Summary
여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.
Abstract
세포막 시스템에서 단백질 단백질 상호 작용은 세포간 상호 작용에서 신호 트랜스듀션에 이르기까지 광범위한 생물학적 프로세스에서 중요한 역할을 합니다. 환경 신호를 감지하는 것에서 생물학적 반응에 이르기까지; 신진 대사 조절에서 발달 제어에 이르기까지. 단백질-단백질 상호 작용의 정확한 구조 정보는 막 단백질 복합체의 분자 메커니즘을 이해하고 이러한 단백질을 조절하기 위해 매우 구체적인 분자의 설계에 매우 중요합니다. 생체 내 및 체외 접근법은 단백질 단백질 상호 작용의 검출 그리고 분석을 위해 개발되었습니다. 그 중 구조적 생물학 접근법은 원자 수준에서 단백질 단백질 상호 작용의 직접적인 구조적 정보를 제공할 수 있다는 점에서 독특합니다. 그러나, 현재 막 단백질 구조 생물학은 여전히 주로 세제 기반 방법으로 제한됩니다. 세제 기반 방법의 주요 단점은 그들의 네이티브 지질 이중층 환경이 세제 분자에 의해 제거되면 종종 해리 또는 변성 막 단백질 복합체이다. 우리는 막 단백질 구조 생물학을 위한 토착 세포막 나노입자 시스템을 개발하고 있습니다. 여기서, 우리는 AcrB의 올리고메황 상태의 사례 연구와 세포막에 단백질 단백질 상호 작용의 분석에 이 시스템의 사용을 보여줍니다.
Introduction
단백질 단백질 상호 작용 (PPI)은 단백질의 구조와 기능의 유지에서 전체 시스템의 조절에 이르기까지 생물학 전반에 걸쳐 중추적 인 역할을합니다. PPI는 다양한 형태로 제공되며 형성되는 상호 작용 유형에 따라 분류될 수 있습니다. 이러한 분류중 하나는 상호작용이 동일한 하위 단위 또는 하위 단위로 작용하는 다른 단백질 사이의 여부에 따라 호모올리고메릭 또는 이종성고름입니다. 또 다른 분류는 상호 작용이 안정적인 복합체 또는 일시적인 복잡한 상태의 형성으로 이어지는 경우 상호 작용의 강도를 기반으로합니다. 단백질 간의 PPI에 대한 구조적 정보는 단백질이 기능을 수행하는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 단백질의 80% 이상이 기능성 역할1을수행하기 위해 복잡한 형성에 의존하는 것으로 추정되고 있다. 생물학에서 그들의 중요성을 제대로 작동하기 위해 PPI에 의존하는 것으로 관찰된 단백질의 비율을 감안할 때, 그러나 이러한 상호 작용에 관여하는 단백질을 제대로 조사 할 수 있다는 것은 단백질이 PPI를 형성할 때 실험적으로 관찰할 수 있는 기술의 제한으로 인해 도전적인 남아 있다.
많은 실험적으로 결정된 PPI에 대한 결과 사이에 는 높은 수준의 노이즈, 거짓 긍정 및 현재 사용 가능한 PPI 결정 기술의 많은에서 파생된 거짓 네거티브로 인해 높은 수준의 불일치가 있습니다. 이는 특히 효모 2하이브리드(Y2H) 시스템, 탠덤 친화정화질량 분광법(TAP-MS), 및 형광공명에너지전달(FRET)에 대해 PPI 결정2,3,4,5,6,7에가장 일반적으로 사용되는 세 가지 방법을 나타낸다. 이에 비해, 핵자기공명(NMR), X선 결정학 및 전자 현미경검사(EM)와 같은 단백질 구조 생물학 기술은 단백질-단백질 상호작용에 대한 고해상도 구조 정보를 원자 수준으로 끌어올리고 목표 단백질에 대한 직접적인 시각적 확인을 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 현재 이용 가능한 비구조적 기반 PPI 결정 연구 기술(예를 들어, Y2H, TAP-MS 및 FRET)은 이러한 능력이 부족하고 단백질5사이의 약하고 일시적인 상호 작용을 식별하는 데 어려움을 겪습니다. 이러한 단점은 적절한 사분위 구조와 이종복합 조립체의 형성에 영향을 미치는 지질 환경의 추가 변수에 의해 추가된 복잡성으로 인해 멤브레인 단백질을 연구할 때 더욱 강화된다.
막 단백질은 프로테아메의 큰 부분을 구성하고 모든 살아있는 유기체 내에서 작동하는 적절한 세포에서 많은 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다. 멤브레인 단백질이 인간 게놈의 27%를 구성하고 모든 현재 약물 표적의 ~60%를 구성하는 것으로 추정되고 있음에도 불구하고 모든 발표된 단백질 구조의 ~2.2%를 구성하는 막 단백질에 대한 해결된 모델의 수에 큰 이상이 있다8,9,10. 구조적 정보의 가용성에 있는 불일치의 1 차적인 원인은 막 단백질 자체의 본질적인 속성에 있습니다. 열악한 용해도, 토착 구조 및 기능을 유지하기 위한 지질 환경과의 상호 작용에 대한 의존, 지질막 자체의 다양한 물리화학적 특성으로 인해 멤브레인 단백질은 이를 연구하기 위해 구조 생물학 기술을 구현할 때 상당한 문제를 계속 나타냅니다. 이러한 본질적인 특성 중 정확한 구조 정보를 얻는 데 가장 중요한 것은 자연적인 지질 환경과의 상호 작용이 기본 구조와 기능을 유지하는 요구 사항입니다. 지질환경은 멤테인의 개념(멤브레인과 단백질의 조합)이 멤테인의 개념과 기능의 구조 및 기능의 일체적인 부분으로, 막 단백질 구조 및기능(11)의기본 단위로 제안되었다. 지질 단백질 상호 작용의 중요성에도 불구하고 현재 사용 가능한 구조 기반 PPI 결정 기술은 종종 연구중인 단백질이 용해되거나 세제로 용해될 것을 요구합니다. 가혹한 세제에 노출은 단백질을 변성하거나 탈지때문에 거짓 긍정과 부정적인 원인이 될 수 있습니다, 이는 응집, 단백질의 거부, 비 공유 상호 작용의 해리, 인공 올리고머 상태의 형성을 유도할 수 있습니다. 본인의 골막 단백질의 정확한 측정을 위한 천연 지질 환경을 유지해야 하기 때문에, 이전에 보고된 스티렌 말레산 지질 입자(SMALP)13 방법에 기초하여 네이티브 세포막 나노입자 시스템(NCMNs)12를 개발하였다.
