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Biochemistry

झिल्ली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली

doi: 10.3791/61298 Published: July 16, 2020

Summary

यहां प्रस्तुत झिल्ली प्रोटीन की अल्पाधिकारी स्थिति के निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल है जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर एक देशी कोशिका झिल्ली नैनोपार्टिकल सिस्टम का उपयोग करता है।

Abstract

कोशिका झिल्ली प्रणालियों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं- सेल-टू-सेल इंटरैक्शन से लेकर संकेत लेनदेन तक; जैविक प्रतिक्रिया के लिए पर्यावरण संकेतों को संवेदन से; मेटाबॉलिक रेगुलेशन से लेकर विकासात्मक नियंत्रण तक। झिल्ली प्रोटीन परिसरों के आणविक तंत्र को समझने और इन प्रोटीनों को मिलाना करने के लिए अत्यधिक विशिष्ट अणुओं के डिजाइन के लिए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की सटीक संरचनात्मक जानकारी महत्वपूर्ण है। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने और विश्लेषण के लिए वीवो और इन विट्रो दृष्टिकोणों में कई विकसित किए गए हैं। उनमें से संरचनात्मक जीव विज्ञान दृष्टिकोण अद्वितीय है कि यह परमाणु स्तर पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की प्रत्यक्ष संरचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकता है । हालांकि, वर्तमान झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक जीव विज्ञान अभी भी काफी हद तक डिटर्जेंट आधारित तरीकों तक ही सीमित है । डिटर्जेंट आधारित तरीकों की प्रमुख खामी यह है कि वे अक्सर डिटर्जेंट अणुओं द्वारा अपने मूल लिपिड बाइलेयर पर्यावरण को हटा दिए जाने के बाद झिल्ली प्रोटीन परिसरों को अलग या विकृत कर देते हैं। हम झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए एक देशी कोशिका झिल्ली नैनोपार्टिकल प्रणाली विकसित कर रहे हैं। यहां, हम एसीआरबी की अल्पाधिकारी स्थिति के एक मामले के अध्ययन के साथ कोशिका झिल्ली पर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के विश्लेषण में इस प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।

Introduction

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प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) पूरे जीव विज्ञान में निर्णायक भूमिका निभाते हैं, संरचना के रखरखाव और प्रोटीन के कार्य से लेकर पूरे सिस्टम के नियमन तक। पीपीआई कई अलग-अलग रूपों में आते हैं और उन्हें किस प्रकार की बातचीत के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है। ऐसा ही एक वर्गीकरण होमोओलिमोमेरिक या हेट्रोलिगोमेमीरिक है, जो इस आधार पर है कि बातचीत समान उपइकाकारों या उपइकायों के रूप में कार्य करने वाले विभिन्न प्रोटीन के बीच है या नहीं। एक और वर्गीकरण बातचीत की ताकत पर आधारित है अगर बातचीत स्थिर परिसरों या क्षणिक जटिल राज्यों के गठन की ओर जाता है । प्रोटीन के बीच पीपीआई के बारे में संरचनात्मक जानकारी उस तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण है जिसके द्वारा प्रोटीन अपने कार्य को पूरा करते हैं । यह अनुमान लगाया गया है कि 80% से अधिक प्रोटीन अपनी कार्यात्मक भूमिकाओं को पूरा करने के लिए जटिल गठन पर भरोसा करते हैं1. उचित सहज कार्य करने के लिए पीपीआई पर निर्भर पाए जाने वाले प्रोटीन के प्रतिशत को देखते हुए जीव विज्ञान में उनका महत्व आसानी से स्पष्ट है, फिर भी इन बातचीत में संलग्न प्रोटीन की ठीक से जांच करने में सक्षम होने के कारण प्रायोगिक रूप से निरीक्षण करने के लिए उपलब्ध तकनीकों में सीमाओं के कारण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है जब प्रोटीन पीपीआई बना रहे हैं ।

शोर, झूठी सकारात्मक, और झूठी नकारात्मक है कि वर्तमान में उपलब्ध पीपीआई निर्धारण तकनीकों में से कई से प्राप्त कर रहे है की उच्च राशि के कारण कई प्रयोगात्मक निर्धारित PPIs के लिए परिणामों के बीच असहमति का एक उच्च डिग्री है । यह खमीर दो-हाइब्रिड (वाई2एच) प्रणाली, टैंडेम एफ़िनिटी शुद्धिकरण-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (टैप-एमएस) और फ्लोरेसेंस प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (एफईआरटी) के लिए विशेष रूप से ऐसा है, जो पीपीआईनिर्धारण2, 3,4,5,6,7के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तीन तरीकों का प्रतिनिधित्व करता है। इसकी तुलना में, प्रोटीन संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीकों, जैसे परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के बारे में उच्च-संकल्प संरचनात्मक जानकारी हासिल करने के लिए परमाणु स्तर तक किया जा सकता है और ब्याज के लक्षित प्रोटीन के लिए होने वाली बातचीत की प्रत्यक्ष दृश्य पुष्टि के लिए अनुमति देता है । वर्तमान में उपलब्ध गैर संरचना आधारित पीपीआई अनुसंधान तकनीकों का निर्धारण (जैसे, Y2H, TAP-MS, और FRET) के सभी इस क्षमता की कमी है और इसके अतिरिक्त प्रोटीन5के बीच कमजोर और क्षणिक बातचीत की पहचान करने में कठिनाई होने से पीड़ित हैं । लिपिड वातावरण के अतिरिक्त चर द्वारा लाई गई अतिरिक्त जटिलता के कारण झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करते समय इन कमियों को और बढ़ाया जाता है जो उचित क्वाटरेरी संरचना और हेट्रोमेरिक जटिल असेंबली के गठन को प्रभावित करता है।

झिल्ली प्रोटीन प्रोटेम का एक बड़ा हिस्सा बनाते हैं और सभी जीवित जीवों के भीतर उचित कोशिका कार्य में कई महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाने के लिए जाने जाते हैं। इस तथ्य के बावजूद कि झिल्ली प्रोटीन मानव जीनोम का 27% बनाने का अनुमान है और सभी वर्तमान दवा लक्ष्यों का ~ 60% है, झिल्ली प्रोटीन के लिए हल किए गए मॉडलों की संख्या में एक बड़ी विसंगति है जो सभी प्रकाशित प्रोटीन संरचनाओं का केवल ~ 2.2% है8,9,10। संरचनात्मक जानकारी की उपलब्धता में विसंगति का प्राथमिक कारण झिल्ली प्रोटीन के आंतरिक गुणों में निहित है। उनकी खराब घुलनशीलता के कारण, देशी संरचना और कार्य को बनाए रखने के लिए लिपिड वातावरण के साथ बातचीत पर निर्भरता, और लिपिड झिल्ली के विभिन्न शारीरिक गुण, झिल्ली प्रोटीन उनका अध्ययन करने के लिए संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीकों को लागू करते समय एक पर्याप्त समस्या का प्रतिनिधित्व करते रहते हैं। इन आंतरिक गुणों में से, सटीक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण उनके लिए अपने प्राकृतिक लिपिड वातावरण के साथ बातचीत करने की आवश्यकता है ताकि वे अपनी मूल संरचना और कार्य को बनाए रख सकें। लिपिड वातावरण झिल्ली प्रोटीन की संरचना और कार्य का इतना अभिन्न हिस्सा है कि झिल्ली की अवधारणा (झिल्ली और प्रोटीन शब्दों का संयोजन) झिल्ली-प्रोटीन संरचना और कार्य11की मौलिक इकाई के रूप में प्रस्तावित किया गया है। लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन के महत्व के बावजूद वर्तमान में उपलब्ध संरचना आधारित पीपीआई निर्धारण तकनीकों के लिए अक्सर यह आवश्यक होता है कि अध्ययन किए जा रहे प्रोटीन घुलनशील हों या डिटर्जेंट के साथ घुलनशील हों । कठोर डिटर्जेंट के संपर्क में प्रोटीन को विकृत कर सकते हैं या परिसीमन के कारण झूठे सकारात्मक और नकारात्मक पैदा हो सकते हैं, जो एकत्रीकरण, प्रोटीन के विकृतीकरण, गैर-सहसंयोजक बातचीत के विघटन और कृत्रिम अल्पाहारीय राज्यों के गठन को प्रेरित कर सकते हैं। झिल्ली प्रोटीन की देशी ओलिगोमेरिक स्थिति के सटीक निर्धारण के लिए एक प्राकृतिक लिपिड वातावरण को बनाए रखने की आवश्यकता के कारण हमने पहले रिपोर्ट किए गए स्टायरीन पुरुषीय अम्लीय लिपिड कणों (SMALP)13 विधि के आधार पर एक देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली (एनसीएमएन)12 विकसित किया है।

