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Neuroscience

कृंतक मस्तिष्क के नमूनों के एक सेट में पोस्ट-स्ट्रोक सेरेब्रल एडीमा, इनफारेक्ट जोन और रक्त-मस्तिष्क बाधा ब्रेकडाउन को मापने

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61309
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 4, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine, Dnepropetrovsk State University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल कृंतक मस्तिष्क के नमूनों के एक ही सेट पर इस्कीमिक मस्तिष्क चोट के तीन सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों को मापने की एक उपन्यास तकनीक का वर्णन करता है। केवल एक मस्तिष्क नमूना का उपयोग नैतिक और आर्थिक लागत के मामले में अत्यधिक लाभप्रद है ।

Abstract

दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर के सबसे आम कारणों में से एक इस्कीमिक स्ट्रोक है। ऐतिहासिक रूप से, इस्कीमिक स्ट्रोक को प्रोत्साहित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक पशु मॉडल में मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्लसियन (एमसीएओ) शामिल है। इनफारेक्ट जोन, ब्रेन एडिमा और ब्लड-ब्रेन बैरियर (बीबीबी) ब्रेकडाउन को पैरामीटर के रूप में मापा जाता है जो एमसीएओ के बाद मस्तिष्क की चोट की सीमा को दर्शाते हैं । इस विधि के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि ये माप आम तौर पर विभिन्न चूहे मस्तिष्क के नमूनों में प्राप्त होते हैं, जिससे चूहों की बड़ी संख्या के कारण नैतिक और वित्तीय बोझ पड़ता है जिन्हें उचित नमूना आकार के लिए इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है। यहां हम चूहे के दिमाग के एक ही सेट में इनफारेक्ट जोन, ब्रेन एडीमा और बीबीबी पारगम्यता को मापने के द्वारा एमसीएएओ के बाद मस्तिष्क की चोट का सही आकलन करने के लिए एक विधि पेश करते हैं। यह उपन्यास तकनीक स्ट्रोक के रोगविज्ञान का मूल्यांकन करने का अधिक कुशल तरीका प्रदान करती है।

Introduction

दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर के सबसे आम कारणों में से एक स्ट्रोक है। विश्व स्तर पर, इस्कीमिक स्ट्रोक स्ट्रोक सभी स्ट्रोक मामलों का 68% प्रतिनिधित्व करता है, जबकि संयुक्त राज्य अमेरिका में इस्कीमिक स्ट्रोक स्ट्रोक के मामलों के 87% के लिए खातेहैं 1,2। यह अनुमान लगाया गया है कि स्ट्रोक का आर्थिक बोझ संयुक्त राज्य अमेरिका में 2 और यूरोपीय संघ में €45 बिलियन तक पहुंचजाताहै। स्ट्रोक के पशु मॉडल अपने रोगविज्ञान का अध्ययन करने, मूल्यांकन के लिए नए तरीकों को विकसित करने और नए चिकित्सीय विकल्पों का प्रस्ताव करने के लिए आवश्यक हैं4।

इस्कीमिक स्ट्रोक एक प्रमुख सेरेब्रल धमनी के ऑक्सक्लूसियन के साथ होता है, आमतौर पर मध्य मस्तिष्क धमनी या इसकी शाखाओं में से एक5। इस प्रकार, इस्कीमिक स्ट्रोक के मॉडलों में ऐतिहासिक रूप से मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्लसेशन (एमसीएओ)6,7,8, 9,10, 11,12शामिल हैं। एमसीएओ के बाद, न्यूरोलॉजिकल चोट सबसे अधिक एक 2,3,3,5-triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला विधि13,मस्तिष्क एडीमा (BE) का उपयोग कर infarct क्षेत्र (IZ) को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जाता है सुखाने या हेमिफेरिक मात्रा 14 ,15,16कीगणना का उपयोग करना , और रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) इवांस ब्लू स्टेनिंग 17 ,18, 19का उपयोग करके एकस्पेक्ट्रोमेट्रीतकनीक द्वारा पारगम्यता ।

पारंपरिक एमसीएओ विधि तीन मस्तिष्क माप में से प्रत्येक के लिए दिमाग के अलग सेट का उपयोग करता है । एक बड़े नमूना आकार के लिए, इसके परिणामस्वरूप नैतिक और वित्तीय विचारों के साथ इच्छामृत्यु वाले जानवरों की एक महत्वपूर्ण संख्या होती है। इन लागतों को कम करने के लिए एक वैकल्पिक विधि में एमसीएओ कृंतक दिमाग के एक सेट में सभी तीन मापदंडों के माप शामिल होंगे।