SMALP는 막 활성 폴리머로서 스티렌 남성산 합분자를 사용하여 막 단백질을 추출하고 용해시킵니다. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA)는 소수성 스티렌 폭정과 정반대의 성수성 남성산 폭정으로 인하여 독특한 수륙양용 폴리머입니다. pH 의존식메커니즘(14)에서세포막을 흡착, 불안정화 및 방해함으로써 나노입자를 형성한다. SMA의 이러한 기능적 활성은 막 단백질 추출 및 용윤화를 위한 세제 없는 시스템으로 활용할 수 있게 해줍니다. NCMN 시스템은 여러 측면에서 SMALP 시스템과 구별됩니다. NCMN 시스템의 가장 독특한 특징은 안정성과 네이티브 기능을 위해 다른 조건을 필요로 하는 많은 다른 멤브레인 단백질의 분리에 적합한 독특한 특성을 갖는 다수의 폴리머를 가진 멤브레인 활성 폴리머 라이브러리를 가지고 있다는 것입니다. NCMN 시스템은 또한 나노 입자를 제조할 때 SMALP 방법에 비해 다른 프로토콜을 갖는다. 이러한 예 중 하나는 NCMN이 고해상도 구조 결정에 대한 단일 단계 니켈 친화성 컬럼 정제를 사용한다는 것입니다. 이러한 상이한 프로토콜의 효과는 3.2 및 3.0 Å 극저온-EM AcrB 구조를 생성한 NCMNs 프로토콜을 비교할 때 관찰될 수 있으며, SMALP 방법을 이용한 유사한 연구와 함께 8.8 Å 해상도12,15에서극저온-EM AcrB 구조를 초래하였다. NCMN 시스템의 이러한 독특한 기능은 이전에 설립 된 SMALP 방법에 대한 개선이며 PPI 연구에 이상적인 후보입니다.
다중 약물 efflux 수송기 AcrB는 대장균12에서기능적 균질트리머로 존재한다. 돌연변이 분석은 AcrB 트리머의 안정성을 담당하는 루프에 위치한 단일 P223G 점 돌연변이가 트리머 상태를 불안정하게 하고, 제지 DDM으로 제조할 때 AcrB 단조량을 산출하는 것으로 제안되었으며, 이는 네이티브 블루 젤전광전지질(16)으로검출될 수 있다. 그러나, AcrB-P223G 돌연변이의 FRET 분석은 네이티브 세포막 지질 이중층 환경에서, 돌연변이 AcrB-P223G의 대다수가 여전히 트리머로 존재하고 야생 형 AcrB 및 AcrB-P223G 모두에 대한 발현 수준이 유사하다는 것을 건의했다. 그러나 FRET 분석 결과에도 불구하고, 돌연변이 수송기의 활동 분석은 야생 형16에비해 활동이 극적으로 감소하는 것으로 나타났다. FRET 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 분석을위해 널리 사용되고 있지만, 연구에 따르면17,18,19,20의거짓 긍정을 자주 줄 수 있는 것으로 나타났습니다.
최근에는 AcrB 트리머의 고해상도 극저온-EM 구조가 NCMNs12의사용을 통해 관련 토종 세포막 지질 이중층과 AcrB의 상호작용을 보여 주었다. 원칙적으로, NCMNs는 네이티브 세포막에서 발견되는 단백질-단백질 상호 작용의 분석을 위해 쉽게 활용될 수 있다. 본 시스템의 시험에서, 본래 세포막 나노입자 및 음의 염색 전자 현미경검사를 사용하여 AcrB-P223G의 올리고메황 상태를 직접 관찰하기 위한 실험이 수행되었다. 야생형 AcrB 나노입자와 비교하기 위해, NCMN 라이브러리에서 NCMNP1-1로 인덱싱된 동일한 멤브레인 활성 폴리머(SMA2000)를 사용했으며, NCMN라이브러리(12)에서발견되는 대체 폴리머의 고해상도 극저온-EM 구조 판정에 사용하였다. 이전에 보고된 결과에 기초하여, AcrB-P223G 돌연변이의 대다수가 트리메릭 네이티브 세포막나노입자(21)의형태로 존재할 것으로 예상되었다. 그러나, 야생형 AcrB로 관찰된 것과 같은 샘플에는 AcrB 트리머가 발견되지 않았다. 이것은 AcrB-P223G의 대다수가 이전에 제안된 대로 네이티브 세포막에 트리머를 형성하지 않는다는 것을 건의합니다.
여기서 우리는 NCMN을 사용하여 야생 형 대장균 AcrB와 비교하여 돌연변이 대장균 AcrB-P223G의 상세한 분석을 보고합니다. AcrB의 이 사례 연구는 NCMNs가 단백질 단백질 상호 작용 분석을 위한 좋은 시스템임을 시사합니다.
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Protocol
1. 단백질 발현
- BL21(DE3) pLysS 세포를 함유한 플라스미드에 특화된 항생제로 15mL의 접종을 접종하여 250rpm에서 37°C에서 밤새 50mL 튜브에서 플라스미드를 발현하는 AcrB를 함유하고 있다.
- 600nm(OD 600)에서 야간배양의 광학 밀도를 확인하고 2.0을 초과하여 있는지 확인하십시오.
- 5mL의 세포 배양을 플라스미드에 특이적 항생제를 함유하고 37°C에서 배양한 후 OD600=0.8까지흔들어 서 최종 농도가 1mM인 IPTG로 유도한다.
- 20°C에서 20시간 동안 흔들림을 수행합니다.
- 4°C및 4,000 x g에서15분 동안 원심분리를 사용하여 세포를 아래로 펠릿다운.
2. 세포 리시스 및 막 격리
- 완충A에서 셀 펠릿을 다시 일시중지(표 1, 다음의 정화 방식에 따라 DDM 버퍼 A 또는 NCMNs 버퍼 A를 사용)은 셀 펠릿의 매 20g당 80mL를 사용합니다.
- 4°C에서 유리 두스 균질화제를 사용하거나 실온에서 얼음에 즉시 넣어야 하는 경우, 재중단된 세포 펠릿을 균질화한다.
- 샘플을 얼음에 금속 비커로 옮기고 4°C 및 1,500bar의 고압 균질화로 하여 세포를 용인합니다.