SMALP झिल्ली प्रोटीन निकालने और घुलनशील करने के लिए एक झिल्ली सक्रिय बहुलक के रूप में स्टायरीन मलिक एसिड कोपॉलिमर का उपयोग करता है। पॉली (स्टायरीन-सह-मलिक एसिड) (एसएमए) एक अद्वितीय एम्फीफिलिक बहुलक है जो इसके हाइड्रोफोबिक स्टायरीन मॉलिसिटी और हाइड्रोफिलिक मलिक एसिड मोइटी का बिल्कुल विरोध करने के कारण है। यह पीएच-निर्भर तंत्र14में कोशिका झिल्ली को सोखने, अस्थिर करने और बाधित करके नैनोकणों का निर्माण करता है। SMA की यह कार्यात्मक गतिविधि है जो इसे झिल्ली प्रोटीन निष्कर्षण और घुलनशीलता के लिए एक डिटर्जेंट मुक्त प्रणाली के रूप में उपयोग करने की अनुमति देता है । एनसीएमएन प्रणाली कई पहलुओं में SMALP प्रणाली से अलग है। एनसीएमएन प्रणाली की सबसे अनूठी विशेषता यह है कि इसमें एक झिल्ली सक्रिय बहुलक पुस्तकालय है जिसमें कई पॉलीमर हैं जिनमें अद्वितीय गुण होते हैं जो उन्हें कई अलग-अलग झिल्ली प्रोटीन के अलगाव के लिए उपयुक्त बनाते हैं जिन्हें स्थिरता और देशी कामकाज के लिए विभिन्न परिस्थितियों की आवश्यकता होती है। नैनोकणों को तैयार करने की बात आती है तो एसएमपी विधि की तुलना में एनसीएमएन प्रणाली में भी अलग-अलग प्रोटोकॉल होते हैं। ऐसा ही एक उदाहरण यह है कि एनसीएमएन उच्च-संकल्प संरचना निर्धारण के लिए एकल-चरण निकल आत्मीयता कॉलम शुद्धि का उपयोग करते हैं; एनसीएमएनएस प्रोटोकॉल की तुलना करते समय इन विभिन्न प्रोटोकॉलों का प्रभाव देखा जा सकता है, जिसने 3.2 और 3.0 Å क्रायो-ईएम एसीआरबी संरचनाएं उत्पन्न कीं, इसी तरह के अध्ययन के साथ SMALP विधि का उपयोग करके, जिसके परिणामस्वरूप 8.8 Å संकल्प12,15पर क्रायो-ईएम एसीआरबी संरचना हुई। एनसीएमएन प्रणाली की ये अनूठी विशेषताएं पहले से स्थापित SMALP विधि पर किए गए सुधार हैं और इसे पीपीआई के अध्ययन के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाते हैं।

मल्टीड्रग एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर एसीआरबी ई. कोलाई12में कार्यात्मक समोसे के रूप में मौजूद है। एक उत्परिवर्तनीय विश्लेषण ने सुझाव दिया कि एक एकल P223G पॉइंट उत्परिवर्तन, जो एक लूप पर स्थित है जो एसीआरबी ट्राइमर की स्थिरता के लिए जिम्मेदार है, ट्राइमर राज्य को अस्थिर करता है और डिटर्जेंट डीडीएम के साथ तैयार होने पर एक एसीआरबी मोनोमर पैदा करता है, जिसे देशी नीले जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस16के साथ पता लगाया जा सकता है। हालांकि, AcrB-P223G उत्परिवर्ती के FRET विश्लेषण का सुझाव दिया है कि जब देशी सेल झिल्ली लिपिड bilayer वातावरण में, उत्परिवर्ती AcrB-P223G के बहुमत अभी भी एक trimer के रूप में मौजूद है और दोनों जंगली प्रकार AcrB और AcrB-P223G के लिए अभिव्यक्ति का स्तर समान हैं । फिर भी FRET विश्लेषण परिणामों के बावजूद, उत्परिवर्ती ट्रांसपोर्टर के लिए एक गतिविधि परख से पता चला है कि गतिविधि नाटकीय रूप से कम हो गई जब जंगली प्रकार16की तुलना में । यद्यपि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए FRET तकनीक का उपयोग लोकप्रिय रूप से किया गया है, अनुसंधान से पता चला है कि यह अक्सर झूठी सकारात्मक17, 18,19,20दे सकता है।

हाल ही में, एसीआरबी ट्रिमर की उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम संरचनाएं निर्धारित की गई थीं, जिन्होंने एनसीएमएनएस12के उपयोग के माध्यम से अपने संबद्ध देशी कोशिका झिल्ली लिपिड बाइलेयर के साथ एसीआरबी की बातचीत दिखाई। सैद्धांतिक रूप से, एनसीएमएन का उपयोग देशी कोशिका झिल्ली पर पाए जाने वाले प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए आसानी से किया जा सकता है। इस प्रणाली के परीक्षण में, देशी कोशिका झिल्ली नैनोकणों और नकारात्मक धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ सीधे AcrB-P223G की अल्पाधिकारी स्थिति का निरीक्षण करने के लिए प्रयोग किए गए थे । जंगली प्रकार AcrB नैनोकणों के साथ तुलना करने के लिए, हम एक ही झिल्ली सक्रिय बहुलक (SMA2000 हमारी प्रयोगशाला में बनाया है, जो NCMNP1-1 NCMN पुस्तकालय में के रूप में अनुक्रमित है) AcrB और वैकल्पिक बहुलक के उच्च संकल्प क्रायो-ईएम संरचना निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया NCMNs पुस्तकालय12में पाया इस्तेमाल किया । पहले रिपोर्ट किए गए परिणामों के आधार पर, यह उम्मीद की गई थी कि AcrB-P223G उत्परिवर्ती का बहुमत ट्राइमेरिक देशी कोशिका झिल्ली नैनोकणों21के रूप में मौजूद होगा। हालांकि, नमूने में कोई एसीआरबी ट्रिमर्स मौजूद नहीं पाया गया, जैसे कि जंगली प्रकार के AcrB के साथ मनाया गया था। यह पता चलता है AcrB-P223G के बहुमत देशी कोशिका झिल्ली पर ट्रिमर फार्म के रूप में पहले से सुझाव नहीं है ।

यहां हम एनसीएमएन का उपयोग करके जंगली प्रकार ई. कोलाई एसीआरबी की तुलना में उत्परिवर्ती ई. कोलाई AcrB-P223G के विस्तृत विश्लेषण की रिपोर्ट करते हैं। एसीआरबी के इस केस स्टडी से पता चलता है कि एनसीएमएन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन एनालिसिस के लिए एक अच्छी प्रणाली है ।

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Protocol

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1. प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. BL21 (DE3) pLysS कोशिकाओं के साथ प्लाज्मिड के लिए विशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं के साथ भयानक शोरबा (टीबी) मीडिया के 15 एमएल टीका 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 50 एमएल ट्यूब में प्लाज्मिड व्यक्त करते हैं।
  2. 600 एनएम(ओडी600) पर रातोंरात संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व की जांच करें और यह सुनिश्चित करें कि यह 2.0 से अधिक है।
  3. टीबी मीडिया के 1 एल में सेल संस्कृति के 5 एमएल को पतला करें जिसमें प्लाज्मिड के लिए विशिष्ट एंटीबायोटिक्स होते हैं और ओडी600= 0.8 तक मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं और फिर आईपीटीजी के साथ प्रेरित होते हैं जिसमें 1 mM की अंतिम एकाग्रता होती है।
  4. 20 घंटे के लिए मिलाते हुए 20 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरण करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस और 4,000 x ग्रामपर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र का उपयोग कर कोशिकाओं को नीचे गोली मार।

2. सेल लाइसिस और झिल्ली अलगाव

  1. बफर ए(टेबल 1) में सेल पेलेट को फिर से रीसुपेंड करें, शुद्धिकरण योजना के आधार पर डीडीएम बफर ए या एनसीएमएनएस बफर ए का उपयोग करें जिसका पालन करना है) सेल पेलेट के हर 20 ग्राम के लिए 80 एमएल का उपयोग करके।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर ग्लास डूंस होमोजेनाइजर का उपयोग करके या कमरे के तापमान पर तुरंत बर्फ पर डालना सुनिश्चित करें।
  3. नमूना को बर्फ पर धातु की बीकर में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस और 1,500 बार में उच्च दबाव वाले समरूप में लोड करके lyse करें।
    1. कोशिकाओं को समरूप में लोड करने की प्रक्रिया दोहराएं और उन्हें 3-4 चक्रों के लिए समरूपता से गुजरने की अनुमति दें या जब तक कि lysate स्पष्ट करना शुरू न हो जाए।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 एक्स ग्राम पर lysate lysuge।
  5. सुपरनेट को इकट्ठा करें और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों और सेंट्रलाइज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 215,000 एक्स ग्राम पर लोड करें।
  6. सुपरनेट को त्यागें और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों से झिल्ली छर्रों को इकट्ठा करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी अतिरिक्त झिल्ली गोली स्टोर करें।

