Summary
Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Hücre zarı sistemlerindeki protein-protein etkileşimleri, hücreden hücreye etkileşimlerden sinyal transdüksiyona kadar çok çeşitli biyolojik süreçlerde çok önemli roller oynar; çevre sinyallerini algılamaktan biyolojik yanıta; metabolik düzenlemeden gelişimsel kontrole kadar. Protein-protein etkileşimlerinin doğru yapısal bilgileri, membran protein komplekslerinin moleküler mekanizmalarını anlamak ve bu proteinleri modüle etmek için son derece spesifik moleküllerin tasarımı için çok önemlidir. Protein-protein etkileşimlerinin tespiti ve analizi için birçok in vivo ve in vitro yaklaşım geliştirilmiştir. Bunlar arasında yapısal biyoloji yaklaşımı, atomik düzeyde protein-protein etkileşimlerinin doğrudan yapısal bilgilerini sağlayabilmesi bakımından benzersizdir. Bununla birlikte, mevcut membran protein yapısal biyolojisi hala büyük ölçüde deterjan bazlı yöntemlerle sınırlıdır. Deterjan bazlı yöntemlerin en büyük dezavantajı, yerel lipid bilayer ortamları deterjan molekülleri tarafından çıkarıldıktan sonra genellikle membran protein komplekslerini ayrıştırmaları veya denatüre etmeleridir. Membran protein yapısal biyolojisi için yerli hücreli membran nanopartikül sistemi geliştiriyoruz. Burada, AcrB'nin oligomerik durumunun bir vaka çalışması ile hücre zarı üzerindeki protein-protein etkileşimlerinin analizinde bu sistemin kullanımını gösteriyoruz.
Introduction
Protein-protein etkileşimleri (ÜFE), proteinlerin yapısının ve işlevinin korunmasından tüm sistemlerin düzenlenmesine kadar biyoloji boyunca önemli roller oynar. PPI'lar birçok farklı biçimde gelir ve ne tür etkileşimler oluşturduklarına göre kategorize edilebilir. Bu kategorilerden biri homooligomerik veya heterooligomeriktir, etkileşimlerin özdeş alt biralar veya alt bira olarak hareket eden farklı proteinler arasında olup olmadığına dayanır. Başka bir kategori, etkileşimler istikrarlı komplekslerin veya geçici karmaşık durumların oluşumuna yol açıyorsa, etkileşimin gücüne dayanır. Proteinler arasındaki PPI'lar hakkında yapısal bilgiler, proteinlerin işlevlerini yerine getirme mekanizmasını anlamada çok önemlidir. Proteinlerin% 80'inden fazlasının fonksiyonel rollerini yerine getirmek için karmaşık oluşuma güvendiği tahmin edilmiştir1. Doğru doğuştan gelen işleyiş için PPI'lara bağımlı olduğu gözlenen proteinlerin yüzdesinin biyolojideki önemi kolayca belirgindir, ancak bu etkileşimlere giren proteinleri düzgün bir şekilde araştırabilmek, proteinlerin PPI'ları oluştururken deneysel olarak gözlemlemek için mevcut tekniklerdeki sınırlamalar nedeniyle zor olmaya devam etmektedir.
Şu anda mevcut PPI belirleme tekniklerinin çoğundan elde edilen yüksek gürültü, yanlış pozitifler ve yanlış negatifler nedeniyle deneysel olarak belirlenen birçok PPI için sonuçlar arasında yüksek derecede anlaşmazlık vardır. Bu özellikle maya iki melez (Y2H) sistemi, tandem benzeşim saflaştırma-kütle spektrometresi (TAP-MS) ve ÜFE belirleme 2 ,3,4,5,6,7için en sık kullanılan yöntemlerden üçünü temsil eden floresan rezonans enerji transferi (FRET) için böyledir. Buna karşılık, nükleer manyetik rezonans (NMR), X-ışını kristalografisi ve elektron mikroskopisi (EM) gibi protein yapısal biyoloji teknikleri, atom seviyesine kadar protein-protein etkileşimleri hakkında yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler elde etmek ve ilgi çekici bir hedef protein için meydana gelen etkileşimlerin doğrudan görsel olarak onaylanmasını sağlamak için kullanılabilir. Şu anda mevcut olan tüm yapı tabanlı olmayan ÜFE belirleme araştırma teknikleri (örneğin, Y2H, TAP-MS ve FRET) bu yetenekten yoksundur ve ayrıca proteinler arasındaki zayıf ve geçici etkileşimleri tanımlamakta zorlanmaktan muzdariptir5. Bu eksiklikler, uygun kuaterner yapı ve heteromerik kompleks montajın oluşumunu etkileyen lipid ortamının ek değişkeninin getirdiği ek karmaşıklık nedeniyle membran proteinleri incelerken daha da artmaktadır.
Membran proteinleri proteomun büyük bir kısmını oluşturan ve tüm canlı organizmalarda uygun hücre işleyişinde birçok önemli rol oynadığı bilinmektedir. Membran proteinlerinin insan genomunun% 27'sini oluşturduğu ve mevcut tüm ilaç hedeflerinin ~ % 60'ını oluşturduğu tahmin etmesine rağmen, yayınlanan tüm protein yapılarının sadece ~ 2.2'sini oluşturan membran proteinleri için çözülmüş modellerin sayısında büyük bir anormallik vardır8,9,10. Yapısal bilgilerin mevcudiyetinde tutarsızlığın birincil nedeni, membran proteinlerinin içsel özelliklerinde yatmaktadır. Zayıf çözünürlükleri, yerel yapıyı ve işlevi korumak için lipid ortamı ile etkileşimlerine güvenmeleri ve lipid zarının kendisinin çeşitli fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, membran proteinleri bunları incelemek için yapısal biyoloji tekniklerini uygularken önemli bir sorunu temsil etmeye devam eder. Bu içsel özelliklerden doğru yapısal bilgi elde etmek için en önemlisi, doğal lipit ortamlarıyla etkileşime sahip olmalarının doğal yapılarını ve işlevlerini korumaları gereksinimidir. Lipid ortamı, membran proteinlerinin yapısının ve işlevinin ayrılmaz bir parçasıdır, membin kavramı (membran ve protein kelimelerinin bir kombinasyonu) membran-protein yapısının ve işlevinin temel birimi olarak önerilmiştir11. Lipid-protein etkileşimlerinin önemine rağmen, şu anda mevcut olan yapı tabanlı PPI belirleme teknikleri genellikle çalışılan proteinlerin çözünür olmasını veya deterjanlarla çözünür olmasını gerektirir. Sert deterjanlara maruz kalmak proteinleri denatüre edebilir veya toplama, proteinin denatürasyonu, yaygın olmayan etkileşimlerin ayrışması ve yapay oligomerik durumların oluşumuna neden olabilen delipidasyon nedeniyle yanlış pozitif ve negatiflere neden olabilir. Membran proteinlerinin doğal oligomerik durumunun doğru tespiti için doğal bir lipit ortamının korunmasının gerekliliği nedeniyle, daha önce bildirilen Stiren Maleik Asit Lipid Parçacıkları (SMALP)13 yöntemine dayanan bir Native Cell Membrane Nanopartiküls sistemi (NCMNs)12 geliştirdik.