- 균질화로 세포를 로드하고 3-4 주기 또는 lysate가 명확히하기 시작할 때까지 균질화기를 통과할 수 있도록하는 과정을 반복하십시오.
- 4°C에서 30분 동안 15,000 x g의 리세스유 원심분리기.
- 4°C에서 1시간 동안 215,000 x g에서 초원심분리기 튜브 및 원심분리기로 상피물을 수집하고 부하를 채취합니다.
- 상체를 버리고 초원심분리기 튜브에서 멤브레인 펠릿을 수집합니다. -80°C에 초과 멤브레인 펠릿을 보관하십시오.
3. 네이티브 세포막 나노 입자의 준비
- 10mL NCMNs 버퍼A(표 1)에서멤브레인 펠릿 1g을 재연한다.
- 20°C에서 유리 두스 균질화로 재중단된 세포막 샘플을 균질화한다.
- 일시 중단된 멤브레인 샘플을 50mL 폴리프로필렌 튜브로 이송하고 멤브레인 활성 폴리머 스톡 용액및 추가 NCMNs 버퍼 A를 추가하여 샘플을 2.5%(w/v) 멤브레인 활성 폴리머(NCMNP1-1 또는 NCMNP5-2)의 최종 농도로 이시료를 유도한다.
참고: 멤브레인 활성 폴리머의 스톡 솔루션은 이중 증류수로 이루어져야 하며 다양한 농도로 보관할 수 있지만 일반적으로 10%(w/v)로 유지될 수 있습니다. - 20°C에서 2시간 동안 샘플을 흔들어 주세요.
- 샘플을 초원심분리기에 적재하고 20°C에서 1시간 동안 150,000 x g에서 회전합니다.
- 샘플이 초원심분리되는 동안 NCMNs 버퍼 A의 25mL와 5mL Ni-NTA 컬럼을 평형하기 시작합니다.
- 초원심분리가 완료된 후 상체를 수집하고 주사기 펌프를 사용하여 0.5mL/min의 유량으로 실온에서 Ni-NTA 컬럼 5mL에 적재한다.
- 시스템을 완전히 플러시한 다음 열을 FPLC 기계에 연결하기에 충분한 NCMNs 버퍼 B(표 1)로빠른 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 라인을 세척하십시오.
- 1mL/분의 유량으로 30mL의 NCMN 버퍼 B로 컬럼을 세척하고 흐름을 수집합니다.
- 1mL/min의 유량으로 30mL의 NCMN 버퍼C(표 1)로컬럼을 세척하고 흐름을 수집합니다.
- NCMNs 버퍼D(표 1)의20mL를 유량으로 엘테우하고 분획 수집기와 각각 1.0mL로 설정된 분획을 사용하여 샘플을 수집한다.
- 단백질 샘플을 4°C에 저장합니다.
- FPLC 용출 그래프에서 관찰된 피크에 해당하는 샘플을 확인하기 위해 SDS-PAGE 젤 전기전도 분석방법을 실행합니다.
4. SDS 페이지 젤 전기 전광
- 주조 장치에 유리를 클램핑하여 주조 챔버를 준비합니다.
- 표 1에나열된 레시피에 따라 12% 분리 젤을 준비한다.
참고: TEMED가 첨가되면 젤이 빠르게 중합되므로 젤을 부어 줄 준비가 된 후에만 이 것을 추가합니다. - 젤을 붓고, 스태킹 젤을 위해 빗 바닥 아래 2cm를 둡다.
- 젤 의 상부를 100% 이소프로판올로 겹쳐서 거품을 제거하고 분리 젤이 중합될 때까지 기다립니다.
- 이소프로판올을 제거하고 증류수로 이소프로파놀의 흔적을 씻어내라.
- 표 1에나열된 레시피에 따라 스태킹 젤을 준비한다.
참고: TEMED가 첨가되면 젤이 빠르게 중합되므로 젤을 부어 줄 준비가 된 후에만 이 것을 추가합니다. - 스태킹 젤을 분리 젤 위에 붓습니다.
- 우물을 형성하고 스태킹 젤이 완전히 중합 될 때까지 기다립니다 챔버에 빗을 추가합니다.
- 젤에서 실행해야 하는 각 분획 샘플에 대해 1M DTT의 1 μL을 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.
- 각 튜브에 4배 로딩 버퍼7 μL을 추가합니다.
- 각 미세 원심 분리기 튜브에 젤에서 실행해야 하는 분획에서 20 μL의 샘플을 추가합니다.
- 샘플을 포함하는 튜브를 소용돌이.
- 3s용 탁상 미세원심분리기를 사용하여 샘플 튜브를 아래로 회전시키고 모든 샘플이 튜브 바닥으로 돌아왔는지 확인합니다.
- 12% 폴리아크릴아미드 젤 카세트를 제자리에 고정하고 트리스 아세테이트-EDTA(TAE)버퍼(표 1)로세포의 내부 및 외부 챔버를 채우어 젤 전기포고전지를 준비한다.
- 분자량 마커를 지침에 필요한 적절한 부피로 젤의 첫 번째 차선에 적재합니다.
- DTT및 적재 버퍼와 혼합된 각 튜브에서 샘플의 28 μL을 로드합니다.
- 전자전도 셀뚜껑을 상자 위에 놓고 뚜껑을 전원 공급 장치에 연결합니다.
- 전원 공급 장치를 켜고 100 V로 설정하고 20 분 동안 실행할 수 있습니다.
- 20분 후 전원 공급 전류를 140V로 늘리고 30-40분 동안 또는 로딩 버퍼 염료가 젤 카세트의 바닥에 도달할 때까지 계속 실행합니다.
- 전기 포진 얼룩을 완료 한 후 젤에 포함 된 단백질 밴드를 시각화 하는 젤을 염색 하 고 염색.
5. DDM을 이용한 단백질 정제
참고: 이러한 정제 공정을 수행하는 목적은 막 활성 중합체를 활용한 실험에 대한 제어 역할을 하는 것이다.
- 막 펠릿의 6-10 g를 다시 중단, 단계 에서 2.6, DDM 버퍼 A(표 1)막 펠릿의 5 mL/g를 사용 하 여.
- 4°C에서 유리 두스 균질화로 재중단 된 샘플을 균질화하거나 실온에서 즉시 얼음에 넣어해야합니다.
- 샘플을 50mL의 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 DDM 및 추가 DDM 버퍼 A를 추가하여 샘플을 2% DDM의 최종 농도로 가져옵니다.