3. देशी कोशिका झिल्ली नैनोकणों की तैयारी

  1. 10 एमएल एनसीएमएनएस बफर ए(टेबल1) में झिल्ली की 1 ग्राम झिल्ली गोली को फिर से 1 ग्राम करें।
  2. 20 डिग्री सेल्सियस पर ग्लास डूंस होमोजेनाइजर के साथ पुनर्नक्षित कोशिका झिल्ली नमूने को समरूप करें।
  3. निलंबित झिल्ली के नमूने को 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें और नमूने को 2.5% (w/v) झिल्ली सक्रिय बहुलक (एनसीएमएनपी 1-1 या एनसीएमएनपी 5-2) की अंतिम एकाग्रता में लाने के लिए झिल्ली सक्रिय पॉलीमर स्टॉक समाधान और अतिरिक्त एनसीएमएनएस बफर ए जोड़ें।
    नोट: झिल्ली सक्रिय बहुलक के स्टॉक समाधान डबल आसुत पानी में किया जाना चाहिए और अलग सांद्रता पर रखा जा सकता है, लेकिन आम तौर पर 10% (w/v) ।
  4. 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए नमूना हिलाएं।
  5. नमूना को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में लोड करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 150,000 एक्स ग्राम पर स्पिन करें।
  6. जबकि नमूना अल्ट्रा-अपकेंद्रित्र किया जा रहा है, एनसीएमएनएस बफर ए के 25 एमएल के साथ 5 एमएल नी-एनटीए कॉलम को बराबर करना शुरू कर दिया गया है ।
  7. अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन पूरा होने के बाद सुपरनेट को इकट्ठा करें और इसे सिरिंज पंप का उपयोग करके 0.5 एमएल/मिन की प्रवाह दर के साथ कमरे के तापमान पर नी-एनटीए कॉलम के 5 एमएल पर लोड करें।
  8. सिस्टम को पूरी तरह से फ्लश करने और फिर कॉलम को एफपीएलसी मशीन से जोड़ने के लिए पर्याप्त एनसीएमएनएस बफर बी(टेबल 1)के साथ फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एफपीएलसी) लाइनों को धोएं।
  9. 1 एमएल/मिन की फ्लो रेट के साथ एनसीएमएनएस बफर बी के 30 एमएल के साथ कॉलम धोएं और फ्लो को इकट्ठा करें ।
  10. 1 एमएल/मिनट की फ्लो रेट के साथ एनसीएमएनएस बफर सी(टेबल 1)के 30 एमएल के साथ कॉलम को धोएं और फ्लो को इकट्ठा करें ।
  11. 0.5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर NCMNs बफर डी(टेबल 1)के 20 एमएल के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें और एक अंश कलेक्टर और अंशों का उपयोग करके नमूना एकत्र करें जो प्रत्येक को 1.0 एमएल तक सेट किया जा रहा है।
  12. प्रोटीन के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  13. एफपीएलसी एल्यूशन ग्राफ पर देखी गई चोटियों के अनुरूप नमूनों की जांच करने के लिए एसडीएस-पेज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस परख चलाएं।

4. एसडीएस-पेज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

  1. कास्टिंग उपकरण के लिए कांच क्लैंपिंग द्वारा कास्टिंग चैंबर तैयार करें।
  2. तालिका 1 में सूचीबद्ध नुस्खा के अनुसार 12%सेपरेशन जेल तैयार करें।
    नोट: एक बार TEMED जोड़ा जाता है तो जेल जल्दी से बहुलक होगा तो केवल यह एक बार जेल डालने के लिए तैयार जोड़ें ।
  3. जेल डालो, स्टैकिंग जेल के लिए कंघी के नीचे 2 सेमी नीचे छोड़ दें।
  4. 100% आइसोप्रोपैनॉल के साथ जेल के शीर्ष को लेयर करके किसी भी बुलबुले को हटा दें और सेपरेशन जेल को पॉलीमराइज करने की प्रतीक्षा करें।
  5. आइसोप्रोपनॉल निकालें और आसुत पानी के साथ आइसोप्रोपेनॉल के किसी भी निशान को धो लें।
  6. टेबल 1में सूचीबद्ध नुस्खा के अनुसार स्टैकिंग जेल तैयार करें।
    नोट: एक बार TEMED जोड़ा जाता है तो जेल जल्दी से बहुलक होगा तो केवल यह एक बार जेल डालने के लिए तैयार जोड़ें ।
  7. सेपरेशन जेल के शीर्ष पर स्टैकिंग जेल डालें।
  8. कुओं के रूप में कक्ष में एक कंघी जोड़ें और स्टैकिंग जेल को पूरी तरह से बहुलक बनाने की प्रतीक्षा करें।
  9. जेल पर चलाने की आवश्यकता वाले प्रत्येक अंश नमूने के लिए 1 एम डीटीटी के 1 माइक्रोल को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें।
  10. प्रत्येक ट्यूब में 4x लोडिंग बफर के 7 माइक्रोल भी जोड़ें।
  11. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर जेल पर चलाने की आवश्यकता वाले अंशों से नमूना के 20 माइक्रोल जोड़ें।
  12. भंवर नमूनों युक्त ट्यूबों।
  13. 3 एस के लिए टेबलटॉप माइक्रोसेंट्रफ्यूज का उपयोग करके नमूना ट्यूबों को नीचे स्पिन करें और सुनिश्चित करें कि सभी नमूना ट्यूबों के नीचे लौट आए हैं।
  14. 12% पॉलीएक्रेलैमाइड जेल कैसेट को जगह में सुरक्षित करके और ट्राइस-एसीटेट-ईडीटीए (टीएई) बफर(टेबल 1)के साथ सेल के भीतरी और बाहरी कक्षों को भरकर जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस सेल तैयार करें।
  15. आणविक वजन मार्कर को इसके निर्देशों के लिए आवश्यक उचित मात्रा के साथ जेल की पहली लेन में लोड करें।
  16. डीटीटी और लोडिंग बफर के साथ मिश्रित प्रत्येक ट्यूब से नमूने के 28 माइक्रोन लोड करें।
  17. बॉक्स के ऊपर इलेक्ट्रोफोरेसिस सेल का ढक्कन रखें और ढक्कन को बिजली आपूर्ति में प्लग करें।
  18. बिजली की आपूर्ति चालू करें और इसे 100 वी पर सेट करें और इसे 20 मिनट तक चलाने की अनुमति दें।
  19. 20 मिनट के बाद, बिजली की आपूर्ति को 140 वी तक बढ़ाएं और इसे एक और 30-40 मिनट के लिए चलाना जारी रखें या जब तक कि बफर डाई लोड करने का बैंड जेल कैसेट के नीचे तक न पहुंच जाए।
  20. इलेक्ट्रोफोरेसिस दाग को पूरा करने और जेल के भीतर निहित प्रोटीन बैंड की कल्पना करने के लिए जेल को डी-दाग करने के बाद।

5. डीडीएम का उपयोग कर प्रोटीन शुद्धिकरण

नोट: इस शुद्धि प्रक्रिया को पूरा करने का उद्देश्य झिल्ली सक्रिय बहुलक का उपयोग करने वाले प्रयोगों के लिए एक नियंत्रण के रूप में काम करना है।