SMALP, membran proteinlerini ayıklamak ve çözündürmek için membran aktif polimer olarak stiren maleik asit kopolölçer kullanır. Poli(Stiren-ko-Maleik Asit) (SMA), hidrofobik stiren moiety ve diyametrik olarak hidrofilik maleik asit moiety'ye karşı olması nedeniyle benzersiz bir amfifilik polimerdir. pH'a bağımlı bir mekanizmada hücre zarını adsorbe ederek, istikrarsızlaştırarak ve bozarak nanopartiküller oluşturur14. SMA'nın bu fonksiyonel aktivitesi, membran protein ekstraksiyonu ve çözünürleştirme için deterjansız bir sistem olarak kullanılmasına izin veren şeydir. NCMN sistemi çeşitli yönlerden SMALP sisteminden farklıdır. NCMN sisteminin en benzersiz özelliği, stabilite ve doğal işleyiş için farklı koşullar gerektiren birçok farklı membran proteininin izolasyonuna uygun hale getiren benzersiz özelliklere sahip çok sayıda polimere sahip bir membran aktif polimer kütüphanesine sahip olmasıdır. NCMN sistemi, nanopartiküllerin hazırlanması söz konusu olduğunda SMALP yöntemine kıyasla farklı protokollere de sahiptir. Bu örneklerden biri, NCMN'lerin yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için tek adımlı nikel benzeşim sütunu saflaştırması kullanmasıdır; Bu farklı protokollerin etkisi, 3.2 ve 3.0 şcryo-EM AcrB yapıları oluşturan NCMNs protokolü ile SMALP yöntemini kullanan benzer bir çalışma karşılaştırıldığında gözlenebilir, bu da 8.8 şçözünürlük12,15'te bir cryo-EM AcrB yapısı ile sonuçlandı. NCMN sisteminin bu benzersiz özellikleri, daha önce kurulan SMALP yönteminde yapılan iyileştirmelerdir ve PPI'lerin incelenmesi için ideal bir aday haline getirmektedir.
Multidrug efflux transporter AcrB, E. coli12'defonksiyonel homotrimer olarak mevcuttur. Bir mutajenik analiz, AcrB trimerinin stabilitesinden sorumlu bir döngü üzerinde bulunan tek bir P223G nokta mutasyonunun, trimer durumunu istikrarsızlaştırdığını ve yerel mavi jel elektroforezi16ile tespit edilebilen deterjan DDM ile hazırlandığında bir AcrB monomer verdiğini öne sürdü. Bununla birlikte, AcrB-P223G mutantının FRET analizi, yerel hücre zarı lipid bilayer ortamındayken, mutant AcrB-P223G'nin çoğunluğunun hala bir trimer olarak var olduğunu ve hem vahşi tip AcrB hem de AcrB-P223G için ifade seviyelerinin benzer olduğunu öne sürdü. Yine de FRET analiz sonuçlarına rağmen, mutant taşıyıcı için bir aktivite tahlili, vahşi tip16ile karşılaştırıldığında aktivitenin önemli ölçüde azaldığını gösterdi. FRET teknolojisi protein-protein etkileşimlerinin analizi için popüler olarak kullanılmış olsa da, araştırmalar sıklıkla yanlış pozitifler verebileceğini göstermiştir17,18,19,20.
Son zamanlarda, AcrB trimerinin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapıları, NCMNs12kullanılarak AcrB'nin ilişkili doğal hücre zarı lipid bilayer ile etkileşimini gösteren belirlendi. Prensip olarak, NCMN'ler doğal hücre zarında bulunan protein-protein etkileşimlerinin analizi için kolayca kullanılabilir. Bu sistemin bir testinde, yerel hücre zarı nanopartikülleri ve negatif boyama elektron mikroskopisi kullanılarak AcrB-P223G'nin oligomerik durumunu doğrudan gözlemlemek için deneyler yapıldı. Vahşi tip AcrB nanopartikülleri ile karşılaştırmak için, NCMNs kütüphanesinde bulunan AcrB ve alternatif polimerlerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapısının belirlenmesi için kullanılan aynı membran aktif polimerini (NCMN kütüphanesinde NCMNP1-1 olarak indekslenen laboratuvarımızda yapılan SMA2000)kullandık. Daha önce bildirilen sonuçlara dayanarak, AcrB-P223G mutantının çoğunluğunun trimerik yerel hücre zarı nanopartikülleri21şeklinde var olması bekleniyordu. Bununla birlikte, vahşi tip AcrB ile gözlenenler gibi örnekte hiçbir AcrB trimer bulunamadı. Bu, AcrB-P223G'nin çoğunluğunun daha önce önerildiği gibi yerel hücre zarında trimer oluşturmadığını göstermektedir.
Burada, NCMN'leri kullanan vahşi E. coli AcrB tipi ile karşılaştırıldığında mutant E. coli AcrB-P223G'nin ayrıntılı bir analizini rapor ediyoruz. AcrB'nin bu vaka çalışması, NCMN'lerin protein-protein etkileşim analizi için iyi bir sistem olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protein ifadesi
- 37 °C'de bir gecede 50 mL tüplerde plazmidleri ifade eden AcrB'yi içeren BL21(DE3) pLysS hücreleri ile plazmidlere özgü antibiyotiklerle 15 mL Müthiş Et Suyu (TB) medyasını 250 rpm'de sallayarak aşıla.
- Geceleme kültürünün optik yoğunluğunu 600 nm 'de (OD600)kontrol edin ve 2,0'ın üzerinde olduğundan emin olun.
- 5 mL hücre kültürünü plazmidlere özgü antibiyotikler içeren 1 L TB ortama seyreltin ve OD600 =0.8'ekadar sallanarak 37 °C'de kuluçkaya yatın ve ardından 1 mM'lik son konsantrasyona sahip IPTG ile indüklenin.
- 20 °C'de 20 saat boyunca sallanarak indüksiyon gerçekleştirin.
- 4 °C ve 4.000 x g'da 15 dakika santrifüjleme kullanarak hücreleri aşağı pelet.