- 4°C에서 2시간 동안 샘플을 흔들어 주세요.
- 샘플을 4°C 및 150,000 x g에서1시간 동안 초원심분리기 튜브 및 원심분리기에 적재합니다.
- 샘플이 초원심분리되는 동안 DDM 버퍼 A(표 1)의25 mL로 세척하여 Ni-NTA 컬럼의 5 mL을 준비하기 시작합니다.
- 초원심분리가 완료되면, 주사기 펌프를 사용하여 0.5mL/min의 유량으로 4°C에서 5mL Ni-NTA 컬럼에 상체를 수집하고 적재한다.
- 충분한 DDM 버퍼 B + 0.05 % DDM(표 1)로FPLC 라인을 세척하여 시스템을 완전히 플러시한 다음 열을 FPLC 기계에 연결합니다.
- 30mL의 DDM 버퍼 B + 0.05% DDM으로 컬럼을 1mL/min의 유량으로 세척하고 흐름을 수집합니다.
- 30mL의 DDM 버퍼 C + 0.05% DDM(표1)으로컬럼을 1mL/min의 유량으로 세척하고 흐름을 수집합니다.
- 20mL의 DDM 버퍼 D + 0.05% DDM(표1)을0.5mL/min의 유량으로 단백질을 엘테우트하고 분수 수집기를 사용하여 흐름을 수집하고 각 분획체와 분획을 각각 1.0 mL로 설정한다.
- 500 μL에 도달할 때까지 원심 농축기 및 원심 농축기를 4,000 x g 및 4°C에서 원심 기류를 사용하여 풀링 및 농축을 위해 용출 피크를 포함하는 분획을 선택합니다.
- 500 μL 루프를 사용하여 샘플을 FPLC 기계에 로드한 다음 4°C에서 25mL 크기 배제 열에 로드합니다. Elute는 30mL의 DDM 버퍼 E + 0.05% DDM(표1)을0.5mL/min의 유량으로 사용하고 분획당 0.5mL로 설정된 분획 크기로 분수 크기로 분수로 수집합니다.
- 280nm 흡광도를 사용하여 분획을 취하고 단백질 농도를 측정하여 FPLC 용출 그래프에서 UV-Vis 곡선을 확인합니다.
- FPLC 용출 그래프에서 관찰된 피크에 해당하는 각 샘플 분획에서 20 μL을 수집하고 흡광도 테스트에 정확하도록 확인하였다.
- 원하는 알리쿼트에 액체 질소 또는 드라이 아이스를 사용하여 그 샘플 분획의 나머지부분을 동결하고 -80 °C에서 단백질 샘플을 저장합니다.
- 이전에 설명된 대로 SDS-PAGE 젤 전기전도 분석체를 실행하여 FPLC 용출 그래프에서 관찰된 피크에 해당하는 샘플을 확인합니다.
6. 네거티브 얼룩 그리드 준비
- 탄소면이 위를 향하도록 필터 용지에 싸인 유리 슬라이드에 샘플 준비에 사용될 그리드를 놓습니다.
- 전자 현미경 그리드와 유리 슬라이드를 두 전극 사이에 광선 방전기의 챔버에 넣고 유리 뚜껑을 교체하여 중앙에 있고 잘 밀봉되었는지 확인합니다.
- 광선 방전 기계를 실행하고 플라즈마에 의해 생성 된 보라색 빛이 볼 수 있는지 확인합니다.
- 기계가 실행되면 챔버가 대기압에 도달하여 유리 뚜껑을 제거한 다음 그리드로 슬라이드를 다시 벤치로 돌려보내 샘플이 해당 에 로드될 때까지 기다립니다.
- 정제된 단백질 시료의 농도를 적절한 완충제로 희석하거나 원심 농축기를 사용하여 집중하여 약 0.1 mg/mL로 조정한다.
- 단백질 샘플의 3.5 μL을 10nm 두께의 탄소 그리드에 적재하고 1분 동안 기다립니다.
- 필터 용지로 EM 그리드 표면에서 액체를 제거합니다.
- 그리드로 3 μL 물방울을 집어 들고 각 액자를 집어 들기 사이에 필터 종이로 그리드에서 물을 제거하여 그리드 표면을 3배 세척합니다.
- 그리드 표면을 2x에 세척하여 3μL 의 신선하고 여과된 2% 우라늄 아세테이트를 집어 들고 각 액적을 집어 들기 사이에 필터 용지로 그리드의 세척 솔루션을 제거합니다.
- 1 분 동안 신선한, 필터링 2 % 우라늄 아세테이트의 3 μL 방울그리드 얼룩.
- 필터 용지로 EM 그리드 표면의 우라늄 아세테이트 용액을 제거하고 공기가 그리드를 최소 1분 동안 건조시합니다.
- 나중에 사용할 수 있는 그리드 상자에 그리드를 저장합니다.
7. EM 이미징
- 준비된 그리드를 안전한 작업벤치에서 그리드 홀더에 로드합니다.
- 현미경을 폴리스티렌 상자에 분해하여 현미경을 준비하고 액체 질소의 전체 분해 3/4을 채웁니다.
- 현미경 창의 고무 덮개가 그것을 덮고 있는지 확인한 다음 플랫폼에 맞을 때까지 구리 와이어를 탈전쟁에 배치하여 현미경에 탈장하는 것을 확인합니다.
- 데워의 나머지 부분을 액체 질소로 채우고 그것을 덮기 위해 데워 위에 캡을 놓습니다.
- 높은 장력을 켜고 현미경을 조건으로 하며 현미경이 워밍업되어 사용하기 위한 안전한 진공 수준을 확립할 때까지 기다립니다.
- 현미경이 준비되면 컬럼 밸브를 열고 현미경 창에 고무 커버를 제거하여 빔이 존재하는지 확인합니다.
- 빔의 강도를 조정하여 빔 의 강도를 배분하여 빔 낙인을 확인하십시오. 난시가 존재하는 경우 빔은 교차에서 멀리 이동하고 빔은 양쪽에 동일한 타원형 모양이어야할 때 타원형 모양을해야합니다.
- 현미경 쌍안경을 관찰자의 눈에 따라 올바른 높이와 거리로 조정합니다.
- 빔이 각각 중심이 될 때까지 세 가지 모드를 모두 순환하여 검색, 초점및 노출 모드를 위한 빔 위치를 확인합니다.