पिछले प्रयास एक ही मस्तिष्क के नमूने में मापदंडों के संयोजन को मापने के लिए किया गया है । एक साथ इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला तरीके20 के साथ ही अन्य आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण21 एक ही मस्तिष्क के नमूने में टीटीसी धुंधला के बाद वर्णित किया गया है । हमने मस्तिष्क के एडिमा का आकलन करने के लिए मस्तिष्क गोलार्द्ध की मात्रा की गणना की है और एक ही मस्तिष्क सेट15में इनफाक्ट जोन की गणना करने के लिए टीटीसी धुंधला प्रदर्शन किया है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम एक संशोधित एमसीएओ तकनीक पेश करते हैं जो कृंतक दिमाग के एक ही सेट में इज़, बीई और बीबीबी पारगम्यता का निर्धारण करके इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट को मापता है। IZ टीटीसी धुंधला द्वारा मापा जाता है, बीई हेमफेरिक मात्रा की गणना करके निर्धारित किया जाता है, और बीबीबी पारमेबिलिटी स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों द्वारा प्राप्त की जाती है19। इस प्रोटोकॉल में, हमने आंतरिक कैरोटिड धमनी (आईसीए) में मोनोफिलामेंट कैथेटर के प्रत्यक्ष सम्मिलन और निर्धारण के आधार पर एक संशोधित एमसीएओ मॉडल का उपयोग किया और मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए)22में रक्त प्रवाह को और अवरुद्ध किया। यह संशोधित विधि पारंपरिक एमसीएओ विधि16,22की तुलना में मृत्यु दर और रुग्णता में कमी को दर्शाती है .

यह नया दृष्टिकोण एमसीएओ के बाद न्यूरोलॉजिकल चोट को मापने के लिए एक आर्थिक रूप से मजबूत और नैतिक मॉडल प्रदान करता है। इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट के मुख्य मापदंडों का यह आकलन इसके रोगविज्ञान की व्यापक जांच करने में मदद करेगा।

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Protocol

निम्नलिखित प्रक्रियाएं हेलसिंकी और टोक्यो की घोषणा की सिफारिशों और यूरोपीय समुदाय के प्रायोगिक जानवरों के उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित की गई थीं । इन प्रयोगों को नेगेव की बेन-गुरियन यूनिवर्सिटी में एनिमल केयर कमेटी ने भी मंजूरी दी थी ।

1. प्रायोगिक प्रक्रिया के लिए चूहों को तैयार करना

  1. खुलकर विकृति के बिना वयस्क पुरुष स्प्राग-डावले चूहों का चयन करें, प्रत्येक का वजन 300 और 350 ग्राम के बीच है।
  2. प्रयोग से पहले 12 घंटे के प्रकाश और अंधेरे चक्र के साथ, कमरे के तापमान पर सभी चूहों को 22 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  3. सुनिश्चित करें कि भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम उपलब्ध हैं।
  4. 6:00 ए.m और 2:00 पी.m के बीच सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।

2. सर्जरी के लिए चूहों की तैयारी

  1. आइसोफलून (प्रेरण के लिए 4% और रखरखाव के लिए 2%) और 24% ऑक्सीजन (1.5 एल/मिनट) के साथ 30 मिनट के लिए चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
    1. चूहों में संज्ञाहरण के स्तर का परीक्षण करके यह सुनिश्चित करें कि उनके पास पेडल निकासी पलटा नहीं है।
  2. पूंछ नस में 24 गेज कैथेटर डालें।
    नोट: वासोडिलेशन के लिए पूंछ वार्मिंग नहीं किया जाता है।
    1. चूहों को मेज पर एक रीढ़ की स्थिति में रखें। चूहों के सभी चार अंगों को प्रत्यय करने के लिए चिकित्सा टेप का उपयोग करें।
  3. सर्जरी से पहले चूहे मलाशय में तापमान माप के लिए जांच रखें।
  4. प्रक्रिया के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस कोर शरीर के तापमान का समर्थन करने के लिए एक हीटिंग प्लेट बनाए रखें।
  5. सुरक्षा के लिए चूहे की दोनों आंखों में मरहम डालें।
  6. सर्जिकल क्षेत्र को शेव करें और 10% पोविडोन-आयोडीन के तीन अनुप्रयोगों के साथ कीटाणुरहित करें और इसके बाद 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल।

