Summary
Presentato qui è un protocollo per la determinazione dello stato oligomerico delle proteine di membrana che utilizza un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa in combinazione con la microscopia elettronica.
Abstract
Le interazioni proteina-proteina nei sistemi a membrana cellulare svolgono un ruolo cruciale in un'ampia gamma di processi biologici, dalle interazioni cellula-cellula alla trasduzione del segnale; dal rilevamento dei segnali ambientali alla risposta biologica; dalla regolazione metabolica al controllo dello sviluppo. Informazioni strutturali accurate sulle interazioni proteina-proteina sono cruciali per comprendere i meccanismi molecolari dei complessi proteici di membrana e per la progettazione di molecole altamente specifiche per modulare queste proteine. Sono stati sviluppati molti approcci in vivo e in vitro per il rilevamento e l'analisi delle interazioni proteina-proteina. Tra questi l'approccio della biologia strutturale è unico in quanto può fornire informazioni strutturali dirette sulle interazioni proteina-proteina a livello atomico. Tuttavia, l'attuale biologia strutturale delle proteine di membrana è ancora in gran parte limitata ai metodi a base di detergenti. Il principale svantaggio dei metodi a base di detergenti è che spesso dissociano o denaturano i complessi proteici della membrana una volta che il loro ambiente bistrato lipidico nativo viene rimosso dalle molecole di detergente. Abbiamo sviluppato un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per la biologia strutturale delle proteine di membrana. Qui, dimostriamo l'uso di questo sistema nell'analisi delle interazioni proteina-proteina sulla membrana cellulare con un caso di studio dello stato oligomerico di AcrB.
Introduction
Le interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale in tutta la biologia, dal mantenimento della struttura e della funzione delle proteine alla regolazione di interi sistemi. Gli IPP sono disponibili in molte forme diverse e possono essere classificati in base ai tipi di interazioni che formano. Una di queste categorizzazioni è omooligomerica o eterooligomerica, basata sul fatto che le interazioni siano tra subunità identiche o proteine diverse che agiscono come subunità. Un'altra categorizzazione si basa sulla forza dell'interazione se le interazioni portano alla formazione di complessi stabili o stati complessi transitori. Le informazioni strutturali sugli IPP tra le proteine sono cruciali per comprendere il meccanismo con cui le proteine svolgono la loro funzione. È stato stimato che oltre l'80% delle proteine si basa su una formazione complessa al fine di svolgere i loro ruoli funzionali1. Data la percentuale di proteine osservate che dipendono dagli IPP per un corretto funzionamento innato, il loro significato in biologia è facilmente evidente, ma essere in grado di indagare correttamente le proteine che si impegnano in queste interazioni è rimasto impegnativo a causa dei limiti nelle tecniche disponibili per osservare sperimentalmente quando le proteine formano IPP.
C'è un alto grado di disaccordo tra i risultati per molti IPP determinati sperimentalmente a causa dell'elevata quantità di rumore, falsi positivi e falsi negativi che derivano da molte delle tecniche di determinazione PPI attualmente disponibili. Ciò è particolarmente vero per il sistema bi-ibrido di lievito (Y2H), la spettrometria di purificazione di purificazione tandem-massa (TAP-MS) e il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET), che rappresentano tre dei metodi più comunemente utilizzati per la determinazione PPI2,3,4,5,6,7. In confronto, le tecniche di biologia strutturale delle proteine, come la risonanza magnetica nucleare (NMR), la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica (EM), possono essere utilizzate per ottenere informazioni strutturali ad alta risoluzione sulle interazioni proteina-proteina fino al livello atomico e consentire la conferma visiva diretta delle interazioni che si verificano per una proteina bersaglio di interesse. Tutte le tecniche di ricerca di determinazione PPI non basate sulla struttura attualmente disponibili (ad esempio, Y2H, TAP-MS e FRET) mancano di questa capacità e soffrono inoltre di difficoltà nell'identificare interazioni deboli e transitorie tra proteine5. Queste carenze sono ulteriormente migliorate quando si studiano le proteine di membrana a causa della complessità aggiunta portata dalla variabile aggiuntiva dell'ambiente lipidico che influenza la formazione di una corretta struttura quaternaria e assemblaggio complesso eteromerico.
Le proteine di membrana covano gran parte del proteoma e sono note per svolgere molti ruoli cruciali nel corretto funzionamento cellulare all'interno di tutti gli organismi viventi. Nonostante si stima che le proteine di membrana costituiscano il 27% del genoma umano e costituiscano ~ 60% di tutti gli attuali obiettivifarmacologici,c'è una grande anomalia nel numero di modelli risolti per le proteine di membrana che costituiscono solo ~ 2,2% di tutte le strutture proteichepubblicate 8,9,10. La causa principale della discrepanza nella disponibilità di informazioni strutturali risiede nelle proprietà intrinseche delle proteine di membrana stesse. A causa della loro scarsa solubilità, della dipendenza dalle interazioni con un ambiente lipidico per mantenere la struttura e la funzione nativa e di varie proprietà fisicochimiche della membrana lipidica stessa, le proteine di membrana continuano a rappresentare un problema sostanziale quando implementano tecniche di biologia strutturale per studiarle. Di queste proprietà intrinseche, la più importante per ottenere informazioni strutturali accurate è il requisito di avere interazioni con il loro ambiente lipidico naturale per mantenere la loro struttura e funzione nativa. L'ambiente lipidico è parte integrante della struttura e della funzione delle proteine di membrana che il concetto di memteina (una combinazione delle parole membrana e proteina) è stato proposto come unità fondamentale della struttura membrana-proteina e dellafunzione 11. Nonostante l'importanza delle interazioni lipidico-proteina, le tecniche di determinazione PPI attualmente disponibili a base di struttura spesso richiedono che le proteine studiate siano solubili o solubilizzate con detergenti. L'esposizione a detergenti aggressivi può denaturare le proteine o causare falsi positivi e negativi a causa della delipidazione, che può indurre aggregazione, denaturazione delle proteine, dissociazione di interazioni non covalenti e formazione di stati oligomerici artificiali. A causa della necessità di mantenere un ambiente lipidico naturale per una determinazione accurata dello stato oligomerico nativo delle proteine di membrana abbiamo sviluppato un sistema di nanoparticelle di membrana a cellule native (NCMN)12 basato sul metodo Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 precedentemente riportato.