- 컬럼 밸브를 닫고 그리드 홀더를 전자 현미경에 로드합니다.
- 현미경을 사용하여 현미경을 우심 높이로 조정하고 중앙에 있는 샘플의 좌우 움직임이 없을 때까지 Z축을 사용하여 단계의 움직임을 조정한다.
- 현미경에 저용량 검색 모드를 사용하여 샘플에 초점을 맞출 존재하는 샘플 분자와 합리적인 대조의 바람직한 영역에 대한 그리드를 검색합니다.
- 샘플이 보일 때까지 높은 단계 크기를 사용하여 Focus 모드의 샘플에 초점을 맞춘 다음 단계를 줄여 올바른 초점 수준을 찾습니다.
- 0 및 빔을 블랭크 한 다음 고무 패드가 현미경 창을 덮고 있는지 확인하십시오.
- 노출 모드를 사용하여 원하는 그리드 영역의 이미지를 사용하여 62,000배배율로 1s 노출을 하고 획득한 이미지를 확인합니다.
- 이미징을 수행하면 그리드가 컬럼 밸브를 닫고 기둥에서 그리드 홀더를 제거합니다.
- 이미징을 완료하면 관심의 모든 그리드가 필라멘트 전력을 끄고 현미경에서 액체 질소 분해를 제거하여 현미경을 종료합니다.
- 현미경의 구리 코일에서 응축을 잡기 위해 데워가 앉아 스탠드에 수분을 흡수할 수 있는 무언가를 놓습니다.
- Cryo 주기 모드를 활성화하고 터보 펌프가 꺼져 있는지 확인합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 절차를 사용하여 대장균 AcrB 야생형 과 대장균 돌연변이 AcrB-P223G 샘플을 정제하였다. 샘플은 그 때 탄소 음성 얼룩 전자 현미경 검사기격자에 흡착하고 측면 블로팅방법(22)을가진 우란 아세테이트를 사용하여 염색하였다. 음의 얼룩 이미지는 투과 전자 현미경 검사를 사용하여 수집되었다. DDM으로 정제된 AcrB 야생형 시료에 대한 음의 얼룩 이미지는 단백질이 잘 정의된 트리메황 사분위 구조를 나타내는 단백질을 가진 단분산 입자의 균일한 용액을나타낸다(도 1A). 이러한 트리메릭 구조는 정제시 관찰된 크기 배제 크로마토그램에대응한다(보충도 1). 이에 비해, AcrB-P223G 돌연변이에 대한 네거티브 얼룩 영상을 볼 때, DDM으로 정제된, 다분산 나노입자의 이질적 용액을 관찰할 수 있으나 관찰가능한 네이티브 트리머(그림1B). 이러한 결과는 또한 크기 배제 크로마토그래피를 수행할 때 관찰된 용출 프로파일에 의해지원된다(보충도 도 1). 돌연변이에 대한 트리메릭 상태 단백질의 부족이 세제로 처리되었기 때문인지 또는 P223G의 불안정한 돌연변이에 의해서만 발생했는지 를 확인하기 위해 단백질은 NCMN 라이브러리 내의 막 활성 폴리머 중 하나인 NCMNP1-1을 사용하여 정제되었다. NCMNP1-1로 정제된 AcrB 야생형 시료에 대한 음의 얼룩 이미지는, 다시, 잘 정의된 트리메릭 사분위구조를 나타내는 단백질을 가진 단분산 입자의 균질한 용액을나타낸다(도 1C). 그리고 DDM 정화와 마찬가지로, AcrB-P223G 돌연변이가 NCMNP1-1로 정제될 때 부정적인 얼룩 이미지는 응집성을 향한 성향을 가진 다분산 나노 입자의 이질적인 용액을 나타내지만 관찰 가능한 네이티브 트리머(그림1D). P223G 돌연변이가 세포막상에 있는 AcrB 트리머를 방해하는지 확인하기 위해 상이한 폴리머(NCMNP5-2)를 독점 NCMNs 멤브레인 활성 폴리머 라이브러리로부터 선택하였다. NCMNP5-2는 훨씬 더 큰 크기의 네이티브 세포막 나노입자를 형성할 수 있으므로 여러 AcrB 트리머가 단일 네이티브 세포막 입자에서 심영상될 수 있습니다. 그 결과, 다중 야생형 AcrB 트리머가 단일입자(도 1E)에포함된 것으로 관찰되었다. 그러나, 야생형 AcrB에 의해 형성된 것과 같은 AcrB-P223G 트리머 입자는 대형 토종 세포막 이중층패치(도 1F)를볼 때에도 관찰되지 않았다. 이는 AcrB-P223G가 이전에 제안된 바와 같이 세포막에 트리머로 존재하지 않는다는 것을시사하며, AcrB-P223G가16을분석했을 때 활동이 급격히 감소하는 이유에 대한 논리적 설명을 제공한다. 시료의 순도와 올바른 단백질의 존재를 확인하기 위해, 전기 전광젤은 모든 정제된 단백질 샘플을 위해 실행되었다. 결과 얼룩은 AcrB의 예측 된 분자량에 대응하는 >95 % 순도와 얼룩의 위치와 모든 샘플에서 AcrB의 존재를 확인(도 1G). 우리의 연구 결과에서 결과는 막 단백질 AcrB-P223G16의올리고메릭 상태를 결정하는 것과 관련하여 이전에 설명된 FRET 분석과 일치하지 않는다. 프로토콜에 기재된 바와 같이 멤브레인 활성 폴리머 및 전자 현미경검사를 활용함으로써 단백질의 토착 올리고머 상태를 직접 관찰할 수 있었다. 단백질의 단백제가 서로 상호 작용하는 방식에 대한 보다 정확한 결정은 고해상도 저온-EM 구조의 결정이 필요합니다.