  1. 5 एमएल/जी झिल्ली गोली का उपयोग करके डीडीएम बफर ए(टेबल 1)में कदम 2.6 से, झिल्ली गोली के 6-10 ग्राम को फिर से खर्च करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर ग्लास डूंस होमोजेनाइजर के साथ पुनर्संपित नमूने को समरूप करें या यदि कमरे के तापमान पर तुरंत बर्फ पर डालना सुनिश्चित करें।
  3. पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब के 50 एमएल में नमूना स्थानांतरित करें और नमूने को 2% डीडीएम की अंतिम एकाग्रता में लाने के लिए डीडीएम और अतिरिक्त डीडीएम बफर ए जोड़ें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए नमूना हिलाएं।
  5. नमूना को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों में लोड करें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 150,000 x ग्रामपर सेंट्रलाइज करें।
  6. जबकि नमूना अल्ट्रा-अपकेंद्रित्र किया जा रहा है डीडीएम बफर ए(टेबल 1)के 25 एमएल के साथ धोने के द्वारा एनआई-एनटीए कॉलम के 5 एमएल तैयार करने के लिए शुरू करते हैं ।
  7. अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन पूरा होने के बाद, सुपरनेट को इकट्ठा करें और इसे सिरिंज पंप का उपयोग करके 0.5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 एमएल नी-एनटीए कॉलम पर लोड करें।
  8. सिस्टम को पूरी तरह से फ्लश करने और फिर एफपीएलसी मशीन से कॉलम संलग्न करने के लिए पर्याप्त डीडीएम बफर बी + 0.05% डीडीएम(टेबल 1)के साथ एफपीएलसी लाइनों को धोएं।
  9. 1 मिली/मिनट की प्रवाह दर के साथ डीडीएम बफर बी + 0.05% डीडीएम के 30 एमएल के साथ कॉलम धोएं और प्रवाह को इकट्ठा करें।
  10. 1 मिली/मिनट की फ्लो रेट के साथ डीडीएम बफर सी + 0.05% डीडीएम(टेबल 1)के 30 एमएल के साथ कॉलम धोएं और प्रवाह को इकट्ठा करें।
  11. 0.5 मिली/मिनट की प्रवाह दर पर डीडीएम बफर डी + 0.05% डीडीएम(टेबल 1)के 20 मिलीएल के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें और एक अंश कलेक्टर और अंशों का उपयोग करके प्रवाह एकत्र करें जो प्रत्येक को 1.0 मिलील तक सेट किया जा रहा है।
  12. 500 माइक्रोल तक पहुंचने तक 4,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अपकेंद्रित्र सांद्रता और अपकेंद्रित्र का उपयोग करके पूलिंग और ध्यान केंद्रित करने के लिए एल्यूशन पीक वाले अंशों का चयन करें।
  13. 500 माइक्रोन लूप का उपयोग करके नमूना को एफपीएलसी मशीन में लोड करें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 एमएल आकार अपवर्जन कॉलम पर। एल्यूट डीडीएम बफर ई + 0.05% डीडीएम(टेबल 1)के 30 मिलीएल का उपयोग करके 0.5 मिली लीटर/मिनट की प्रवाह दर पर और अंश आकार के साथ अंश के रूप में एकत्र करें जो प्रति अंश 0.5 एमएल होने के लिए निर्धारित है।
  14. अंश लें और एफपीएलसी एल्यूशन ग्राफ से यूवी-विस वक्र की पुष्टि करने के लिए 280 एनएम अवशोषण का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
  15. प्रत्येक नमूना अंश से 20 माइक्रोन ले लीजिए जो एफपीएलसी एल्यूशन ग्राफ पर देखी गई चोटियों के अनुरूप है और अवशोषण परीक्षण के साथ सटीक होने की पुष्टि की गई थी।
  16. वांछित aliquots में तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ का उपयोग कर उन नमूना अंशों के शेष फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन के नमूनों की दुकान ।
  17. एफपीएलसी एल्यूशन ग्राफ पर देखे गए चोटियों के अनुरूप नमूनों की जांच करने के लिए पहले वर्णित एसडीएस-पेज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस परख चलाएं।

6. नकारात्मक दाग ग्रिड तैयारी

  1. ग्रिड है कि एक गिलास फिल्टर कागज में लिपटे स्लाइड पर नमूना तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहे है कार्बन की ओर का सामना करना पड़ के साथ रखें ।
  2. दो इलेक्ट्रोड के बीच एक चमक छुट्टी के कक्ष में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ग्रिड के साथ ग्लास स्लाइड प्लेस और यह सुनिश्चित करें कि यह केंद्रित है और अच्छी तरह से सील कर ग्लास ढक्कन की जगह ।
  3. ग्लो डिस्चार्जिंग मशीन चलाएं और सुनिश्चित करें कि प्लाज्मा द्वारा उत्पन्न बैंगनी प्रकाश दिखाई दे रहा है।
  4. जब मशीन चल रही है, जब तक चैंबर वायुमंडलीय दबाव तक पहुंच गया है कांच के ढक्कन को हटाने के लिए और फिर बेंच जहां नमूने उन पर लोड किया जाएगा करने के लिए ग्रिड के साथ स्लाइड वापस रुको ।
  5. शुद्ध प्रोटीन नमूनों की एकाग्रता को उचित बफर के साथ या तो नमूने को पतला करके या एक अपकेंद्रित्र सांद्रता का उपयोग करके लगभग 0.1 मिलीग्राम/एमएल में समायोजित करें।
  6. 10 एनएम मोटी कार्बन ग्रिड पर प्रोटीन नमूना के 3.5 μL लोड और 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  7. एक फिल्टर पेपर के साथ ईएम ग्रिड की सतह से तरल निकालें।
  8. ग्रिड के साथ पानी की 3 माइक्रोन बूंदें उठा और प्रत्येक बूंद उठा के बीच में फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड से पानी को हटाने के द्वारा ग्रिड सतह 3x धोएं ।
  9. ताजा, फ़िल्टर 2% यूरेनियम एसीटेट की 3 μL बूंदों को उठाकर ग्रिड की सतह 2x धोएं और प्रत्येक बूंद को चुनने के बीच में फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड पर वॉश समाधान हटा दें।
  10. ताजा की एक 3 μL बूंद के साथ ग्रिड दाग, 1 मिनट के लिए 2% यूरेनियम एसीटेट फ़िल्टर ।
  11. फिल्टर पेपर के साथ ईएम ग्रिड की सतह पर यूरेनियम एसीटेट समाधान निकालें और हवा कम से कम 1 मिनट के लिए ग्रिड सूखी।
  12. बाद में उपयोग के लिए ग्रिड बॉक्स में ग्रिड स्टोर करें।

7. ईएम इमेजिंग

  1. तैयार ग्रिड को सुरक्षित कार्यक्षेत्र में ग्रिड धारक में लोड करें।
  2. माइक्रोस्कोप को पॉलीस्टीरिन बॉक्स में रखकर माइक्रोस्कोप तैयार करें और तरल नाइट्रोजन से भरा देवर 3/4मना भरें।
  3. पुष्टि करें कि माइक्रोस्कोप खिड़की का रबर कवर इसे कवर कर रहा है और फिर देवर को तांबे के तारों को देवर में रखकर माइक्रोस्कोप पर लोड करें जब तक कि यह प्लेटफॉर्म पर फिट न हो जाए।
  4. शेष देवर को तरल नाइट्रोजन से भरें और उसे ढकने के लिए देवर के ऊपर एक टोपी रखें।
  5. उच्च तनाव को चालू करें, माइक्रोस्कोप की स्थिति करें, और माइक्रोस्कोप को गर्म करने और उपयोग के लिए एक सुरक्षित वैक्यूम स्तर स्थापित करने की प्रतीक्षा करें।
  6. एक बार माइक्रोस्कोप तैयार हो जाने के बाद कॉलम वाल्व खोलें और पुष्टि करें कि माइक्रोस्कोप खिड़की पर रबर कवर को हटाकर बीम मौजूद है।
  7. बीम की तीव्रता को समायोजित करके में और बाहर फैल कर बीम कलंक की जांच करें। यदि astigmatism मौजूद है बीम एक अंडाकार आकार के रूप में एक पार से दूर ले जाता है और बीम दोनों पक्षों पर एक ही अंडाकार आकार होना चाहिए होगा ।
  8. प्रेक्षक की आंखों के अनुसार सही ऊंचाई और दूरी बनने के लिए माइक्रोस्कोप दूरबीन को समायोजित करें।
  9. प्रत्येक में बीम केंद्र होने तक तीनों मोड के माध्यम से साइकिल चलाकर खोज, फोकसऔर एक्सपोजर मोड के लिए बीम स्थिति की जांच करें।
  10. कॉलम वाल्व बंद करें और ग्रिड धारक को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में लोड करने के लिए आगे बढ़ें।
  11. माइक्रोस्कोप लड़खड़ा सुविधा का उपयोग करके और जेड-अक्ष का उपयोग करके मंच के आंदोलन को समायोजित करके माइक्रोस्कोप को यूसेंट्रिक ऊंचाई में समायोजित करें जब तक कि केंद्र में नमूने की कोई साइड-टू-साइड गति न हो।
  12. माइक्रोस्कोप पर कम खुराक खोज मोड का उपयोग नमूने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए मौजूद नमूना अणुओं के साथ उचित विपरीत के एक वांछनीय क्षेत्र के लिए ग्रिड खोज ।
  13. एक उच्च कदम आकार का उपयोग करके फोकस मोड में नमूने पर ध्यान केंद्रित करें जब तक कि नमूना देखा न जाए और फिर सही फोकस स्तर खोजने के लिए चरणों को कम न करें।
  14. शून्य और बीम खाली और फिर सुनिश्चित करें कि रबर पैड माइक्रोस्कोप खिड़की को कवर कर रहा है।
  15. एक्सपोजर मोड का उपयोग करके 62,000x आवर्धन पर 1 एस एक्सपोजर के लिए वांछित ग्रिड क्षेत्र की छवि लें और प्राप्त छवि की जांच करें।
  16. जब एक ग्रिड कॉलम वाल्व बंद कर दिया और कॉलम से ग्रिड धारक को हटा दिया इमेजिंग किया।
  17. जब समाप्त इमेजिंग ब्याज के सभी ग्रिड फिलामेंट पावर को बंद करके और माइक्रोस्कोप से तरल नाइट्रोजन देवर को हटाकर माइक्रोस्कोप को बंद कर देते हैं।
  18. स्टैंड पर नमी को अवशोषित करने के लिए कुछ रखें जहां देवर माइक्रोस्कोप के तांबे के कुंडल से संघनन को पकड़ने के लिए बैठे थे।
  19. क्रायो साइकिल मोड को सक्रिय करें और सुनिश्चित करें कि टर्बो पंप बंद हो गया है।