SMALP utilizza il copolimero dell'acido maleico stirene come polimero attivo di membrana per estrarre e solubilizzare le proteine della membrana. Il poli(acido stirene-co-maleico) (SMA) è un polimero anfifilo unico per la sua moietà di stirene idrofobica e la moietà dell'acido maleico idrofilo diametralmente opposta. Forma nanoparticelle adsorbendo, destabilizzando e interrompendo la membrana cellulare in un meccanismo dipendente dal pH14. Questa attività funzionale di SMA è ciò che consente di utilizzarla come sistema privo di detergenti per l'estrazione e la solubilizzazione delle proteine di membrana. Il sistema NCMN è distinto dal sistema SMALP sotto diversi aspetti. La caratteristica più unica del sistema NCMN è che ha una libreria di polimeri attivi a membrana con una moltitudine di polimeri che hanno proprietà uniche che li rendono adatti all'isolamento di molte diverse proteine di membrana che richiedono condizioni diverse per la stabilità e il funzionamento nativo. Il sistema NCMN ha anche protocolli diversi rispetto al metodo SMALP quando si tratta di preparare le nanoparticelle. Uno di questi esempi è che gli NCMN utilizzano una purificazione della colonna di affinità al nichel a passo singolo per la determinazione della struttura ad alta risoluzione; l'effetto di questi diversi protocolli può essere osservato quando si confronta il protocollo NCMN, che ha generato strutture crio-EM AcrB 3.2 e 3.0 Å, con uno studio simile utilizzando il metodo SMALP, che ha portato a una struttura crio-EM AcrB con una risoluzione 8.8 Å12,15. Queste caratteristiche uniche del sistema NCMN sono i miglioramenti apportati al metodo SMALP precedentemente stabilito e lo rendono un candidato ideale per lo studio degli IPP.
Il trasportatore multifarmaco Efflux AcrB esiste come omotrimero funzionale in E. coli12. Un'analisi mutagena ha suggerito che una singola mutazione puntino P223G, situata su un circuito responsabile della stabilità del trimer AcrB, destabilizza lo stato del trimer e produce un monomero AcrB quando preparato con il detergente DDM, che potrebbe essere rilevato con elettroforesi del gel blu nativo16. Tuttavia, l'analisi FRET del mutante AcrB-P223G suggerì che quando nell'ambiente bistrato lipidico della membrana cellulare nativa, la maggior parte dell'AcrB-P223G mutante esisteva ancora come trimestre e che i livelli di espressione sia per il tipo selvaggio AcrB che per L'AcrB-P223G sono simili. Tuttavia, nonostante i risultati dell'analisi FRET, un test di attività per il trasportatore mutante ha mostrato che l'attività è diminuita drasticamente rispetto al tiposelvaggio 16. Sebbene la tecnologia FRET sia stata popolarmente utilizzata per l'analisi delle interazioni proteina-proteina, la ricerca ha dimostrato che può spesso dare falsi positivi17,18,19,20.
Recentemente, sono state determinate strutture crio-EM ad alta risoluzione del trimer AcrB che hanno mostrato l'interazione di AcrB con il suo bistrato lipidico a membrana cellulare nativa associata attraverso l'uso delle NCMN12. In linea di principio, gli NCMN possono essere facilmente utilizzati per l'analisi delle interazioni proteina-proteina trovate sulla membrana cellulare nativa. In un test di questo sistema, sono stati effettuati esperimenti per osservare direttamente lo stato oligomerico di AcrB-P223G con l'uso di nanoparticelle di membrana cellulare nativa e microscopia elettronica di colorazione negativa. Al fine di confrontare con le nanoparticelle AcrB di tipo selvatico, abbiamo utilizzato lo stesso polimero attivo a membrana (SMA2000 realizzato nel nostro laboratorio, che è indicizzato come NCMNP1-1 nella libreria NCMN) utilizzato per la determinazione della struttura crio-EM ad alta risoluzione di AcrB e polimeri alternativi trovati nella libreria NCMNs12. Sulla base dei risultati precedentemente riportati, ci si aspettava che la maggior parte del mutante AcrB-P223G esistesse sotto forma di nanoparticelle di membrana cellulare nativa trimerica21. Tuttavia, nel campione non sono stati trovati trimer AcrB, come quelli osservati con il tipo selvaggio AcrB. Ciò suggerisce che la maggior parte dell'AcrB-P223G non forma trimer sulla membrana cellulare nativa come suggerito in precedenza.
Qui riferiamo un'analisi dettagliata del mutante E. coli AcrB-P223G in confronto al tipo selvatico E. coli AcrB utilizzando le NCMN. Questo caso di studio dell'AcrB suggerisce che gli NCMN sono un buon sistema per l'analisi dell'interazione proteina-proteina.
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Protocol
1. Espressione proteica
- Inoculare 15 ml di supporti di brodo terrificante (TB) con antibiotici specifici per i plasmidi con cellule pLysS BL21(DE3) contenenti l'AcrB che esprime plasmidi in tubi da 50 ml durante la notte a 37 °C con scuotimento a 250 giri/min.
- Controllare la densità ottica della coltura notturna a 600 nm (OD600) e assicurarsi che sia superiore a 2,0.
- Diluire 5 mL di coltura cellulare in 1 L di mezzi tb contenenti antibiotici specifici per i plasmidi e incubare a 37 °C con scuotimento fino a OD600=0,8 e quindi indurre con IPTG che ha una concentrazione finale di 1 mM.
- Effettuare l'induzione a 20 °C con scuotimento per 20 ore.
- Pellet giù per le cellule utilizzando centrifugazione per 15 min a 4 °C e 4.000 x g.
2.Lisi cellulare e isolamento della membrana
- Resuspend il pellet di cellule nel tampone A(tabella 1, utilizzare DDM Buffer A o NCMNs Buffer A a seconda dello schema di purificazione che deve seguire) utilizzando 80 mL per ogni 20 g del pellet cellulare.