3. राइट साइड मिडिल सेरेब्रल धमनी ऑक्क्क्यूशन

नोट: एमसीएओ एक संशोधित तकनीक द्वारा किया जाता है, जैसा कि पहले16,22, 23वर्णित है, मैकगैरी एट अल द्वारा वर्णित उपकरणों के उपयोग के साथ।24 और उलूका एटअल।

  1. घुमावदार ब्लेड के साथ सर्जिकल चिमटी और कैंची के साथ गर्दन के वेंट्रल मिडलाइन पर त्वचा और सतही प्रावरणी को विच्छेदन करें।
  2. मांसपेशियों के त्रिकोण की पहचान करें, जिसमें आईसीए, बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) और आम कैरोटिड धमनी (सीसीए) शामिल हैं।
  3. सावधानी से वैस्कुलर सर्जरी के लिए माइक्रोफोर्स के साथ वेगस तंत्रिका से सही सीसीए और आईसीए को अलग करें।
  4. सही सीसीए और आईसीए का पर्दाफाश करें। संवहनी सर्जरी के लिए या तो माइक्रो क्लिप या विशेष टूनीकेट्स का उपयोग करके सीसीए से आईसीए में आने वाले रक्त प्रवाह को ब्लॉक करें। संवहनी सर्जरी के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग कर आईसीए पर एक चीरा (लगभग 1 मिमी) बनाओ।
  5. आईसीए के माध्यम से सीधे एक मोनोफिलामेंट कैथेटर (4-0 नायलॉन) डालें, जो एक हल्के प्रतिरोध तक पहुंचने तक, एमसीए 26 तक पहुंचने तक विलिस के सर्कल में सही सीसीए के विभाजन बिंदु से लगभग18.5-19 मिमीहै।
  6. सीसीए के विभाजन के ऊपर आईसीए के चारों ओर लिगेट।
  7. नकली संचालित नियंत्रण समूह के लिए, चरण 3.5 और 3.616,22के बजाय नायलॉन धागे का एक सम्मिलन करें।
  8. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 0.9% सोडियम क्लोराइड के 5 एमएल प्रशासन।
  9. सीवन द्वारा घाव को बंद करें और चूहे को एक वसूली क्षेत्र में ले जाएं।
    नोट: संज्ञाहरण के अंत के कुछ मिनट बाद, चूहा जाग जाएगा और पिंजरे के चारों ओर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो जाएगा।
  10. एमसीएओ के बाद 23 घंटे में, खारा (4 एमएल/किलो) 23, 26 में2%इवांस ब्लू को कैनुला27 के माध्यम से दोनों संचालित समूहों के लिए पूंछ नस में इंजेक्ट करें ।
    नोट: यह एक रक्त मस्तिष्क पारगम्यता ट्रेसर के रूप में प्रयोग किया जाता है । 60 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें।