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Representative Results

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यहां प्रस्तुत प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए ई कोलाई एसीआरबी वाइल्ड टाइप और ई कोलाई उत्परिवर्ती एसीआरबी-पी223जी के नमूनों को शुद्ध किया गया । इसके बाद नमूनों को कार्बन निगेटिव दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड में शामिल किया गया और साइड ब्लॉटिंग विधि22के साथ यूरेसिल एसीटेट का उपयोग करके दाग दिया गया । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नकारात्मक दाग छवियों को एकत्र किया गया था। डीडीएम के साथ शुद्ध AcrB जंगली प्रकार के नमूने के लिए नकारात्मक दाग छवि एक अच्छी तरह से परिभाषित ट्राइमेरिक क्वार्टेरी संरचना(चित्रा 1A)प्रदर्शित प्रोटीन के साथ मोनोडिस्परेड कणों के एक समरूप समाधान का पता चलता है । ये ट्राइमेरिक संरचनाएं शुद्ध होने पर मनाए गए आकार के बहिष्कार क्रोमाटोग्राम के अनुरूपहोती हैं (अनुपूरक चित्रा 1)। इसकी तुलना में, जब AcrB-P223G उत्परिवर्ती के लिए नकारात्मक दाग छवि को देखते हुए, डीडीएम के साथ भी शुद्ध किया जाता है, तो कोई भी एकत्रीकरण की दिशा में प्रवृत्ति के साथ पॉलीडिस्पर्स नैनोकणों के विषम समाधान का निरीक्षण कर सकता है, लेकिन कोई अवलोकन योग्य देशी ट्रिमर्स(चित्रा 1B)नहीं। आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी(अनुपूरक चित्रा 1)को ले जाने पर इन परिणामों को मनाया गया एल्यूशन प्रोफाइल द्वारा भी समर्थन दिया जाता है। यह निर्धारित करने के लिए कि म्यूटेंट के लिए ट्राइमेरिक स्टेट प्रोटीन की कमी डिटर्जेंट के साथ उपचार के कारण थी या पूरी तरह से P223G के अस्थिर उत्परिवर्तन के कारण प्रोटीन को NCMNP1-1 का उपयोग करके शुद्ध किया गया था, जो एनसीएमएन लाइब्रेरी के भीतर झिल्ली सक्रिय बहुलकों में से एक था। NCMNP1-1 के साथ शुद्ध AcrB जंगली प्रकार के नमूने के लिए नकारात्मक दाग छवि, फिर से, एक अच्छी तरह से परिभाषित ट्राइमेरिक क्वार्टेरी संरचना(चित्रा 1C)प्रदर्शित प्रोटीन के साथ मोनोडिस्पर्ड कणों के एक समरूप समाधान का पता चलता है । और डीडीएम शुद्धिकरण के साथ की तरह, जब AcrB-P223G उत्परिवर्ती NCMNP1-1 के साथ शुद्ध है नकारात्मक दाग छवि एकत्रीकरण की दिशा में एक प्रवृत्ति के साथ पॉलीडिस्पर्स नैनोकणों का एक विषम समाधान दिखाता है, लेकिन कोई अवलोकन देशी ट्रिमर्स(चित्रा 1D)। आगे पुष्टि करने के लिए कि P223G उत्परिवर्तन कोशिका झिल्ली पर AcrB ट्रिमर को बाधित करता है एक अलग बहुलक (NCMNP5-2) मालिकाना NCMNs झिल्ली सक्रिय बहुलक पुस्तकालय से चुना गया था । NCMNP5-2 बहुत बड़े आकार में देशी सेल झिल्ली नैनोकणों का गठन कर सकते हैं, इस प्रकार एक देशी कोशिका झिल्ली कण में कई AcrB ट्रिमर्स छवि की अनुमति । नतीजतन, यह देखा गया कि कई जंगली प्रकार एसीआरबी ट्रिमर्स एकल कणों(चित्रा 1E)में निहित थे; हालांकि, जंगली प्रकार AcrB द्वारा गठित उन लोगों की तरह कोई AcrB-P223G trimer कणों को देखा गया, यहां तक कि जब बड़े देशी सेल झिल्ली बाइलेयर पैच(चित्रा 1F)को देख रहे हैं । इससे पता चलता है कि AcrB-P223G कोशिका झिल्ली पर एक ट्रिमर के रूप में मौजूद नहीं है जैसा कि पहले21 का सुझाव दिया गया था और एक तार्किक स्पष्टीकरण प्रदान करता है कि एसीआरबी-पी223जी16को बताए जाने पर गतिविधि में नाटकीय गिरावट क्यों दिखाता है । नमूनों की शुद्धता और सही प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, सभी शुद्ध प्रोटीन नमूनों के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस जैल चलाए गए थे। परिणामस्वरूप दाग और 95% शुद्धता और दाग के स्थान के साथ सभी नमूनों में AcrB की उपस्थिति की पुष्टि की AcrB(चित्रा 1G)की भविष्यवाणी की आणविक वजन से मेल खाती है । हमारे अध्ययन के परिणाम झिल्ली प्रोटीन AcrB-P223G16की अल्पाधिकारी स्थिति का निर्धारण करने के संबंध में पहले वर्णित FRET परख के साथ असंगत हैं । प्रोटोकॉल में वर्णित झिल्ली सक्रिय पॉलिमर और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटीन की मूल अल्पाधिकारी स्थिति सीधे नमूदार थी। प्रोटीन के मोनोमर एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं, इसका अधिक सटीक निर्धारण उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम संरचनाओं के निर्धारण की आवश्यकता होगी।