- Omogeneizzare i pellet cellulari rimescolati utilizzando un omogeneizzatore Dounce in vetro a 4 °C o se a temperatura ambiente assicurarsi di mettere sul ghiaccio subito dopo.
- Trasferire il campione in un becher metallico sul ghiaccio e liscire le cellule caricandole in un omogeneizzatore ad alta pressione a 4 °C e 1.500 bar.
- Ripetere il processo di caricamento delle cellule nell'omogeneizzatore e consentire loro di passare attraverso l'omogeneizzatore per 3-4 cicli o fino a quando il lisato inizia a chiarire.
- Centrifugare il lysate a 15.000 x g per 30 min a 4 °C.
- Raccogliere il supernatante e caricarlo in tubi ultracentrifugo e centrifuga a 215.000 x g per 1 h a 4 °C.
- Scartare il supernatante e raccogliere i pellet di membrana dai tubi ultracentrifugo. Conservare il pellet di membrana in eccesso a -80 °C.
3. Preparazione di nanoparticelle di membrana cellulare nativa
- Resuspend 1 g di pellet di membrana in 10 mL NCMN Buffer A(Tabella 1).
- Omogeneizzare il campione di membrana cellulare rimorsied con un omogeneizzatore Dounce in vetro a 20 °C.
- Trasferire il campione di membrana sospesa in un tubo di polipropilene da 50 ml e aggiungere la soluzione di stock di polimeri attivi a membrana e il buffer A NCMN aggiuntivo per portare il campione a una concentrazione finale del polimero attivo a membrana 2,5% (w/v) (NCMNP1-1 o NCMNP5-2).
NOTA: Le soluzioni stock di polimeri attivi a membrana devono essere realizzate in acqua distillata doppia e possono essere mantenute a concentrazioni variabili, ma in genere al 10% (w/v). - Agitare il campione per 2 ore a 20 °C.
- Caricare il campione in un ultracentrifugo e girare a 150.000 x g per 1 h a 20 °C.
- Mentre il campione è ultra-centrifugato iniziano ad equilibrare una colonna Ni-NTA da 5 mL con 25 mL di NCMN Buffer A.
- Raccogliere il supernatante al termine dell'ultracentrifugazione e caricarlo su 5 ml di colonna Ni-NTA a temperatura ambiente con una portata di 0,5 ml/min utilizzando una pompa per siringhe.
- Lavare le linee di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) con un numero sufficiente di NCMN Buffer B (Tabella 1) per sciacquare completamente il sistema e quindi collegare la colonna alla macchina FPLC.
- Lavare la colonna con 30 mL di NCMN Buffer B con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso attraverso.
- Lavare la colonna con 30 mL di NCMN Buffer C (Tabella 1) con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso.
- Elute la proteina con 20 mL di NCMNs Buffer D (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere il campione utilizzando un raccoglitore di frazioni e le frazioni ciascuna impostate su 1,0 mL.
- Conservare i campioni proteici a 4 °C.
- Eseguire un test di elettroforesi del gel SDS-PAGE per controllare i campioni che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC.
4. Elettroforesi gel SDS-PAGE
- Preparare la camera di colata bloccando il vetro all'apparecchio di colata.
- Preparare il gel di separazione del 12% secondo la ricetta elencata nella tabella 1.
NOTA: Una volta aggiunto TEMED, il gel si polimerizzerà rapidamente, quindi aggiungi questo solo una volta pronto per versare il gel. - Versare il gel, lasciando 2 cm sotto il fondo del pettine per il gel impilamento.
- Rimuovere eventuali bolle stratificando la parte superiore del gel con isopropanolo al 100% e attendere che il gel di separazione polimerizzi.
- Rimuovere l'isopropanolo e lavare eventuali tracce dell'isopropanolo con acqua distillata.
- Preparare il gel impilamento secondo la ricetta elencata nella tabella 1.
NOTA: Una volta aggiunto TEMED, il gel si polimerizzerà rapidamente, quindi aggiungi questo solo una volta pronto per versare il gel. - Versare il gel impilamento sopra il gel di separazione.
- Aggiungere un pettine alla camera per formare i pozzi e attendere che il gel impilamento polimerizzi completamente.
- Posizionare 1 μL di 1 M DTT in un tubo di microcentrifugo per ogni campione di frazione che deve essere eseguito sul gel.
- Aggiungere anche 7 μL di tampone di carico 4x a ciascun tubo.
- Aggiungere 20 μL di campione dalle frazioni che devono essere eseguite sul gel a ciascun tubo di microcentrifugo.
- Vortice i tubi contenenti i campioni.
- Ruotare i tubi campione utilizzando un microcentrifugo da tavolo per 3 s e assicurarsi che tutto il campione sia tornato sul fondo dei tubi.
- Preparare la cella di elettroforesi in gel fissando una cassetta in gel di poliacrilammide al 12% in posizione e riempiendo le camere interne ed esterne della cella con tampone Tris-acetato-EDTA (TAE)(tabella 1).
- Caricare il marcatore di peso molecolare nella prima corsia del gel con il volume appropriato richiesto dalle sue istruzioni.
- Caricare 28 μL del campione da ciascun tubo miscelato con DTT e tampone di carico.
- Posizionare il coperchio della cella di elettroforesi sopra la scatola e collegare il coperchio all'alimentatore.
- Accendere l'alimentatore e impostarlo su 100 V e consentirgli di funzionare per 20 minuti.
- Dopo 20 minuti, aumentare la corrente di alimentazione a 140 V e continuare a eseguirla per altri 30-40 minuti o fino a quando la banda di carico del colorante tampone raggiunge il fondo della cassetta di gel.
- Dopo aver completato la macchia di elettroforesi e de-macchiare il gel per visualizzare le bande proteiche contenute all'interno del gel.
5. Purificazione delle proteine con DDM
NOTA: Lo scopo di eseguire questo processo di purificazione è quello di servire da controllo per gli esperimenti che utilizzano i polimeri attivi a membrana.