2. Hücre lizisi ve membran izolasyonu
- Hücre peletinin her 20 g'ı için 80 mL kullanarak hücre peletini A Tamponunda(Tablo 1, izlenecek saflaştırma şemasına bağlı olarak DDM Buffer A veya NCMNs Buffer A kullanın) yeniden kullanın.
- 4 °C'de bir cam Dounce homojenizatör kullanarak veya oda sıcaklığında hemen sonra buza koyduğunuzdan emin olun.
- Numuneyi buz üzerinde metal bir behere aktarın ve hücreleri 4 °C ve 1.500 bar'da yüksek basınçlı bir homojenizatöre yükleyerek ıslatın.
- Hücreleri homojenizatöre yükleme işlemini tekrarlayın ve homojenizatörden 3-4 döngü boyunca veya lysate netleştirmeye başlayana kadar geçmelerine izin verin.
- 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı toplayın ve 4 °C'de 1 saat boyunca 215.000 x g'da ultracentrifuge tüplere ve santrifüje yükleyin.
- Süpernatantı atın ve membran topaklarını ultracentrifuge tüplerinden toplayın. Fazla membran peletini -80 °C'de saklayın.
3. Yerli hücre zarı nanopartiküllerinin hazırlanması
- 10 mL NCMNs Tampon A'da 1 g membran peletini yeniden sunun (Tablo 1).
- Yeniden canlanan hücre zarı örneğini 20 °C'de cam dounce homojenizatör ile homojenize edin.
- Askıya alınan membran örneğini 50 mL polipropilen tüpe aktarın ve numuneyi% 2,5 (w/v) membran aktif polimer (NCMNP1-1 veya NCMNP5-2) nihai konsantrasyonuna getirmek için membran aktif polimerler stok çözeltisi ve ek NCMNs Tampon A ekleyin.
NOT: Membran aktif polimerlerin stok çözeltileri çift damıtılmış suda yapılmalı ve değişen konsantrasyonlarda tutulabilir, ancak tipik olarak% 10 (w/ v). - Numuneyi 20 °C'de 2 saat sallayın.
- Numuneyi ultrasantrifüje yükleyin ve 20 °C'de 1 saat boyunca 150.000 x g'da döndürün.
- Numune ultra santrifüjlenirken, 25 mL NCMNs Buffer A ile 5 mL Ni-NTA sütununu dengelemeye başlayın.
- Ultrasantrifüj tamamlandıktan sonra süpernatantı toplayın ve bir şırınna pompası kullanarak 0,5 mL / dk akış hızı ile oda sıcaklığında 5 mL Ni-NTA sütununa yükleyin.
- Sistemi tamamen yıkamak ve ardından sütunu FPLC makinesine bağlamak için hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) hatlarını yeterli NCMNs Buffer B(Tablo 1)ile yıkayın.
- Sütunu 30 mL NCMNs Buffer B ile 1 mL/dk akış hızıyla yıkayın ve akışı toplayın.
- Sütunu 30 mL NCMNs Buffer C (Tablo 1) ile 1 mL / dk akış hızı ile yıkayın ve akışı toplayın.
- Proteini 20 mL NCMNs Buffer D (Tablo 1) ile 0,5 mL / dk akış hızında elute edin ve bir kesir toplayıcı ve her biri 1,0 mL olarak ayarlanan fraksiyonları kullanarak numuneyi toplayın.
- Protein örneklerini 4 °C'de saklayın.
- FPLC elution grafiğinde gözlenen tepelere karşılık gelen örnekleri kontrol etmek için bir SDS-PAGE jel elektroforezi tahlili çalıştırın.
4. SDS-PAGE jel elektroforez
- Camı döküm aparatına kenetleyerek döküm haznesini hazırlayın.
- %12'lik ayırma jelini Tablo 1'delistelenen tarife göre hazırlayın.
NOT: TEMED eklendikten sonra jel hızlı bir şekilde polimerize olur, bu nedenle jeli dökmeye hazır olduğunda bunu ekleyin. - İstifleme jeli için tarağın altında 2 cm bırakarak jeli dökün.
- Jelin üst kısmını% 100 izopropanol ile katmanlayarak kabarcıkları çıkarın ve ayırma jelinin polimerize olmasını bekleyin.
- İzopropanol'i çıkarın ve izopropanol izlerini damıtılmış suyla yıkayın.
- İstifleme jelini Tablo 1'de listelenen tarife göre hazırlayın.
NOT: TEMED eklendikten sonra jel hızlı bir şekilde polimerize olur, bu nedenle jeli dökmeye hazır olduğunda bunu ekleyin. - İstifleme jelini ayırma jelinin üzerine dökün.
- Kuyuları oluşturmak için odaya bir tarak ekleyin ve istifleme jelinin tamamen polimerize olmasını bekleyin.
- Jel üzerinde çalıştırılması gereken her fraksiyon örneği için bir mikrosantrifüj tüpüne 1 μL 1 M DTT yerleştirin.
- Her tüpe 7 μL 4x yükleme tamponu da ekleyin.
- Her mikrosantrifüj tüpüne jel üzerinde çalıştırılması gereken fraksiyonlardan 20 μL numune ekleyin.
- Örnekleri içeren tüpleri girdapla.
- 3 s için bir masa üstü mikrosantrifüj kullanarak numune tüplerini aşağı çevirin ve tüm numunenin tüplerin dibine döndüğünden emin olun.
- %12 poliakrilamid jel kaseti yerine sabitleyerek ve hücrenin iç ve dış odalarını Tris-asetat-EDTA (TAE) Tamponu (Tablo 1)ile doldurarak jel elektroforez hücresini hazırlayın.
- Moleküler ağırlık işaretleyicisini, talimatlarının gerektirdiği uygun hacimle jelin ilk şeridine yükleyin.
- DTT ve yükleme tamponu ile karıştırılan her tüpten numunenin 28 μL'sini yükleyin.
- Elektroforez hücresinin kapağını kutunun üzerine yerleştirin ve kapağı güç kaynağına takın.
- Güç kaynağını açın ve 100 V'a ayarlayın ve 20 dakika çalışmasına izin verin.
- 20 dakika sonra, güç kaynağını 140 V'a çıkarın ve 30-40 dakika daha veya yükleme tampon boyası bandı jel kasetin altına ulaşana kadar çalıştırmaya devam edin.
- Elektroforez lekesini tamamladıktan ve jelin içindeki protein bantlarını görselleştirmek için jeli lekeden arındırdıktan sonra.
5. DDM kullanarak protein saflaştırma
NOT: Bu saflaştırma işlemini gerçekleştirmenin amacı, membran aktif polimerlerini kullanan deneyler için bir kontrol görevi görmektir.