Figure 1
चित्रा 1: शुद्ध AcrB निर्माण के नकारात्मक दाग और इलेक्ट्रोफोरेसिस जेल छवियों। (A)डीडीएम के साथ शुद्ध जंगली प्रकार AcrB के लिए लिया गया नकारात्मक दाग छवि। (ख)एसीआरबी-पी223जी प्रोटीन के लिए ली गई नकारात्मक दाग छवि डीडीएम के साथ शुद्ध । (ग)एनसीएमएनपी1-1 के साथ शुद्ध जंगली प्रकार AcrB के लिए लिया गया नकारात्मक दाग छवि । (घ)AcrB-P223G के लिए लिया गया नकारात्मक दाग छवि NCMNP1-1 के साथ शुद्ध निर्माण । (ई)NCMNP5-2 के साथ शुद्ध जंगली प्रकार AcrB के लिए लिया नकारात्मक दाग छवि (लाल बॉक्स छवि में मनाया ट्रिमर नैनोकणों में से कुछ पर प्रकाश डाला गया) । (एफ)NCMNP5-2 के साथ शुद्ध AcrB-P223G के लिए लिया नकारात्मक दाग छवि (ग्रीन बॉक्स NCMNP5-2 द्वारा कब्जा कर लिया लिपिड पैच के एक हिस्से पर प्रकाश डाला गया छवि में मनाया) । (जी)एसडीएस-पेज जेल डीडीएम (लेन 1), NCMNP1-1 (lane2),(एच)एसडीएस-पेज जेल के साथ ACRB-P223G के शुद्धिकरण से अंतिम उत्पादों का उपयोग कर के अंतिम उत्पादों का उपयोग कर चलाते हैं । (I)चित्रा 1E से हाइलाइट किए गए फीचर्स में जूम इन ।(J)एफ से हाइलाइट किए गए फीचर्स में जूम करें । चित्रा 1 में सभी नकारात्मक दाग छवियों 50 एनएम के एक ही पैमाने पर बार है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डीडीएम शुद्धिकरण बफ़र्स बहुलक शुद्धिकरण बफ़र्स जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस बफ़र्स
बफर ए 50 mM HEPES, पीएच 7.8 एनसीएमएन बफर ए 50 mM HEPES, पीएच 8.4 टीएई बफर 40 एमएमएम ट्रिस बेस
300 एमएमएल एनएसीएल 500 एमएमएल एनएसीएल 1 एमएमए एडटा
5% ग्लाइसरोल 5% ग्लाइसरोल 20 mM एसीटिक एसिड
20 mM इमिडाजोल 20 mM इमिडाजोल
1 एमएमएम एमजीसीएल2-6 एच2 0.1 mM TCEP
0.1 mM TCEP
बफर बी 50 mM HEPES, पीएच 7.8 एनसीएमएन बफर बी 25 m HEPES, पीएच 7.8 डिटेनिंग बफर 40% मेथनॉल
300 एमएमएल एनएसीएल 500 एमएमएल एनएसीएल 10% एसीटिक एसिड
5% ग्लाइसरोल 5% ग्लाइसरोल
40 mM इमिडाजोल 40 mM इमिडाजोल
1 एमएमएम एमजीसीएल2-6 एच2 0.1 mM TCEP
0.1 mM TCEP
बफर सी 50 mM HEPES, पीएच 7.8 एनसीएमएन बफर सी 25 m HEPES, पीएच 7.8 स्टैकिंग जेल 1.5 एम ट्रिस पीएच 8.8 (0.63 मिलीलीटर)
300 एमएमएल एनएसीएल 500 एमएमएल एनएसीएल 30% एक्रिलामाइड/बीआईएस (0.43 मिलीलीटर)
5% ग्लाइसरोल 5% ग्लाइसरोल 10% एसडीएस (0.025 मिलीलीटर)
75 एमएम इमिडाजोल 75 एमएम इमिडाजोल 10% एपीएस (0.025 मिलीलीटर)
1 एमएमएम एमजीसीएल2-6 एच2 0.1 mM TCEP TEMED (4 माइक्रोन)
0.1 mM TCEP एच2O (1.39 मिलीलीटर)
बफर डी 50 mM HEPES, पीएच 7.8 एनसीएमएन बफर डी 25 m HEPES, पीएच 7.8 12% अलग जेल 1.5 एम ट्रिस पीएच 8.8 (1.3 मिलीलीटर)
300 एमएमएल एनएसीएल 500 एमएमएल एनएसीएल 30% एक्रिलैमाइड/बीआईएस (2 मिली)
5% ग्लाइसरोल 5% ग्लाइसरोल 10% एसडीएस (0.05 मिलीलीटर)
300 mM इमिडाजोल 300 mM इमिडाजोल 10% एपीएस (0.05 मिलीलीटर)
1 एमएमएम एमजीसीएल2-6 एच2 0.1 mM TCEP TEMED (5 माइक्रोन)
0.1 mM TCEP एच2O (1.6 मिलीलीटर)
बफर ई 40 mM HEPES, पीएच 7.8 एनसीएमएन बफर ई 40 mM HEPES, पीएच 7.8
200 एमएमएल एनएसीएल 200 एमएमएल एनएसीएल
0.1 mM TCEP 0.1 mM TCEP

तालिका 1: कॉलम क्रोमेटोग्राफी और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए उपयोग किए जाने वाले शुद्धिकरण बफ़र्स की सूची।

अनुपूरक चित्रा 1: आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी एल्यूशन प्रोफाइल। (A)आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी प्रयोगों के लिए मनाए गए दो एल्यूशन प्रोफाइल का ओवरले ग्राफ डीडीएम और वाइल्ड टाइप एसीआरबी (ऑरेंज) के साथ और डीडीएम और उत्परिवर्ती एसीआरबी-पी223जी (नीला) के साथ शुद्ध होते समय किया जाता है । (ख)डीडीएम प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले आकार अपवर्जन कॉलम के लिए कॉलम अंशांकन प्रोफाइल।
1: Thyroglobulin (श्री ६६९ ०००), 2: Ferritin (श्री ४४० ०००), 3: Aldolase (श्री १५८ ०००), 4: Conalbumin (श्री ७५ ०००), 5: ओवलबुमिन (श्री ४४ ०००), 6: कार्बोनिक हाइड्रेज (श्री २९ ०००), 7: रिबोन्यूक्लिज ए (श्री १३ ७००) । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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झिल्ली प्रोटीन की संरचना और कार्य की अखंडता के लिए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन महत्वपूर्ण हैं। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। घुलनशील प्रोटीन की तुलना में, झिल्ली प्रोटीन और उनके पीपीआई झिल्ली प्रोटीन के अद्वितीय आंतरिक गुणों के कारण अध्ययन करना अधिक कठिन होता है। यह कठिनाई मुख्य रूप से संरचनात्मक स्थिरता और कार्यक्षमता के लिए एक देशी लिपिड बाइलेयर वातावरण में एम्बेडेड होने के लिए झिल्ली प्रोटीन की आवश्यकता से आती है। यह समस्याग्रस्त हो जाता है क्योंकि प्रोटीन की उच्च संकल्प संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए उन्हें कोशिका झिल्ली से निकाला जाना चाहिए। FRET कोशिका झिल्ली पर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक लोकप्रिय तकनीक रही है, हालांकि, संकल्प कम है और अक्सर झूठी सकारात्मक17, 18,19,20पैदा करता है। यहां यह पहली बार प्रदर्शित किया जाता है कि एनसीएमएन का उपयोग मूल कोशिका झिल्ली पर जंगली प्रकार के एसीआरबी ट्रिमर और एसीआरबी-पी223जी मोनोमर का संरचनात्मक विश्लेषण करके झिल्ली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने और FRET का उपयोग करके पिछले विश्लेषण के साथ परिणामों की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। जंगली प्रकार AcrB और AcrB-P223G के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एकल कण छवियों की तुलना करके, यह सुझाव दिया जाता है कि AcrB-P223G के बहुमत जे कोलाई सेल झिल्ली पर ट्रिमर नहीं बना है जब झिल्ली सक्रिय बहुलक का उपयोग कर शुद्ध, जैसे NCMNP1-1 और NCMNP5-2 । हम यहां प्रस्ताव करते हैं कि FRET विश्लेषण के परिणाम एक झूठी सकारात्मक हो सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप FRET दृष्टिकोण की संकल्प सीमा होती है। एसीआरबी-पी223जी ट्रिमर को स्थिर करने वाला कृत्रिम डिसल्फाइड बॉन्ड भी एक विरूपण साक्ष्य हो सकता है जो समाधान21में हुआ । नकारात्मक दाग छवियों का सुझाव है कि P223G उत्परिवर्तन AcrB trimer के गठन को रोका और है कि AcrB के मोनोमेरिक रूप एक ही संरचना में नहीं रह सकता है जब अपने त्रिकोणीय रूप में मनाया । इस उत्परिवर्तन वाले लूप को पहले उत्परिवर्तन और संरचनात्मक विश्लेषण के माध्यम से ट्राइमर के गठन के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण दिखाया गया था, जिसने पड़ोसी एसीआरबी मोनोमर23में दफन करके प्रत्येक लूप रूपों की बातचीत के कारण इसका संरचनात्मक महत्व दिखाया।

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन डिटेक्शन और विश्लेषण के लिए देशी कोशिका झिल्ली नैनोपार्टिकल सिस्टम का उपयोग करके, एक सही मायने में देशी कोशिका झिल्ली वातावरण में झिल्ली प्रोटीन (एस) को रखकर प्रोटीन की अल्पाधिकारी स्थिति का सीधे पता लगा सकता है, जिसका उपयोग नमूने के एकल कण क्रायो-ईएम विश्लेषण के माध्यम से परमाणु स्तर पर उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। एनसीएमएन प्रणाली डिटर्जेंट24के साथ नमूनों के इलाज के कारण पीपीआई डिटेक्शन में अक्सर झूठी सकारात्मकता और झूठी नकारात्मकता से बचने में मदद करती है । ये झूठे परिणाम आम तौर पर एकत्रीकरण, प्रोटीन नमूने के तिरस्कार, गैर-सहसंयोजक बातचीत के वियोजन, और डिटर्जेंट के परिसीमन प्रभावों के कारण कृत्रिम अल्पाहारी राज्यों के गठन के कारण उत्पन्न होते हैं। इसके अतिरिक्त, एनसीएमएन के साथ संयोजन के रूप में संरचनात्मक विश्लेषण का उपयोग अतिरिक्त संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है और आणविक बातचीत के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है, जो पीपीआई का पता लगाने के पहले स्थापित तरीकों का उपयोग करते समय पीपीआई को समझने के लिए महत्वपूर्ण होते हैं और आमतौर पर खो जाते हैं। इस विधि का सफलतापूर्वक उपयोग जंगली प्रकार एसीआरबी के संरचनात्मक अध्ययनों के लिए किया गया है और इसमें संरचनात्मक विश्लेषण के अन्य रूपों जैसे एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और ठोस राज्य एनएमआर के लिए व्यापक प्रयोज्यता हो सकती है, और उपन्यास प्रोटीन लक्ष्यों द्वारा प्रदर्शित बातचीत को निर्धारित करने की मांग करने वाले अन्य शोध में कई अलग-अलग प्रोटीन का उपयोग किया जा रहा है।