- Resuspend 6-10 g di pellet di membrana, dal passaggio 2.6, in DDM Buffer A(Tabella 1)utilizzando 5 mL/g di pellet di membrana.
- Omogeneizzare il campione rimescolato con un omogeneizzatore Dounce in vetro a 4 °C o se a temperatura ambiente assicurarsi di mettere sul ghiaccio subito dopo.
- Trasferire il campione in un tubo di polipropilene da 50 ml e aggiungere DDM e tampone DDM A aggiuntivo per portare il campione a una concentrazione finale del 2% di DDM.
- Agitare il campione per 2 ore a 4 °C.
- Caricare il campione in tubi ultracentrifugo e centrifuga per 1 h a 4 °C e 150.000 x g.
- Mentre il campione viene ultra-centrifugato, iniziare a preparare i 5 mL della colonna Ni-NTA lavandosi con 25 mL di tampone DDM A(tabella 1).
- Al termine dell'ultracentrifugazione, raccogliere il supernatante e caricarlo sulla colonna Ni-NTA da 5 ml a 4 °C con una portata di 0,5 mL/min utilizzando una pompa per siringhe.
- Lavare le linee FPLC con un DDM Buffer B + 0,05% DDM sufficiente (Tabella 1) per svuotare completamente il sistema e quindi collegare la colonna alla macchina FPLC.
- Lavare la colonna con 30 mL di DDM Buffer B + 0,05% DDM con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso attraverso.
- Lavare la colonna con 30 mL di DDM Buffer C + 0,05% DDM (Tabella 1) con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso.
- Elute la proteina con 20 mL di DDM Buffer D + 0,05% DDM (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere il flusso utilizzando un raccoglitore di frazioni e le frazioni ciascuna impostate su 1,0 mL.
- Selezionare le frazioni contenenti il picco di eluizione per la messa in comune e la concentrazione utilizzando un concentratore centrifugo e centrifugando a 4.000 x g e 4 °C fino a raggiungere i 500 μL.
- Utilizzando un loop da 500 μL caricare il campione nella macchina FPLC e quindi sulla colonna di esclusione delle dimensioni di 25 mL a 4 °C. Elute utilizzando 30 mL di DDM Buffer E + 0,05% DDM (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere come frazioni con le dimensioni delle frazioni impostate su 0,5 mL per frazione.
- Prendi le frazioni e misura la concentrazione proteica usando l'assorbanza di 280 nm per confermare la curva UV-Vis dal grafico di eluizione FPLC.
- Raccogliere 20 μL da ogni frazione campione che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC e sono stati confermati accurati con il test di assorbanza.
- Congelare il resto di tali frazioni di campione utilizzando azoto liquido o ghiaccio secco nelle aliquote desiderate e conservare campioni proteici a -80 °C.
- Eseguire un test di elettroforesi del gel SDS-PAGE come descritto in precedenza per controllare i campioni che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC.
6. Preparazione negativa della griglia di macchie
- Posizionare le griglie che verranno utilizzate per la preparazione del campione su uno scivolo di vetro avvolto in carta da filtro con il lato in carbonio rivolto verso l'alto.
- Posizionare lo scivolo di vetro con le griglie del microscopio elettronico nella camera di uno scaricatore di bagliore tra i due elettrodi e sostituire il coperchio di vetro assicurandosi che sia centrato e ben sigillato.
- Eseguire la macchina di scarico del bagliore e assicurarsi che la luce viola generata dal plasma sia visibile.
- Al termine della macchina, attendere che la camera abbia raggiunto la pressione atmosferica per rimuovere il coperchio di vetro e quindi riportare lo scivolo con le griglie sul banco dove verranno caricati i campioni su di essi.
- Regolare la concentrazione dei campioni di proteine purificate a circa 0,1 mg/mL diluendo il campione con il tampone appropriato o concentrandosi utilizzando un concentratore centrifugo.
- Caricare 3,5 μL di campione proteico sulla griglia di carbonio spessa 10 nm e attendere 1 minuto.
- Rimuovere il liquido dalla superficie della griglia EM con una carta da filtro.
- Lavare la superficie della griglia 3 volte captando 3 μL di goccioline d'acqua con la griglia e rimuovendo l'acqua dalla griglia con carta da filtro tra il prelievo di ogni goccia.
- Lavare la superficie della griglia 2 volte raccogliendo 3 goccioline di acetato di uranio fresco filtrato al 2% e rimuovere le soluzioni di lavaggio sulla griglia con carta da filtro tra il prelievo di ogni goccia.
- Macchiare la griglia con una goccia da 3 μL di acetato di uranio fresco filtrato al 2% per 1 min.
- Rimuovere la soluzione di acetato di uranio sulla superficie della griglia EM con carta da filtro e asciugare ad aria la griglia per almeno 1 minuto.
- Archiviare la griglia in una casella della griglia per l'uso successivo.
7. Imaging EM
- Caricare la griglia preparata nel supporto della griglia in un workbench sicuro.
- Preparare il microscopio posizionando i microscopi dewar in una scatola di polistirolo e riempire il dewar 3/4° pieno di azoto liquido.
- Verificare che il coperchio in gomma della finestra del microscopio lo copra e quindi caricare il dewar al microscopio posizionando i fili di rame nel dewar fino a quando non si adatta alla piattaforma.
- Riempire il resto del dewar con azoto liquido e posizionare un tappo sopra il dewar per coprirlo.
- Accendi l'alta tensione, condiziona il microscopio e attendi che il microscopio si il riscaldamento e stabilisca un livello di vuoto sicuro per l'uso.
- Una volta che il microscopio è pronto aprire la valvola a colonna e confermare che il fascio è presente rimuovendo il coperchio di gomma sulla finestra del microscopio.
- Controllare la stigmatizzazione del fascio diffondendosi in uscita regolando l'intensità del fascio. Se l'astigmatismo è presente, la trave avrà una forma ellittica mentre ci si allontana dalla traversa e la trave dovrebbe avere la stessa forma ovale su entrambi i lati.
- Regolare il binocolo del microscopio in modo che sia la giusta altezza e distanza secondo gli occhi dell'osservatore.