- 6-10 g membran peletini, adım 2.6'dan, DDM Buffer A'da (Tablo 1) 5 mL / g membran pelet kullanarak yeniden atın.
- Yeniden canlanan numuneyi 4 °C'de bir cam Dounce homojenizatör ile homojenize edin veya oda sıcaklığında hemen sonra buza koyduğunuzdan emin olun.
- Numuneyi 50 mL polipropilen tüpe aktarın ve numuneyi% 2 DDM'lik son konsantrasyona getirmek için DDM ve ek DDM Tampon A ekleyin.
- Numuneyi 4 °C'de 2 saat sallayın.
- Numuneyi ultracentrifuge tüplerine yükleyin ve 4 °C ve 150.000 x g'da 1 saat boyunca santrifüj içine yükleyin.
- Numune ultra santrifüjlenirken, 25 mL DDM Buffer A (Tablo 1)ile yıkanarak 5 mL Ni-NTA sütununu hazırlamaya başlayın.
- Ultrasantrifüjleme tamamlandıktan sonra, süpernatantı toplayın ve şırınna pompası kullanarak 0,5 mL/ dk akış hızı ile 4 °C'deki 5 mL Ni-NTA sütununa yükleyin.
- Sistemi tamamen yıkamak için FPLC hatlarını yeterli DDM Buffer B + %0,05 DDM(Tablo 1)ile yıkayın ve ardından sütunu FPLC makinesine takın.
- Sütunu 30 mL DDM Buffer B + %0,05 DDM ile 1 mL/dk akış hızıyla yıkayın ve akışı toplayın.
- Sütunu 30 mL DDM Buffer C + %0,05 DDM(Tablo 1)ile 1 mL/dk akış hızıyla yıkayın ve akışı toplayın.
- Proteini 20 mL DDM Buffer D + %0,05 DDM(Tablo 1)ile 0,5 mL/dk akış hızında elute edin ve akışı bir kesir toplayıcı ve her biri 1,0 mL olarak ayarlanan kesirler kullanarak toplayın.
- 500 μL'ye ulaşana kadar 4.000 x g ve 4 °C'de santrifüjleme kullanarak havuzlama ve konsantre etme için elution tepesini içeren kesirleri seçin.
- 500 μL döngü kullanarak numuneyi FPLC makinesine ve ardından 4 °C'deki 25 mL boyutu dışlama sütununa yükleyin. 0,5 mL/dk akış hızında 30 mL DDM Buffer E + %0,05 DDM (Tablo 1)kullanarak elute edin ve kesir boyutları kesir başına 0,5 mL olarak ayarlanmış kesirler olarak toplayın.
- FPLC elution grafiğinden UV-Vis eğrisini doğrulamak için fraksiyonları alın ve 280 nm emici kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
- FPLC elution grafiğinde gözlenen zirvelere karşılık gelen ve absorbans testi ile doğru olduğu doğrulanan her örnek fraksiyondan 20 μL toplayın.
- İstenilen aliquotlarda sıvı azot veya kuru buz kullanarak bu numune fraksiyonlarının geri kalanını dondurun ve protein örneklerini -80 °C'de saklayın.
- FPLC elution grafiğinde gözlemlenen tepelere karşılık gelen örnekleri kontrol etmek için daha önce açıklandığı gibi bir SDS-PAGE jel elektroforezi tahlili çalıştırın.
6. Negatif leke ızgarası hazırlığı
- Numune hazırlama için kullanılacak ızgaraları, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdına sarılmış bir cam kaydırağa yerleştirin.
- Elektron mikroskop ızgaraları ile cam kaydırağı iki elektrot arasındaki bir kızdırma deşarj odasına yerleştirin ve cam kapağı ortalanmış ve iyi kapatılmış olduğundan emin olarak değiştirin.
- Işıma boşaltma makinesini çalıştırın ve plazma tarafından üretilen mor ışığın görünür olduğundan emin olun.
- Makinenin çalışması bittiğinde, cam kapağı çıkarmak için oda atmosferik basınca ulaşana kadar bekleyin ve ardından ızgaralarla birlikte slaytı numunelerin yüklendiği tezgaha geri verin.
- Numuneyi uygun tamponla seyrelterek veya bir santrifüj konsantratörü kullanarak konsantre ederek saflaştırılmış protein örneklerinin konsantrasyonu yaklaşık 0,1 mg/mL'ye ayarlayın.
- 10 nm kalınlığındaki karbon ızgarasına 3,5 μL protein örneği yükleyin ve 1 dakika bekleyin.
- Sıvıyı bir filtre kağıdı ile EM ızgarasının yüzeyinden çıkarın.
- Izgara ile 3 μL su damlacıkları toplayarak ve her damlacığın toplanması arasında filtre kağıdı ile suyu ızgaradan çıkararak ızgara yüzeyini 3x yıkayın.
- 3 μL'lik taze damlacık, filtrelenmiş %2 uranyum asetat toplayarak ızgara yüzeyini 2x yıkayın ve her damlacığın toplanması arasında ızgaradaki yıkama çözeltilerini filtre kağıdı ile çıkarın.
- Izgarayı 1 dakika boyunca 3 μL taze, filtrelenmiş% 2 uranyum asetat damlası ile lekeleyin.
- EM ızgarasının yüzeyindeki uranyum asetat çözeltisini filtre kağıdı ile çıkarın ve ızgarayı en az 1 dakika kurutun.
- Izgarayı daha sonra kullanmak üzere bir kılavuz kutusunda saklayın.
7. EM görüntüleme
- Hazırlanan ızgarayı güvenli bir tezgahta ızgara tutucusuna yükleyin.
- Mikroskopları bir polistiren kutusuna yerleştirerek mikroskobu hazırlayın ve dewar 3/4'ü sıvı nitrojenle doldurun.
- Mikroskop penceresinin kauçuk kapağının kapladığını onaylayın ve ardından bakır telleri platforma sığana kadar dewar'a yerleştirerek dewar'ı mikroskopa yükleyin.
- Dewar'ın geri kalanını sıvı nitrojenle doldurun ve örtmek için dewar'ın üzerine bir kapak yerleştirin.
- Yüksek gerilimi açın, mikroskobu koşullayın ve mikroskobun ısınmasını bekleyin ve kullanım için güvenli bir vakum seviyesi oluşturun.
- Mikroskop hazır olduğunda kolon vanasını açın ve mikroskop penceresindeki kauçuk kapağı çıkararak kirişin mevcut olduğunu onaylayın.
- Işın yoğunluğunu ayarlayarak içeri ve dışarı yayılarak ışın damgalamayı kontrol edin. Astigmatizma mevcutsa, ışın çaprazdan uzaklaştıkça eliptik bir şekle sahip olacaktır ve ışın her iki tarafta da aynı oval şekil olmalıdır.