그림 1: 정제된 AcrB 구조의 음수 얼룩 및 전기 전구 겔 이미지. (A)DDM으로 정제된 야생형 AcrB용 네거티브 얼룩 이미지. (B)DDM으로 정제된 AcrB-P223G 단백질 구조를 위해 촬영한 네거티브 얼룩 이미지. (C)NCMNP1-1로 정제된 야생형 AcrB용 네거티브 얼룩 이미지. (D)NCMNP1-1로 정제된 AcrB-P223G 구조에 대해 촬영한 네거티브 얼룩 이미지. (E)NCMNP5-2로 정제된 야생형 AcrB용 네거티브 얼룩 이미지(빨간색 상자는 이미지에서 관찰된 트리머 나노입자 의 일부를 강조). (F)NCMNP5-2로 정제된 AcrB-P223G용 네거티브 얼룩 이미지(그린 박스는 이미지에서 관찰된 NCMNP5-2에 의해 캡처된 지질 패치의 일부를 강조한다). (G)SDS-PAGE 젤은 DDM(레인 1), NCMNP1-1(레인2),(H)SDS-PAGE 젤이 NCMNP5-2를 이용한 AcrB-P223G의 정제로부터 최종 제품을 사용하여 실행되는 AcrB-P223G의 정제로부터 최종 제품을 이용하여 실행된다. (I)도 1E에서 강조 표시된 피쳐를 확대합니다.(J)F에서 강조 표시된 피쳐의 확대. 도 1의 모든 음수 얼룩 이미지는 50 nm의 동일한 스케일 막대를 가지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| DDM 정화 버퍼 | 폴리머 정화 버퍼 | 젤 전기 전도 버퍼 | |||
| 버퍼 A | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN 버퍼 A | 50 mM 헤페, pH 8.4 | TAE 버퍼 | 40 mM 트리스 베이스 |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| 5% 글리세롤 | 5% 글리세롤 | 20 mM 아세트산 | |||
| 20 mM 이미다졸 | 20 mM 이미다졸 | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0.1 mM TCEP | ||||
| 0.1 mM TCEP | |||||
| 버퍼 B | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN 버퍼 B | 25 mM 헤페, pH 7.8 | 디스테인링 버퍼 | 40% 메탄올 |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 10% 아세트산 | |||
| 5% 글리세롤 | 5% 글리세롤 | ||||
| 40 mM 이미다졸 | 40 mM 이미다졸 | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0.1 mM TCEP | ||||
| 0.1 mM TCEP | |||||
| 버퍼 C | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN 버퍼 C | 25 mM 헤페, pH 7.8 | 스태킹 젤 | 1.5 M 트라이 pH 8.8 (0.63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 아크릴아미드/비스 30% 아크릴아미드/비스 (0.43 ml) | |||
| 5% 글리세롤 | 5% 글리세롤 | SDS 10% (0.025 ml) | |||
| 75 mM 이미다졸 | 75 mM 이미다졸 | 10% APS (0.025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0.1 mM TCEP | TEMED (4 μl) | |||
| 0.1 mM TCEP | H2O (1.39 ml) | ||||
| 버퍼 D | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN 버퍼 D | 25 mM 헤페, pH 7.8 | 12% 분리 젤 | 1.5 M 트라이 pH 8.8 (1.3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 아크릴아미드/비스 30% 아크릴아미드/비스 (2ml) | |||
| 5% 글리세롤 | 5% 글리세롤 | SDS 10% (0.05 ml) | |||
| 300 mM 이미다졸 | 300 mM 이미다졸 | 10% APS (0.05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0.1 mM TCEP | TEMED (5 μl) | |||
| 0.1 mM TCEP | H2O (1.6 ml) | ||||
| 버퍼 E | 40 mM 헤페, pH 7.8 | NCMN 버퍼 E | 40 mM 헤페, pH 7.8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0.1 mM TCEP | 0.1 mM TCEP | ||||
표 1: 열 크로마토그래피 및 겔 전기포광에 사용되는 정제 버퍼 목록.
보충 도 1: 크기 제외 크로마토그래피 용출 프로파일. (A)DDM 및 야생형 AcrB(orange)와 DDM 및 돌연변이 AcrB-P223G(blue)로 정화할 때 수행된 크기 배제 크로마토그래피 실험을 위해 관찰된 두 용출 프로파일의 오버레이 그래프. (B)DDM 실험에 사용되는 크기 배제 열에 대한 컬럼 보정 프로파일.
1: 티로글로불린 (미스터 669 000), 2: 페리틴 (미스터 440 000), 3: 알돌라세 (미스터 158 000), 4: 콘알란인 (미스터 75 000), 5: 오팔린 (미스터 44 000), 6: 카보닉 안수드라제 (Mr 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 미스터 리벨리스 (미스터 29 000), 73 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단백질 단백질 상호 작용은 막 단백질의 구조와 기능의 무결성에 중요합니다. 많은 접근은 단백질 단백질 상호 작용을 조사하기 위하여 개발되었습니다. 수용성 단백질과 비교할 때 막 단백질과 PPI는 막 단백질의 독특한 본질적인 특성으로 인해 연구하기가 더 어렵습니다. 이 어려움은 주로 구조적 안정성과 기능을 위해 토착 지질 이중층 환경에 내장될 막 단백질의 요구 사항에서 비롯됩니다. 단백질의 고해상도 구조를 결정하기 위해서는 세포막에서 추출해야 하기 때문에 문제가 됩니다. FRET는 세포막에 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 인기있는 기술이지만, 해상도가 낮고 자주 거짓 긍정17,18,19,20을생성한다. 여기서 처음으로 NCMN은 네이티브 세포막에서 야생형 AcrB 트리머 및 AcrB-P223G 단조근을 구조적으로 분석하고 FRET를 이용한 이전 분석과 결과를 비교하여 멤브레인 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 야생형 AcrB 및 AcrB-P223G의 전자 현미경 단일 입자 이미지를 비교하여, AcrB-P223G의 대다수가 NCMNP1-1 및 NCMNP5-2와 같은 막 활성 폴리머를 사용하여 정화될 때 야생형 AcrB 단백질과 같은 대장균 세포막에 트리머를 형성하지 않는 것이 좋습니다. FRET 분석의 결과는 FRET 접근법의 해상도 제한으로 인한 잘못된 긍정일 수 있음을 여기에서 제안합니다. AcrB-P223G 트리머를 안정화시킨 인공 디황화물 결합은 용액21에서발생한 유물일 수도 있다. 부정적인 얼룩 이미지는 P223G 돌연변이가 AcrB 트리머의 형성을 방지하고 AcrB의 단황 형태가 트리메릭 형태로 관찰 된 동일한 형태로 유지 될 수 없다는 것을 시사한다. 이 돌연변이를 포함하는 루프는 이전에 돌연변이 및 구조 분석을 통해 트리머의 형성에 절대적으로 중요한 것으로 나타났으며, 이는 인접한 AcrB단조량(23)에묻어 각 루프 형태의 상호 작용에 기인하는 구조적 중요성을 보여주었다.