- Controllare il posizionamento del fascio per le modalitàRicerca , Messaa fuoco ed Esposizione pedalando in tutte e tre le modalità fino a quando la trave non è al centro in ciascuna di essi.
- Chiudere la valvola a colonna e procedere al caricamento del supporto della griglia nel microscopio elettronico.
- Regolare il microscopio in altezza eucentrica utilizzando la funzione wobbler dei microscopi e regolando il movimento dello stadio utilizzando l'asse Z fino a quando non vi è alcun movimento laterale del campione al centro.
- Utilizzando la modalità di ricerca a bassa dose al microscopio cercare nella griglia un'area desiderabile di ragionevole contrasto con le molecole campione presenti per concentrarsi sul campione.
- Concentrati sull'esempio in modalità Messa a fuoco usando una dimensione del passaggio elevata fino a quando il campione non viene visto e quindi riduci i passaggi per trovare il livello di messa a fuoco corretto.
- Azzerare e spegnere il fascio e quindi assicurarsi che il cuscinetto di gomma copra la finestra del microscopio.
- Utilizzando la modalità Esposizione prendere l'immagine dell'area della griglia desiderata per un'esposizione di 1 s a 62.000 volte l'ingrandimento e controllare l'immagine ottenuta.
- Al termine dell'imaging di una griglia, chiudere le valvole della colonna e rimuovere il supporto della griglia dalla colonna.
- Al termine dell'imaging, tutte le reti di interesse arrestano il microscopio spegnendo la potenza del filamento e rimuovendo il dewar dell'azoto liquido dal microscopio.
- Posizionare qualcosa per assorbire l'umidità sul supporto dove il dewar sedeva per catturare la condensa dalle bobine di rame del microscopio.
- Attivare la modalità Cryo Cycle e assicurarsi che la pompa turbo sia spenta.
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Representative Results
Utilizzando le procedure qui presentate, sono stati purificati campioni di tipo selvatico E. coli AcrB e AcrB-P223G mutante E. coli. I campioni sono stati quindi adsorbiti alle griglie di microscopia elettronica a macchia negativa di carbonio e macchiati usando acetato di uranile con il metodo di soffiatura laterale22. Le immagini delle macchie negative sono state raccolte usando la microscopia elettronica a trasmissione. L'immagine di macchia negativa per il campione di tipo selvatico AcrB purificato con DDM rivela una soluzione omogenea di particelle monodisperse con la proteina che mostra una struttura trimestrele trimerica ben definita (Figura 1A). Queste strutture trimeriche corrispondono al cromatogramma di esclusione delle dimensioni osservato quando vengono purificate (Figura complementare 1). In confronto, quando si osserva l'immagine di macchia negativa per il mutante AcrB-P223G, purificata anche con DDM, si può osservare una soluzione eterogenea di nanoparticelle polidisperse con una propensione all'aggregazione, ma nessun trimer nativo osservabile (Figura 1B). Questi risultati sono supportati anche dal profilo di eluizione osservato durante l'esecuzione della cromatografia ad esclusione delle dimensioni (Figura complementare 1). Per determinare se la mancanza di proteine dello stato trimerico per il mutante fosse dovuta al trattamento con detergente o solo alla mutazione destabilizzante di P223G, le proteine sono state purificate usando NCMNP1-1, uno dei polimeri attivi della membrana all'interno della libreria NCMN. L'immagine di macchia negativa per il campione di tipo selvatico AcrB purificato con NCMNP1-1, ancora una volta, rivela una soluzione omogenea di particelle monodisperse con la proteina che mostra una struttura trimestrele trimerica ben definita (Figura 1C). E proprio come con la purificazione DDM, quando il mutante AcrB-P223G viene purificato con NCMNP1-1 l'immagine della macchia negativa mostra una soluzione eterogenea di nanoparticelle polidisperse con una propensione all'aggregazione, ma nessun trimer nativo osservabile(Figura 1D). Per confermare ulteriormente che la mutazione P223G interrompe il trimer AcrB sulla membrana cellulare è stato selezionato un polimero diverso (NCMNP5-2) dalla libreria proprietaria di polimeri attivi a membrana NCMN. NCMNP5-2 può formare nanoparticelle di membrana cellulare native in dimensioni molto più grandi, permettendo così a più trimer AcrB di essere imageati in una singola particella di membrana cellulare nativa. Di conseguenza, è stato osservato che più trimer AcrB di tipo selvatico erano contenuti in singole particelle(figura 1E); tuttavia, non sono state osservate particelle trimer AcrB-P223G come quelle formate da AcrB di tipo selvatico, anche quando si osservano le grandi patch bistrato a membrana cellulare nativa (Figura 1F). Ciò suggerisce che AcrB-P223G non esiste come trimer sulla membrana cellulare come suggerito in precedenza21 e offre una spiegazione logica sul perché AcrB-P223G mostra un drammatico declino dell'attività quandoviene saggiato 16. Per confermare la purezza dei campioni e la presenza della proteina corretta, sono stati eseguiti gel di elettroforesi per tutti i campioni di proteine purificate. Le macchie risultanti hanno confermato la presenza di AcrB in tutti i campioni con purezza >95% e la posizione della macchia corrispondeva al peso molecolare previsto di AcrB (Figura 1G). I risultati del nostro studio non sono coerenti con il saggio FRET precedentemente descritto per quanto riguarda la determinazione dello stato oligomerico della proteina di membrana AcrB-P223G16. Utilizzando polimeri attivi a membrana e microscopia elettronica come descritto nel protocollo, lo stato oligomerico nativo della proteina era direttamente osservabile. Una determinazione più accurata di come i monomeri della proteina interagiscono tra loro richiederà la determinazione di strutture crio-EM ad alta risoluzione.