4. इनफाक्ट जोन का निर्धारण

  1. एमसीएओ के बाद 24 घंटे में IZ को मापना , जैसा कि पहले9,15,18,19,26बतायागया है ।
    नोट: चूहों कि उनके वजन का 20% से अधिक खो दिया है या बरामदगी या अर्धाघात विकसित प्रयोग से बाहर रखा गया है ।
  2. प्रेरित गैस मिश्रण को 20% ऑक्सीजन और 80% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ बदलकर चूहे को इच्छामृत्यु दें जब तक कि चूहा अनायास सांस लेने के लिए बंद न हो जाए।
  3. कैंची और सर्जिकल संदंश का उपयोग कर रिब पिंजरे के नीचे पेट की दीवार के माध्यम से एक 5-6 सेमी पार्श्व चीरा के साथ छाती खोलें।
  4. कैंची और सर्जिकल संदंश के साथ रिब पिंजरे की पूरी लंबाई के साथ एक डायाफ्रामेटिक चीरा प्रदर्शन करते हैं।
  5. ध्यान से फेफड़ों को विस्थापित, रिब पिंजरे के माध्यम से दाएं और बाएं पक्षों पर हंसली तक काट28।
  6. दिल के बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से सामान्य खारा के 200 एमएल के साथ पर्फ्यूज करें।
  7. पंचर या कैंची के साथ दिल के सही आलिंद चीरा।
  8. गिलोटिन का उपयोग करके डेपुटेशन करें और मस्तिष्क के ऊतकों को इकट्ठा करें।
  9. आईरिस कैंची का उपयोग करना, दोनों पक्षों पर पीछे खोपड़ी सतह के डिस्टल किनारे करने के लिए foramen मैग्नम से काट दिया।
  10. घ्राण बल्ब, वेंट्रल सतह और मस्तिष्क से खोपड़ी की पृष्ठीय सतह के साथ तंत्रिका कनेक्शन अलग करें।
  11. सिर से दिमाग निकालें।
  12. एक .009 "स्टेनलेस स्टील, अनकोटेड, सिंगल एज रेजर ब्लेड के साथ 2 मिमी मोटी क्षैतिज वर्गों का निर्माण करके 6 मस्तिष्क स्लाइस का उत्पादन करें।
  13. 005% टीटीसी में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  14. मस्तिष्क के ऊतकों को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें और 1600x1600 डीपीआई के संकल्प के साथ इन 6 मस्तिष्क-स्लाइस की ऑप्टिकल स्कैनिंग करें (उदाहरण के लिए पूरक 1 देखें)।
  15. चैनल मिक्सर फ़ंक्शन(इमेज एंड जीटी, एडजस्टमेंट एंड जीटी; चैनल मिक्सर)का उपयोग करके फोटो एडिटर (जैसे, एडोब फोटोशॉप CS2) के साथ एक नीला फ़िल्टर जोड़ें और इमेज को जेपीईजी फाइल फॉर्मेट के रूप में सहेजें।
    नोट: ब्लू फ़िल्टर लगाने के बाद, छवि ग्रेस्केल दिखाई देगी।
  16. इमेजजे 1.37v29, 30में सहेजी गई छविखोलें।
    नोट: यह कंप्यूटर प्रोग्राम उन पिक्सेल को अलग करने और गणना करने के लिए एक सीमा फ़ंक्शन का उपयोग करता है जो या तो काले या सफेद हैं (चित्रा 1देखें)।
  17. छवि के 6 मस्तिष्क स्लाइस में से प्रत्येक के लिए, मुख्य मेनू से "बहुभुज चयन" उपकरण का उपयोग करके एक अलग छवि फ़ाइल के रूप में प्रत्येक गोलार्द्ध (दाएं घायल इप्सिलाटरल और बाएं अघायल कॉन्ट्रालेटरल) का चयन और बचत करें।
  18. इमेज > एडजस्ट एंड जीटी; थ्रेसहोल्डका चयन करके इमेजजे सॉफ्टवेयर के मुख्य मेनू से ऑटो थ्रेसहोल्ड फ़ंक्शन का उपयोग करके IZ का निर्धारण करने के लिए कट-ऑफ सेट करें, और एक ही मस्तिष्क सेट के प्रत्येक गोलार्द्ध में पिक्सेल की संख्या को मापें।
    नोट: मैक्रो का उपयोग इमेजजे सॉफ्टवेयर में इस चरण के लिए किया जा सकता है (कोड के लिए पूरक 2 देखें)। कट ऑफ यह निर्धारित करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि कौन से पिक्सेल सफेद में परिवर्तित होते हैं और जो ग्रे की छाया के आधार पर काले रंग में परिवर्तित होते हैं (उदाहरण के रूप में पूरक 3 और पूरक 4 देखें)। ImageJ तो IZ निर्धारित करने के लिए सफेद और काले पिक्सल की तुलना करता है । धुंधला प्रोटोकॉल और स्कैनर सेटिंग्स के आधार पर, हमने 0.220 के निरंतर कट-ऑफ मूल्य का उपयोग किया।
  19. इप्सिलाटेरल और कॉन्ट्रालेटरल सेरेब्रल गोलार्द्ध (रिच) विधि13,23 (पूरक 5में उदाहरण देखें) के अनुपात का उपयोग करके ऊतक सूजन के लिए आईजेड को ठीक करने का मापन करें।
    Equation 1
    नोट: इनफाक्ट आकार को कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध के प्रतिशत के रूप में आंका जाता है।