- Mikroskop dürbünü gözlemcinin gözlerine göre doğru yükseklik ve mesafe olacak şekilde ayarlayın.
- Işın her birinde ortalanana kadar üç modda da bisiklete binerek Arama, Odakve Pozlama modları için ışın konumlandırmasını kontrol edin.
- Sütun vanasını kapatın ve ızgara tutucuyu elektron mikroskobuna yüklemeye devam edin.
- Mikroskop sallayıcı özelliğini kullanarak ve numunenin merkezde yan yana hareketi olmayana kadar Z eksenini kullanarak sahnenin hareketini ayarlayarak mikroskobu ösantrik yüksekliğe ayarlayın.
- Mikroskopta düşük doz Arama modunu kullanarak, numuneye odaklanmak için mevcut örnek moleküllerle makul kontrastta arzu edilen bir alan için ızgarayı arayın.
- Örnek görülene kadar yüksek adım boyutu kullanarak Odak modunda örneğe odaklanın ve ardından doğru odak düzeyini bulmak için adımları azaltın.
- Işını sıfırla ve boşalt ve sonra kauçuk pedin mikroskop penceresini kapladığını unutma.
- Pozlama modunu kullanarak, 62.000x büyütmede 1 s pozlama için istenen ızgara alanının görüntüsünü alın ve elde edilen görüntüyü kontrol edin.
- Bir ızgara görüntülemeyi bitirdiğinizde sütun vanalarını kapatın ve ızgara tutucuyu sütundan çıkarın.
- Tüm ilgi ızgaralarını görüntülemeyi bitirdiğinizde, filament gücünü kapatarak ve sıvı azot dewar'ı mikroskoptan çıkararak mikroskobu kapatın.
- Mikroskobun bakır bobinlerinden yoğuşma yakalamak için dewar'ın oturduğu standa nemi emecek bir şey yerleştirin.
- Cryo Cycle modunu etkinleştirin ve turbo pompanın kapalı olduğundan emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan prosedürler kullanılarak, E. coli AcrB vahşi tipi ve E. coli mutant AcrB-P223G örnekleri saflaştırılmıştır. Numuneler daha sonra karbon negatif leke elektron mikroskopi ızgaralarına adsorbe edildi ve yan blotting yöntemi ile uranil asetat kullanılarak lekelendi22. Negatif leke görüntüleri iletim elektron mikroskopisi kullanılarak toplandı. DDM ile saflaştırılmış AcrB vahşi tip numunesi için negatif leke görüntüsü, iyi tanımlanmış bir trimerik kuaderik yapı gösteren protein ile monodispersed parçacıkların homojen bir çözeltisini ortaya koymaktadır (Şekil 1A). Bu trimerik yapılar saflaştırıldığında gözlenen boyut dışlama kromatogramı ile karşılık gelir (Tamamlayıcı Şekil 1). Buna karşılık, DDM ile de saflaştırılmış olan AcrB-P223G mutant için negatif leke görüntüsüne bakıldığında, toplama eğilimi olan, ancak gözlemlenebilir yerel trimer içermeyen heterojen bir polidispersed nanopartikül çözeltisi gözlemlenebilir (Şekil 1B). Bu sonuçlar, boyut dışlama kromatografisi(Tamamlayıcı Şekil 1)gerçekleştirilirken gözlenen elüsyon profili ile de desteklenir. Mutant için trimerik durum proteinlerinin eksikliğinin deterjanla tedaviden mi yoksa sadece P223G'nin istikrarsızlaştırıcı mutasyonunun neden olup olmadığını belirlemek için proteinler, NCMNs kütüphanesindeki membran aktif polimerlerinden biri olan NCMNP1-1 kullanılarak da saflaştırılmıştır. NCMNP1-1 ile saflaştırılmış AcrB vahşi tip numunesi için negatif leke görüntüsü, yine, iyi tanımlanmış bir trimerik kuatener yapısını gösteren protein ile monodispersed parçacıkların homojen bir çözeltisini ortaya koymaktadır (Şekil 1C). Ve tıpkı DDM saflaştırmada olduğu gibi, AcrB-P223G mutant NCMNP1-1 ile arındırıldığında, negatif leke görüntüsü toplama eğilimi olan, ancak gözlemlenebilir yerel trimer içermeyen heterojen bir polidispersed nanopartikül çözeltisi gösterir (Şekil 1D). P223G mutasyonun hücre zarındaki AcrB trimerini bozduğunu daha da doğrulamak için tescilli NCMNs membran aktif polimer kütüphanesinden farklı bir polimer (NCMNP5-2) seçildi. NCMNP5-2, çok daha büyük boyutlarda yerel hücre zarı nanopartikülleri oluşturabilir, böylece birden fazla AcrB trimerin tek bir yerel hücre zar parçacığında görüntülenebilir. Sonuç olarak, tek parçacıklarda birden fazla vahşi tip AcrB trimerin bulunduğu gözlenmiştir (Şekil 1E); bununla birlikte, büyük yerel hücre zarı bilayer yamalarına bakıldığında bile, vahşi tip AcrB tarafından oluşturulanlar gibi hiçbir AcrB-P223G trimer parçacığı gözlenmedi (Şekil 1F). Bu, AcrB-P223G'nin daha önce önerilen21 gibi hücre zarında bir trimer olarak mevcut olmadığını ve AcrB-P223G'nin test edildiğinde neden aktivitede dramatik bir düşüş gösterdiğine dair mantıklı bir açıklama sunduğunu göstermektedir16. Numunelerin saflığını ve doğru proteinin varlığını doğrulamak için, tüm saflaştırılmış protein örnekleri için elektroforezi jelleri çalıştırıldı. Elde edilen lekeler , %95 saflıktaki tüm örneklerde AcrB varlığını doğruladı ve lekenin yeri AcrB'nin öngörülen moleküler ağırlığına karşılık geliyor (Şekil 1G). Çalışmamızdan elde edilen sonuçlar, membran proteini AcrB-P223G16'nınoligomerik durumunun belirlenmesi ile ilgili olarak daha önce açıklanan FRET tahlilleri ile tutarsızdır. Protokolde açıklandığı gibi membran aktif polimerler ve elektron mikroskopisi kullanılarak proteinin doğal oligomerik durumu doğrudan gözlemlenebilirdi. Proteinin monomerlerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğinin daha doğru bir şekilde belirlenmesi, yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapılarının belirlenmesini gerektirecektir.