उच्च शुद्धता की उचित प्रोटीन पैदावार के साथ प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए झिल्ली सक्रिय पॉलिमर के साथ शुद्धिकरण प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका पालन किया जाना चाहिए। पहला महत्वपूर्ण कदम झिल्ली अलगाव की प्रक्रिया है, इस प्रकार यह 15,000 x ग्राम पर सेल lysate अपकेंद्रित्र करने के लिए महत्वपूर्ण है और 215,000 x g पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के साथ इस कदम का पालन करें ताकि वास्तव में कोशिका झिल्ली को बाकी कोशिका ओं से अलग किया जा सके। अगला महत्वपूर्ण कदम दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 2.5% की एकाग्रता पर झिल्ली सक्रिय पॉलिमर के साथ झिल्ली अंश को सोलबिलाइज कर रहा है। शुद्धिकरण के अनुकूलन प्रयोग किए गए और इस चरण में इन मापदंडों का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए दिखाया गया कि एसीआरबी की इष्टतम मात्रा झिल्ली से निकाली जाती है और देशी कोशिका झिल्ली नैनोकणों का उचित गठन होता है। शुद्धिकरण प्रक्रिया का अंतिम महत्वपूर्ण कदम कमरे के तापमान पर नी-एनटीए कॉलम पर नमूना लोड कर रहा है । यह आवश्यक है, क्योंकि झिल्ली सक्रिय बहुलक 4 डिग्री सेल्सियस की तुलना में कमरे के तापमान पर अधिक घुलनशील होते हैं, इस प्रकार कमरे के तापमान पर लोड होने से आत्मीयता स्तंभ पर बाध्यकारी प्रोटीन की मात्रा में वृद्धि होगी और अघुलनशील बहुलक बिल्डअप के कारण उच्च दबाव से बचा जा सकेगा जो संभवतः कॉलम को नुकसान पहुंचा सकता है। सटीक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए लगभग समान रूप से महत्वपूर्ण नकारात्मक धुंधला प्रक्रिया में निहित कदम हैं। इस प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में 10 एनएम मोटी होले कार्बन ग्रिड, पानी और यूरेनाइल एसीटेट की मात्रा, और नमूना सोखने और धुंधला करने के लिए समय की लंबाई का उपयोग शामिल है। नमूना तैयार करने के दौरान इन प्रमुख मापदंडों का उपयोग गुणवत्ता संरचनात्मक डेटा सुनिश्चित करेगा जिसका उपयोग नमूने के अल्पाहारिक राज्यों के सटीक मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है। विभिन्न पॉलीपेप्टाइड्स की अनूठी विशेषताओं के कारण उत्पन्न होने वाली समस्याओं को दूर करने के लिए विभिन्न प्रोटीन का उपयोग करते समय शुद्धिकरण प्रोटोकॉल में संशोधन आवश्यक हो सकते हैं। प्रोटीन नमूना की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने में कठिनाई होने पर संशोधित करने पर विचार करने के प्राथमिक कारक इंडक्शन चरण के दौरान उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर, घुलनशीलीकरण चरण में उपयोग किए जाने वाले झिल्ली अंश की मात्रा, और घुलनशीलीकरण प्रक्रिया के लिए समय और तापमान की लंबाई होनी चाहिए। यदि शुद्धता के साथ कोई समस्या है तो शुद्धिकरण के लिए नी-एनटीए कॉलम का उपयोग करने के बजाय वैकल्पिक आत्मीयता स्तंभों जैसे बायोटिन एफ़िनिटी कॉलम का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है। इसी प्रकार, यदि कमजोर/क्षणिक प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का रखरखाव आवश्यक है, तो टैप-टैग आत्मीयता कॉलम के लिए नी-एनटीए कॉलम का आदान-प्रदान इष्टतम परिणामों के लिए फायदेमंद है । अंत में, स्तनधारी प्रोटीन का अध्ययन करते समय, स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग प्रोटीन की प्राकृतिक अल्पाधिकारी स्थिति के सटीक निर्धारण के लिए आवश्यक सच्चे देशी कोशिका झिल्ली लिपिड रचनाओं को बनाए रखने के लिए किया जाना चाहिए। इसके लिए इस प्रोटोकॉल के प्रोटीन एक्सप्रेशन और सेल लाइसिस स्टेप्स को पूरी तरह से संशोधित करने की जरूरत होगी । ऐसे मामलों में, प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेल लाइसिस के लिए पहले स्थापित प्रोटोकॉल जो ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति प्रणाली के अनुरूप हैं, का पालन किया जाना चाहिए।

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ एनसीएमएन का उपयोग पीपीआई का पता लगाने में उपयोग के लिए FRET की तुलना में महान फायदे प्रदर्शित करता है। इस अध्ययन से प्राप्त परिणामों के अनुसार, पहले किए गए FRET प्रयोग एसीआरबी उत्परिवर्ती प्रोटीन21की अल्पाधिकारी संरचना के संरचनात्मक विश्लेषण के साथ असंगत थे। यह स्पष्ट रूप से दिखाया गया था और सीधे नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, जो उत्परिवर्ती AcrB-P223G16के लिए गतिविधि के पहले वर्णित नुकसान के अनुरूप है के साथ लिया छवियों द्वारा पुष्टि की । यदि AcrB-P223G वीवो में ट्रिमर फार्म किया था NCMNP5-2 बहुलक उंहें बड़े देशी सेल झिल्ली पैच यह अर्क में पकड़ा जाएगा । यह संभव है कि उत्परिवर्ती एसीआरबी के FRET विश्लेषण के परिणामस्वरूप कई सीमाओं में से किसी के कारण झूठी सकारात्मक हुई जो भौतिक प्रक्रियाओं के लिए आंतरिक हैं तकनीक पर निर्भर करती है और फ्लोरोसेंट प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक। FRET की एक प्रमुख सीमा कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की संकल्प सीमा है और इससे इंटरमॉलिकुलर दूरी में गंभीर सीमाएं हो जाती हैं जो FRET परख के साथ हल होने में सक्षम होती हैं19. इसकी तुलना में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर एनसीएमएन का उपयोग करना यूआरटी की उपरोक्त सीमा के अधीन नहीं है, जब कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में काफी अधिक संकल्प सीमाएं हैं। पहले वर्णित FRET पर संभावित प्रभाव वाले इन सीमाओं के आधार पर, हम यह मानते हैं कि वीवो में एक एसीआरबी-पी223जी ट्रिमर का गलत पता लगाना FRET21की कम संकल्प सीमा से हुआ। इस कागज द्वारा सीधे बताए गए सिर्फ FRET पर लाभ के अलावा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में NCMNs का उपयोग कर सभी वर्तमान प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन तकनीकों पर लाभ है, जैसे Y2H प्रणाली और नल-एमएस, कि यह उच्च संकल्प में सीधे देशी सेल झिल्ली वातावरण में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और क्षमता के लिए परमाणु स्तर पर प्रोटीन संरचनाओं का निर्धारण किया जा सकता है ।