5. मस्तिष्क एडिमा का निर्धारण31

नोट: बीई 32, 33 के माप के लिए इमेजजे1.37vका उपयोग करें।

  1. उपाय MCAO के बाद 24 घंटे हो । बीई की गणना के लिए, बाएं और दाएं गोलार्द्ध की मात्रा (इकाइयों में) से डेटा का उपयोग करें।
  2. 1600x1600 डीपीआई के संकल्प के साथ ऑप्टिकल स्कैनिंग करें (उदाहरण के लिए पूरक 1 देखें)।
  3. मस्तिष्क गोलार्द्धों का चयन करें और चित्रजे 1.37v के साथ बीई निर्धारित करने के लिए कट-ऑफ सेट करें, जैसा कि 4.17-4.19 वर्गों में ऊपर वर्णित है।
  4. बीई क्षेत्र को अप्रभावित कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध के मानक क्षेत्रों के प्रतिशत के रूप में व्यक्त करें, जिसकी गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके रिच विधि द्वारा की जाती है (पूरक 5में उदाहरण देखें )23,34।
    Equation 2
    नोट: बीई की सीमा को कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध के प्रतिशत के रूप में आंका जाता है।

6. बीबीबी व्यवधान का निर्धारण

  1. उपाय BBB व्यवधान 24 घंटे MCAO के बाद ।
  2. दाएं और बाएं गोलार्द्धों को छह स्लाइस में विभाजित करें और हर एक को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में डालें।
  3. 50% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड के 4 एमएल में मस्तिष्क ऊतक के 1 ग्राम की गणना के आधार पर ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड में मस्तिष्क ऊतक के प्रत्येक टुकड़े को समरूप बनाना।
  4. 20 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  5. 96% इथेनॉल के साथ पतला सुपरनेट लिक्विड 1:3।
  6. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, प्लेट स्थापित करके, और निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके एक नमूना पढ़ने का प्रदर्शन करके ल्यूमिनेसेंस स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री करें: फ्लोरेसेंस तीव्रता उत्तेजन तरंगदैर्ध्य 620 एनएम (बैंडविड्थ 10 एनएम) और 680 एनएम (बैंडविड्थ 10 एनएम)23,35; मॉड टॉप; संख्या मांस 25; मैनुअल 100; मिलाते हुए 1 सेकंड, 1 मिमी।
    नोट: 620 एनएम (बैंडविड्थ 10 एनएम) की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 680 एनएम (बैंडविड्थ 10 एनएम) की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें। 23,35

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Representative Results

इनफाक्ट जोन मेजरमेंट

एक स्वतंत्र नमूना टी परीक्षण से संकेत मिलता है कि 19 चूहों कि स्थाई एमसीएओ से गुजरना मस्तिष्क infarct मात्रा में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का प्रदर्शन 16 नकली संचालित चूहों की तुलना में (MCAO = 7.49% ± ३.५७ बनाम । शाम = 0.31% ± 1.9, टी(28.49) = 7.56, पी एंड एलटी; 0.01 (चित्रा 2 एदेखें)) । डेटा एसडी के ± कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध के एक औसत प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है ।

ब्रेन एडिमा माप

एक स्वतंत्र नमूना टी परीक्षण से संकेत मिलता है कि 19 चूहों कि स्थाई एमसीएओ से गुजरना 16 नकली संचालित चूहों (MCAO = 12.31% ± ८.६ बनाम की तुलना में 24 घंटे के बाद मस्तिष्क एडेमा की सीमा में महत्वपूर्ण वृद्धि का प्रदर्शन किया । शाम = 0.64% ± 10.2, टी(29.37) = 3.61, पी = 0.01, डी = 1.23 (चित्रा 2Bदेखें))। डेटा एसडी के ± कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध के एक औसत प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है ।

रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता

एक स्वतंत्र नमूना टी परीक्षण से संकेत मिलता है कि 19 चूहों कि स्थाई एमसीएओ से गुजरना 16 नकली संचालित चूहों (MCAO = 2235 एनजी/जी ± ११०१ बनाम की तुलना में 24 घंटे के बाद BBB टूटने की सीमा में महत्वपूर्ण वृद्धि का प्रदर्शन किया । शाम = 94 एनजी/जी ± 36, टी(18.05) = 8.47 पी एंड एलटी; 0.01, डी = 2.7 (चित्रा 2Cदेखें)) । डेटा मस्तिष्क ऊतक के एनजी/जी में मापा जाता है और एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया ।

