMALPs-Wirkmechanismus pH-abhängig ist, kann er nicht mit niedrigen pH-Bedingungen und chelaten divalenten Ionen verwendet werden. Während die SMILP- und DIBMA-Methoden Versprechen in Bezug auf die Überwindung dieser Einschränkungen gegeben haben, ist ihre Anwendbarkeit auf verschiedene Sets Proteine unsichtbargeblieben 27,28. NCMNs versucht, diese Einschränkungen zu überwinden, indem eine Struktur-Aktivitäts-Beziehungsanalyse (SAR) verwendet wird, um alternative Polymere zu erstellen, die größere Nanopartikel bilden können, die unter niedrigen pH-Bedingungen funktionieren und chelatische divalente Ionen vermeiden können. Ein beispielhaftes Beispiel für die Polymere, die für NCMNs entwickelt wurden, ist das NCMNP5-2-Polymer, das die Fähigkeit zeigt, größere Nanopartikel zu erzeugen, wie in Abbildung 1E,Fgezeigt.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Fortschritten in der Nanopartikeltechnologie besteht die zukünftige Ausrichtung von NCMNs in der Entwicklung noch mehr membranaktiver Polymere, die der NCMNs-Polymerbibliothek eine höhere Extraktionseffizienz und die Fähigkeit geben, mit Proteinen aller verschiedenen Transmembranbereichsgrößen zu arbeiten, die bei viel breiteren pH-Werten funktionieren oder sich auf jede Art von Ionen verlassen, um ihre Struktur und Funktion zu erhalten. Dies wird es allen Membranproteinforschern ermöglichen, diese Technologie in ihren Experimenten zu nutzen und Zugang zu genaueren und biologisch relevanten Ergebnissen zu haben. Indem die Vorteile von Polymer-Nanopartikeln in eine größere Vielfalt von Proteinen gebracht werden, besteht die Hoffnung, dass dies zur Lösung hochauflösender Strukturen einheimischer Membranproteinkomplexe auf atomarer Ebene führt und somit die intramolekularen atomaren Wechselwirkungen bestimmt, die in die Aufrechterhaltung dieser Komplexe gehen. Solche Fortschritte würden auch viele neue Möglichkeiten in Bezug auf die Entdeckung und Entwicklung von Membranproteinmedikamenten durch strukturbasierte Arzneimitteldesign-Bemühungen ermöglichen. Die Nutzung von strukturbasierten Arzneimitteldesign-Techniken für Membranproteine wäre ein massiver Vorteil für die medizinische Industrie, da dies die spezifische Spezifität und Wirksamkeit von Medikamentenbindungen erhöhen würde, um unerwünschte Nebenwirkungen und die Menge an Verbindungen zu reduzieren, die notwendig sind, um gewünschte therapeutische Effekte zu entlocken, wodurch Medikamente, die auf Membranproteine abzielen, deutlich sicherer und effektiver werden. Das native Zellmembran-Nanopartikelsystem befindet sich noch in der Entwicklung, hat sich aber bereits als unglaublich leistungsfähig erwiesen, indem es zum ersten Mal die Untersuchung von Membranproteinen in ihren wirklich nativen Zuständen ermöglicht und die nativen Protein-Protein-Wechselwirkungen aufklärt, die auf der Zellmembran auftreten.
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Disclosures
Y.G ist als Erfinder des membranaktiven Polymers NCMNP5-2 und des NCMN Systems gelistet.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom VCU Startup Fund (zu Y.G.) und dem National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01GM132329 (zu Y.G.) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Wir danken Montserrat Samso und Kevin McRoberts für ihre großzügige Unterstützung bei der Videoaufnahme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
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