단백질-단백질 상호 작용 검출 및 분석을 위한 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하여 막 단백질을 진정으로 네이티브 세포막 환경에서 유지함으로써 단백질의 올리고메황 상태를 직접 검출할 수 있으며, 이는 샘플의 단일 입자 극저온-EM 분석을 통해 원자 수준에서 고해상도 구조 정보를 얻는 데 사용될 수 있다. NCMN 시스템은세제(24)로샘플을 치료하여 PPI 검출에서 관찰되는 빈번한 거짓 긍정 및 거짓 네거티브를 방지하는 데 도움이 된다. 이러한 거짓 결과는 전형적으로 단백질 샘플의 응집, 거부, 비 공유 상호 작용의 해리 및 세제의 탈지 효과로 인한 인공 올리고메릭 상태의 형성으로 인해 발생합니다. 또한 NCMN과 함께 구조 분석을 사용하면 추가적인 구조적 정보를 제공하고 이전에 확립된 PPI 검출 방법을 활용할 때 PPI를 이해하는 데 중요하며 일반적으로 손실되는 분자 상호 작용을 직접 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 야생 형 AcrB의 구조 연구에 성공적으로 사용되었으며 X 선 결정학 및 고체 상태 NMR과 같은 다른 형태의 구조적 분석에 광범위한 적용 성을 가질 수 있으며 새로운 단백질 표적에 의해 표시되는 상호 작용을 결정하기 위해 다른 연구에서 많이 사용되는 단백질이 많이 사용됩니다.
고순도의 합리적인 단백질 수율로 재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 따라야 할 멤브레인 활성 폴리머를 사용하여 정화 공정에서 몇 가지 중요한 단계가 있다. 첫 번째 중요한 단계는 막 격리 의 과정이며, 따라서 15,000 x g에서 세포 용액을 원심 분리하고 215,000 x g에서 초원심 분리로이 단계를 따라 세포 의 나머지 부분에서 세포 막을 진정으로 분리하는 것이 중요합니다. 다음 중요한 단계는 2시간 동안 실온에서 2.5%의 농도로 멤브레인 활성 폴리머로 멤브레인 분획을 용해시키는 것입니다. 정화의 최적화 실험은 이러한 단계에서 이러한 파라미터를 활용하여 본래의 멤브레인으로부터 최적의 양의 AcrB가 추출되고 토종 세포막 나노입자의 적절한 형성이 발생하는지 확인하는 것으로 나타났다. 정화 공정의 마지막 중요한 단계는 실온에서 Ni-NTA 컬럼에 샘플을 적재하는 것입니다. 이는 멤브레인 활성 폴리머가 4°C보다 실온에서 더 용해되기 때문에, 따라서 실온에서 적재하면 친화성 컬럼에 결합하는 단백질 의 양을 증가시키고 잠재적으로 열을 손상시킬 수 있는 불용성 폴리머 축적으로 인한 고압을 피할 수 있기 때문이다. 정확한 구조 정보를 얻는 데 거의 똑같이 중요한 것은 위에서 언급한 부정적인 염색 절차에 포함된 단계입니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 10 nm 두께의 구멍이 많은 카본 그리드, 물 및 우라일 아세테이트의 양 및 샘플 흡착 및 염색에 대한 시간의 길이를 포함한다. 샘플 준비 중에 이러한 주요 매개 변수를 활용하면 이미지화되는 샘플의 올리고메릭 상태를 정확하게 평가하는 데 사용할 수 있는 품질 구조 데이터를 보장합니다. 다양한 폴리펩티드의 고유한 특성으로 인해 발생할 수 있는 문제를 해결하기 위해 상이한 단백질을 사용할 때 정제 프로토콜에 대한 수정이 필요할 수 있다. 적절한 양의 단백질 시료를 얻는 데 어려움을 가질 때 수정을 고려하는 주요 요인은 유도 단계에서 사용되는 파라미터, 용해화 단계에서 사용되는 멤브레인 분획의 양 및 용해화 공정에 대한 시간 및 온도의 길이여야 한다. 순도에 문제가 있는 경우 정제를 위해 Ni-NTA 컬럼을 사용하는 대신 비오틴 친화성 컬럼과 같은 대체 친화성 컬럼을 활용해야 할 수도 있다. 마찬가지로, 약한/과도 단백질 상호 작용의 유지 보수가 필요한 경우, TAP 태그 친화성 컬럼에 대한 Ni-NTA 컬럼을 교환하는 것이 최적의 결과에 유익합니다. 마지막으로, 포유류 단백질을 연구할 때, 포유류 발현 시스템은 단백질의 자연적인 올리고메황 상태의 정확한 측정을 위해 필요한 진정한 토착 세포막 지질 조성물을 유지하기 위하여 이용되어야 합니다. 이것은 이 프로토콜의 단백질 발현 및 세포 lysis 단계를 완전히 개정하는 것을 요구할 것입니다. 이러한 경우, 관심있는 표적 단백질에 필요한 발현 시스템에 해당하는 단백질 발현 및 세포 용해에 대한 이전에 확립 된 프로토콜을 따라야한다.
전자 현미경 검사법을 가진 NCM의 사용은 PPI의 검출에 사용하기 위한 FRET에 비교될 때 큰 이점을 표시합니다. 본 연구의 결과에서 알 수 있듯이, 이전에 수행된 FRET 실험은 AcrB 돌연변이단백질(21)의올리고메릭 구조의 구조적 분석과 일치하지 않았다. 이는 돌연변이 AcrB-P223G16에대한 이전에 설명된 활성 손실과 일치하는 음의 얼룩 전자 현미경으로 촬영한 이미지에 의해 명확하게 표시되고 직접 확인되었다. AcrB-P223G가 생체 내에서 트리머를 형성했다면 NCMNP5-2 폴리머는 큰 네이티브 세포막 패치에서 이를 발견했을 것이다. 돌연변이 AcrB의 FRET 분석은 기술이 의존하는 물리적 프로세스에 본질적인 몇 가지 제한 중 어느 한 가지 제한사항과 형광 공명 에너지 전달을 측정하는 데 사용되는 기술로 인해 거짓 양성을 초래할 수 있습니다. FRET의 한 가지 주요 제한은 공초점 현미경 검사법의 해상도 한계이며, 이것은 FRET분석19로해결될 수 있는 분자 간 거리에서 심각한 한계로 이어집니다. 이에 비해, 전자 현미경 검사법과 함께 NCMN을 활용하는 것은 앞서 언급한 FRET 제한의 적용을 받지 않으며, 공초점 현미경 검사법과 비교할 때 해상도가 현저히 높다. 이전에 설명된 FRET 분석서에 잠재적인 영향을 미치는 이러한 제한에 기초하여, 우리는 생체 내에서 AcrB-P223G 트리머의 잘못된 검출이 FRET21의낮은 해상도 제한에서 비롯된 것을 양세합니다. 이 논문에서 직접 지적한 FRET에 비해 이점을 제외하고, 전자 현미경검사법과 함께 NCMN을 사용하는 것은 Y2H 시스템 및 TAP-MS와 같은 모든 현재 단백질 단백질 상호 작용 기술에 비해 장점이 있으며, 이는 고해상도로 네이티브 세포막 환경에서 단백질-단백질 상호 작용을 직접 관찰하는 데 사용될 수 있으며 원자 수준에서 단백질 구조를 결정하는 데 사용될 가능성이 있다는 점에서 장점이 있다.