समूह समय प्रक्रियाओं
नकली संचालित (16 चूहों) 0 एमसीएएओ का शामिल करना और नकली संचालित समूह के लिए फिलामेंट का सम्मिलन
एमसीएओ (19 चूहे)
नकली संचालित (16 चूहों) 23h इवांस ब्लू का इंजेक्शन
एमसीएओ (19 चूहे)
नकली संचालित (16 चूहों) 24h IZ, BE, और BBB व्यवधान के माप के लिए मस्तिष्क संग्रह
एमसीएओ (19 चूहे)

तालिका 1: प्रोटोकॉल टाइमलाइन। एमसीएओ के बाद 23 घंटे में इवांस ब्लू सॉल्यूशन को इंजेक्ट किया गया । एक घंटे बाद (एमसीएओ के बाद 24 घंटे), मस्तिष्क संग्रह किया गया था, और IZ, BE और BBB पारगम्यता सभी समूहों में मापा गया ।

Figure 1
चित्रा 1: नकली संचालित और एमसीएओ चूहों के प्रतिनिधि मस्तिष्क स्लाइस।
(ए-बी) मूल स्कैन की गई छवि। (सी-डी) ग्रेस्केल में परिवर्तन। (ई-जी) दहलीज फ़ंक्शन। (जी-एच) एक नीले फिल्टर का आवेदन। (I-J) ब्लू फ़िल्टर एप्लिकेशन के बाद थ्रेसहोल्ड फ़ंक्शन। (K-L) मस्तिष्क एडिमा का आकलन करने के लिए थ्रेसहोल्ड फ़ंक्शन का उपयोग करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नकली संचालित चूहों की तुलना में एमसीएओ चूहों के हिस्टोलॉजिकल परिणाम।
(A)इनफेक्ट जोन। एमसीएओ के बाद 19 चूहों में इनफाक्ट जोन की मात्रा सर्जरी के बाद 16 नकली संचालित चूहों 24 घंटे (*पी & 0.01) की तुलना में काफी बढ़ गई थी। (ख)ब्रेन एडिमा । एमसीएओ के बाद 19 चूहों में मस्तिष्क एडिमा की मात्रा सर्जरी के बाद 24 घंटे 16 नकली संचालित चूहों की तुलना में काफी बढ़ गई थी (*p & 0.01)। (ग)रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता। एमसीएओ के बाद 19 चूहों में रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता सर्जरी के बाद 16 नकली संचालित चूहों 24 घंटे की तुलना में काफी बढ़ गई थी (*p & 0.01)। मूल्यों को एसडी ± कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध के एक औसत प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था और स्वतंत्र नमूनों टी-परीक्षण के अनुसार मस्तिष्क ऊतक ± एसडी के एनजी/जी में इवांस ब्लू एक्स्ट्राट्रेशन इंडेक्स का मतलब था । पी एंड एलटी 0.05, और पी एंड एलटी; 0.01 होने पर परिणाम को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। इस आंकड़े को कुट्स एट अल से संशोधित किया गया है ।23कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक 1: मस्तिष्क स्लाइस का उदाहरण स्कैन। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक 2: ऑटो थ्रेसहोल्ड फ़ंक्शन और पिक्सल मापने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर में उपयोग किए जाने वाले मैक्रो का उपयोग किया जा सकता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक 3: उदाहरण ऑटो सीमा। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक 4: प्रत्येक गोलार्द्ध पर मापा पिक्सेल का उदाहरण। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक 5: नमूना विश्लेषण। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य इस्कीमिक चोट के तीन मुख्य मापदंडों के लगातार माप प्रदर्शित करना था: IZ, BE और BBB पारिझकता । इस क्षेत्र में पिछले अध्ययनों ने एक ही नमूने में इन मापदंडों में से एक या दो को एक साथ प्रदर्शन करने की संभावना का प्रदर्शन किया है। लागत में कमी है कि इस तीन भाग विधि प्रदान करता है के अलावा, यह भी एक अधिक वांछनीय जैव नैतिक मॉडल है कि जानवरों की संख्या है कि पर संचालित किया जाना चाहिए और बाद में इच्छामृत्यु की सीमा प्रदान करता है । सभी हिस्टोलॉजिकल तकनीकों के रूप में, विधि गतिशील रूप से इस्कीमिक चोटों का निरीक्षण करने में असमर्थता से सीमित है।