Figura 1: Macchie negative e immagini in gel di elettroforesi di costrutti AcrB purificati. (A) Immagine di macchia negativa scattata per il tipo jolly AcrB purificato con DDM. (B) Immagine di macchia negativa scattata per il costrutto proteico AcrB-P223G purificato con DDM. (C) Immagine di macchia negativa scattata per il tipo jolly AcrB purificato con NCMNP1-1. (D) Immagine di macchia negativa scattata per il costrutto AcrB-P223G purificato con NCMNP1-1. (E) Immagine di macchia negativa scattata per il tipo selvaggio AcrB purificato con NCMNP5-2 (la scatola rossa evidenzia alcune delle nanoparticelle trimer osservate nell'immagine). (F) Immagine di macchia negativa scattata per AcrB-P223G purificata con NCMNP5-2 (la scatola verde evidenzia una porzione delle macchie lipidiche catturate da NCMNP5-2 osservate nell'immagine). (G) Il gel SDS-PAGE viene eseguito utilizzando i prodotti finali delle purificazione di AcrB-P223G con DDM (Corsia 1), NCMNP1-1 (corsia2),(H)SDS-PAGE gel funzionano utilizzando i prodotti finali delle purificazione di AcrB-P223G con NCMNP5-2. (I) Ingrandire le feature evidenziate della figura 1E. (J) Ingrandire le feature evidenziate da F. Tutte le immagini di macchie negative nella figura 1 hanno la stessa barra di scala di 50 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer di purificazione DDM | Tamponi di purificazione dei polimeri | Tamponi per elettroforesi in gel | |||
| Buffer A | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer A | 50 mM HEPES, pH 8.4 | TAE Buffer | Base Tris da 40 mM |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| 5% glicerolo | 5% glicerolo | Acido acetico da 20 mM | |||
| 20 mM Imidazolo | 20 mM Imidazolo | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffer B | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer B | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Destaining Buffer | 40% di metanolo |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 10% acido acetico | |||
| 5% glicerolo | 5% glicerolo | ||||
| 40 mM Imidazolo | 40 mM Imidazolo | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffer C | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer C | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Gel impilamento | 1,5 M Tris pH 8,8 (0,63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrilammide/Bis (0,43 ml) | |||
| 5% glicerolo | 5% glicerolo | 10% SDS (0,025 ml) | |||
| 75 mM Imidazolo | 75 mM Imidazolo | 10% APS (0,025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (4 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,39 ml) | ||||
| Buffer D | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer D | 25 mM HEPES, pH 7,8 | 12% Gel di separazione | 1,5 M Tris pH 8,8 (1,3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrilammide/Bis (2 ml) | |||
| 5% glicerolo | 5% glicerolo | 10% SDS (0,05 ml) | |||
| 300 mM Imidazolo | 300 mM Imidazolo | 10% APS (0,05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (5 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,6 ml) | ||||
| Buffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0,1 mM TCEP | 0,1 mM TCEP | ||||
Tabella 1: Elenco dei tamponi di purificazione utilizzati per la cromatografia delle colonne e l'elettroforesi del gel.
Figura complementare 1: Profili di eluizione cromatografica ad esclusione di dimensioni. (A) Grafico sovrapposto dei due profili di eluizione osservati per gli esperimenti di cromatografia ad esclusione delle dimensioni effettuati durante la purificazione con DDM e tipo selvatico AcrB (arancione) e con DDM e il mutante AcrB-P223G (blu). (B) Profilo di calibrazione delle colonne per la colonna di esclusione delle dimensioni utilizzata per gli esperimenti DDM.
1: Tireoglobulina (Sig. 669 000), 2: Ferritina (Sig. 440 000), 3: Aldolasi (Sig. 158 000), 4: Conalbumin (Sig. 75 000), 5: Ovalbumin (Mr 44 000), 6: Anhydrase carbonica (Mr 29 000), 7: Ribonuclease A (Mr 13 700). Clicca qui per scaricare questa cifra.
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Discussion
Le interazioni proteina-proteina sono importanti per l'integrità della struttura e della funzione delle proteine di membrana. Sono stati sviluppati molti approcci per studiare le interazioni proteina-proteina. Rispetto alle proteine solubili, le proteine di membrana e i loro IPP sono più difficili da studiare a causa delle proprietà intrinseche uniche delle proteine di membrana. Questa difficoltà deriva principalmente dal requisito che le proteine di membrana siano incorporate in un ambiente bistrato lipidico nativo per la stabilità strutturale e la funzionalità. Questo diventa problematico perché per determinare le strutture ad alta risoluzione delle proteine devono essere estratte dalla membrana cellulare. FRET è stata una tecnologia popolare per indagare le interazioni proteina-proteina sulla membrana cellulare, tuttavia, la risoluzione è bassa e spesso produce falsi positivi17,18,19,20. Qui è dimostrato, per la prima volta, che gli NCMN possono essere utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina di membrana analizzando strutturalmente il trimer AcrB di tipo selvatico e il monomero AcrB-P223G sulla membrana cellulare nativa e confrontando i risultati con l'analisi precedente utilizzando FRET. Confrontando le immagini a particelle singole al microscopio elettronico di tipo selvaggio AcrB e AcrB-P223G, si suggerisce che la maggior parte dell'AcrB-P223G non forma tritori sulla membrana cellulare E.coli come la proteina AcrB di tipo selvatico quando purificata usando polimeri attivi a membrana, come NCMNP1-1 e NCMNP5-2. Proponiamo qui che i risultati dell'analisi FRET possano essere un falso positivo derivante dalla limitazione della risoluzione dell'approccio FRET. Il legame disolfuro artificiale che ha stabilizzato il trimer AcrB-P223G potrebbe anche essere un artefatto che si è verificato nellasoluzione 21. Le immagini di macchie negative suggeriscono che la mutazione P223G impediva la formazione del trimero AcrB e che la forma monomerica di AcrB non poteva rimanere nella stessa conformazione osservata nella sua forma trimerica. Il ciclo che contiene questa mutazione è stato precedentemente dimostrato essere assolutamente critico per la formazione del trimer attraverso l'analisi mutagena e strutturale, che ha mostrato che il suo significato strutturale è dovuto alle interazioni che ogni ciclo forma seppellendo nel vicino monomero AcrB23.