Şekil 1: Saflaştırılmış AcrB yapılarının negatif leke ve elektroforez jel görüntüleri. (A) DDM ile saflaştırılmış vahşi tip AcrB için çekilen negatif leke görüntüsü. (B) DDM ile saflaştırılmış AcrB-P223G protein yapısı için çekilen negatif leke görüntüsü. (C) NCMNP1-1 ile saflaştırılmış vahşi tip AcrB için çekilen negatif leke görüntüsü. (D) NCMNP1-1 ile saflaştırılmış AcrB-P223G yapısı için çekilen negatif leke görüntüsü. (E) NCMNP5-2 ile saflaştırılmış vahşi tip AcrB için çekilen negatif leke görüntüsü (kırmızı kutu, görüntüde gözlenen bazı trimer nanopartiküllerini vurgular). (F) NCMNP5-2 ile saflaştırılmış AcrB-P223G için çekilen negatif leke görüntüsü (yeşil kutu, görüntüde gözlenen NCMNP5-2 tarafından yakalanan lipit yamalarının bir kısmını vurgular). (G) SDS-PAGE jel, DDM (Lane 1), NCMNP1-1 (lane2), (H) SDS-PAGE jel ile AcrB-P223G saflaştırmalarından elde edilen nihai ürünleri kullanarak çalışır. (I) Şekil 1E'den vurgulanan özellikleri yakınlaştırın. (J) Vurgulanan özellikleri F'den yakınlaştırın. Şekil 1'deki tüm negatif leke görüntüleri 50 nm'lik aynı ölçek çubuğuna sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| DDM Arıtma Tamponları | Polimer Arıtma Tamponları | Jel Elektroforez Tamponları | |||
| Arabellek A | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN Arabelleği A | 50 mM HEPES, pH 8.4 | TAE Arabelleği | 40 mM Tris Tabanı |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| %5 Gliserol | %5 Gliserol | 20 mM Asetik Asit | |||
| 20 mM Imidazol | 20 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Arabellek B | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN Arabelleği B | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Arabellek Çıkartma | %40 Metanol |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | %10 Asetik Asit | |||
| %5 Gliserol | %5 Gliserol | ||||
| 40 mM Imidazol | 40 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Arabellek C | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN Arabelleği C | 25 mM HEPES, pH 7,8 | İstifleme Jeli | 1,5 M Tris pH 8,8 (0,63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | %30 Akrilamid/Bis (0,43 ml) | |||
| %5 Gliserol | %5 Gliserol | %10 SDS (0,025 ml) | |||
| 75 mM Imidazol | 75 mM Imidazol | %10 APS (0,025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (4 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,39 ml) | ||||
| Arabellek D | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN Arabellek D | 25 mM HEPES, pH 7,8 | %12 Ayırma Jeli | 1,5 M Tris pH 8,8 (1,3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | %30 Akrilamid/Bis (2 ml) | |||
| %5 Gliserol | %5 Gliserol | %10 SDS (0,05 ml) | |||
| 300 mM Imidazol | 300 mM Imidazol | %10 APS (0,05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (5 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,6 ml) | ||||
| Arabellek E | 40 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN Arabelleği E | 40 mM HEPES, pH 7.8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0,1 mM TCEP | 0,1 mM TCEP | ||||
Tablo 1: Kolon kromatografisi ve jel elektroforezi için kullanılan saflaştırma tamponlarının listesi.
Tamamlayıcı Şekil 1: Boyut dışlama kromatografi elution profilleri. (A) DDM ve vahşi tip AcrB (turuncu) ve DDM ve mutant AcrB-P223G (mavi) ile saflaştırırken gerçekleştirilen boyut dışlama kromatografisi deneyleri için gözlenen iki elution profilinin kaplama grafiği. (B) DDM denemeleri için kullanılan boyut hariç tutma sütunu için sütun kalibrasyon profili.
1: Thyroglobulin (Bay 669 000), 2: Ferritin (Bay 440 000), 3: Aldolaz (Bay 158 000), 4: Konalbumin (Sn. 75 000), 5: Ovalbumin (Bay 44 000), 6: Karbonik anhidraz (Bay 29 000), 7: Ribonikli A (Bay 13 700). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein etkileşimleri membran proteinlerinin yapısının ve işlevinin bütünlüğü için önemlidir. Protein-protein etkileşimlerini araştırmak için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Çözünür proteinlerle karşılaştırıldığında, membran proteinlerinin benzersiz içsel özellikleri nedeniyle membran proteinlerinin ve PPI'larının incelenmesi daha zordur. Bu zorluk esas olarak membran proteinlerinin yapısal stabilite ve işlevsellik için yerel bir lipid bilayer ortamına gömülmesi gereksiniminden gelir. Bu sorunlu hale gelir, çünkü proteinlerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirlemek için hücre zarından çıkarılmaları gerekir. FRET, hücre zarı üzerindeki protein-protein etkileşimlerini araştırmak için popüler bir teknoloji olmuştur, ancak çözünürlük düşüktür ve sıklıkla yanlış pozitifler üretir17,18,19,20. Burada, ilk kez, NCMN'lerin, doğal hücre zarındaki vahşi tip AcrB trimer ve AcrB-P223G monomerini yapısal olarak analiz ederek ve sonuçları FRET kullanarak önceki analizle karşılaştırarak membran protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabileceği gösterilmiştir. Vahşi AcrB ve AcrB-P223G tipi elektron mikroskopi tek parçacıklı görüntüleri karşılaştırılarak, AcrB-P223G'nin çoğunluğunun, NCMNP1-1 ve NCMNP5-2 gibi membran aktif polimerleri kullanılarak saflaştırıldığında vahşi tip AcrB proteini gibi E.coli hücre zarında trimer oluşturmadığı ileri sürülmektedir. Burada, FRET analizinden elde edilen sonuçların, FRET yaklaşımının çözüm sınırlamasından kaynaklanan yanlış bir olumlu olabileceğini öneriyoruz. AcrB-P223G trimerini stabilize eden yapay disülfid bağı da çözelti21'de meydanagelen bir eser olabilir. Negatif leke görüntüleri, P223G mutasyonunun AcrB trimer oluşumunu engellediğini ve AcrB'nin monomerik formunun trimerik formunda gözlenen aynı konformasyonda kalamayacağını göstermektedir. Bu mutasyonu içeren döngünün daha önce, her döngünün komşu AcrB monomer23'egömülerek oluşturduğu etkileşimlerden kaynaklandığını gösteren mutajenik ve yapısal analiz yoluyla trimer oluşumu için kesinlikle kritik olduğu gösterilmiştir.