छवि विश्लेषण में चार कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग किया गया: इमेजजे 1.37v, एडोब फोटोशॉप सीएस 2, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल 365, और आईबीएम एसपीएसएस स्टैटिस्टिक्स 22। इमेजजे का उपयोग इनफारेक्ट जोन और ब्रेन एडिमा के विस्तार को मापने के लिए किया गया था। एडोब फोटोशॉप का उपयोग मस्तिष्क के ऊतकों पर इवांस ब्लू के प्रभाव को सीमित करने के लिए किया गया था, क्योंकि एक नीला रंग बीबीबी टूटने को इंगित करता है। इनफारेक्ट जोन की गणना करने से पहले, छवि से नीले रंग को हटाना आवश्यक है, क्योंकि रंग इनफाक्ट क्षेत्र के सटीक माप के लिए अनुमति नहीं देता है (चित्र 1बी, 1D, 1Fदेखें)। डेटा प्रोसेसिंग के लिए एक्सेल और एसपीएसएस का इस्तेमाल किया गया।

इमेजजे कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के साथ एक इनफारेक्ट जोन का आकलन करने की तकनीक एक स्वस्थ गोलार्द्ध में काले और सफेद पिक्सेल की तुलना पर आधारित है जो एक इनफाक्टेड गोलार्द्ध में पिक्सल के लिए है। इनफाक्ट गोलार्द्ध में, इनफाक्ट क्षेत्र टीटीसी से सना नहीं है; इसलिए, यह चित्रा 1 B में एक सफेद क्षेत्र द्वारा इंगित किया जाता है जिसे मापा जाता है। कार्यक्रम को सही ढंग से इनफारेक्ट ज़ोन की गणना करने के लिए, पिक्सल को ग्रे रंगों की अलग-अलग तीव्रता के रंगों में परिवर्तित करना आवश्यक है (चित्रा 1एफ, 1Jदेखें)। नीला रंग, जो इवांस ब्लू (चित्रा 1 बीदेखें) के कारण होता है, इनफाक्ट क्षेत्र के आकलन को प्रभावित कर सकता है (चित्रा 1Fदेखें)। इसलिए, पहला कदम नीले रंग के फ़िल्टर का उपयोग करके नीले रंग को हटाना और फिर छवि को काले और सफेद छवि में परिवर्तित करना है (चित्र 1Jदेखें)। हमने एडोब फ़ोटोशॉप का उपयोग किया, लेकिन अन्य कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग इस उद्देश्य के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि RawTherapeePortable।

इसके बाद हमने माप प्रक्रिया को मानकीकृत करने के लिए इमेजजे का उपयोग करके एक मस्तिष्क सेट के सभी 6 स्लाइस में इनफारेक्ट जोन की गणना के लिए एक समान पैरामीटर स्थापित किए। यह आवश्यक है क्योंकि प्रत्येक सेट से सभी 6 स्लाइस दाग और एक ही शर्तों के तहत स्कैन किया गया और एक एकीकृत कट-ऑफ पैरामीटर की आवश्यकता होती है । कट ऑफ यह निर्धारित करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि कौन से पिक्सेल सफेद में परिवर्तित होते हैं और जो ग्रे की छाया के आधार पर काले रंग में परिवर्तित होते हैं (चित्रा 1डी, 1Hदेखें)। हमने इस उद्देश्य के लिए मुख्य मेनू से थ्रेसहोल्ड फ़ंक्शन का उपयोग किया। इमेज एनालिसिस में अंतिम कदम इनफेक्ट जोन और ब्रेन एडिमा की गणना थी ।

इनफार्क्ट जोन मापन विभिन्न तकनीकों द्वारा किया जा सकता है, जिसमें हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग या रेडियोलॉजिक तकनीकें जैसे गणना टोमोग्राफ36,पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी, और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग23,36शामिल हैं। प्रयोगशाला में पिछले अध्ययनों ने टीटीसी15,26के साथ धुंधला उपयोग करके इनफाक्ट वॉल्यूम के मूल्यांकन का प्रदर्शन किया है । यह विधि टीटीसी और न्यूरॉन्स के माइटोकॉन्ड्रियल डिहाइड्रोजनेस के बीच एक रासायनिक प्रतिक्रिया पर आधारित है। डिहाइड्रोजनेस से भरपूर स्वस्थ ऊतक, इस धुंधला के साथ लाल रंग के होते हैं। हालांकि, परिगलित कोशिकाओं में, यह रंग परिवर्तन कार्बनिक यौगिकों37के ऑक्सीकरण में भाग लेने वाले सिस्टम में नुकसान के कारण नहीं होता है। हमारे पिछले अध्ययनों में, हमने इस हिस्टोलॉजिकल तकनीक और इस क्षेत्र के मस्तिष्क छवि स्कैनिंग के परिणामों के बीच एक उच्च संबंध का प्रदर्शन किया23।