멤브레인 활성 폴리머 및 전자 현미경 검사법은 제한없이 없습니다. 현재 NCMN 정화의 주요 문제점은 세제 기반 방법(NCMN 라이브러리 디스플레이의 폴리머 ~70%DDM의 추출 효율)과 비교할 때 추출 효율이 낮다는 것이다. 또한 말토스 바인딩 열과 같은 일부 친화성 열과의 호환성 문제가 있습니다. 더욱이, NCMN 정제는 고동적인 막 단백질 또는 복합체(공개된 데이터)로 는 여전히 성공적이지 않습니다. 올리고메황 상태 결정 실험을 위한 막 활성 폴리머 및 전자 현미경 검사를 활용하려면 기본 세포 환경에서 단백질을 제거해야 하는 반면 FRET는 생체 내에서 수행됩니다. 그러나 막 활성 폴리머에 의해 형성된 나노입자는 세포로부터 단백질을 추출할 때 가능한 가장 원토종같은 환경을 허용하며, 단백질 추출 및 정제에 의해 유발되는 것으로 알려진 실험적으로 파생된 부정확성을 감소시킵니다. 또한, 전염 전자 현미경검사의 한계로서 분해능 및 입자 크기 문제는 지난 10년 동안 현저히 감소했지만, 여전히 음극분석에 사용되고 있는 현미경은 여전히 더 큰 분자 또는 분자 복합체(>200 kDa)로 비교적 제한될 것이고, 일반적으로 약 0.1-0.3nm25의정보 한계를 가지고 있기 때문에. SMALP는 또한 응용 프로그램 측면에서 매우 유연하지만 NCMN보다 더 큰 한계를 표시합니다. SMA에 의해 형성된 나노 디스크는 약 15nm의 최대 직경을 가지므로 일반적으로 400 kDa26이상인 단백질 및 단백질 복합체를 추출하는 데 효과적이지 않습니다. 이러한 제한 이외에, SMA는 또한 낮은 pH 환경에 존재하는 단백질과 함께 작동하거나 구조적 및 기능적 목적을 위해 이온을 활용할 수 없습니다. pH 의존적인 SMALPs 작용 메커니즘으로 인해 pH 조건이 낮고 이온을 chelates로 사용할 수 없습니다. SMILP와 DIBMA 방법은 이러한 한계를 극복하는 것과 관련하여 약속을 제공했지만, 다양한 세트 단백질에 대한 적용 가능성은 보이지 않는27,28로남아 있습니다. NCMN은 구조 활동 관계(SAR) 분석을 사용하여 더 큰 나노입자를 형성하고, 낮은 pH 조건에서 기능하며, 이온을 킬로팅하지 않는 대체 폴리머를 생성함으로써 이러한 한계를 극복하고자 합니다. NCMN을 위해 개발된 중합체의 한 가지 예는 도 1E,F에서입증된 바와 같이 더 큰 나노입자를 생성하는 능력을 나타내는 NCMNP5-2 폴리머이다.
이전에 설명된 나노입자 기술의 발전 외에도 NCMN의 미래 방향은 NCMN 폴리머 라이브러리에 추출 효율을 높이고 모든 다른 막 영역 크기의 단백질과 함께 작업할 수 있는 능력을 부여할 멤브레인 활성 폴리머를 더욱 개발하고 있으며, 이는 훨씬 더 넓은 pH 수준에서 작동하거나, 구조 및 기능의 유지를 위해 임의의 유형의 이온에 의존한다. 이것은 모든 막 단백질 연구원이 그들의 실험에 있는 이 기술을 이용하고 더 정확하고 생물학으로 관련있는 결과에 접근할 수 있게 할 것입니다. 폴리머 나노입자의 장점을 더 다양한 단백질에 도입함으로써 이물질이 원자 수준에서 토착 막 단백질 복합체의 고해상도 구조를 해결하고 따라서 이러한 복합체유지로 이동하는 분자 내 원자 상호 작용을 결정할 수 있기를 희망합니다. 이러한 발전은 또한 구조 기반 약물 설계 노력을 통해 막 단백질 약물 발견 및 개발 측면에서 많은 새로운 가능성을 가능하게 할 것입니다. 멤브레인 단백질에 대한 구조 기반 약물 설계 기술의 활용은 원치 않는 부작용과 원하는 치료 효과를 유도하는 데 필요한 화합물의 양을 줄이기 위해 약물 결합 특이성과 효능을 증가시켜 멤브레인 단백질을 훨씬 안전하고 효과적으로 표적으로 하는 약물을 만들기 때문에 의료 산업에 큰 도움이 될 것입니다. 네이티브 세포막 나노 입자 시스템은 아직 발달 단계에 있지만 이미 그들의 진정으로 네이티브 상태에서 막 단백질의 연구를 허용하고 세포막에서 발생하는 네이티브 단백질 단백질 상호 작용을 해명함으로써 매우 강력하다는 것을 입증했습니다.
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Disclosures
Y.G는 막 활성 폴리머 NCMNP5-2 및 NCMN 시스템의 발명가로 나열된다.
Acknowledgments
이 연구는 VCU 스타트업 기금 (Y.G.)과 국립 보건 원의 국립 의학 연구소에 의해 지원되었다 수상 번호 R01GM132329 (Y.G.에) 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 몬세라트 삼소와 케빈 맥로버츠가 비디오 녹화에 대한 후원을 아끼지 해 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
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