Protein-protein etkileşimi tespiti ve analizi için yerel hücre zarı nanopartikül sistemini kullanarak, membran proteinlerini gerçekten yerli bir hücre zarı ortamında tutarak bir proteinin oligomerik durumunu doğrudan tespit edebilirsiniz, bu da numunenin tek parçacık kriyo-EM analizi yoluyla atom seviyesinde yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi elde etmek için kullanılabilir. NCMN sistemi, numunelerin deterjanlarla tedavi edilmesiyle ortaya çıkan ÜFE tespitinde sıklıkla gözlenen yanlış pozitif ve yanlış negatiflerin önlenmesine yardımcı olur24. Bu yanlış sonuçlar tipik olarak, protein örneğinin toplanması, denatürasyonu, yaygın olmayan etkileşimlerin ayrışması ve deterjanların delipidasyon etkilerinin neden olduğu yapay oligomerik durumların oluşumu nedeniyle ortaya çıkar. Ek olarak, NCMN'lerle birlikte yapısal analiz kullanmak ek yapısal bilgiler sağlar ve hem PPI'ları anlamak için kritik öneme sahip olan hem de daha önce belirlenmiş PPI algılama yöntemlerini kullanırken tipik olarak kaybolan moleküler etkileşimlerin doğrudan gözlemlenmesine izin verir. Bu yöntem, vahşi tip AcrB'nin yapısal çalışmaları için başarıyla kullanılmıştır ve X-ışını kristalografisi ve katı hal NMR gibi diğer yapısal analiz biçimlerine ve yeni protein hedefleri tarafından görüntülenen etkileşimleri belirlemek isteyen diğer araştırmalarda kullanılan birçok farklı proteine geniş uygulanabilirliğe sahip olabilir.
Yüksek saflıkta makul protein verimi ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, takip edilmesi gereken membran aktif polimerlerle saflaştırma sürecinde birkaç kritik adım vardır. İlk kritik adım membran izolasyonu işlemidir, bu nedenle hücre zarını hücre lisatının geri kalanından gerçekten izole etmek için hücre lilyosatını 15.000 x g'da santrifüjleme ve 215.000 x g'da ultracentrifugation ile bu adımı takip etmek kritik öneme sahiptir. Bir sonraki kritik adım, membran fraksiyonunu iki saat boyunca oda sıcaklığında% 2,5 konsantrasyonda membran aktif polimerlerle çözündürmektedir. Saflaştırmanın optimizasyon deneyleri yapıldı ve bu adımda bu parametrelerin kullanılması, membrandan en uygun miktarda AcrB çıkarılmasını ve doğal hücre zarı nanopartiküllerinin uygun oluşumunu sağlamak için gösterildi. Arıtma işleminin son kritik adımı, numuneyi oda sıcaklığında Ni-NTA sütununa yüklemektir. Bu gereklidir, çünkü membran aktif polimerler oda sıcaklığında 4 ° C'den daha çözünür, böylece oda sıcaklığında yükleme, benzeşim sütununa protein bağlama miktarını artıracak ve kolona zarar verebilecek çözünmeyen polimer birikmesinin neden olduğu yüksek basıncı önleyecektir. Doğru yapısal bilgi elde etmek için neredeyse eşit derecede önemli olan, yukarıda belirtilen negatif boyama prosedüründe yer alan adımlardır. Bu prosedürün en kritik yönleri arasında 10 nm kalınlığında delikli karbon ızgaraları, su ve uranil asetat hacimleri ve numune adsorpsiyonu ve lekelenme için zaman süreleri yer almaktadır. Numune hazırlama sırasında bu anahtar parametrelerin kullanılması, görüntülenmekte olan numunenin oligomerik durumlarının doğru değerlendirilmesi için kullanılabilecek kaliteli yapısal veriler sağlayacaktır. Çeşitli polipeptitlerin benzersiz özellikleri nedeniyle ortaya çıkabilecek sorunları gidermek için farklı proteinler kullanırken saflaştırma protokolünde değişiklikler yapılması gerekebilir. Yeterli miktarda protein örneği almakta güçlük çekerken değiştirmeyi göz önünde bulundurmak için göz önünde bulundurulması gereken birincil faktörler, indüksiyon adımı sırasında kullanılan parametreler, çözünürleştirme adımında kullanılan membran fraksiyonu miktarı ve çözünürlükleşme işlemi için zaman ve sıcaklık uzunluğu olmalıdır. Saflıkla ilgili bir sorun varsa, saflaştırma için Ni-NTA sütununu kullanmak yerine biyotin benzeşim sütunu gibi alternatif benzeşim sütunlarının kullanılması gerekebilir. Benzer şekilde, zayıf/geçici protein-protein etkileşimlerinin sürdürülmesi gerekiyorsa, Ni-NTA sütununu TAP etiketi benzeşim sütunu ile değiştirmek optimum sonuçlar için faydalıdır. Son olarak, memeli proteinlerini incelerken, proteinin doğal oligomerik durumunun doğru belirlenmesi için gerekli gerçek yerli hücre zarı lipid bileşimlerini korumak için memeli ekspresyon sistemleri kullanılmalıdır. Bu, bu protokolün protein ekspresyonunun ve hücre liziz adımlarının tamamen gözden geçirilmesini gerektirecektir. Bu gibi durumlarda, daha önce belirlenen protein ekspresyoyması protokolleri ve ilgi çekici hedef protein için gerekli ifade sistemine karşılık gelen hücre lizizi takip edilmelidir.
NCMN'lerin elektron mikroskopisi ile kullanımı, PPI'lerin algılanmasında kullanılmak üzere FRET ile karşılaştırıldığında büyük avantajlar sunar. Bu çalışmadan elde edilen sonuçların gösterdiği gibi, daha önce yapılan FRET deneyleri, AcrB mutant proteininin oliigomerik yapısının yapısal analizi ile tutarsızdı21. Bu açıkça gösterildi ve doğrudan mutant AcrB-P223G16için daha önce açıklanan aktivite kaybı ile tutarlı negatif leke elektron mikroskopisi ile çekilen görüntülerle doğrulandı. Eğer AcrB-P223G, NCMNP5-2 polimerini vivo olarak düzelticiler oluştursaydı, onları çıkardığı büyük yerli hücre zarı yamalarında yakalardı. Mutant AcrB'nin FRET analizinin, tekniğin dayandığı fiziksel süreçlere ve floresan rezonans enerji transferlerini ölçmek için kullanılan teknolojiye ilişkin çeşitli sınırlamalardan herhangi biri nedeniyle yanlış pozitifle sonuçlanması mümkündür. FRET'in önemli bir sınırlaması konfokal mikroskopinin çözünürlük sınırlarıdır ve bu, FRET tahlilleri19ile çözülebilen intermoleküler mesafelerde ciddi sınırlamalara yol açar. Buna karşılık, NCMN'lerin elektron mikroskopisi ile birlikte kullanılması, konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek çözünürlük sınırları ile FRET'in yukarıda belirtilen sınırlamasına tabi değildir. Daha önce açıklanan FRET tahlilleri üzerinde potansiyel etkileri olan bu sınırlamalara dayanarak, bir AcrB-P223G trimer in vivo'nun yanlış algılanmasının FRET21'indüşük çözünürlük sınırlamasından kaynaklandığını iddia ediyoruz. Doğrudan bu makalenin işaret ettiği sadece FRET'e göre avantajların yanı sıra, NCMN'lerin elektron mikroskopisi ile birlikte kullanılması, Y2H sistemi ve TAP-MS gibi tüm mevcut protein-protein etkileşim tekniklerine göre avantajlıdır, çünkü yerel hücre zarı ortamlarındaki protein-protein etkileşimlerini doğrudan yüksek çözünürlükte gözlemlemek için kullanılabilir ve atomik düzeyde protein yapılarını belirlemek için kullanılma potansiyeline sahiptir.