झिल्ली सक्रिय पॉलिमर और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सीमाओं के बिना भी नहीं हैं। वर्तमान में, एनसीएमएन शुद्धिकरण का मुख्य मुद्दा डिटर्जेंट-आधारित तरीकों (एनसीएमएन लाइब्रेरी में पॉलिमर प्रदर्शन ~ 70% डीडीएम की निष्कर्षण दक्षता) की तुलना में इसकी कम निष्कर्षण दक्षता है। इसमें कुछ आत्मीयता स्तंभों के साथ अनुकूलता के मुद्दे भी हैं, जैसे कि माल्टोज़ बाध्यकारी कॉलम। इसके अलावा, एनसीएमएन शुद्धिकरण अभी भी अत्यधिक गतिशील झिल्ली प्रोटीन या परिसरों (डेटा अप्रकाशित) के साथ बहुत सफल नहीं है। ओलिगोमेरिक राज्य निर्धारण प्रयोगों के लिए झिल्ली सक्रिय पॉलिमर और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए देशी कोशिका वातावरण से प्रोटीन को हटाने की आवश्यकता होती है, जबकि वीवो में वीआरटी किया जाता है। हालांकि, झिल्ली सक्रिय बहुलक द्वारा गठित नैनोकण कोशिकाओं से प्रोटीन निकालते समय सबसे देशी जैसे वातावरण के लिए अनुमति देते हैं, प्रोटीन निष्कर्षण और शुद्धिकरण के कारण ज्ञात संभावित प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त अशुद्धियों को कम करने के लिए। इसके अतिरिक्त, जबकि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की सीमा के रूप में संकल्प और कण आकार का मुद्दा पिछले एक दशक में काफी कम हो गया है, नकारात्मक दाग विश्लेषण के लिए अभी भी उपयोग किए जा रहे माइक्रोस्कोप अभी भी अपेक्षाकृत बड़े अणुओं या आणविक परिसरों (>200 kDa) तक सीमित होंगे क्योंकि उनके पास आम तौर पर लगभग 0.1-0.3 एनएम25की सूचना सीमा होती है । SMALP भी अनुप्रयोगों के मामले में अत्यधिक लचीला होना दिखाया गया है, लेकिन NCMNs की तुलना में भी अधिक सीमाओं को प्रदर्शित करता है । एसएमए द्वारा बनाए गए नैनोडिस्क का अधिकतम व्यास लगभग 15 एनएम होता है और इस प्रकार 400 केडीए26से अधिक प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों को निकालने के लिए आमतौर पर अप्रभावी होते हैं । इस सीमा के अलावा, SMA भी प्रोटीन है कि कम पीएच वातावरण में मौजूद है या संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रयोजनों के लिए divalent आयनों का उपयोग के साथ काम करने में असमर्थ है । कार्रवाई के SMALPs तंत्र पीएच निर्भर होने के कारण, यह कम पीएच शर्तों और chelates divalent आयनों के साथ इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । जबकि SMILP और DIBMA तरीकों ने इन सीमाओं पर काबू पाने के संबंध में वादा किया है, विविध सेट प्रोटीन के लिए उनकी प्रयोज्यताअनदेखी 27,28बनी हुई है । एनसीएमएन वैकल्पिक पॉलीमर बनाने के लिए संरचना-गतिविधि संबंध (एसएआर) विश्लेषण का उपयोग करके इन सीमाओं को दूर करना चाहता है जो बड़े नैनोकणों का निर्माण कर सकते हैं, कम पीएच स्थितियों में काम कर रहे हैं, और डिवेलेंट आयनों को छोड़ने से बच सकते हैं। एनसीएमएन के लिए विकसित किए गए पॉलीमर का ऐसा ही एक उदाहरण एनसीएमएनपी5-2 बहुलक है जो चित्रा 1ई, एफमें प्रदर्शित बड़े नैनोकणों को बनाने की क्षमता प्रदर्शित करता है ।

नैनोपार्टिकल प्रौद्योगिकी में पहले वर्णित प्रगति के अलावा, एनसीएमएन की भविष्य की दिशा और भी अधिक झिल्ली सक्रिय बहुलक विकसित करने में है जो एनसीएमएनएस पॉलीमर पुस्तकालय को निष्कर्षण दक्षता में वृद्धि करेगी और सभी विभिन्न ट्रांसमेम्ब्रान क्षेत्र के आकारों के प्रोटीन के साथ काम करने की क्षमता, जो बहुत व्यापक पीएच स्तर पर कार्य करती है, या उनकी संरचना और कार्य के रखरखाव के लिए किसी भी प्रकार के आयन पर भरोसा करती है। यह सभी झिल्ली प्रोटीन शोधकर्ताओं को अपने प्रयोगों में इस तकनीक का उपयोग करने और अधिक सटीक और जैविक रूप से प्रासंगिक परिणामों तक पहुंच बनाने की अनुमति देगा। बहुलक नैनोकणों के फायदों को प्रोटीन की एक व्यापक विविधता में लाकर आशा है कि इससे परमाणु स्तर पर देशी झिल्ली प्रोटीन परिसरों की उच्च संकल्प संरचनाओं को हल करने में मदद मिलेगी और इस प्रकार इन परिसरों को बनाए रखने में जाने वाले इंट्रामोलिकुलर परमाणु बातचीत का निर्धारण होगा । इस तरह की प्रगति से संरचना आधारित दवा डिजाइन प्रयासों के माध्यम से झिल्ली प्रोटीन दवा खोज और विकास के मामले में कई नई संभावनाएं भी सक्षम होंगी । झिल्ली प्रोटीन के लिए संरचना आधारित दवा डिजाइन तकनीकों का उपयोग चिकित्सा उद्योग के लिए एक बड़े पैमाने पर लाभ होगा क्योंकि इससे अवांछित दुष्प्रभावों को कम करने के लिए दवा बाध्यकारी विशिष्टता और प्रभावकारिता में वृद्धि होगी और वांछित चिकित्सीय प्रभावों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक यौगिक की मात्रा, इस प्रकार ऐसी दवाएं बनाई जाएंगी जो झिल्ली प्रोटीन को काफी सुरक्षित और अधिक प्रभावी बनाते हैं । देशी कोशिका झिल्ली नैनोकण प्रणाली अभी भी अपने विकास के चरणों में है, लेकिन पहले से ही पहली बार अपने वास्तव में मूल राज्यों में झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन की अनुमति देने और कोशिका झिल्ली पर होने वाले देशी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को स्पष्ट करके अविश्वसनीय रूप से शक्तिशाली साबित हुई है।

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Disclosures

वाईजी झिल्ली सक्रिय बहुलक NCMNP5-2 और NCMN प्रणाली के आविष्कारक के रूप में सूचीबद्ध है।

Acknowledgments

इस शोध को वीसीयू स्टार्टअप फंड (वाईजी को) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज द्वारा पुरस्कार संख्या R01GM132329 (वाईजी को) के तहत समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है । हम वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए उनके उदार समर्थन के लिए मोंटसराट सैमसो और केविन मैकरॉबर्ट्स को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) Bio-Rad 161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) Bio-Rad 1610747
Acetic Acid Glacial ThermoFisher Scientific A38S-212
Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700
Chloramphenicol Goldbio C-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder Bio-Rad 161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free Goldbio DTT10
Glycerol ThermoFisher Scientific G33-4
HEPES ThermoFisher Scientific BP310-1
Imidazole Affymetrix 17525 1 KG
IPTG Goldbio I2481C100
Kanamycin Goldbio K-120-25
Magnesium chloride hexahydrate ThermoFisher Scientific AA3622636
Methanol ThermoFisher Scientific A412-4
N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) Merck 8.03779.0100
NCMNS-P5-2 Not commercially available yet Submit request for obtaining to corresponding author
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) Bio-Rad 161-0301
SMA2000 Cray Valley Submit request for obtaining to corresponding author
Sodium Chloride ThermoFisher Scientific S271-10
TCEP-HCl Goldbio TCEP25
TEMED Bio-Rad 161-0800
Terrific Broth Media Affymetrix 75856 1 KG
Tris Base Bio-Rad 161-0719
Uranyl Acetate Ambinter Amb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPI Beckman Coulter B14538
Avanti JXN-30 Beckman Coulter B34193
Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) Electron Microscopy Sciences CF300-Cu-TH
Con-Torque Tissue Homogenizer Eberbach E7265
Corning LSE Mini Microcentrifuge ThermoFisher Scientific 07-203-954
EmulsiFlex-C3 Avestin
Fraction Collector F9-R GE Healthcare Life Sciences 29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 165-8004
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder Wheaton 358013
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump Razel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 28990944
Tecnai F20 200kV FEI
Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter
General Materials
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa Millipore Sigma UFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLC GE Healthcare Life Sciences 29018225
BL21(DE3)pLysS Cells ThermoFisher Scientific C606003
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A
HisTrap HP 5 ml Column GE Healthcare Life Sciences 17524802
pET-24a EMD Biosciences 69749-3

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References

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झिल्ली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली
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Kroeck, K. G., Qiu, W., Catalano, C., Trinh, T. K. H., Guo, Y. Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis. J. Vis. Exp. (161), e61298, doi:10.3791/61298 (2020).More

Kroeck, K. G., Qiu, W., Catalano, C., Trinh, T. K. H., Guo, Y. Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis. J. Vis. Exp. (161), e61298, doi:10.3791/61298 (2020).

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