सेरेब्रल एडिमा के माप का आकलन वीवो और इन विट्रो दोनों में किया जा सकता है। सेरेब्रल एडिमा का परिणाम सोडियम और कैल्शियम आयन चैनलों और ट्रांसपोर्टरों की गतिविधियों में रोग परिवर्तन से होता है जिससे इंट्रासेलुलर पानी में वृद्धि होती है38,39,40,41. वैकल्पिक रूप से, सूजन बीबीबी क्षति से हो सकती है जो बाह्राश पानी को बढ़ाती है। 42 पिछले अध्ययनों में, सेरेब्रल एडिमा का निर्धारण गीली और सूखी तकनीकों के आधार पर किया गया था जिसके बाद ऊतक जल सामग्री43की गणना की गई थी। इस प्रोटोकॉल में हम जो विधि प्रस्तुत करते हैं , उसका एक लाभ इसकी सादगी और सटीकता है जो अन्य मौजूदा तकनीकों की तुलना में23,44,45है ।

BBB टूटने का पता लगाने के लिए सबसे उपयोगी तरीका इवांस ब्लू इंजेक्शन के बाद ल्यूमिनेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी है। BBB पारियक्षा का माप इवांस ब्लू के इंजेक्शन पर आधारित है, जो एल्बुमिन को बांधता है । बदले में, एल्बुमिन का आणविक द्रव्यमान 66 केडीए है और इवांस ब्लू 961 डीए के आणविक वजन की तुलना में बहुत अधिक महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, बीबीबी पारियक्षा का माप एल्बुमिन के आणविक द्रव्यमान द्वारा ठीक से निर्धारित किया जाता है जो क्षतिग्रस्त बीबीबी के माध्यम से प्रवेश करता है, जिससे इवांस ब्लू स्थानांतरित होता है। ऊपर वर्णित तकनीकों के अलावा, अन्य तकनीकें हैं, विशेष रूप से विभिन्न डेक्सट्रांस और रेडियोधर्मी अणुओं के संयोजन के आधार पर, जो एक साथ अधिक सटीक परिणाम देते हैं। अधिक सटीक लेकिन अधिक महंगी तकनीकों की तुलना में, ल्यूमिनेसेंस स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बीबीबी ब्रेकडाउन का मापन सस्ता और उपयोग करना आसान है। हमने इस विधि का उपयोग बीबीबी व्यवधान के मूल्यांकनों के लिए इनफारेक्ट जोन और ब्रेन एडिमा के माप के साथ किया। एमसीएओ को शामिल करने से पहले बीबीबी पारगम्यता के मूल्यांकन के लिए इवांस ब्लू का इंजेक्शन इन दोमापदंडोंको मापने की सटीकता को प्रभावित नहीं करता है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक ही मस्तिष्क के नमूने पर इस्कीमिक मस्तिष्क चोट के तीन सबसे महत्वपूर्ण निर्धारकों को मापने के लिए एक उपन्यास तकनीक प्रस्तुत करता है। इस विधि को मस्तिष्क की अन्य चोटों के मॉडलों पर भी लागू किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल इस्कीमिक इंजरी के पैथोफिजियोलॉजी के अध्ययन में योगदान देगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मेरीना कुश्चेरियावा, मकसिम क्रिवोनोसोव, डार्यना याकुमेंको और फिजियोलॉजी विभाग के एवगेनिया गोंचरेक, फैकल्टी ऑफ बायोलॉजी, इकोलॉजी, एंड मेडिसिन, ओल्स होंचर, निप्रो विश्वविद्यालय, निप्रो, यूक्रेन को उनके समर्थन और हमारी चर्चाओं में सहायक योगदान के लिए धन्यवाद देते हैं। प्राप्त डेटा रुसलान कुट्स की पीएचडी थीसिस का हिस्सा हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22 IBM
Office 365 ProPlus Microsoft - Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

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References

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कृंतक मस्तिष्क के नमूनों के एक सेट में पोस्ट-स्ट्रोक सेरेब्रल एडीमा, इनफारेक्ट जोन और रक्त-मस्तिष्क बाधा ब्रेकडाउन को मापने
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Frank, D., Gruenbaum, B. F.,… More

Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

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