Membran aktif polimerler ve elektron mikroskopisi de sınırlamasız değildir. Şu anda, NCMN saflaştırmanın ana sorunu deterjan bazlı yöntemlerle karşılaştırıldığında daha düşük ekstraksiyon verimliliğidir (NCMN kütüphanesindeki polimerler DDM'nin ekstraksiyon verimliliğini ~% 70 olarak göstermektedir). Ayrıca, maltoz bağlama sütunları gibi bazı benzeşim sütunlarıyla uyumluluk sorunları vardır. Ayrıca, NCMN saflaştırması son derece dinamik membran proteinleri veya kompleksleri (yayınlanmamış veriler) ile hala çok başarılı değildir. Olimetrik durum belirleme deneyleri için membran aktif polimerler ve elektron mikroskopisinin kullanılması, proteinlerin yerli hücre ortamından çıkarılmasını gerektirirken, FRET in vivo olarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, membran aktif polimerlerin oluşturduğu nanopartiküller, proteinleri hücrelerden çıkarırken mümkün olan en doğal ortama, protein ekstraksiyonu ve saflaştırmanın neden olduğu bilinen deneysel olarak türetilmiş yanlışlıkları azaltmaya izin verir. Ek olarak, iletim elektron mikroskopisinin bir sınırlaması olarak çözünürlük ve parçacık boyutu sorunu son on yılda önemli ölçüde azalmış olsa da, negatif leke analizi için hala kullanılan mikroskoplar, genellikle 0.1-0.3 nm25civarında bir bilgi sınırına sahip oldukları için daha büyük moleküller veya moleküler komplekslerle (>200 kDa) nispeten sınırlı olacaktır. SMALP ayrıca uygulamalar açısından oldukça esnek olduğunu göstermiştir, ancak NCMN'lerden daha büyük sınırlamalar görüntüler. SMA tarafından oluşturulan nanodiskler kabaca 15 nm maksimum çapa sahiptir ve bu nedenle 400 kDa26'nınüzerindeki proteinleri ve protein komplekslerini çıkarmak için genellikle etkisizdir. Bu sınırlamaya ek olarak, SMA düşük pH ortamlarında bulunan proteinlerle çalışamaz veya yapısal ve işlevsel amaçlar için divalent iyonlarını kullanamaz. PH'a bağımlı olan SMALP etki mekanizması nedeniyle, düşük pH koşulları ve chelates divalent iyonları ile kullanılamaz. SMILP ve DIBMA yöntemleri bu sınırlamaların aşılması konusunda umut vaat etse de, çeşitli set proteinlerine uygulanabilirlikleri görünmeden kalmıştır27,28. NCMNs, daha büyük nanopartiküller oluşturabilen, düşük pH koşullarında çalışabilen ve şelatlı divalent iyonlarından kaçınabilen alternatif polimerler oluşturmak için yapı-aktivite ilişkisi (SAR) analizini kullanarak bu sınırlamaların üstesinden gelmeyi amaçlamaktadır. NCMN'ler için geliştirilen polimerlerin bu örneklerinden biri, Şekil 1E,F'degösterildiği gibi daha büyük nanopartiküller oluşturma yeteneğini gösteren NCMNP5-2 polimerdir.
Nanopartikül teknolojisinde daha önce açıklanan gelişmelere ek olarak, NCMN'lerin gelecekteki yönü, NCMNs polimer kütüphanesine daha fazla ekstraksiyon verimliliği ve çok daha geniş pH seviyelerinde çalışan veya yapılarının ve işlevlerinin bakımı için her türlü iyona dayanan tüm farklı transmembran bölge boyutlarındaki proteinlerle çalışma yeteneği verecek daha da fazla membran aktif polimerleri geliştirmektir. Bu, tüm membran protein araştırmacılarının deneylerinde bu teknolojiyi kullanmalarını ve daha doğru ve biyolojik olarak ilgili sonuçlara erişmelerini sağlayacaktır. Polimer nanopartiküllerin avantajlarını daha çeşitli proteinlere getirerek, bunun atomik düzeyde yerel membran protein komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapılarının çözülmesine yol açacağı ve böylece bu komplekslerin korunmasına giden intramoleküler atomik etkileşimleri belirleyeceği umudu vardır. Bu tür gelişmeler, yapı bazlı ilaç tasarım çabalarıyla membran protein ilacının keşfi ve geliştirilmesi açısından birçok yeni olasılık sağlayacaktır. Membran proteinleri için yapı bazlı ilaç tasarım tekniklerinin kullanılması tıp endüstrisi için büyük bir fayda sağlayacaktır, çünkü bu, istenmeyen yan etkileri ve istenen terapötik etkileri ortaya çıkarmak için gerekli bileşik miktarını azaltmak için ilaç bağlama özgüllüğünü ve etkinliğini artıracak, böylece membran proteinlerini hedefleyen ilaçları önemli ölçüde daha güvenli ve daha etkili hale getirecektir. Yerli hücre zarı nanopartikülleri sistemi hala gelişim aşamasındadır, ancak ilk kez membran proteinlerinin gerçekten yerel durumlarında çalışmasına izin vererek ve hücre zarında meydana gelen yerel protein-protein etkileşimlerini aydınlatarak inanılmaz derecede güçlü olduğunu kanıtlamıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.G, membran aktif polimer NCMNP5-2 ve NCMN sisteminin mucidi olarak listelenmiştir.
Acknowledgments
Bu araştırma, VCU başlangıç fonu (Y.G.'ye) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından R01GM132329 Ödül Numarası altında (Y.G.'ye) desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Montserrat Samso ve Kevin McRoberts'e video kaydına verdikleri cömert destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