Utilizzando il sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per il rilevamento e l'analisi dell'interazione proteina-proteina si può rilevare direttamente lo stato oligomerico di una proteina mantenendo le proteine di membrana in un ambiente di membrana cellulare veramente nativo, che può essere utilizzato per ottenere informazioni strutturali ad alta risoluzione a livello atomico attraverso l'analisi crio-EM a singola particella del campione. Il sistema NCMN aiuta ad evitare i frequenti falsi positivi e falsi negativi osservati nel rilevamento PPI causati dal trattamento di campioni con detergenti24. Questi falsi risultati in genere sorgono, a causa dell'aggregazione, denaturazione del campione proteico, dissociazione di interazioni non covalenti e formazione di stati oligomerici artificiali causati dagli effetti di delipidazione dei detergenti. Inoltre, l'utilizzo dell'analisi strutturale in combinazione con gli NCMN fornisce ulteriori informazioni strutturali e consente l'osservazione diretta delle interazioni molecolari, che sono sia fondamentali per comprendere gli IPP che in genere perse quando si utilizzano metodi precedentemente stabiliti di rilevamento PPI. Questo metodo è stato utilizzato con successo per studi strutturali di tipo selvaggio AcrB e potrebbe avere un'ampia applicabilità ad altre forme di analisi strutturale, come la cristallografia a raggi X e la NMR allo stato solido, e molte proteine diverse utilizzate in altre ricerche che cercano di determinare le interazioni mostrate da nuovi bersagli proteici.
Al fine di ottenere risultati riproducibili con ragionevoli rese proteiche di elevata purezza ci sono diversi passaggi critici nel processo di purificazione con polimeri attivi a membrana che devono essere seguiti. Il primo passo critico è il processo di isolamento della membrana, quindi è fondamentale centrifugare il lisato cellulare a 15.000 x g e seguire questo passaggio con ultracentrifugazione a 215.000 x g per isolare veramente la membrana cellulare dal resto del lisato cellulare. Il prossimo passo critico è solubilizzare la frazione di membrana con polimeri attivi a membrana ad una concentrazione del 2,5% a temperatura ambiente per due ore. Sono stati effettuati esperimenti di ottimizzazione della purificazione e l'utilizzo di questi parametri in questa fase è stato dimostrato per garantire che la quantità ottimale di AcrB sia estratta dalla membrana e si verifichi una corretta formazione delle nanoparticelle della membrana cellulare nativa. La fase critica finale del processo di purificazione è il caricamento del campione sulla colonna Ni-NTA a temperatura ambiente. Ciò è necessario, perché i polimeri attivi a membrana sono più solubili a temperatura ambiente rispetto ai 4 °C, quindi il caricamento a temperatura ambiente aumenterà la quantità di legame proteico sulla colonna di affinità ed eviterà l'alta pressione causata dall'accumulo di polimeri insolubili che potrebbe potenzialmente danneggiare la colonna. Quasi altrettanto importanti per ottenere informazioni strutturali accurate sono i passaggi contenuti nella procedura di colorazione negativa di cui sopra. Gli aspetti più critici di questa procedura includono l'uso di griglie di carbonio holey spesse 10 nm, volumi di acqua e acetato di uranile e la durata dell'adsorbimento e della colorazione del campione. L'utilizzo di questi parametri chiave durante la preparazione del campione garantirà dati strutturali di qualità che possono essere utilizzati per una valutazione accurata degli stati oligomerici del campione che viene immaginato. Modifiche al protocollo di purificazione possono essere necessarie quando si utilizzano proteine diverse per risolvere i problemi che possono sorgere a causa delle caratteristiche uniche di vari polipeptidi. I fattori primari da considerare per modificare quando hanno difficoltà a ottenere una quantità adeguata di campione proteico dovrebbero essere i parametri utilizzati durante la fase di induzione, la quantità di frazione di membrana utilizzata nella fase di solubilizzazione e il periodo di tempo e temperatura per il processo di solubilizzazione. Se si verifica un problema di purezza, potrebbe essere necessario utilizzare colonne di affinità alternative, ad esempio una colonna di affinità alla biotina, invece di utilizzare la colonna Ni-NTA per la purificazione. Allo stesso modo, se è necessario mantenere interazioni proteina-proteina debole/transitoria, lo scambio della colonna Ni-NTA con una colonna di affinità tap-tag è vantaggioso per risultati ottimali. Infine, quando si studiano le proteine dei mammiferi, i sistemi di espressione dei mammiferi dovrebbero essere utilizzati per mantenere vere composizioni lipidiche della membrana cellulare nativa necessarie per una determinazione accurata dello stato oligomerico naturale della proteina. Ciò richiederà una revisione completa dell'espressione proteica e delle fasi di lisi cellulare di questo protocollo. In questi casi, dovrebbero essere seguiti protocolli precedentemente stabiliti per l'espressione proteica e la lisi cellulare che corrispondono al sistema di espressione necessario per la proteina bersaglio di interesse.
L'uso degli NCMN con microscopia elettronica mostra grandi vantaggi rispetto al FRET per l'uso nel rilevamento di IPP. Come dimostrano i risultati di questo studio, gli esperimenti FRET precedentemente effettuati non erano coerenti con l'analisi strutturale della struttura oligomerica della proteina mutante AcrB21. Ciò è stato chiaramente dimostrato e confermato direttamente dalle immagini scattate con microscopia elettronica a macchia negativa, che sono coerenti con la perdita di attività precedentemente descritta per il mutante AcrB-P223G16. Se L'AcrB-P223G formasse tritori in vivo, il polimero NCMNP5-2 li avrebbe catturati nelle grandi chiazze di membrana a cellule native che estrae. È possibile che l'analisi FRET dell'AcrB mutante abbia portato a un falso positivo a causa di una delle diverse limitazioni intrinseche ai processi fisici su cui si basa la tecnica e alla tecnologia utilizzata per misurare i trasferimenti di energia di risonanza fluorescente. Una delle principali limitazioni del FRET sono i limiti di risoluzione della microscopia confocale e questo porta a gravi limitazioni nelle distanze intermolecolari che possono essere risolte con i test FRET19. In confronto, l'utilizzo di NCMN in combinazione con la microscopia elettronica non è soggetto alla suddetta limitazione del FRET, con limiti di risoluzione significativamente più elevati rispetto a quelli della microscopia confocale. Sulla base di queste limitazioni che hanno potenziali effetti sui test FRET descritti in precedenza, riteniamo che il rilevamento errato di un trimer AcrB-P223G in vivo sia il risultato della limitazione a bassa risoluzione di FRET21. A parte i vantaggi rispetto al solo FRET sottolineato direttamente da questo articolo, l'utilizzo di NCMN in combinazione con la microscopia elettronica ha il vantaggio rispetto a tutte le attuali tecniche di interazione proteina-proteina, come il sistema Y2H e TAP-MS, in quanto può essere utilizzato per osservare le interazioni proteina-proteina in ambienti di membrana cellulare nativa direttamente in alta risoluzione e ha il potenziale per essere utilizzato per determinare le strutture proteiche a livello atomico.
Anche i polimeri attivi a membrana e la microscopia elettronica non sono senza limitazioni. Attualmente, il problema principale della purificazione NCMN è la sua minore efficienza di estrazione rispetto ai metodi a base di detergenti (i polimeri nella libreria NCMN mostrano ~ 70% l'efficienza di estrazione di DDM). Ha anche problemi di compatibilità con alcune colonne di affinità, come le colonne di associazione del maltosio. Inoltre, la purificazione NCMN non ha ancora molto successo con proteine o complessi di membrana altamente dinamici (dati inediti). L'utilizzo di polimeri attivi a membrana e microscopia elettronica per esperimenti di determinazione dello stato oligomerico richiede la rimozione delle proteine dall'ambiente delle cellule native, mentre il FRET viene effettuato in vivo. Tuttavia, le nanoparticelle formate da polimeri attivi a membrana consentono l'ambiente più nativo possibile quando si estraggono le proteine dalle cellule, per ridurre le potenziali imprecisioni derivate sperimentalmente note per essere causate dall'estrazione e dalla purificazione delle proteine. Inoltre, mentre la questione della risoluzione e delle dimensioni delle particelle come limitazione della microscopia elettronica a trasmissione è significativamente diminuita nell'ultimo decennio, i microscopi che vengono ancora utilizzati per l'analisi delle macchie negative saranno ancora relativamente limitati a molecole più grandi o complessi molecolari (>200 kDa) in quanto generalmente hanno un limite di informazioni di circa 0,1-0,3 nm25. SMALP ha anche dimostrato di essere altamente flessibile in termini di applicazioni, ma presenta limitazioni ancora maggiori rispetto agli NCMN. I nanodisci formati dalla SMA hanno un diametro massimo di circa 15 nm e quindi sono comunemente inefficaci per l'estrazione di proteine e complessi proteici che sono oltre 400 kDa26. Oltre a questa limitazione, SMA non è nemmeno in grado di lavorare con proteine che esistono in ambienti a basso pH o utilizzano ioni divalenti per scopi strutturali e funzionali. A causa del fatto che il meccanismo d'azione degli SMALP dipende dal pH, non può essere utilizzato con condizioni di pH basse e chelati ioni divalenti. Mentre i metodi SMILP e DIBMA hanno offerto promesse per quanto riguarda il superamento di queste limitazioni, la loro applicabilità a diverse proteine di insiemi è rimasta invisibile27,28. Gli NCMN cercano di superare queste limitazioni utilizzando l'analisi della relazione struttura-attività (SAR) per creare polimeri alternativi in grado di formare nanoparticelle più grandi, funzionando in condizioni di basso pH ed evitare di imbrogliare ioni divalenti. Uno di questi esempi di polimeri che sono stati sviluppati per NCMN è il polimero NCMNP5-2 che mostra la capacità di creare nanoparticelle più grandi come dimostrato nella figura 1E,F.
Oltre ai progressi precedentemente descritti nella tecnologia delle nanoparticelle, la direzione futura degli NCMN è nello sviluppo di polimeri attivi ancora più a membrana che daranno alla libreria di polimeri NCMN una maggiore efficienza di estrazione e la capacità di lavorare con proteine di tutte le diverse dimensioni della regione transmembrana, che funzionano a livelli di pH molto più ampi, o si basano su qualsiasi tipo di ione per il mantenimento della loro struttura e funzione. Ciò consentirà a tutti i ricercatori di proteine di membrana di utilizzare questa tecnologia nei loro esperimenti e di avere accesso a risultati più accurati e biologicamente rilevanti. Portando i vantaggi delle nanoparticelle polimeriche in una più ampia varietà di proteine, la speranza è che questo porti a risolvere strutture ad alta risoluzione di complessi proteici di membrana nativi a livello atomico e quindi determinare le interazioni atomiche intramolecolari che vanno nel mantenimento di questi complessi. Tali progressi consentirebbero anche molte nuove possibilità in termini di scoperta e sviluppo di farmaci proteici di membrana attraverso sforzi di progettazione di farmaci basati sulla struttura. L'utilizzo di tecniche di progettazione di farmaci a base di struttura per le proteine di membrana sarebbe un enorme beneficio per l'industria medica in quanto ciò aumenterebbe la specificità e l'efficacia del legame farmacologico al fine di ridurre gli effetti collaterali indesiderati e la quantità di composto necessaria per ottenere gli effetti terapeutici desiderati, rendendo così i farmaci che prendono di mira le proteine di membrana in modo significativamente più sicuro ed efficace. Il sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa è ancora nelle sue fasi di sviluppo, ma ha già dimostrato di essere incredibilmente potente consentendo per la prima volta lo studio delle proteine di membrana nei loro stati veramente nativi e illustrando le interazioni proteina-proteina native che si verificano sulla membrana cellulare.
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Disclosures
Y.G è elencato come inventore del polimero attivo a membrana NCMNP5-2 e sistema NCMN.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal fondo di avviamento VCU (a Y.G.) e dal National Institute Of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di premio R01GM132329 (a Y.G.) Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità. Ringraziamo Montserrat Samso e Kevin McRoberts per il loro generoso supporto per la registrazione video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
